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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp. 182-190, mayo-agosto, 2015.
Validación de la técnica de cianometahemoglobina en la determinación de
hemoglobina al trofín® deshidratado
Maritza González-Pérez, Yanisleydis Otero-Cabrera*, Yenela García-Hernández**
Mislén Gómez-Matos***, Mariela García-Felipe**** y Janet Llamas-Valiente*****
Lic. Microbiología, MSc. y Tecnólogo Nivel I Dirección de Investigaciones. Laboratorio de Reconstituyentes
Calle 31B e/n 186 y 190 Edif.CG-14 apto 15. Playa. Ciudad de la Habana. *Técnico Medio en Química .Laboratorio de
Reconstituyentes Calle 31 e/n 250 y 252 Apto 9 Edif.25005 La Lisa **Lic. en Biología, MSc. e Inv. Auxiliar Calle: 32 # 2504
e/n 25 y 27. Quivicán. Mayabeque ***Lic. Ciencias Farmacéuticas y MSc. Calle: Oquendo e/n Santa Marta y Clavel # 1069
Apto 2. Centro Habana ****Técnico Medio en Química.Laboratorio de Control de la Calidad Calle: Ave31# 8237% 82y84.
La Salud Quivicán. Mayabeque *****Ingeniera Química. Laboratorio de Control de la Calidad Calle: Ave 33 # 3809 entre
38 y 40. San Antonio de los Baños Centro Nacional de Biopreparados: Carretera Beltrán Km 1 ½ Bejucal. Prov. Mayabeque.
maritzaglez@biocen.cu
Recibido: 4 de noviembre de 2013.
Aceptado: 23 de febrero de 2014.
Palabras clave: cianometahemoglobina, validación, trofin deshidratado, hemoglobina bovina.
Key words: cyanmetahaemoglobin, validation, dehydrated trofin, bovine haemoglobin.
RESUMEN. El Trofín® deshidratado es un ingrediente farmacéutico activo que contiene sangre bovina a partir del
cual se elaboran diferentes suplementos nutricionales en tabletas. En esta formulación, la hemoglobina (Hb) bovina
es la proteína de mayor interés puesto que aporta el hierro (Fe) hemínico, por el cual ejerce su efecto antianémico. El
objetivo del trabajo consistió en validar la técnica de la cianometahemoglobina (CMH) para cuantificar la Hb, que
contiene el Trofín® deshidratado, con el fin de elaborar un material de referencia para el control de calidad de los
lotes industriales de Trofín® y de las tabletas. La especificidad del método demostró, que el placebo no interfiere con
la cuantificación de Hb en el deshidratado, al no haber presencia de sangre bovina en este. La linealidad se estudió
mediante un patrón de CMH certificado, a artir de una curva de concentraciones entre 9,3 y 56,2 mg/100 mL, así
como en suspensiones de Trofín® deshidratado las concentraciones entre 10 y 30 g/100 mL. En ambos casos se
comprobo que r2 ≥ 0,98. Se estableció que el método es lineal, preciso y exacto en el intervalo de concentraciones de
Hb bovina entre (30,80 g/L y 101,12 g/L).Se demostró la precisión del método ya que la repetibilidad, la precisión
intermedia y la reproduciblidad, presentaron un coeficiente de variación ≤ 5 %. La exactitud se evidenció al no
obtenerse diferencias entre la concentración de Hb bovina adicionada al Trofín® deshidratado y la calculada (p >
0,05). El recobrado fue de 100 %.
ABSTRACT. The Trofín® in dehydrated form is an active pharmaceutical ingredient which contains bovine blood
that is used to elaborate different nutritional supplements in tablets. In this formulation bovine hemoglobin (Hb) is the
protein of major interest because it brings heme iron (Fe), compound by which exert its antianemic effect. The
objective of this work consisted in to validate the cianmethahaemoglobin technique (CHM) for quantification the Hb
that contains the dehydrated Trofín® with the aim of to elaborate a reference material for the quality control of the
industrial batches of Trofín® and the tablets. The specificity of the method was demonstrated because the components
of the placebo do not interfering with the quantification of Hb in the dehydrated, because it haven´t presence of
bovine blood The linearity was studied using a certificated CMH as a standard, preparing a curve of concentrations
between 9,3 mg/100 to 56,2 mg/100 mL, thus like, in the suspension of dehydrated Trofín® as a concentration
between 10 g to 30 g/100 mL, demonstrating that in both cases the r2≥ 0,98. It was established the linearity, precision
and accuracy of the method in the bovine Hb concentration range of (30,80 y 101,12 g/L). The precision of the
method was demonstrated with the repeatability, intermediate precision and reproducibility presented a CV ≤ 5
%.Accuracy was demonstrated because was not obtained differences between the concentration of added Hb at
dehydrated Trofín® and the calculated concentration for (p > 0,05) and was obtaining a recover of 100%.
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INTRODUCCION
La formulación de Trofín® en forma deshidratada,1 es un ingrediente farmacéutico activo de
origen natural que contiene sangre bovina como componente principal, además de miel de abejas
y extracto acuoso abomasal (ABM), así como benzoato de sodio y propóleos como preservantes.
La sangre a su vez contiene Hemoglobina (Hb),2 la cual es liberada por los eritrocitos en el
proceso de hidrólisis a que es sometida durante la fabricación del Trofín®.1A partir de esta
formulación se elaboran tabletas como NeoTrofín®, NeoTrofínC® y NeoTrofínCF® que han
demostrado una elevada eficacia en la prevención de la anemia en embarazadas.3 Con el objetivo
de obtener el registro sanitario como medicamento para las tabletas que contienen Trofín®
deshidratado, se requiere de elaborar un material de referencia para que se utilice en el control de
calidad del Trofín® deshidratado y de las tabletas. Este material de referencia debe ser
caracterizado a partir de parámetros físicos, químicos o biológicos que se determinan a partir de
métodos validados.4 En tal sentido, se ha desarrollado el método de cuantificación de la Hb
bovina, que es la proteína de mayor interés en la formulación del Trofín® ya que aporta el hierro
Fe hemínico,5 compuesto más importante por el cual esté preparado ejerce su efecto
antianémico.3,6
El método de cuantificación de la Hb bovina en el Trofín® deshidratado se desarrolló a partir de
la técnica de la cianometahemoglobina (CMH),9 el cual constituye un método de rutina en los
laboratorios clínicos por su amplia utilización.7,8,9 Este método fue validado para sangre humana y
como disolución reaccionante se utilizó el reactivo Hemostest (Helfa diagnostic, Cuba),10 que
tiene la misma composición del reactivo de Drabkin que se utiliza en la determinación de la
CMH.7 Este método puede ser utilizado también para determinar la concentración de Hb en la
sangre de animales, debido a que la molécula de Fe hemínico presenta una elevada conservación
en todos los metazoos.5Además, en esta molécula, específicamente el átomo Fe, es el que
reacciona con el cianuro de potasio que contiene la disolución de Hemotest para formar el
compuesto de la CHM, cuya absorbancia máxima se mide a 540 nm (λ).7
Se ha descrito el uso de esta técnica en décadas anteriores para la determinación de la
concentración de Hb en procedimientos para la elaboración de sustitutos de la sangre humana,11,12
pero en este trabajo se utiliza por primera vez, para la determinación de Hb bovina al Trofín®
deshidratado con resultados satisfactorios.
El objetivo de este trabajo consistió en validar la técnica de CMH para la determinación del
contenido de Hb bovina en el Trofín® deshidratado, a través de experimentos que permitan
demostrar la especificidad, exactitud, linealidad, precisión del método empleado y determinar el
intervalo de trabajo recomendado.
MATERIALES Y METODOS
Materias primas
Se utilizó el lote industrial de Trofín® en forma deshidratada 2P24-A (Centro Nacional de
Biopreparados).
Cristalería
Matraz aforado de 5 mL, 10 mL, 50 mL, 100 mL y 1000 mL, pipetas de cristal de 10 mL, tubos de
100 mm x 13 mm.
Reactivos y Disoluciones
Reactivo Hemotest (hexacianoferrato de potasio III / Cianuro de potasio (HELFA
DIAGNOSTICOS, Cuba), hipoclorito de sodio (Electroquímica de Sagua, Cuba), Hidróxido de
sodio (Electroquímica de Sagua, Cuba), ácido clorhídrico 37 % (Merck, Alemania), etanol grado
técnico al 95 % (Gran Comercial, Cuba), Hb bovina (Fluka, Alemania).
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Sustancias de referencia
Patrón de cianometahemoglobina (Diagnostiscs Reagents Ltd., Reino Unido). Reactivo biológico
de referencia internacional (56,2 mg / 100 mL).
Equipos
Balanza analítica Sartorius, modelo MSU 4202S (Sensibilidad 0.001 g) (Alemania), agitador
magnético Retomed, modelo AM 03 (Cuba), horno MEMMERT (Alemania), espectrofotómetro
modelo Ultrospec 2000, (Pharmacia Biotech, (Suecia), Autoclave modelo Sakura (Japón),
dispensador de líquidos (1-10 mL) modelo LabMax (Francia), espectrofotómetro UV-Visible
modelo Jenway, (Reino Unido de Gran Bretaña), pipetas Eppendorf automáticas variables de 10
µL -100 µL y de 100 µL -1000µL (Alemania).
PARTE EXPERIMENTAL
Cuantificación de Hb bovina en el Trofín® deshidratado
A partir del patrón de CMH de 56,2 mg/100 mL se prepararon las concentraciones de 9,3; 18,7;
28,1; 37,4 y 46,8 mg/100 mL (Tabla 1) que fueron disueltas en la disolución de trabajo de
Hemotest diluido 1 : 50 con agua destilada, los cuales fueron analizados en un espectrofotómetro
a una longitud de onda (λ) de 540 nm y los valores de longitud de onda obtenidos fueron
correlacionados en una curva de concentración del patrón de CMH vs. DO. Esta curva se utilizó
para la determinación de la concentración de Hb de todos los ensayos que se realizaron en la
validación del método mediante la sustitución de los valores de λ a 540 nm de las muestras en la
ecuación de la recta obtenida del análisis de regresión que se realizó con la lectura de los patrones
de CMH para obtener la concentración de Hb bovina en mg/100mL. Para expresar la
concentración de Hb bovina en el Trofín® deshidratado en g/100 mL se multiplicó por el factor
de dilución (251) y se dividió por 1000.
Tabla 1. Preparación de los patrones de CMH
Volumen del patrón Disolución de
CMH
Hemotest
(μL)
(μL)
0,5
2,5
1,0
2,0
1,5
1,5
2,0
1,0
2,5
0,5
Concentración
patrones CMH
(mg/100mL)
9,3
18,7
28,1
37,4
46,8
de Concentración
patrones CMH
(g/L)
93,0
187,0
281.0
374,0
468,0
de
Validación del método
Estudio de Especificidad
Se comparó la concentración de Hb bovina en suspensiones de Trofín® deshidratado de 20
g/100 mL en agua destilada con una muestra con la misma composición de la formulación del
Trofín® deshidratado,1 excepto la sangre bovina, cuyo volumen se sustituyó por agua destilada.
Se utilizó como criterio de aceptación de la especificidad del método, que se obtuvieran
diferencias estadísticas significativas entre las concentraciones de Hb en las suspensiones de
Trofín® deshidratado y del placebo para p < 0,05 según la prueba de t de Student.
Estudio de Linealidad
Se estudió el comportamiento de la λ a 540 nm para diferentes concentraciones del patrón de
CMH certificado y en suspensiones de Trofín® deshidratado disuelto en agua destilada a
concentraciones de (10, 15, 20, 25 y 30 g/100 mL).
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Para la realización del ensayo se preparó una suspensión en agua destilada de Trofín®
deshidratado a 10 g/100 mL y a partir de esta se añadieron volúmenes crecientes para completar
las diferentes concentraciones que se utilizaron (Tabla 2). Se realizó el análisis de correlación
lineal, mediante el uso del método de los mínimos cuadrados, entre la λ a 540 nm y la
concentración de Hb bovina para el caso del patrón de CMH. Para las muestras de Trofín® se
realizó el análisis entre la concentración de Trofín® deshidratado en las muestras (g/100 mL) y la
λ a 540 nm. Se utilizó como criterio de aceptación de linealidad que r 2  0,98.
Tabla 2. Preparación de las muestras de Trofín® deshidratado
Trofín®
Volumen de la
Disolución de
deshidratado
disolución deTrofín®
Hemotest
(g/100mL)
(μL)
(μL)
10
20
5000
15
30
4990
20
40
4980
25
50
4970
30
60
4960
Estudio de precisión
Se efectuó el análisis de repetibilidad evaluando muestras de Trofín® deshidratado a las
concentraciones de 10, 20 o 30 g /100 mL, con tres réplicas de cada una, por un analista del
laboratorio de Reconstituyentes. El ensayo de precisión intermedia se realizó por dos analistas
del laboratorio para las tres concentraciones de Trofín® deshidratado, mientras que el ensayo de
reproducibilidad se realizó a partir de la comparación del CV obtenido por dos analistas del
laboratorio de Reconstituyentes con dos analistas del laboratorio de Química de Control de la
Calidad a partir de las concentraciones de Hb bovina calculados en las muestras, a las tres
concentraciones preparadas de este. En todos los casos, se utilizó como criterio de aceptación de
la precisión del método que el CV ≤ 5 %.
Estudio de Exactitud
Se determinó la exactitud del método de cuantificación de la concentración de la Hb al Trofín®
deshidratado adicionando cantidades conocidas de una muestra preparada a dos concentraciones
de Hb previamente determinadas. Para ello, se preparó una disolución de Hb bovina liofilizada
(pureza ≥ 90 %) a una concentración de 10 g/100 mL. Por otra parte, se pesaron 2 g de Trofín®
deshidratadopor triplicado. A una de las muestras con 2 g de Trofín® deshidratado, se le adicionó
2 mL de la solución de Hb bovina (correspondiente a una concentración de 2 g Hb /100 mL). A la
otra muestra con 2 g de Trofín® deshidratado se le adicionó 4 mL de la disolución de Hb
liofilizada (correspondiente a una concentración de 4 g Hb / 100 mL). La tercera muestra se
utilizó como control ya que no se le adicionó solución de Hb bovina. Se enrasaron las tres
muestras con agua destilada a 10 mL en matraz aforado, siendo la concentración de Trofín®
deshidratado en todos los casos de 20 g / 100 mL.
Se determinó la concentración de Hb bovina a cada una de las réplicas de las muestras y al
control. Además, se calculó la concentración de Hb bovina esperada en cada una de las muestras
experimentales, a partir de la sumatoria de la concentración de Hb bovina determinada en la
muestra control y la cantidad correspondiente de Hb bovina que se adicionó a cada muestra. Se
expresaron los resultados como porcentaje de recuperación (R), según la expresión:
R = (Conc. Calculada/Conc. Esperada) x 100 %.
Se utilizó como criterio de aceptación de la exactitud del método que no existieran diferencias
significativas entre R y el 100%, para una p > 0,05que se determinó por la prueba de t de Student.
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Determinación del intervalo del ensayo
El intervalo del ensayo se determinó según las concentraciones de Hb bovina que contiene el
Trofín® deshidratado en que se cumplen los requisitos de linealidad, precisión y exactitud que en
este caso fue entre 10 y 30 g de Trofín® deshidratado por 100 mL.
Para el diseño de los experimentos se tomó como referencia la regulación 41/2007.13Para realizar
todos los análisis estadísticos se utilizó el programa Stat Graphics Centurión XV (Versión 15 –
2002, USA).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los métodos analíticos que se utilizan en el control de calidad de los medicamentos cuando son
desarrollados en los laboratorios deben ser validados.13 En el ensayo de especificidad se demostró,
que en el placebo no se obtienen valores de Hb; sin embargo, para la suspensión de Trofín®
deshidratado, a la concentración de 10 g/100 mL, fue de 6,381 ± 0,115 g/100 mL, con lo que se
demostró que el aporte de Hb es procedente solamente de la sangre hidrolizada; por lo tanto, se
obtuvieron diferencias significativas entre la concentración de Hb bovina de ambas muestras
(t = –124,8 y p = 0,0). Este resultado evidenció que los componentes del Trofín® deshidratado,
tales como el ABM, los propóleos y la miel de abejas,1 no interfieren en la cuantificación de Hb
bovina por el método de la CMH.
En el estudio de la linealidad para el patrón de CMH y las muestras de Trofín® deshidratado a las
concentraciones entre 10 y 30 g/100 mL se demostró en todos los casos que r2 ≥ 0,98 (Tabla 3) y
la desviación estándar relativa de la pendiente cumplió con el criterio < 5 % para el patrón y para
el Trofín® (Tabla 3a).
Tabla 3. Resultados de linealidad
Rectas
Pendiente
(a)
Intercepto
(b)
Patrón Recta 1
Patrón Recta 2
Patrón Recta 3
Trofín® Recta 1
Trofín® Recta 2
Trofín® Recta 3
0,0613
0,0616
0,0614
0,0439
0,0449
0,0466
0,0039
0,0027
0,0031
0,0485
0,0437
0,0378
Coeficiente de
determinación
r2> 0,98
0,9980
0,9969
0,9978
0,9947
0,9978
0,9992
Tabla 3 a. Resultados de la desviación estándar relativa de la pendiente
Muestras
Media
DE
DE Relativa de la pendiente (<5%)
Patrón
Trofín®
0,0614
0,0451
0,0002
0,0014
0,25
3,02
Se demostró la precisión del método porque la cuantificación de Hb bovina en muestras de
Trofín® deshidratado a tres niveles de concentración diferente por un mismo analista cumplió con
los criterios de aceptación de la repetibilidad, ya que en todos los casos el CV es ≤ 5 %.
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Tabla 4. Resultados del ensayo de repetibilidad
Concentración de Hb (g/dL)
Concentración Analista 1
de Trofín®
Réplica
(g/100 mL)
1
2
3
3,08
3,155
3,004
20
6,564
6,564
6,451
30
10,125
10,125
10,087
10
Media ± DE
Criterio de
aceptación
CV (%) CV ≤ 5 %
Cumple
Si o No
3,08
± 0,076
6,526
± 0,065
10,112
± 0,022
2,452
Si
1,000
Si
0,217
Si
La precisión intermedia del método fue demostrada al comparar la concentración de Hb bovina
determinada por dos analistas utilizando el mismo equipamiento obteniéndose un CV ≤ al 5 %
(Tabla 5).
Tabla 5. Resultados del ensayo de precisión intermedia
CV (%)
Criterio de
aceptación
CV ≤ 5%
Cumple
Si o No
3,181
± 0,147
4,609
Sí
6,506
6,516
± 0,009
1,398
Sí
10,431
10,288
± 0,222
2,156
Sí
Concentración
de Hb (g/dL)
Concentración
de Hb (g/dL)
Analista 1
Analista 2
10
3,080
3,282
20
6,526
30
10,112
Trofín®
deshidratado
(g/100 mL)
Media ± DE
Se demostró la reproducibilidad del método ya que al analizarse muestras de Trofín®
deshidratado a tres niveles de concentración diferente en dos laboratorios diferentes se cumplió
que el CV fue ≤ 5 % (Tabla 6).
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Tabla 6. Resultados del ensayo de reproducibilidad
Concentración de Hb (g/dL)
Prom
Prom
Analista1* Analista2*
Prom
Prom
Analista1** Analista 2**
Promedio
general
CV (%)
± DE
Criterio de
aceptación
CV ≤ 5%
Cumple
Si o No
3,227
3,041
Si
± 0,098
6,482
6,526
6,506
6,506
6,388
0,975
Si
± 0,063
10,148
10,112
10,431
10,431
9,617
3,787
Si
± 0,384
*Analista del laboratorio de Reconstituyentes. **Analista del laboratorio de Control de la
Calidad. Prom Las concentraciones reportadas corresponden a promedio de las tres réplicas
analisadas por cada analista
3,080
3,282
3,282
3,262
La exactitud se demostró al no obtenerse diferencias entre la concentración de Hb bovina
calculada en las muestras de Trofín® deshidratado y la concentración de Hb bovina esperada para
(p > 0,05). En cada nivel de concentración recobrado alcanzando del 100 %. (Tabla 7).
Tabla 7. Resultados del análisis de exactitud
Muestra
Conc. Hb
calculada
(g/100 mL)
Muestra
20gTrofín®/ 6,410
100mL
Muestra
20g/100mL
8,572
+ 2 g Hb/100
mL
Muestra
20g/100 mL
10,611
+ 4 g Hb/100
mL
Conc. Hb
esperada
(g/100mL)
R promedio
%
Prueba t de
student´s
Criterio de
aceptación
p > 0,05
6,381
100,40
t = 0,3872
p = 0,714
Sí
8,410
101,5
t = 1,9417
p = 0,109
Sí
10,410
101,93
t = 2,1847
p = 0,080
Sí
Al cumplirse los criterios de aceptación de la linealidad, precisión y exactitud, para la
cuantificación de Hb bovina en el Trofín® deshidratado, quedó establecido que para las
suspensiones de Trofín® deshidratado a 10 y 30 g/100 mL, la concentración de Hb bovina se
encuentra entre 30,80 y 101,12 g/L.
El análisis de robustez de la técnica fue realizado previamente utilizando hemoglobina bovina
liofilizada con pureza ≥ 90 %. Se determinó la variación de la concentración de Hb con
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variaciones del pH desde 3 hasta 7,2 y se demostró que a pH por debajo de 5,0 para la Hb en
disolución, la técnica sobreestima las concentraciones de Hb obtenidas.14
Se ha descrito que en la sangre bovina los sólidos corresponden aproximadamente al 20 % de su
peso seco, mientras que de ellos, las proteínas corresponden al 91,05 %.15 Por otra parte, durante
el proceso de obtención de la formulación de Trofín® en forma deshidratada, la sangre bovina,
representa aproximadamente el 50 % del total de los ingredientes que se utilizan en su obtención y
aporta la Hb, la que a su vez contiene la molécula de Fe hemínico, que es la de mayor interés en
el efecto antianémico del preparado.1,3,5 Sin embargo, actualmente el control de calidad de los
lotes industriales de Trofín® deshidratado en relación con los parámetros que caracterizan su
composición proteica está restringida a la cuantificación de nitrógeno amínico,1,3 de ahí que la
utilización de una técnica sencilla para cuantificar la Hb bovina en el Trofín® deshidratado
constituye una herramienta de trabajo útil, que podrá ser utilizada no solo para la elaboración de
un material de referencia de Trofín® deshidratado, sino también, como parte del control de
calidad de las producciones del Centro de Biopreparados, ya sea de Trofín® deshidratado como de
las diferentes tabletas producidas.
CONCLUSIONES
Los resultados del presente trabajo han permitido validar la técnica de CMH para la cuantificación
del contenido de Hb bovina al Trofín® deshidratado, quedó validada tanto intra-laboratorio
como inter-laboratorio, con la participación del Laboratorio de Química de Control de la Calidad.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. González R, Aznar E, Achong A. Hemoderivado en polvo para la profilaxis y tratamiento
de la deficiencia de hierro. Oficina Cubana de la Propiedad Industrial 2000; No. CU
22599 A1.
2. VOET DE. Función de la hemoglobina en el microcosmos. Cap.9 Edic. Omega; España:
2002.
3. Aznar E, González R, González M, Suárez S. Utilización del Trofín®, NeoTrofín® y sus
formulaciones con vitamina C y ácido fólico para disminuir la anemia por deficiencia de
hierro. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos (eds). Alimentación, Nutrición y
Salud, La Habana Viceministerio de Higiene e Epidemiología, Ministerio de la Salud
Publica de la República de Cuba, 2009: p. 173-175.
4. CECMED REGULACIÓN No.22/2012. Materiales de Referencia para medicamentos..
Ministerio de Salud Pública. Cuba. 2012.
5. Schultz IJ, Chen C, Paw BH, Hamza I. Iron and Porphyrin Trafficking in hemebiogenesis.
J. Biol. Chem. 2010; 85(35): 26753-26759.
6. González R, Aznar E, González M, Hernández JC, Varela A, Silva P, García Y. Nueva
línea de productos para prevenir y tratar la anemia partiendo del hierro hemínico.
Informacéutico 2008; 15:43-8.
7. International Council for Standarization in Haematology. Recommendations for reference
method for haemoglobinometry in human blood (ICSH standard 1995) and specifications
for international haemoglobincyanide standard (4th edition).J ClinPathol. 1996; 49:271274.
8. Stanbio Laboratory Procedimientos No. 0320,0321 y 0325 Stanbio Hemoglobina para la
determinación cuantitativa colorimétrica de Hemoglobina en sangre total. Texas: 2001.
9. Drabkin DL, Austin JM. Spectrophotometric constants for common haemoglobin
derivatives, in human, dog and rabbit blood.J. Biol Chem. 1932; 98(2): 719-733.
10. Díaz M et al. Validación de técnicas analíticas utilizadas en el control de la calidad Rev.
Cubana Farm. 1998; 32(2):106-12.
189
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 2, pp. 182-190, mayo-agosto, 2015.
11. Hiromi S, Shinji T and Hiroaki Y. Purification of concentrated haemoglobin using organic
solvent and heat treatment. Protein expression and purification. 1993;4, 563-569.
12. Andrade CT, Barros LAM, Lima MCP, Azero EG.Purification and characterization of
human haemoglobin effect of the haemolysisconditions. Int. J of Biol Molecules. 2004; 34,
233-240.
13. CECMED REGULACIÓN No. 41/2007. Validación de métodos analíticos. Ministerio de
salud de la República de Cuba, 2007.
14. González M. et al .Determinación de la acidificación permisible a la sangre bovina para la
cuantificación de hemoglobina en la técnica de Drabkin. Rev CENIC de Ciencias
Bilógicas 2012; .43 (2):
15. Duarte RT, Carvalho MS, Sgarbieri VC. Bovine Blood Components: Fractionation,
Composition, and Nutritive Value. J Agric.Food.Chem 1999; 47: 231-36.
190