GRKs
תקציר חישת הטעם הינה מערכת מורכבת המאפשרת לבעלי חיים לזהות ולברור מקורות מזון איכותיים בהתאם לצרכים הפיסיולוגיים ולמנוע הרעלה .תאי הטעם ) (taste receptor cellsהאחראים על חישה זו ממוקמים בעיקר בלשון ומרוכזים יחד ביחידות מורפולוגיות בשם פקיעיות הטעם ) (taste budsאשר בעצמן מאורגנות בתוך שלושה סוגים של פפילות ) folate ,fungiform :(papillaeוcircumvallate - ) .(CVהקולטנים אשר אחראים על זיהוי וקשירת התרכובות המתוקות ) (T1Rsוהמרות )(T2Rs שבמזון התגלו לפני מספר שנים ומשתייכים למשפחה הרחבה של קולטנים התלויים בחלבון G ) .(GPCRsגירוי חוש הטעם הינו תהליך מהיר אשר מסתיים תוך שניות ספורות .למרות זאת ,טעמם של טעמנים מרים וממתיקים לא סוכריים רבים נמשך לתקופות ארוכות יותר ,עד מספר דקות ,תופעה המכונה שאריתיות .התחושה הלא נעימה שנגרמת כתוצאה מכך מונעת צריכה גדולה יותר של מגוון רחב של מזונות בעלי ערך תזונתי ,כגון ירקות המכילים טעמנים מרים או מוצרים דיאטטים המכילים ממתיקים דלי קלוריות .למרות השלכותיה ,המנגנון המולקולרי של תופעה זו אינו ידוע. רבים מן התרכובות המרות והממתיקים המלאכותיים הם בעלי אופי אמפיפטי ,כלומר מכילים קבוצות הידרופיליות והידרופוביות במבנה הכימי שלהם .מחקרים הראו כי תכונה זו מאפשרת למולקולות אלו לחדור במהירות ממברנות ליפידיות של ליפוזומים ואף ממברנות פלסמטיות של תאים ביתר קלות .בנוסף, מחקרים אלקטרופיזיולוגיים וביוכימיים הראו פעילות מוגברת של תאי הטעם כתוצאה מחשיפתם לטעמנים אמפיפטיים .השערת העבודה הינה שבמקביל להפעלת קולטני הטעם ,טעמנים אמפיפטיים חודרים את הממברנה הפלסמטית של תאי הטעם .בתוך ציטוזול התאים ,אותם הטעמנים יכולים לבוא במגע עם מרכיבים ציטוזוליים שונים ,ובין היתר לשבש את תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטנים ע"י עיכוב קינאזות הקשורות לכיבוי הסיגנל ,כגון הקינאזות ממשפחת ה.(GPCR kinases) GRKs - במקרה כזה ,על פי השערת העבודה ,הטעמנים האמפיפטיים גורמים לקולטני הטעם להיות פעילים ולסיגנל להימשך לזמן רב יותר ,ולכן גורמים לתחושת השאריתיות. מחקרים קודמים הראו שטעמנים אמפיפטיים חודרים לתוך תאי טעם מפפילות CVאו פקיעיות טעם מבודדות .המטרה הראשונה במחקר הנוכחי היה להוכיח כי יכולת זו קיימת גם בתנאים פיזיולוגיים ,בהם תאי הטעם חשופים לטעמנים אך ורק מצידם האפיקלי .חשיפתה של פפילת CVשלמה לתמיסות טעמנים אמפיפטיים בעלי פלואורסצנציה עצמית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי אפשר לעקוב אחר חדירתם של הטעמנים לתוך הפפילה .הופעתה של פלואורסצנציה בדיוק בתעלת הפפילה ,בה ממוקמות מרבית פקיעיות הטעם ,הראתה כי הטעמנים חודרים ומצטברים בתוך פקיעיות הטעם עצמן .חוסר יכולתו של מדעיך הפלואורסצנציה KIלהפחית את עוצמת הפלואורסצנציה אשר התקבלה לאחר חשיפתה של פפילת ה CV -לטעמנים השונים הוכיח כי אלה אכן חדרו לתוך ציטוזול התאים .בנוסף ,הזרמת תמיסות טעמנים שונים לתוך פיה של חולדה מורדמת הובילה למציאת ריכוזים גבוהים )מילימולרים( של אותם הטעמנים בתוך ציטוזול תאי הטעם ,כפי שנקבע בעזרת .HPLCיחד ,תוצאות אלו תומכות לא רק 1 בהשערה כי הטעמנים אכן חודרים בתנאים פיזיולוגיים לתוך ציטוזול תאי הטעם ,אלא מראות שבמקרים מסוימים ,כמו קפאין וכינין ,טעמנים אלה עשויים להצטבר כנגד מפל הריכוזים. בהמשך נבחנה נוכחותן של קינאזות ממשפחת ה ,GRKs -האחראיות על תהליך הדסנסיטיזציה של קולטנים ממשפחת ה ,GPCR -בתאי פקיעית הטעם של פפילת .CVתוצאות מניסוי RT-PCRהראו כי GRK5 ,GRK3 ,GRK2ו GRK6 -מתבטאים בפפילת ה CV -עצמה אך גם באפיתל הלא-סנסורי הסמוך לה בלשון .צביעה פלואורסצנטית של חתכי פפילת CVבעזרת נוגדנים המכוונים כנגד כל אחד מה GRKs -הראתה שלעומת GRK5ו GRK2 -אשר מתבטאים בפקיעיות הטעם עצמן GRK6 ,נמצא בעיקר בתאים הלא-סנסוריים שברקמת הפפילה .רמת הביטוי של ,GRK3לעומת זאת ,נמצאה כה נמוכה שמיקומה לא נקבע. מכיוון שתהליך הדסנסיטזציה של הקולטנים לטעם המתוק והמר ) (T2Rs ,T1Rsאינו ידוע ,הקולטן ה- β2ARשימש בהמשך המחקר כמודל המייצג את כלל משפחת ה .GPCRs -על מנת להוכיח את השערת העבודה ולחקור את השפעותיהם של טעמנים אמפיפטיים על תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן ה- ,β2ARבוטא הקולטן באופן מלאכותי בתאי .HeLaתאים אלו נבחרו כתאי המודל הטובים ביותר להמשך המחקר על בסיס יכולתם של הטעמנים לחדור לתוכם ולהגיע לריכוזים ציטוזוליים הדומים לאלו שנמצאו בתאי הטעם .נבחנו השפעותיהן של שש תרכובות אמפיפטיות ,שלוש מתוקות )סכריןD-TRP , ו ,(NHD -ושלוש מרות )קפאין ,נרינגין וכינין( .ראשית ,נבחנה השפעת הטעמנים על תפקוד הקולטן ה- .β2ARחשיפה מוקדמת של התאים לטעמנים השונים למשך 10דקות גרמה להגברה משמעותית ברמות ה cAMP -בתגובה ל ,(ISO) isoproterenol -אשר נמשכה גם 2דקות לאחר גירוי הקולטן .התוצאות הראו כי הטעמנים לא פעלו כליגנדים לקוטלן ה ,β2AR -ושחדירתם לתוך ציטוזול התאים הייתה הכרחית על מנת לקבל את ההגברה ברמות ה ,cAMP -דבר אשר מוכיח כי מקור השפעת הטעמנים היה ציטוזולי ולא רצפטורלי .בנוסף ,השפעתם של הטעמנים על רמות השליח המשני לא הייתה תלויה בפעילותם של ,PDEאשר אחראי על פירוק נוקלאוטידים ציקליים בתא ,או של ,PKAאשר משתתף בתהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן .תוצאות אלו יחד מצביעות על כך שההגברה שנראתה ברמות ה- cAMPבנוכחות הטעמנים נבעה מהגברה בפעילות הקולטן עצמו .בהמשך ,נעשה שימוש בנוגדן המכוון ספציפית כנגד אתר בקולטן המזורחן ע"י GRK2ו GRK5 -בלבד ,על מנת לעקוב אחר התקדמותו של תהליך הדסנסיטיזציה .חשיפה של התאים לטעמנים השונים גרמה לא רק לעיכוב בעוצמת הזרחון של הקולטן אלא גם להשהיה בזמן הופעתו .בנוסף ,תהליך האינטרנליזציה אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה- ,GRKsומתאפיין בהחדרת הקולטן לציטוזול התאים ,נמצא אף הוא מעוכב בנוכחות הטעמנים .עיכוב זה תורגם באחוז גבוה יותר של תאים המכילים קולטן ממברנלי ונוכחות גדולה יותר של קולטן בממברנה הפלסמטית של התאים גם 15-20דקות לאחר גירוי הקולטן .תהליך נוסף אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה GRKs -הינו מסלול ה .(Mitogen-activated protein kinase) MAPK -מסלול העברת אותות זה מופעל מצד אחד כתוצאה מזרחון הקולטן ה β2AR -ע"י PKAאך גם לאחר קשירת β-arrestinלאתרי הקולטן המזורחנים ע"י .GRKsכתוצאה מהפעלת מסלול זה ,מזורחן ומשופעל .ERKהטעמנים לא 2 השפיעו על רמת הזרחון הבסיסית של , ERKוגם לא על השפעול התלוי ב .PKA -לעומת זאת ,הם עיכבו ספציפית את השפעול התלוי במסלול ה.GRKs/β-arrestin - לסיכום ,תוצאות עבודה זו מוכיחות את השערת העבודה לפיה טעמנים אמפיפטיים חודרי ממברנות מעכבים את הקינאזות ממשפחת ה GRKs -ולכן משבשים את מהלך הדסנסיטיזציה של הקולטן .כתוצאה מכך ,הטעמנים גורמים לקולטן עצמו להיות פעיל יותר לזמן ארוך יותר .ייתכן ומנגנון זה יסביר בעתיד את תחושת השאריתיות המורגשת בזמן טעימת טעמנים מרים וממתיקים מלאכותיים .מכיוון שקינאזות ה- GRKsמשתתפות בדסנסיטיזציה של מגוון רחב של קולטנים ,ייתכן ולטעמנים האמפיפטיים השפעות רחבות יותר משל חישת הטעם עצמה .למשל ,ידוע כי טעמנים אלה מגיעים במהירות לאפיתל המעי ,אשר הוכח לאחרונה כי הוא מכיל קולטנים T1Rsהמעורבים בוויסות ספיגת הגלוקוז ואולי רכיבים תזונתיים נוספים .בנוסף ,ידוע כי מספר תרכובות כגון קפאין ,נרינגין או סכרין יכולות להימצא בדם ובאיברים שונים בגוף מספר דקות לאחר צריכתן .ייתכן כי טעמנים כאלה יוכלו להשפיע באותם האיברים על תהליכים פיזיולוגיים התלויים בקולטנים אחרים השייכים למשפחת ה. GPCRs - 3 תוכן עניינים .1מבוא 8............................................................................................................................. - 1.1חושים כימיים 8 ........................................................................................................ - 1.2חישת הטעם8 ........................................................................................................... - 1.3אברוני חוש הטעם ביונקים 9 ....................................................................................... - 1.4מנגנונים תאיים של חישת הטעם 10 ............................................................................. - 1.4.1הטעם המר 10 ................................................................................................... - 1.4.2הטעם המתוק 13 ................................................................................................ - 1.4.3הטעם האוממי )חומצות אמינו( 15 ......................................................................... - 1.4.4הטעם המלוח 16 ................................................................................................ - 1.4.5הטעם החמוץ 16 ................................................................................................ - 1.5העברת אותות בין-תאית וקידוד הטעם במערכת הפריפרית 17 ............................................ - 1.5.1העברת המידע אל תאי העצב לאחר גירוי קולטני הטעם 17 ......................................... - 1.5.2תתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם מבחינות בין הטעמים השונים18 ............................ - 1.6מנגנון סיום העברת האותות )דסנסיטיזציה( של קולטנים מסוג 20 ............................ GPCR - 1.6.1תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה20 ..................................................... GPCRs - - 1.6.2מאפיינים מבניים של קינאזות ממשפחת ה22 ............................................... GRKs - - 1.6.3בקרה על פעילות 22 ................................................................................ GRK2 - 1.6.4שפעול מסלולי העברת האותות לאחר הדסנסיטיזציה של קולטני ה24 .............GPCRs - - 1.7חשיבות המחקר ומטרת העבודה 24 ............................................................................... .2חומרים ושיטות 28............................................................................................................. - 2.1חומרים 28 ............................................................................................................... - 2.1.1רשימת חומרים 28 ............................................................................................. - 2.1.2נוגדנים ,אנזימים ,חומצות גרעין וערכות 29 ............................................................. - 2.1.3בופרים ותמיסות 30 ............................................................................................ 2.2שיטות 32 .................................................................................................................. - 2.2.1הדמיית חדירת טעמנים לתוך פפילות CVשלמות תוך מעקב דינמי ) (in situבמיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי 32 ............................................................................................... - 2.2.2הפרדת פפילת ה CV -בחולדה 33 ......................................................................... - 2.2.3הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת CVוקביעת כמות חלבון 33 .................................. - 2.2.4חדירת הטעמן לתוך תאי הטעם של פפילת (in vivo) CVבחולדות מורדמות 34 ............ - 2.2.5קביעה כמותית של טעמנים בתוך תאי טעם מפפילת CVבעזרת שיטת 35 ...........HPLC 36 ....................................................................................................RT-PCR - 2.2.6 - 2.2.6.1הפקת רנ"א כללי ) (total RNAמתוך פפילת CVואפיתל לא סנסורי 36 ................ 36 ............................................................... Reverse Transcription (RT) - 2.2.6.2 37 ...................................................Polymerase Chain Reaction (PCR) - 2.2.6.3 - 2.2.6.4בחירת תחלים 37 ........................................................................................ - 2.2.6.5קביעת רצף חומצות הגרעין )37 ..................................................(sequences - 2.2.7קביעת נוכחות קינאזות ממשפחת ה GRK -בפפילת CVע"י צביעת חתכים מרקמות לשון )אימונוהיסטוכימיה( 38 .................................................................................................. - 2.2.7.1הכנת חתכים מלשון 38 ................................................................................ - 2.2.7.2צביעת חתכי פפילת CVבעזרת נוגדנים39 ....................................................... - 2.2.7.3בדיקת ספציפיות של נוגדנים בשיטת 39 ..................................... Western blot - 2.2.8קביעת חדירת טעמנים אמפיפטיים בתאי 40 ................................................... HeLa - 2.2.8.1החזקת תאים 40 .......................................................................................... – 2.2.8.2הכנת תמיסות סטוק של הטעמנים וקביעת חדירתם לתאי 40 ...................... HeLa - 2.2.9מדידת שינויים ברמות 41 ......................................................................... cAMP 4 - 2.2.9.1ביטוי מלאכותי )טרנספקציה( של הקולטן ה β2AR -בתאי 41 ....................HeLa - 2.2.9.2הכנת הדוגמאות 41 ...................................................................................... - 2.2.9.3קביעת כמות cAMPבשיטת ה42 ....................... (RIA) radioimmunoassay - - 2.2.9.4קביעת חלבון בשיטת ברדפורד 42 .................................................................. - 2.2.10קביעת רמת הזרחון של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי 42 .................................. - 2.2.10.1הכנת הדוגמאות 42 .................................................................................... - 2.2.10.2קשירת החרוזים לנוגדן כנגד 43 ............................................................. HA - 2.2.10.3השקעה אימונית ) (immunoprecipitationשל הקולטן הבטא-אדרנרגי 43 ......... - 2.2.11מדידת אינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי 44 ............................ - 2.2.12מידור )פרקציונציה( של התא 44 ......................................................................... - 2.2.13קביעת שפעול של 45 ............................................................................... ERK - 2.2.14ניתוח סטטיסטי של התוצאות45 .......................................................................... .3תוצאות 46........................................................................................................................ - 3.1חדירת טעמנים אמפיפטיים לפפילות CVשלמות 46 ......................................................... - 3.1.1מעקב אחר חדירת הטעמנים במיקרוסקופ קונפוקלי 46 ............................................... - 3.1.2חדירת טעמנים אמפיפטיים במודל של חיות 47 ......................................................... - 3.2נוכחות ודפוס התבטאות של קינאזות ממשפחת ה GRKs -בפפילת CVבחולדות 48 ............... -3.2.1ביטוי GRKsשונים בפפילת ה CV -בשיטת ה48 .................................... RT-PCR - – 3.2.2קביעת מיקומם של ה GRKs -השונים בשיטת 49 ......................... immunostaining -3.3חקר השפעת הטעמנים על מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני GPCRsבעזרת מודל בתאי HeLa 51 ................................................................................................................................. -3.3.1חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתאי 51 .......................................... HeLa -3.3.2השפעת טעמנים אמפיפטיים על היווצרות השליח המשני cAMPלאחר גירוי הקולטן ה- 51 ................................................................................................................... β2AR -3.3.2.1הטעמנים האמפיפטיים גורמים להגברה תלוית ריכוז ביצירת ה cAMP -בתגובה לגירוי הקולטן ה β2AR -ע"י 52 ........................................................................... ISO - 3.3.2.2הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים אנדוגניים 52 ................................. - 3.3.2.3פראינקובציה של הטעמן עם התאים הינה הכרחית להשפעתו על יצירת cAMP בתגובה לגירוי הקולטן ה54 ............................................................................. β2AR - - 3.3.2.4השפעת הטעמנים איננה תלויה ב PDE -או ב55 ................................... .PKA - - 3.3.3השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה β2AR -ע"י GRK2/5בעקבות גירוי ע"י 56 ISO - 3.3.4השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה58 .......................... β2AR - – 3.3.5השפעת חשיפת התאים לטעמנים על מסלול העברת האותות של ERKבתגובה לגירוי עם 61 ..................................................................................................................... .ISO .4דיון ומסקנות 63................................................................................................................. - 4.1חדירת טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי הטעם 63 ............................................................... - 4.2איפיון ביטוי קינאזות ממשפחת ה GRKs -בתאי פפילת ה CV -בחולדה 66 ........................... - 4.3טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הדסנסיטיזציה של קולטני ה GPCRs -על ידי עיכוב פעילותן של קינאזות ה67 .................................................................................................. .GRKs - רשימת ספרות 74................................................................................................................... 5 רשימת קיצורים β2AR β2-adrenergic receptor BSA Bovine serum albumin cAMP Adenosine 3’-5’ cyclic monophosphate CAFF Caffeine CCCP Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone cGMP Guanine 3’-5’ cyclic monophosphate CLT Cyclo(Leu-Trp) / Cyclo(L-Leucine-L-Tryptophan) CV Circumvallate D-TRP D-Tryptophan DABCO 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octane DAG Diacylgycerol DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO Dimethylsulfoxide EGTA Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid ERK Extracellular signal-regulated kinase FBS Fetal bovine serum G protein Guanine nucleotide binding protein GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GMP Guanosine 5’-monophosphate GPCR G-protein-coupled receptor GRK G-protein-coupled receptor kinase HEPES (N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid]) HPLC High performance liquid chromatography IBMX 3-Isobutyl 1-methylxanthine IMP Inosine 5’-monophosphate IP3 Inositol 1,4,5-trisphosphate ISO Isoproterenol hydrochloride KI Potassium iodide MAPK Mitogen-activated protein kinase MSG Monosodium glutamate 6 NaF Sodium fluoride NAR Naringin NHD Neohesperidin dihydrochalcone PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PDE Phosphodiesterase PI Propidium iodide PKA Phosphokinase A PKC Phosphokinase C PLC Phospholipase C QUIN Quinine RIA Radio-immuno assay RIPA Radio-immunoprecipitation assay buffer RT Reverse transcription SACC Saccharin T1R Taste receptor family 1 T2R Taste receptor family 2 TCA Trichloroacetic acid 7 .1מבוא - 1.1חושים כימיים היכולת לזהות ,לפרש ולהגיב לגירויים סביבתיים הינה תכונה חיונית להתפתחותם ,הסתגלותם והישרדותם של בעלי חיים בסביבה בה הם חיים .מנגנוני החישה הפריפריים הכוללים חישת גירויים חיצוניים )חושי הראייה ,השמיעה והמישוש( וחישת גירויים החודרים לתוך הגוף )חוש הטעם והריח( נועדו למטרה זו. חוש הריח וחוש הטעם המזהים חומרים כימים ,נדיפים או מוצקים בהתאמה ,הינן שתי מערכות חישה המאפשרות זיהוי מקורות מזון וסכנות מסוגים שונים )אויבים או רעלים( .מערכת חישת הריח מורכבת משני איברים המופרדים מבחינה פיזית :האפיתל האולפקטורי באף אשר אחראי על זיהוי המגוון האדיר של הריחנים הקיימים ) (main olfactory epithelium MOEואזור נוסף הנקרא האברון הוומרונזלי ) ,(vomeronasal organ VNOהמשתתף בתהליך חישת הפרומונים המגדירים התנהגות מינית כגון רביה ,תוקפנות כלפי בעלי חיים אחרים ועוד .אפיתל חוש הטעם ),(taste sensory epithelium הממוקם בלשון ,בחך ובתחילת הוושט מספק מידע מידי על הרכב היונים ,הימצאות מרכיבים עתירי קלוריות ונוכחות חומרים לא רצויים במזון .למרות מיקום נפרד ותפקידים פיזיולוגיים שונים ,חוש הטעם והריח משתפים פעולה לעיתים קרובות :בהערכת איכות המזון למשל ,חוש הריח מאפשר לזהות מראש מזון מקולקל או להגביר את התיאבון למאכלים מסוימים .בנוסף ,ריחנים המשתחררים לאחר לעיסת המזון ומגיעים לחלל הפה מגרים את התאים הסנסוריים הממוקמים במוקוזה :השילוב בין חוש הטעם לחוש הריח יפורש בזיכרון כ"טעם המזון" ).(42 - 1.2חישת הטעם חישת הטעם משחקת תפקיד מרכזי בתזונת בעלי החיים ,בהערכת ההרכב היוני והקלורי של המזון ובזיהוי חומרים העלולים להיות רעילים .כיום הוכח שיונקים מסוגלים להבחין בין חמישה טעמים שונים :בנוסף לארבעת הטעמים הידועים מתוק ,מר ,מלוח וחמוץ ,טעם המונוסודיום גלוטמאט התגלה כייחודי ומכונה כעת בספרות "הטעם האוממי" .קיימת עדיין מחלוקת לגבי קיומו של "הטעם השומני" :יש הטוענים כי מדובר אך ורק בתחושת מרקם ,אך לפני כמה שנים התגלו ראיות בהן חומצות שומניות חופשיות מסוגלות לעורר תגובה בתאי טעם דרך תעלות אשלגן ולגרום להעברת אותות ).(53 טעמנים מתוקים ,מלוחים או אוממי וכן נוכחות חומצות שומן במזון מעוררים תחושה שלעיתים מהנה ומעוררת תיאבון .תגובות אלו חשובות מבחינה אבולוציונית בכך שהן מאפשרות לבעלי החיים להעדיף מזונות עתירי אנרגיה הדרושים להישרדות .חישת הטעם המר ובמידה מסוימת גם החמוץ חיונית לא פחות ומהווה קו הגנה ,מאחר והיא מאפשרת ,ביחד עם חוש הריח ,זיהוי מזון מקולקל או חומרים רעילים 8 טבעיים )טוקסינים( כגון אלקלואידים צמחיים .לכן תגובה אופיינית ,מולדת ברוב היונקים ,לטעם מר הינה סלידה .יש לציין יחד עם זאת שדחיית הטעם המר איננה חד משמעית :חלק משמעותי מן החומרים המרים והחמוצים הם בעלי חשיבות תזונתית )חסה ,כרוב ,כרובית ,ברוקולי( ואפילו מעוררי תיאבון )לימון ,אשכוליות ,תפוחים ,סודה לשתייה ועוד( .בנוסף להערכת הרכב יוני וקלורי ,נמצא שלמערכת חישת הטעם מנגנונים מיוחדים להערכת ריכוז המים מול ריכוז המומסים במזון הנבלע ולכן לחישת הטעם המלוח ,החמוץ וטעם המים חשיבות בשמירה על איזון מערכתי של אוסמולריות וריכוז יונים מעבר להספקת יונים חיוניים לגוף ).(124 - 1.3אברוני חוש הטעם ביונקים תאי הטעם ) (taste receptor cells - TRCsהאחראים על חישת הטעם הינם תאים נוירואפיתליאליים קטנים )אורכם 40-60 μmוקוטרם (20-40 μmבעלי אופי ביפולרי :באזור האפיקלי נמצאים מיקרווילי ) (microvilliהמכילים את הקולטנים לטעם ,ובצד הבזולטרלי מועבר המידע למוח במנגנון מורכב הכולל תקשורת בין תאים וקשרים סינפטיים עם סיבים עצביים ) .(143תאי הטעם מאורגנים ביחידות מורפולוגיות הנקראות פקיעיות טעם ) ,(taste budsובתוכן בין 50ל 150 -תאים ,כאשר כל התאים מפנים את המיקרווילי לעבר פתח פקיעית הטעם ) (taste poreהחשוף לחלל הפה וכך למזון ולטעמנים. תאי הטעם ,המכונים מבחינה היסטורית גם תאים מסוג ,(type II cells) IIנמצאים בפקיעית בסמיכות לשלושה סוגי תאים נוספים ) (type I, III and IVהאחראים בין היתר על תקשורת בין תאית ,העברת המידע למוח ,חידוש תאי הפקיעית ועוד .פקיעיות הטעם נמצאות בעיקר על הלשון אך ניתן למצוא בודדות בין תאי האפיתל בכל חלל הפה .באדם ,בערך שני שליש מפקיעיות הטעם מאורגנות באברונים הנקראים פפילות ) .(taste papillaeמבחינים בשלושה סוגי פפילות ,הנבדלות במבנה ,מיקום ומספר פקיעיות הטעם שהן מכילות fungiform papillae :הנמצאות במספר רב )מאות( בעיקר בשליש הקדמי של הלשון ומכילות פקיעיות בודדות foliate papillae ,הממוקמות בצידיו האחוריים של הלשון ומכילים מספר גדול יותר של פקיעיות ,ו circumvallate papillae -הנמצאות בחלק האחורי של הלשון במספרים בודדים ) 1-5לפי בעל החיים( אך מכילות את המספר הרב ביותר של פקיעיות )איור .(1.1 חלוקה טופוגרפית של הלשון על פי רגישותו של כל אזור לטעמים השונים הייתה מקובלת עד לפני כמה שנים .ידוע כיום שניתן לחוש בכל אחד מן הטעמנים ע"י גירוי של כל אחד מסוגי פפילות הטעם מכל אזור בלשון .בנוסף לפפילות הטעם ,קיימות על פני הלשון פפילות נוספות ) (filliformאשר אינן מכילות פקיעיות טעם והן בעלות תפקידים שונים מחישת טעם כמו למשל ערבוב המזון בפה. 9 איור - 1.1מיקום ומבנה של פפילות ופקיעיות הטעם בלשון. -aשלושה סוגי פפילות ) foliate ,fungiformו (circumvallate -הנבדלות במבנה ,מיקום ומספר פקיעיות הטעם ) (taste budsשהן מכילות .בתוך פקיעית הטעם ,תאי הטעם ) (TRCנחשפים לטעמנים דרך ה.taste pore - -bניתן לחוש בכל אחד מחמשת הטעמים המוכרים בכל מקום בלשון .לקוח מתוך ).(23 - 1.4מנגנונים תאיים של חישת הטעם - 1.4.1הטעם המר תרכובות מרות מעוררות חוסר נעימות בריכוזים נמוכים עד לדחייה חזקה בריכוזים גבוהים .מגוון רחב של תרכובות אורגניות ,חלקן מקורן בצומח וחלקן מתוצרת תעשייתית הינן מרות וביניהן ניקוטין ,קפאין, סטריכנין ,סוכרוז אוקטאצטט ,ציקלוהקסימיד ,כינין ,נרינגין ,דנטוניום ועוד .אבולוציונית ,הטעם המר מזהיר אותנו מפני מזונות מקולקלים ורעלים מן הטבע :אחד האתגרים המרתקים במחקר הטעם הינו להבין כיצד קולטנים לטעם המר עוצבו באבולוציה לשרת מטרה זו. משפחת הקולטנים לטעם מר ,כמו זאת לטעם המתוק ואוממי ,זוהתה בוודאות רק בסוף שנות התשעים הודות למאגרי מידע גנומיים ברשת .קבוצה חדשה של קולטנים מצומדים לחלבוני (G-protein- G ) coupled receptors - GPCRsמוקמה בכרומוזום מספר 6וקרויה בשם משפחת ה.(104 ,2) T2R - זוהי משפחה רחבה למדיי של עד 80קולטנים בעכברים ,חולדות ובני אדם .עד כה לפחות 26גנים פוטנציאליים זוהו בבני אדם ו 33 -בעכברים .הקולטנים מראים קרבה לקולטנים הוומרונזאלים )הקולטנים לפרומונים ב (VNO -ומראים בין 30 %ל 70 % -זהות ברצף חומצות האמינו בתוך המשפחה .ייתכן והשוני בין הקולטנים הוא המאפשר את זיהוי המגוון הרחב של מבנים כימיים הקיים בקבוצת הטעמנים המרים .בדומה ל GPCRs -אחרים בעלי קצה -Nטרמינלי חוץ תאי קצר ,ההנחה היא 10 שחומצות האמינו החשובות לקשירת הליגנד ולקביעת הספציפיות לטעמנים שונים נמצאות באזורים הטרנסממברנליים ובאחת הלולאות החוץ תאיות של הקולטן ) .(111זיהוי ליגנדים לקולטנים שונים ממשפחת ה T2Rs -התאפשר בשנים האחרונות ע"י ביטוי של אותם הקולטנים בתרביות תאים ),18 ,8 ,(149 ,137 ,89 ,24אך עד כה רובם של הקולטנים למר עדיין מוגדרים "יתומים" (orphan ) .receptorsבנוסף לספציפיות לליגנדים שונים ,ייתכן והפולימורפיזם הקיים בגנים המקודדים לקולטני ה T2Rs -אחראי גם להבדלים ברגישות לטעמנים שונים בפרטים שונים ולקיום tastersוnon- - ,tastersתופעה ידועה גם בבעלי חיים וגם בבני אדם ).(24 ניסויים שנעשו בחולדות ועכברים הראו נוכחות של T2R mRNAsב 15% -מתאי פקיעיות הטעם בפפילות circumvallateו ,foliate -אך רק ב 2% -מהתאים בפפילות ה .(24 ,2) fungiform -יש הטוענים שתא אחד יכול לבטא מגוון רחב של קולטני ,T2Rדבר המרמז על היכולת של תא בודד לזהות טעמנים מרים שונים ) .(2בניגוד לטענה זו ,מחקר אחר הראה שתאים המגיבים למר מופעלים אך ורק על ידי טעמן אחד מתוך חמישה ,כך שטעמנים שונים מעוררים תת-אוכלוסיות שונות של תאי טעם ).(21 ,9 חלבון (Guanine nucleotide binding protein – protein G) Gבשם ,gustducinבעל הומולוגיה גבוהה לחלבון Gאחר בשם transducinומתבטא במערכת הראייה ,נמצא ברקמת הטעם )ומאוחר יותר גם ברקמות אחרות ) ((101 ,10ומתבטא באופן סלקטיבי ב 20-30% -מתאי הטעם בכל סוגי הפפילות ) .(107 ,16הקשר בין gustducinלטעם המר ידוע כבר מתחילת שנות ה .(107) 90 -ניסויי knock- outבעכברים הראו שתת-היחידה α-gustducinמעורבת בטרנסדוקצית הטעם המר דרך הפעלת פוספודיאסטראז ספציפי לטעם שזוהה כ .(147) PDE1A -הפעלת אנזים זה גורמת לירידה ברמת הנוקלאוטידים הציקליים ) (cNMPsבתא .השפעת ירידה זו בהמשך מסלול העברת האותות איננה ברורה .ייתכן ורמות נמוכות של נוקלאוטידים משפיעות על פעילות קינאזות בתא או לחילופין תתכן בקרה של תעלות יוניות שונות המבוטאות בתאי טעם ,אשר חלקן מעוכבות ע"י (cNMP- cNMPs ) inhibitedוחלקן תלויות ב.(179) ( cNMP-gated channels) cNMPs - בנוסף ל α-gustducin -נמצאו בתאי טעם תת-יחידות αמחלבוני Gאחרים,Gαq ,Gαs ,Gαi3 ,Gαi2 : Gα14 ,Gα15ו .(179 ,147 ,107) α-transducin -סביר שאחת או יותר מתת-יחידות אלה משחקת תפקיד בטרנסדוקצית הטעם המר מכיוון ש knock-out -של α-gustducinאיננו מבטל לחלוטין את התגובה לתרכובות מרות ) .(57 ,20לאחרונה ,הוכח שהקולטנים לטעם המר מתבטאים יחד עם Gαi2 בפקיעיות טעם ) (20ושקולטנים כגון mT2R5מעוררים מסלולי העברת אותות המערבים שפעול של חלבון Gמסוג .(127) Gi/o עוד לפני שזוהו הקולטנים ,מסלולי העברת האותות של חישת הטעם המר נחקרו בהרחבה .היום ,מסלול העברת האותות המערב היווצרות (IP3) Inositol-1,4,5-trisphosphateודיאצילגליצרול )(DAG נחשב למרכזי בחישת הטעם המר ).(23 במקביל להפעלת תת-היחידה αשל ,gustducinתת-היחידה βγמשתחררת כקומפלקס וגורמת לעלייה ברמת ה IP3 -בתא על ידי הפעלת פוספוליפאז שזוהה כ .(183 ,179 ,146 ,145 ,66) PLCβ2 -עלייה 11 ב IP3 -גורמת לשחרור מאגרים תוך תאיים של סידן ,ובהמשך לשפעול תעלה המשתייכת למשפחת ה- (Transient Receptor Potential protein) TRPsוזוהתה כ .(134 ,131) TRPM5 -פתיחת התעלה וכניסה מסיבית של יוני נתרן דרכה גורמים לדפולריזציה של התא .מחקרים הראו שknock- - outשל PLCβ2או של TRPM5גורמים לחוסר רגישות לטעם המר וכן לטעם המתוק והאוממי ,דבר המצביע על חשיבות מרכזית של מסלול זה בחישת שלושת טעמים אלו ) .(183 ,34מכיוון שהטעמים מלוח וחמוץ לא נפגעו מ knock-out -זה ,נראה כי טעמים אלו מנצלים מסלולי העברת אותות שונים. איור – 1.2שני מסלולי העברת אותות מצטיירים כמרכזיים בחישת הטעם המר ,המתוק ואוממי. לאחר גירוי הקולטן ,שני מסלולי העברת אותות אפשריים .מצד אחד שפעול תת-היחידה αיכולה לגרום לשפעול )או עיכוב( של אדניליל ציקלאז או פוספודיאסטראזות ,אשר גורמים לשינוי ברמות נוקלאוטידים ציקליים .בנוסף, שחרור תת-היחידה βγגורם לשפעול הפוספוליפאז PLCβ2אשר גורם לעלייה ברמות ה IP3 -בתא ושפעול תעלות ה .TRPM5 -מסלול ה TRPM5/PLCβ2 -ידוע כחיוני לחישת הטעמים מר ,מתוק ואוממי .לקוח מתוך ).(143 תרכובות מרות מגוונות כגון כינין ,אוראה ,דנטוניום ,קפאין ,מתיל-קסאנטין וחומצות אמינו מסוימות, מסוגלות בנוסף למסלולים שפורטו מקודם להשפיע על מסלול העברת האותות ללא תיווך של קולטן אלא ע"י חדירה דרך הממברנה הפלסמטית ואינטראקציה ישירה עם חלבוני הטרנסדוקציה ככל הנראה הודות למבנה סטרוקטורלי דומה לאתר הקולטן הקושר את החלבון .כינין ככל הנראה מסוגל לעבור בדרך זו אינטראקציה ישירות עם חלבוני ,(116) Gלעכב תעלות אשלגן בסלמנדרה אמריקנית (31) Necturus ולהפעיל תעלות קטיונים בצפרדע הקרקרנית .(170) bullfrogדנטוניום מעכב תעלות אשלגן התלויות במתח ) ,(159וקפאין מעכב פוספודיאסטראזות וכך גורם לעלייה ברמות הנוקלאוטידים הציקליים כגון cGMPבתא ) .(144במקרים אלה ,תאים שאינם בהכרח קשורים לטעם המר מסוגלים להגיב לאותן תרכובות. 12 - 1.4.2הטעם המתוק זמן קצר לאחר זיהוי הקולטנים לטעם המר ,מספר קבוצות חוקרים דיווחו על זיהוי קולטן לטעם המתוק בשם T1R3 .(119 ,110 ,106 ,86) T1R3התגלה ע"י סריקת גנים ל GPCRs -הממוקמים בגנום האנושי באזור המקביל לזה בגנום העכברי הנקרא .Sac locusלוקוס זה הינו אחד משני האזורים בגנום העכבר )לוקוסים( הידועים למעלה משלושים שנה כאחראים על חישת הטעם המתוק :הSac locus - שמיקומו בזרוע הדיסטלית של כרומוזום 4ואחראי על תגובה לסוכרוז ,סכרין וממתקים מלאכותיים נוספים .בנוסף ,ה Dpa locus -שמופה בזרוע הפרוקסימלית של כרומוזום 4נמצא אחראי על תגובה ל- -Dפנילאלנין ) .(121 ,96 ,5פיזיולוגית ,הוכח ששני אזורים אלו משפיעים על העברת תגובה עיצבית פריפריאלית לסוכרוז ,דבר המרמז על קידוד לקולטן או מרכיב אחר של מסלול הטרנסדוקציה של הטעם המתוק .ואכן הקולטן הראשון לטעם מתוק אותר בלוקוס ה.Sac - לאחר בדיקות נוספות נמצאה הומולוגיה של 30%בין T1R3לשני קולטנים "יתומים" ממשפחת ה- GPCRsהמתבטאים בתאי טעם הקרויים T1R1ו T1R2 -שתפקידם לא הוגדר עד אז .בעכברים וחולדות T1R3מתבטא בכ 15-30% -מתאי הטעם בכל שלושת סוגי הפפילות .לעומתו T1R1 ,מבוטא בעיקר בפפילות מסוג fungiformו T1R2 -בפפילות מסוג foliateו .circumvallate -ניסויים של in situ hybridizationהראו שבכל תא שבו מתבטא T1R3מתבטא איתו T1R1או T1R2בהתאם לסוג הפפילה ) .(119 ,82עובדה זו מרמזת על כך שקולטנים ממשפחת ה ,T1Rs -בדומה לGPCRs - אחרים ,פועלים דרך הטרודימריזציה )יצירת קומפלקס בין שתי יחידות קולטן לפני או אחרי קישור הליגנד ,המאפשרת יציבות בקשירת הליגנד או שפעול פעילות אנזימטית בחלק התוך תאי של הקומפלקס כגון פעילות של קינאז( .כחיזוק להשערה זו (119) Nelson et al. ,הראו שקולטן T1Rבודד איננו פונקציונלי .לעומת זאת תאים המבטאים T1R3ו T1R2 -מגיבים בצורה חזקה ביותר לטעמנים מתוקים כגון הסוכרים הטבעיים סוכרוז ופרוקטוז אך גם לממתיקים מלאכותיים כמו סכרין ואצסולפאם.K- בנוסף ,הטרודימר זה מגיב לחומצות אמינו בעלות טעם מתוק כמו -Dטריפטופן ולחלבונים מתוקים כמו .(94) monellinמחקרים רבים נעשו בשנים אחרונות במטרה להסביר את יכולתו של הקולטן T1R2/T1R3לקשור מגוון כה רחב של מולקולות מתוקות בעלות מבנים ומשקלים מולקולרים כה שונים .בניגוד לקולטנים לטעם המר ) ,(T2Rsקולטני ה T1Rs -הינם בעלי קצה -Nטרמינלי ארוך ולכן אזור זה נחשב תחילה למרכזי בקשירת הליגנדים .מיפוי אזורי הקשירה של הקולטן נעשה בעזרת כימרות של T1R3ו T1R2 -מאדם ומעכבר והראה שטעמנים שונים נקשרים לקולטן ההטרודימרי באזורים שונים .למשל האזור הטרנסממברנלי (transmembranal domain) TMDשל T1R3מעורב בקשירת הממתיק ,(74) cyclamateלעומת האזור החוץ תאי (Venus flytrap module) VFTMשל T1R2 אשר אחראי לקשירת הממתיקים neotameו .(178 ,75) aspartame -אזור עשיר בחומצת האמינו ציסטאין ב T1R3 -ומכונה (cystein rich domain) CRDמקשר בין ה VFTM -ל ,TMD -ונמצא חיוני לקשירת חלבונים מתוקים כגון monellinאו .(75) brazzeinמולקולת ה ,lactisole -הידועה 13 בבני אדם כמעכבת את המתיקות של מגוון סוכרים טבעיים ,גליקוזודים וממתיקים ,נקשרת ל TMD -של .(73) T1R3ממצא זה מסביר באותה עת את העובדה ש lactisole -פועלת גם כמעכב לטעם האוממי. התייחסות לביטוי מקביל של T1R3ו T1R1 -תעשה בפרק הדן בטעם האוממי. איור - 1.3מיפוי אזורי הקשירה לתרכובות מתוקות שונות בהטרודימרים T1R3/T1R2ו- .T1R3/T1R1לקוח מתוך ).(178 על בסיס מחקרים ביוכימיים ופיסיולוגיים רבים ,הוצעו מספר מודלים לטרנסדוקצית הטעם המתוק: לאחר גילוי קולטני ה ,T1Rs -מחקרים הראו שבדומה לקולטנים לטעם מר ,ההטרודימר T1R2/T1R3 מפעיל גם הוא את מסלול העברת האותות המערב את PLCβ2ו ,(183 ,146 ,131) TRPM5 -ו- knock-outבשני גנים אלו מבטל את תחושת הטעם המתוק ) .(183למרות שמסלול ה IP3 -נחשב היום למרכזי בחישת הטעם המתוק )כמו לזו של הטעם המר( ,מחקרים אחרים מראים מעורבות של מספר מסלולי העברת אותות נוספים )איור ,(1.2ואף על קיום מסלולים שונים לסוכרים טבעיים וממתיקים לא סוכריים. סוכרים טבעיים מעוררים מסלול העברת אותות בו מעורבים חלבון Gמהסוג ,Gsשפעול האנזים אדניליל ציקלאז ויצירת השליח המשני .(164 ,163 ,115) cAMPאותו cAMPיכול מאוחר יותר להשפיע על תעלות יוניות תלויות נוקלאוטידים ) (109) (cNMPs - gated channelsאו לגרום להפעלת PKA ) (protein kinase Aוזרחון תעלות אשלגן וכך לדפולריזציה של הממברנה ) .(4לאחרונה ,פורסמו מחקרים המראים שהעלייה ברמות cAMPלאחר גירוי תאי טעם בסוכרוז אינה תלויה בנוכחות סידן חוץ או תוך תאי .בנוסף ,ביטוי של איזופורמים ספציפיים לטעם של האדניליל ציקלאז נמצאו מקבילים לביטויו של .PLCβ2לאור התוצאות ,החוקרים מציעים שלאחר חשיפת תאי טעם לסוכרים טבעיים מתקיימים שני מסלולים מקבילים אך בלתי תלויים ,והם היווצרות cAMPועלייה ברמות סידן תוך תאיות דרך .(169 ,1) IP3 14 במסלול העברת האותות של ממתיקים מלאכותיים כגון סכרין ו SC45647 -מעורב חלבון Gמסוג Gq המפעיל פוספוליפאז Cלשחרור IP3ו .DAG -שיטות של Calcium imagingבפקיעיות טעם מבודדות הראו שבניגוד לסוכרים הטבעיים הגורמים לחדירת יוני סידן מחוץ לתוך התא ,ממתיקים מלאכותיים גורמים לשחרור מאגרים תוך תאיים של יוני סידן ,כתוצאה מיצירת .(9) IP3 ממצאים נוספים מסבכים את התמונה :לאחר שנמצא שמעכב ל (H89) PKA -לא ביטל את התגובה לטעם המתוק אלא הגביר אותה ,נראה ש PKA -איננו מעורב במסלול העברת האותות אלא יותר בתופעת האדפטציה )ירידה ברגישות לגירוי לאורך הזמן כאשר גירוי זה מופעל שוב ושוב( ) .(173ההגברה בתגובה התקבלה עבור ממתיקים טבעיים ומלאכותיים כאחד .לעומת זאת עיכוב PKCלא השפיע על התגובה לסוכרוז אבל ביטל את התגובה לממתיקים מלאכותיים :ממצא זה מחזק את ההשערה על פיה מתקיימים מסלולים שונים לממתיקים טבעיים ומלאכותיים .בנוסף ,בדיקת שליחים משניים בזמנים קצרים של מילישניות לאחר הפעלת הטעמן הראתה שהנוקלאוטיד cGMPמשחק תפקיד בגירוי הראשוני ) (75-250 msשל תהליך הטרנסדוקציה ,כאשר cAMPמופיע רק מאוחר יותר ).(88 - 1.4.3הטעם האוממי )חומצות אמינו( "אוממי" שמשמעותו ביפנית "טעים מאוד" ,הינו טעם דומיננטי במזונות המכילים חומצות אמינו )מוצרי בשר וגבינות ישנות( ובמיוחד -Lמונוסודיום גלוטמאט ) .(MSGהמשמעות הביולוגית הרבה של הטעם הזה היא בכך שהוא מספק לגוף אינדיקציה על תכולת חומצות אמינו חיוניות במזון .הוכח שנוכחות של '-5ריבונוקלאוטידים כמו IMPו GMP -מגבירה את עוצמת הטעם האוממי ).(90 ,79 בעקבות גילוי הקולטנים לטעם המתוק ,נמצאו הקולטנים לטעם האוממי השייכים למשפחת ה.T1Rs - כפי שכבר צוין ,קולטנים ממשפחה זו מופעלים דרך הטרודימריזציה :בניגוד לקולטן לטעם המתוק המורכב מ T1R3 -ו ,T1R2 -הקולטן לטעם האוממי מורכב מ T1R3 -ו ,(118) T1R1 -והוכח שצירוף זה הינו ספציפי לחומצות האמינו בעלות מבנה איזומרי .Lמיפוי אזורי הקשירה של הקולטן T1R1/T1R3אשר נעשה במקביל לזה של הקולטן למתוק ,גילה שקשירת חומצות האמינו מתבצעת ככל הנראה באזור החוץ תאי ) (VFTMשל .(178) T1R1נמצא כי התגובה לחומצות האמינו מוגברת בנוכחות ,(90) IMPאפילו בריכוזים נמוכים ביותר של הריבונוקלאוטיד .ההשערה היא ש IMP -נקשר אף הוא לקולטן באזור שאינו מתחרה על קישור חומצת האמינו ומגביר את זמינות הליגנד ) (167או את האפיניות שלו ) .(91על פי IMP ,(178) Xu et al.צפוי להיקשר ל ,T1R1 -לאור העובדה שנוכחותו לא השפיעה על עוצמת התגובה של הקולטן המתוק T1R2/T1R3לציקלמאט. זמן רב לפני גילוי קולטן ה ,T1R1/T1R3 -חוקרים חשדו במעורבות של קולטנים יונוטרופיים (ligand- ) gated ionic channelsומטבוטרופיים )קולטנים ממשפחת ה(G-protein-coupled receptors - בחישת הטעם האוממי .הקולטן הראשון שהוכחה מעורבותו בטעם האוממי היה קולטן מטבוטרופי בשם (25) mGluR4המשתייך למשפחת ה mGluR -הידועה זמן רב בתאי העצב ) .(30קולטנים יונוטרופיים ,המאפשרים זרימת יונים לאחר קישור ספציפי של ליגנד ,מתבטאים אף הם בלשון ,אך לא 15 הוכח עד היום שביטוי זה הינו ספציפי לתאי טעם ולכן מעורבותם בחישת הטעם האוממי נשארה מעורפלת .בדומה לטעם המר וטעם המתוק ,מסלול הטרנסדוקציה העיקרי בחישת הטעם האוממי הינו מסלול ה IP3 ,PLCβ2 -ו .(183) TRPM5 -למרות זאת ,מחקרים אחרים מראים שחלק מחומצות האמינו מעלה את רמות ה cAMP -במקביל ל ,IP3 -לעומת חומצות אחרות אשר מפעילות ישירות תעלות יוניות ,ביניהן תעלות סידן. - 1.4.4הטעם המלוח הטעם המלוח והטעם החמוץ מאופיינים בכך שהם נובעים מנוכחות יונים במזון .חישת הטעם המלוח מספקת אינפורמציה על תכולת NaClומינרלים נוספים במזון ולכן משרתת את שימור ההומאוסטאזיס של יונים ומים בגוף .למרות שמספר מלחים מעוררים את הטעם המלוח ),(NaCl, KCl, LiCl, NH4Cl המלח NaClהוא האופייני ביותר ליונקים ,בגלל הרעב הספציפי כלפיו .כיום ידועים שני מנגנונים לחישת הטעם המלוח :מסלול ספציפי לנתרן ) (Na+-specific pathwayומסלול שאינו ספציפי (Na+- ).nonspecific pathway במנגנון הראשון ,שנחקר בהרחבה ,מתרחשת כניסה של יוני נתרן דרך תעלות נתרן הרגישות ל- (Amiloride sensitive sodium channels) amilorideהנקראות בשם מקוצר ASSC or EnaC ) .(58 ,40תעלות אלה הינן אפיקליות ומורכבות משלוש תת-יחידות כאשר אחת מהן לפחות מושפעת מההורמון הסטרואידי אלדוסטרון ) .(95התעלה מתפקדת כקולטן לטעם המלוח ע"י כך שהיא נפתחת באופן ספציפי בנוכחות יוני נתרן בחלל הפה ומאפשרת זרימת נתרן פנימה ועקב כך לדפולריזציה של הממברנה הבזולטרלית הגוררת אירועים סינפטיים נוספים .למרות שמעורבות ה ASSCs -בחישת הטעם המלוח ברורה ,הרגישות לאמילורייד בבני אדם מוגבלת ופחות משמעותית ,דבר המרמז על מעורבות של מסלול נוסף שאיננו רגיש לאותו מעכב .הסברים אפשריים הם נוכחות תעלות יוניות בלתי ספציפיות בממברנה האפיקלית של תאי הטעם ) (41או דיפוזית יוני נתרן דרך ה tight junctions -והפעלת תעלות נתרן בצד הבזולטרלי של התאים ) ,(181 ,157דבר הגורם לדפולריזציה .מחקרים פיזיולוגיים מראים שתעלות ASSCsחדירות ליוני נתרן ,ליתיום ופרוטונים אך לא לאשלגן .לעומת זאת ,חישת מלחי אשלגן ואמוניום מתרחשת באופן מקביל למסלול הלא ספציפי לחישת מלחי נתרן ) .(162למרות שחישת הטעם המלוח נחקרה בהרחבה כבר עשרות שנים ,עדיין אין לנו הבנה מלאה של כלל התהליכים המתרחשים והתורמים לה. - 1.4.5הטעם החמוץ הטעם החמוץ ,המאפשר בטבע לזהות מזונות מקולקלים ולמנוע צריבה ע"י חומצות ,יכול להיות נעים או נסבל כאשר הוא חלש אך נהיה דוחה כאשר הוא חזק .הגירוי העיקרי האחראי על הטעם החמוץ הינו כניסת פרוטונים לתוך תא הטעם ,דבר המשפיע על ה pH -וגורם כך לפוטנציאל פעולה ) .(84שני מסלולים אפשריים מעורבים בחישת הטעם החמוץ :במסלול הראשון כניסת פרוטונים לתוך התא 16 מתאפשרת הודות לפתיחת תעלות רגישות אמילורייד ) (51) (ASSCsובמסלול השני מעורבות תעלות תלויות פרוטונים הנפתחות רק בנוכחות פרוטונים בסביבה ,ביניהן תעלות אשלגן בסלמנדרה האמריקנית ,(84) Necturusתעלות קטיונים בלתי ספציפיות ממשפחת ה ,(171) ENaC/Deg channels -ותעלות קטיונים המופעלות ע"י דפולריזציה ונפתחות ע"י קשירת נוקלאוטידים (Hyperpolarized-activated ) .(161) nucleotide-gated cation channelבנוסף ,נראה שפרוטונים יכולים לחדור דרך הtight - junctionsוכך למלא את החלל של פקיעית הטעם ) .(39כתוצאה מתנועת הפרוטונים מחלל הפה לתוך הפקיעית ,ובהמשך לתאי הטעם ,השינויים ב pH -יכולים להשפיע על מערכות תוך תאיות רבות ביניהן תעלות יוניות שונות ומספר מסלולי טרנסדוקציה .לאחרונה ,מחקרים הראו כי לתעלה PKD2L1 חשיבות רבה בחישת הטעם החמוץ ) .(65תעלה זו מתבטאת בכל סוגי פקיעיות הטעם אך בתאים שונים מאלה המבטאים את הקולטנים לטעם המר ) (T2Rsאו לטעם המתוק ) .(T1Rsשימוש בעכברים מהונדסים גנטית הראה כי knock-outשל תעלה זו בעכברים במטל באופן ספציפי את חישת הטעם החמוץ ולא אף טעם אחר .המגוון הרחב של מסלולים שנמצאו עבור הטעם החמוץ מדגיש את מורכבות מסלול טרנסדוקצית הטעם החמוץ. - 1.5העברת אותות בין-תאית וקידוד הטעם במערכת הפריפרית - 1.5.1העברת המידע אל תאי העצב לאחר גירוי קולטני הטעם עד לפני כמה שנים ,סברו החוקרים שלאחר גירוי קולטן הטעם והפעלת מסלול העברת האותות ,תא הטעם מעביר את המידע אל סיב עצב ע"י קיום סינפסה ושחרור נוירוטרנסמיטור ,בדומה למערכות עצביות ידועות אחרות כגון חוש הריח ) .(113מחקרים אשר נערכו בשנים האחרונות מציירים תמונה מורכבת הרבה יותר. מבחינה היסטורית ,התאים בפקיעית הטעם מוספרו מ I -עד IVעל פי מאפיינים ציטולוגיים .התאים מסוג Iהינם תאי "תמיכה" ,ותאים מסוג ,IVהנקראים גם "תאים בזלים" ,מהווים מקור לשאר סוגי התאים שבפקיעית הטעם .שני סוגי תאים אלו אומנם חשובים לתפקוד מלא של פקיעית הטעם אך תפקידם בעיבוד המידע לא נחקר עד כה .התאים מסוג IIו III -מהווים את תאי הטעם המבטאים את הקולטנים לטעם והתאים הסינפטיים ,בהתאמה ).(143 שני מחקרים אשר פורסמו במקביל הראו שתאי הטעם המבטאים את הקולטנים לטעם אינם מבטאים חלבונים אשר ממוקמים במערכות אחרות באזור הפרסינפטי של תא עצב .החוקרים הראו שהחלבונים synaptin II ,SNAP25ו ,NCAM -אשר מעורבים במנגנון שחרור ווסיקולות מלאות נוירוטנסמיטורים לחלל הסינפטי אינם מתבטאים בתאים מסוג IIאלא בתאים מסוג .(180 ,36 ,28) III ממצאים אלו מציעים מנגנון בו תאי הטעם עצמם אינם מקיימים תקשורת ישירה עם תאי עצב אלא עם התאים מסוג ,IIIואלה הם המעבירים את המידע לתאי העצב )איור .(1.4 בעקבות מחקרים אשר הראו שחרור של הנוירוטרנסמיטור סרוטונין לאחר גירוי תאי טעם )(67-69 וביטוי ספציפי של הקולטן לסרוטונין (5-hydroxytryptamine) 5-HTבתאי הטעם ),(81 ,80 17 סרוטונין הוצע להיות אחד הנוירוטרנסמיטורים המעורבים בהעברת האינפורמציה אל תאי העצב .אך לאור העובדה שעכברי knock-outל 5-HT -לא הראו שינוי התנהגותי כלשהו ) ,(45נראה שסרוטונין משחק תפקיד שונה .לעומת זאת (45) Finger et al. ,הראו שמולקולת ה ATP -מהווה נוירוטרנסמיטור אשר מעורר ישירות את תאי עצב הראשוניים המעצבבים את פקיעית הטעם (primary afferent ) .nervesבנוסף ,הקולטנים היונוטרופיים ל P2X2 ,ATP -ו ,P2X3 -מתבטאים ספציפית בתאי עצב אלו ) (12ו knock-out -בהם מחליש באופן דרמטי את התגובה לטעמנים מרים ,מתוקים ואוממים ).(45 הגילוי ש ATP -משוחרר מתאים מסוג IIוששחרור סרוטונין מתבצע בתאים מסוג IIIהביא למודל בו לאחר גירוי הקולטנים לטעם ע"י טעמנים ,תאי הטעם משחררים ATPבצורה פרה-קרינית אשר יהווה מצד אחד נוירוטרנסמיטור ישיר לתאי העצב ,אך ייתכן גם לתאים מסוג .IIIהתאים מסוג ,IIIלעומת זאת ,משחררים סרוטונין להעברת המידע לתאי עצב המעצבבים אותו )איור .(1.4 איור – 1.4דרכי תקשורת בין תאים בתוך פקיעית הטעם. לאחר גירוי הקולטנים לטעם אשר בקצה האפיקלי של תאי הטעם )תאים מסוג ATP ,(IIמשוחרר בצורה פרה- קרינית ומהווה נוירוטרנסמיטור לתאי העצב ) (sensory afferent fibersאך גם לתאים מסוג .IIIבתגובה ,התאים מסוג IIIמשחררים סרוטונין להעברת המידע לתאי עצב המעצבבים אותו .לקוח מתוך ).(143 - 1.5.2תתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם מבחינות בין הטעמים השונים ישנה מחלוקת בספרות לגבי יכולתו של תא טעם בודד לחוש במקביל במספר טעמים )תופעה הקרויה בשם ,(multiple modalities broadly tuned cellsאו שמא מתקיימות תתי אוכלוסיות שונות של תאים ,כאשר כל אחת רגישה לטעם אחר ) .(single taste modalities tuned cellsבנוסף ,מנגנון העברת המידע מתא הטעם אל המוח מהווה גם הוא נושא לדיון מדעי :אפשרות ראשונה הינה שסיבי העצב מעצבבים באופן ייחודי תאים אשר רגישים לאותו הטעם ולכן מעבירים מידע עבור אחד מן טעמים בלבד, וזהות הטעם נקבעת על פי העצב המעוצבב ) .(labeled-line modelמודל מנוגד מציע שסיבי עצב 18 מעצבבים ללא הבחנה תאי טעם שונים ולכן מעבירים את המידע עבור כל הטעמים (across fiber ) ,modelוזיהוי הטעם עצמו טמון בעיבוד מידע נוסף אשר טרם פוענח. איור – 1.5קידוד הטעם בפריפריה. כאן מוצגים שני מודלים מנוגדים לקידוד הטעמים בפקיעית הטעם - a .במודל זה ,התאים מתוכננים להגיב לטעם אחד בלבד ומעוצבבים ע"י סיב עצבי ייחודי לכל טעם .במקרה זה ,אין כל חפיפה בין הטעמים השונים – c ,b .שתי אפשרויות למודל בו סיבי העצב מעבירים מידע עבור מספר טעמים .ייתכן ותאי הטעם רגישים לכל הטעמים השונים וכל תא טעם מעוצבב ע"י סיב עצב אחר ) (bאו שכל תא טעם רגיש לטעם אחד בלבד וסיבי העצב מעצבבים ללא הבחנה תאים בעלי אופי שונה ) .(cבמקרים אלו ,ההבחנה הסופית בין הטעמים השונים תיעשה ע"י סיבי העצב או המוח בדרך ייחודית .לקוח מתוך ).(23 מספר מחקרים אלקטרופיזיולוגיים וניסויי calcium-imagingהראו שתאי טעם מבודדים מסוגלים להגיב ליותר מטעם אחד והציעו מודל בו תאי הטעם עצמם מגיבים למספר טעמים וההבחנה בין הטעמים נעשית ברמת העברת המידע לסיבים עצביים ) .(152 ,141 ,52 ,19בנוסף ,מחקר בו נעשה knock out ב gustducin -הראה ירידה בתגובה לתרכובות מרות וגם מתוקות ) .(176מצד שני ,מספר רב של מחקרים מראים שהקולטנים למר ולמתוק אינם מתבטאים באותם תאים .כבר בHoon et al. ,1999 - ) (62הראו שבשלושת סוגי הפפילות T1Rs ,ו T2Rs -מתבטאים בתתי אוכלוסיות שונות של תאי טעם. בשנים האחרונות ,שימוש מרובה בחולדות מהונדסות גנטית אפשר לשפוך אור על נושא זה .ניסוי בו חולדות הונדסו באופן כזה שהגן PLCβ2יבוטא אך ורק בתאים המבטאים את הקולטנים למר ,הראה שבאופן סלקטיבי מאוד הטעם המר בלבד חודש )למרות ש PLCβ2 -מעורב בחישת הטעמים מר ,מתוק ואוממי( ,ומתוך כך הוסק שהטעמים השונים אינם תלויים באותם תאי הטעם ) .(183במחקר אחר ,קולטן לאופיואידים ) (κ-opioid receptor RASSLבוטא בתאי טעם תחת הפרומוטור של הקולטנים למתוק. החוקרים הראו שהמולקולה spiradolineאשר מהווה ליגנד ל RASSL -וחסרת טעם בדרך כלל ,הפכה למולקולה מתוקה .לעומת זאת כאשר RASSLבוטא תחת הפרומוטור לקולטנים מרים ,הפכה spiradolineלמרה ) .(114כמו כן (65) Huang et al. ,הראו שהרס ספציפי של תאים אשר מבטאים את הקולטנים לאחד הטעמים )מר ,מתוק או אוממי( מבטל ייחודית את הטעם עצמו מבלי לפגוע בטעמים 19 האחרים .מחקרים אלו ביחד עם רבים נוספים מהווים עדויות יותר ויותר מבוססות התומכות במודל ה- .labelled line - 1.6מנגנון סיום העברת האותות )דסנסיטיזציה( של קולטנים מסוג GPCR - 1.6.1תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני הGPCRs - משפחת ה ,(G-protein-coupled receptors) GPCRs -לה משתייכים קולטני הטעם ,הינה המשפחה הגדולה ביותר של קולטנים המתבטאים על פני הממברנה הפלסמטית של התא .לאחר קשירת הליגנד לקולטן ,קיימים מספר מסלולי העברת אותות אפשריים ,התלויים בסוג חלבון ה G -המוצמד לקולטן עצמו ,ומערבים שפעול )או עיכוב( של אנזימים ציטוזוליים )אדניליל ציקלאז ,פוספודיאסטראזות, פוספוליפאזות ועוד( אשר מעבירים את ה"מידע" הלאה בתוך ציטוזול התא .כל המערכות בהן מעורבים קולטנים מסוג GPCRמראות הסתגלות בעוצמת תגובתן לסביבה :רגישות התא לסיגנל מסוים בדרך כלל משתנה על פי העוצמה ומשך הסיגנל .מטרת מנגנון אדפטציה זה הינו למנוע תגובת יתר לסיגנל אינטנסיבי או ממושך מדי באופן המסכן את מערכות הגוף .כתוצאה מחשיפה חוזרת ונשנית לליגנד או חשיפה לריכוזי ליגנד גבוהים ,קולטני ה GPCR -עוברים תהליך מורכב הנקרא "דסנסיטיזציה" ) (desensitizationאשר מוריד את רגישותו של הקולטן ואת יכולתו להגיב לליגנדים סביבתיים .אחד השלבים העיקריים של תהליך זה הינו זרחון הקולטן בקצה ה C -טרמינלי וב loop -השלישי התוך-תאי שלו ע"י קינאזות ממשפחת ה serine/threonine kinases -הנקראות (G-protein-coupled GRKs )) receptor kinasesאיור .(1.5בעקבות זרחון הקולטן ע"י ה ,GRKs -החלבון β-arrestinמונע אל הממברנה ונקשר ספציפית לאתרים המזורחנים של הקולטן :קשירה זו תמנע מנקודה זו ואילך כל אפשרות לשפעל חלבוני Gנוספים ,ובכך מסמנת את תחילת כיבוי מסלול העברת האותות .על מנת להרחיק סופית את הקולטן מן הממברנה הפלסמטית וכך למנוע ממנו כל שפעול אפשרי נוסף ,מתקיים תהליך נוסף הקרוי בשם אינטרנליזציה ) .(internalizationלקומפלקס קולטן β-arrestin/נקשרים עתה מספר רב של חלבונים נוספים ,כגון AP2ו ,clathrin -היוצרים יחד קומפלקס ענק אשר גורם להחדרתו של הקולטן לתוך ציטוזול התא דרך יצירת ווסיקולה בשם .clathrin-coated pitלאחר האינטרנליזציה, הקולטן יכול לעבור תהליך של מחזור לממברנה הפלסמטית ,או לחילופין עיכול אנזימטי לאחר איחוי ווסיקולת ה clathrin-coated pit -עם ליזוזום. הוכח במספר מחקרים שביטול או פגיעה בפעילותם של ה (142 ,47 ,46) GRKs -וכן של הβ- - (15 ,14) arrestinגורמים לפעילות יתר של הקולטן ולחוסר יכולת של המערכת הנחקרת "להירגע" לאחר גירוי. זרחון של קולטן ה GPCR -ע"י GRKsלאחר שפעולו ע"י ליגנד נקרא בספרות "דסנסיטיזציה הומולוגית" ונבדל מ"-הדסנסיטיזציה ההטרולוגית" אשר מתארת זרחון של הקולטן ע"י הקינאז ,PKA 20 ובמקרים מסוימים גם ע"י PKA .(150 ,38 ,26) PKCו PKC -משתייכים אף הם למשפחת ה- serine/threonine kinasesאך מזרחנים קולטנים גם כאשר הם אינם תפוסים ע"י ליגנד ובעמדות שונות משל ה.GRKs - מעבר לתפקידו בשיתוק הקולטן והרחקת הקולטן מהממברנה הפלסמטית ,לזרחון הקולטן ע"י GRKsו- PKAהשלכות רבות לגבי מסלולי העברת אותות המשופעלים מאוחר יותר ,אשר יפורטו בפרק .1.6.4 עי תהליך הדסנסיטיזציה ואינטרנליזציה. איור – 1.5בקרת פעילותו של קולטן " GPCR לאחר קשירת הליגנד )מסומן ב ,(∗ -תת-היחידות של חלבון ה G -משתחררות ומשפעלות את מסלול העברת האותות )שלב .(1לאחר מכן GRKs ,מזרחנים את הקולטן התפוס ע"י ליגנד וגורמים כך לקשירת β-arrestin לקצה ה-C -טרמינלי שלו )שלב .(2הקומפלקס קולטן β-arrestin/הופך מטרה לקשירה למספר חלבונים ביניהם (AP-2) adapter protein 2 ,clathrinו -פוספואינוזיטידים ) ,(PIP2אשר גורמים להחדרת הקולטן לציטוזול התא )שלב .(3לאחר האינטרנליזציה ,הקומפלקס קולטן β-arrestin/הינו אחראי לשפעול של מספר מסלולי העברת אותות )שלב (4ולאחר מכן יכול לעבור דגרדציה )שלב (5aאו מחזור חזרה לממברנה הפלסמטית )שלב .(5bלקוח מתוך ).(112 21 - 1.6.2מאפיינים מבניים של קינאזות ממשפחת הGRKs - משפחת ה GRKs -מורכבת משבע קינאזות אשר מזהות באופן ייחודי קולטנים תלויי חלבון G ) (GPCRsומזרחנות באופן ספציפי את חומצות האמינו סרין וטראונין .משפחה זו מחולקת לשלוש תת משפחות :א( לתת המשפחה הראשונה משתייכים GRK1ו ,GRK7 -אשר מתבטאים יחודית במערכת הראייה ,ב( לתת המשפחה השנייה ,אשר מכונה גם משפחת הקינאזות של הקולטן הבטא-אדרנרגי ) (βARKמשתייכים GRK2ו ,GRK3 -ולבסוף ג( משפחת ה GRK4 -לה משתייכים ,GRK4 GRK5ו .GRK6 -ל GRKs -השונים מבנה שמור למדי המורכב משלושה אזורים :מרכז החלבון ) ∼270חומצות אמינו( בעל הפעילות הקטליטית )זרחון חומצות אמינו סרין וטראונין( שמור בתוך משפחת ה ∼45%) serine/threonine kinases -הומולוגיה( .הקצוות ה-N -טרמינליים ) ∼185חומצות אמינו( מעורבים בזיהוי חלבון המטרה )הסובסטרט( ומראים הומלוגיה נמוכה בין האנזימים השונים ) .(∼27%הקצוות ה-C -טרמינליים אינם מראים כלל הומולוגיה ,הם בעלי אורך משתנה באנזימים שונים ) ∼105-230חומצות אמינו( ,וקובעים את מיקום האנזים ותנועתו בתא בכך שהם מקיימים אינטראקציה עם ליפידים ו/או חלבונים ממברנליים שונים .הקצה ה-C -טרמינלי של GRK2ו GRK3 -מכיל אזור הנקרא (PH) pleckstrin homology domainאשר מאפשר קשירה לפוספוליפיד PIP2ולתת- היחידות βγשל חלבוני ה .G -מכיוון ש GRK2 -ו GRK3 -הינם בעיקר חלבונים ציטוזוליים נראה שמטרתן של אינטראקציות מסוג זה לאפשר הימצאות של חלק מן ה GRKs -קרוב לממברנה בטרם הופעל הקולטן GRK4 .ו GRK6 -עוברים פלמיטואילציה ) (palmitoylationאשר גורמת להימצאותם הקבועה בממברנה הפלסמטית .לעומתם GRK1 ,ו GRK7 -הינם בעיקר ממברנליים הודות לפרנזילציה ) (farnesylationבקצה ה-C -טרמינלי שלהם GRK5 .נמצא אף הוא קשור לממברנה באופן קבוע הודות לאתר בקצה ה-N -טרמינלי שלו הקושר PIP2ולאתר בקצה ה-C -טרמינלי הקושר פוספוליפידים באופן קונסטיטוטיבי. לעומת ,GRK4 ,GRK1ו GRK7 -אשר מתבטאים באופן יחודי ברקמות ספציפיות ) GRK1ו- GRK7מתבטאים אך ורק ב retinal rods -ו ,retinal cones -כאשר GRK4נמצא בעיקר ברקמות הצרבלום במוח ,בכליה ובאשכים( GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,ו GRK6 -מתבטאים בכמעט כל רקמות הגוף ) .(ubiquitously expressedמסיבה זו ,ארבעת הקינאזות האלו הינן אחראיות על וויסות המגוון הרחב ביותר של מערכות פיזיולוגיות ).(135 - 1.6.3בקרה על פעילות GRK2 GRK2הינו האיזופורם הנחקר ביותר בספרות מכל משפחת ה .GRKs -זהו ה GRK -היחיד אשר knock-outבו גורם ל 100% -מוות עוברי ) ,(70כאשר הוא נמצא מעורב בתהליך הדסנסיטיזציה של המגוון הרחב ביותר של קולטני ,GPCRשהידוע מביניהם הינו הקולטן ה-β2 -אדרנרגי (β2- ) GRK2 .adrenergic receptor – β2ARנמצא מעורב בתפקוד תקין של המערכת הקרדיווסקולרית, 22 המערכת האימונית ,מערכת העצבים ,התפתחות העצם ועוד ) .(135בקרת פעילותו של GRK2הינה תהליך מורכב המשלב אינטראקציות תוך-מולקולריות ,קשירה לחלבונים ציטוזוליים שונים )כגון תת- היחידה βγשל חלבון (Gוזרחון על ידי קינאזות אחרות ).(140 איור – 1.6משפחת ה.GRKs - קינאזות ממשפחת ה GRKs -חולקו לתתי משפחות על פי הומולוגיה בין הרצפים והשינויים שלאחר תרגום החלבון בקצה ה-C -טרמינלי ) farnesylationעבור GRK1ו GRK7 -לעומת palmitoylationעבור GRK4 ו .(GRK6 -לקוח מתוך ).(128 אחד ממנגנוני הבקרה על ה GRKs -מתווך על ידי קינאזות ממשפחת ה.serine/threonine kinases - זרחון GRK2בעמדות של סרינים ספציפיים יכול ,במצבים שונים ,לגרום לעיכוב או להגברת פעילות האנזים .מחקרים הראו שזרחון GRK2בעמדת Ser670ע"י הקינאז ERKממשפחת ה MAPK -גורם לעיכובו ,ע"י כך שאינו מאפשר את קשירתו ל .(43) Gβγ -לעומת זאת זרחון בעמדת Ser685ע"י PKAגורם להגברת הפעילות ,על ידי כך שנחשפים אזורים המעורבים בקשירה ל.(29) Gβγ - מנגנון בקרה נוסף אשר התגלה לאחרונה מתווך על ידי קינאז בשם ,c-Srcממשפחת הtyrosine - ,kinasesומערב זרחון של GRK2בעמדות טירוזינים שונות בקצה ה-N -טרמינלי ) .(151 ,44מחקרים הראו שזרחון מסוג זה מגדיל את האפיניות של GRK2כלפי חלבונים ממברנליים )קולטנים( וכן ציטוזוליים כגון Gαqו .Gα11 -הוכח שאינטראקציה מסוג Gαq/GRK2גורמת לעיכוב של חלבון ה- .(35) Gqלכן ,זרחון ה GRK -ע"י c-Srcגורם לדיכוי מזורז של מסלול העברת האותות ע"י עיכוב 23 מסלול ה Gαq/PLCβ2 -במקביל לדסנסיטיזציה מוגברת של קולטן ה .GPCR -בקרה מסוג זה הינה ספציפית ל GRK2 -ולא נמצאה ב GRKs -אחרים כגון GRK5או .GRK6 - 1.6.4שפעול מסלולי העברת האותות לאחר הדסנסיטיזציה של קולטני הGPCRs - במשך תקופה ארוכה ,נחשב תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני ה GPCRs -לתהליך אשר מטרתו היחידה הייתה כיבוי העברת האותות לאחר שפעול הקולטן .בשנים האחרונות ,מחקרים רבים הראו שלא כך המצב :ישנן היום ראיות מוצקות לכך שתהליך הדסנסיטיזציה מעורר בעצמו מסלולי העברת אותות מאוחרים יותר ,כאשר העיקרי מביניהם הינו מסלול ה(Mitogen-activated protein MAPK - ).(100 ,99 ,92) kinases ישנן שתי דרכים דרכן קולטן ה) β2AR -לגביו נעשו רוב המחקרים בנושא( גורם לשפעול של מסלול ה- :MAPKאחת התלויה בזרחון הקולטן ע"י (PKA dependent) PKAוהשנייה התלויה בזרחון הקולטן ע"י GRKוקשירת β-arrestinאליו ).(β-arrestin dependent גירוי הקולטן ה β2AR -גורם לשפעול ושחרור חלבון Gsוכך לשפעול אדניליל ציקלאז ,היווצרות השליח המשני cAMPושפעול PKA .PKAעצמו יכול לזרחן בחזרה את הקולטן ה) β2AR -כמתואר בפרק .(1.6.1כתוצאה מזרחון זה ,האפיניות של הקולטן לחלבון Gsיורדת לטובת אפיניות גדולה יותר לחלבון .(182 ,32) Giנמצא שתת-היחידה βγהמשתחררת מחלבון ה Gi -מסוגלת לשפעל את מולקולת ה ,Ras -אשר משפעל את c-Srcומכאן את מסלול ה ,MAPK -עד לקינאזות ,p42/44הידועות גם בשם .(98 ,13) ERK1/2שפעול זה של ERK1/2דרך PKAהינו מהיר למדי וקורה בפחות מ2 - דקות. בנוסף ,נמצא שהקומפלקס של הקולטן המזורחן ע"י GRKיחד עם ה β-arrestin -מסוגל לשפעל גם הוא את c-Srcולכן גם הוא גורם לשפעול מסלול ה .(97) MAPK -שפעול של ERK1/2בדרך זו נראה מאוחר יותר יחסית לשפעול ע"י ) PKAהיות וזרחון הקולטן ע"י GRKוקשירת β-arrestinאליו הינו תהליך ארוך יותר( ,אך קיים לזמן ארוך הרבה יותר )עד 30-45דקות( ) .(155מחקרים הראו ששפעול ERK1/2בדרך זו הינה תלויה בחוזק האינטראקציה בין הקולטן ל (87) β-arrestin -אשר תלוי בעצמו בזהות חומצות האמינו המזורחנות ע"י ה GRKs -השונים ).(155 - 1.7חשיבות המחקר ומטרת העבודה בשנים האחרונות עלתה בעולם המערבי צריכת הסוכר בצורה ניכרת ,דבר המגביר את הסיכון והרגישות למחלות כגון השמנה ,יתר לחץ דם ,סכרת וכו' .פתרון אפשרי לבעיה זו הוא מציאת ממתיק מלאכותי בעל טעם זהה לסוכר טבעי אך במהותו חסר קלוריות .טרם נמצא ממתיק מלאכותי כזה שמתיקותו וטעמו יידמו לאלה של סוכרים כגון סוכרוז ,הנחשב לממתיק אופטימלי .בנוסף ,צריכת ירקות ופירות מסוימים בעלי טעם מר כגון חסה ,ברוקולי ,כרוב ,כרובית ,אשכוליות איננה עולה עקב טעם חזק הנתרם ע"י פנולים 24 ותרכובות אחרות )חלקן הגדול בעלות ערך תזונתי או בריאותי( .בנוסף ,התפתחות מנגנוני עיבוד המזון בתעשייה הביאה במקרים מסויימים להיווצרות תרכובות מרות )חלקן בעלות תרומה תזונתית( אשר עלולות לגרום לדחייה של מוצרים אלו .לכן ,על מנת למסך את המרירות במזונות המעובדים ,מוסיפות חברות המזון ממסכי מרירות הכוללים לעיתים סוכר ,דבר הגורם להשקעת כסף רב והפיכת המוצרים לעתירי קלוריות. איור – 1.7מבנים מולקולריים של מספר תרכובות מרות ומתוקות אמפיפטיות )המרות מוצגות בצד שמאל ,המתוקות בצד ימין( אשר שימשו במחקר הנוכחי. ידוע כי תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מעוררים תחושות "מוזרות" של טעמי לוואי כגון הטעם המתכתי .תופעה ידועה נוספת הינה תופעת ה"-טעם המים המתוקים" ),(water sweet aftertaste המתארת מצב בו מים מורגשים כמתוקים כאשר הם נבלעים לאחר טעימת ממתיקים כגון סכרין או אצסולפאם .K-במשך שנים ,לא נמצא הסבר לתופעה זו עד שלאחרונה פורסם מחקר אשר מציע מנגנון חדש בו הממתיק עצמו יכול ,בריכוזים גבוהים ,לפעול כמעכב לקולטן למתוק על ידי קשירה לאזור 25 הטרנסממברנלי של .T1R3שטיפה של הטעמן ע"י בליעת המים משחררת את הקולטן מהמעכב שלו וכך המים מורגשים כמתוקים ).(49 בנוסף ,ידוע כי בניגוד לסוכרים טבעיים המורגשים מיד לאחר הטעימה ולמשך זמן קצר ,הטעם של תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מגיע לשיא לאחר זמן ממושך ,תופעה הידועה בשם ,slow onset ונשאר זמן רב בפה ,תופעה המכונה שאריתיות או .lingering aftertasteתופעת השאריתיות גורמת לתחושה לא נעימה לאורך זמן )לעתים עשרות דקות( לאחר סיום צריכת מוצר המזון ,ובכך מהווה גורם מגביל לצריכה רחבה יותר של מוצרים הכוללים תרכובות מסוג זה .המנגנון המולקולרי של תופעת השארתיות אינו ידוע. תרכובות מרות וממתיקים מלאכותיים מגוונים מאוד במבנה שלהם אך לרובם תכונה משותפת בהיותם תרכובות אמפיפטיות ,כלומר מולקולות בעלות חלק הידרופובי וחלק הידרופילי )איור .(1.7 לפני מספר שנים ,הועלתה ההשערה לפיה תכונת האמפיפטיות מקנה לתרכובות אלו אפשרות להיצמד לממברנת התא ,לחדור דרכה לתוך הציטוזול ,ושם להשפיע על פעילותם של מרכיבים תוך תאיים .בעבר נמצא שתרכובות אמפיפטיות מרות יכולות לחדור ממברנות ליפוזומים ) ,(133 ,132 ,22לעבור אינטראקציה ישירות עם חלבוני ,(116) Gלעכב או ולהפעיל תעלות מסוגים שונים ) ,(170 ,31או לעכב אנזימים כגון פוספודיאסטראזות ) (132) Peri et al. .(144הראו שתרכובות מרות כמו כינין ו- ) ,cyclo(Leu-Trpותרכובות מתוקות כמו סכרין ו-D -טריפטופן אכן חודרות לתוך תאי טעם בפפילה מבודדת )המופרדת מאפיתל הלשון ע"י טיפול בקולגנאז( וגם לתוך תאי טעם בפקיעיות מבודדות. השערת העבודה הינה שבמקביל לקשירה לקולטן והפעלת מסלול העברת האותות ,תרכובות מרות ומתוקות אמפיפטיות מסוגלות לחדור את ממברנת תאי הטעם ומרגע שנמצאות בתוך ציטוזול התא, משבשות את פעילותן של קינאזות ממשפחת ה .GRKs -עיכוב פעילותן של ה GRKs -תגרום לעיכוב מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטן ) (desensitizationולכן למסלול העברת האותות להימשך זמן רב יותר .תופעה כזו ,אם תוכח ,תהווה מנגנון אפשרי לתופעת השאריתיות )איור .(1.8 ד"ר מירב צוברי-סמואלוב הראתה בעבודת הדוקטור שלה כי טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים מסוגלים לעכב in-vitroאת פעילותן של GRK5 ,GRK2ו ,PKA -שלוש קינאזות אשר אחראיות על מנגנון הדסנסיטיזציה של מגוון קולטני .(186) GPCR 26 איור – 1.8השערת העבודה :טעמנים אמפיפטיים מעכבים את מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני .GPCRs המודל מתאר מצב בו טעמנים מרים ומתוקים אמפיפטיים ) (Tמשפעלים מצד אחד את הקולטן שלהם ) (Rאך במקביל חודרים לתוך ציטוזול תאי הטעם ושם מעכבים את פעילותן של קינאזות ממשפחת ה ,GRK -ובדרך זו מעכבים את מנגנון הדסנסיטיזציה ) (desensitizationשל הקולטן .במקרה כזה ,הקולטן צפוי להראות פעילות ממושכת מהרגיל. מטרה ראשונה של עבודת המחקר הנוכחית הייתה להוכיח את יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור באופן טבעי לתוך תאי הטעם )דרך הצד האפיקלי ,בהתאם לתנאים פיזיולוגיים( .לשם כך נעשה בשלב ראשון בעזרת מיקרוסקופיה קונפוקלית מעקב דינמי אחר חדירתם של טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לפפילת (CV) circumvallateשלמה )שלא הופרדה מהלשון( .ניסויים נוספים נערכו בחולדות מורדמות במטרה להעריך את ריכוז הטעמנים בתוך תאי פקיעית הטעם לאחר צריכתם .בשלב הבא, נבדקה נוכחותם של GRKsבתאי פקיעית הטעם מפפילת CVבמטרה לזהות קיום מנגנון של דסנסיטיזציה הומולוגית לקולטני GPCRsבתאים אלו .בנוסף ,נבחנה השפעתם של טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים על מנגנון הדסנסיטיזציה המתווך ע"י ,GRKsע"י שימוש בקולטן ה-β2 -אדרנרגי ) (β2ARכמודל לקולטנים ממשפחת ה ,GPCRs -לה משתייכים הקולטנים לטעם .לשם כך נבחנה השפעתם של טעמנים חודרי ממברנות על שלושת הקריטריונים האופייניים לדסנסיטיזציה של הקולטן ה- (1 :β2ARדסנסיטיזציה של האותות )סיגנל( המועברים על ידי הקולטן; (2מידת זרחון הקולטן; (3 אינטרנליזציה של הקולטן לציטוזול התא .בנוסף ,נבחנה השפעה אפשרית של הטעמים האמפיפטיים על שפעול ERKאשר תלוי בדסנסיטיזציה של הקולטן ה β2AR -עצמו. 27 חומרים ושיטות.2 חומרים- 2.1 רשימת חומרים- 2.1.1 Acetic acid Acetic anhydride Acrylamide-bis Adenosine 3’5’ cyclic monophosphate (cAMP) [125-I]- cAMP (Adenosine 3’5’ cyclic phosphoric acid, 2’-O-succinyl [125-I] iodotyrosine methyl ester Agarose Aprotinin Anti cAMP-BSA serum Benzamidine Bovine serum albumin (BSA) Caffeine Calcium chloride Collagenase D Coomassie brilliant blue G Cyclo (Leu-Trp) Deoxycholic acid sodium salt 1,4-Diazabicyclo[2.2.2] octane (DABCO) Dimethylsulfoxide (DMSO) Dithiothreithol (DTT) Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Ether Ethidium bromide Ethyl alcohol Ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA) Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether) -N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) Fetal bovine serum (FBS) heat inactivated Glucose Glutamine solution Glycerol β-Glycerophosphate Glycine N-[2-Hydroxyethyl]piperazineN’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Isopentane (−)-Isoproterenol hydrochloride (ISO) Leupeptin Magnesium chloride Frutarom, Israel Sigma, USA Serva, Germany Sigma, USA NEN, USA Gibco, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Boehringer, Germany Sigma, USA Bachem, Switzerland Fluka, Israel Sigma, USA Merck, Germany Sigma, USA Sigma, USA Gadot, Israel Tamar, Israel Bio-Lab, Israel Sigma, USA Sigma, USA Gibco, USA Merck, Germany Biological Industries, Israel Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA 28 Magnesium sulfate Neohesperidin dihydrochalcone (NHD) Naringin Optimal Cutting Temperature (OCT) Opti-MEM® I Orthovanadate Paraformaldehyde (PFA) Penicillin-Streptomycin Pepstatin A Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Potassium carbonate Potassium chloride Potassium dihydrogen phosphate Potassium iodide Propidium iodide Protein G PLUS-Agarose beads Pyruvic acid Quinine hydrochloride Sodium acetate Sodium bicarbonate Sodium chloride Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sodium fluoride (NaF) di- Sodium hydrogen phosphate heptahydrate Sodium hydroxide Sodium phosphate Sodium saccharin Trichloroacetic acid (TCA) Tricine Triethylamine Tris (Tris [hydroxymethyl]aminomethane) Triton X-100 Trypsin-EDTA solution C Trypsin inhibitor (type П-S: soybean) D-Tryptophan Tween-20 Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Menzel-Glazer, Germany Gibco, USA Sigma, USA Sigma, USA Biological Industries, Israel Sigma, USA Sigma, USA Frutarom, Israel Frutarom, Israel Merck, Germany Sigma, USA Sigma, USA Santa-Cruz, USA Sigma, USA Sigma, USA Merck, Germany Merck, Germany Frutarom, Israel Sigma, USA Sigma, USA Merck, Germany Frutarom, Israel Merck, Germany Sigma, USA Merck, Germany Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA Biological Industries, Israel Sigma, USA Sigma, USA Sigma, USA חומצות גרעין וערכות, אנזימים, נוגדנים- 2.1.2 GRK2, GRK5, GRK6, HA probe, β2AR and antiphosphoSer(355-356) β2AR first antibodies ERK and phosphoERK first antibodies HRP/FITC-conjugated secondary antibodies ECL luminescence kit 29 all Santa-Cruz, USA Sigma, USA Jackson, USA Santa-Cruz, USA Rneasy Protect Starter kit PCR purification kit Reverse-iT 1st strand synthesis kit ReddyMix PCR Master kit Red Load Taq Master Primers pcDNA3 plasmid containing human β2AR gene pcDNA3 plasmid containing HA tagged-β2AR gene MaxFect™ Qiagen, Germany Qiagen, Germany ABgene, UK ABgene, UK Larova GmbH, Germany HyLabs, Israel Dr. Lefkowitz, R.J., Howard Hughes Medical Institute, Durham, NC, USA Missouri S&T cDNA Resource Center, USA (www.cdna.org) Molecula Research Labs, USA (www.molecula.com) בופרים ותמיסות- 2.1.3 Phosphate buffered saline (PBS X1): NaCl 120 mM, KCl 2.5 mM, EGTA 1 mM and Tris 2.0 mM titrated with HCl to pH 7.4. Bradford solution: Coomassie brilliant Blue G 10% (w/v), ethanol 4.75% (v/v) and phosphoric acid 8.5% (v/v) in DDW. Buffer A: β-glycerophosphate 50 mM, EGTA 1.5 mM, orthovanadate 0.1 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM with HCl to pH 7.3. Buffer H: β-glycerophosphate 50 mM, EGTA 1.5 mM, orthovanadate 0.1 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, benzamidine 1 mM, aprotinin 10 μg/ml, leupeptin 10 μg/ml, pepstatin A, 2 μg/ml. Hank's buffer: NaCl 137 mM, KCl 5.3 mM, Na2HPO4 0.3 mM, MgSO4 0.4 mM, MgCl2 0.5 mM, Hepes 5 mM, Tricine 6.5 mM, glucose 30 mM, NaHCO3 4 mM. Mounting solution: Glycerol 90% (v/v), Tyrode 10% (v/v), DABCO 3% (w/v), sodium azide 0.1% (w/v). RIPA buffer: Tris 20 mM, NaCl 137 mM, Glycerol 10%, SDS 0.1%, Deoxycholate 0.5%, Triton X-100 1%, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Leupeptin 20 μM. Running buffer: Tris 25 mM, Glycine 192 mM and SDS 0.1% (w/v). Sample buffer X4: Tris 0.2 M, glycerol 40% (v/v), SDS 0.08% (w/v), DTT 0.1 M, bromophenol blue for blue color. TBST: Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 0.05% (v/v). 30 Tyrode Buffer: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, Hepes 10 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM fixed to pH 7.4 with tris. TGPP: Tyrode buffer containing pyruvic acid 10 mΜ and glucose 10 mM. TAE buffer: Tris- acetate 40 mM, EDTA 1 mM. Transfer buffer: Tris 15 mM and Glycine 120 mM. 31 2.2שיטות - 2.2.1הדמיית חדירת טעמנים לתוך פפילות CVשלמות תוך מעקב דינמי )(in situ במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי חולדות נקבות מזן ,Sprague-Dawleyבמשקל של 150-175גרם ,התקבלו מבית החיות האוניברסיטאי .החיות הוחזקו בכלובים בגודל 25×40ס"מ עם מזון ומים ללא הגבלה ,בטמפרטורה של 23±2°Cובמחזור הארה של 12שעות אור 12 ,שעות חושך .ביום הניסוי ,החולדות הורדמו ע"י אתר והומתו ע"י הסרת ראש ).(decapitation על מנת לעקוב אחר תנועה והצטברות של הטעמנים לתוך רקמת הפפילה ,ניצלנו את התכונות הפלואורסצנטיות שלהם תוך שימוש בשיטת מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית .בעזרת מספריים עדינות וללא טיפול בקולגנאז ,הוצא מלשון החולדה משטח רקמת אפיתל בגודל של 2X2X2מ"מ ובמרכזו פפילת ה (CV) circumvallate -ביחד עם רקמות השומן והשריר שבצד הבזולטרלי ,כך שהצד האפיקלי בלבד של הפפילה נמצא חשוף לסביבה ,בדומה למצב פיזיולוגי .משטח זה הונח על זכוכית נושא בתוך 5 μLשל בופר .TGPPלאחר מכן ,הוספו 5 μLשל תמיסה מרוכזת של טעמן כך שהריכוז הסופי של הטעמנים היה :סכרין -D ,10 mM -טריפטופן ,10 mM -נרינגין ,1 mM - CLT ,1 mM -כינין 1 mMוקפאין .10 mM -הצילומים התמקדו בתעלה הפנימית של הפפילה ),(inner trench circleהיכן שפקיעיות הטעם מרוכזות .זמן הוספת הטעמן הוגדר כזמן ,0כאשר רמת הפלואורסצנציה הותאמה לרמת הרקע .לאחר מכן ,תמונות נוספות צולמו כל שתי דקות .כביקורת ,צולמה הפפילה בתוך תמיסת TGPPבהיעדר טעמן .לאחר 6דקות של הדגרה עם הטעמן ,הוספה תמיסה של אשלגן יודיד )(KI בריכוז סופי של 0.5 Mלמשך שתי דקות נוספות KI .הינו מלח מדעיך פלואורסצנציה )(quencher אשר אינו חודר ממברנות של תאים ולכן מטרתו בניסוי זה לגרום לדעיכת הפלואורסצנציה של מולקולות הטעמנים אשר נספחו על פני שטח ממברנת הפפילה .על פי אותו היגיון ,מולקולות הטעמנים אשר חדרו דרך ממברנות התאים פנימה ,לתוך הציטוזול ,תהינה מוגנות מפני השפעת ה .KI-כביקורת חיובית לפעילות המדעיך ולחיותם של תאי הטעם השתמשנו בפרופידיום יודיד ,(50 μg/mL) PIתרכובת פלואורסצנטית אשר נקשרת לחומצות הגרעין אך אינה חודרת ממברנות של תאים חיים ולכן משמשת במחקרים רבים לזיהוי תאים מתים ע"י צביעת הגרעין שלהם .התמונות נשמרו בפורמאט TIFFועובדו בעזרת התוכנות Image-Pro Plus Media Cybernaticsו.Adobe Photoshop - לפני שבוצעו ניסויים במיקרוסקופ הקונפוקלי ,נקבע כושרו של KIבהדעכת פלואורסצנציה של הטעמנים הנבדקים ופרופידיום יודיד מומסים בתמיסת TGPPבעזרת ספקטרופוטומטר מסוג Carry Eclipse .(Variant Australia PTY LTD, Australia) fluorescence spectrophotometer 32 - 2.2.2הפרדת פפילת ה CV -בחולדה רקמת פפילת ה CV -הופרדה מהלשון לפי )) (163איור .(2.1החיות הורדמו בעזרת אתר והומתו ע"י הסרת ראש .הלשון הוצאה ונשטפה מיד בבופר TGPPקר. במטרה להפריד בין רקמת הפפילה לבין רקמת החיבור בלשון ,הוזרקו מסביב לפפילה ומתחתה 500 μl מתמיסה המורכבת מקולגנאז בריכוז של 4 mg/mlומעכב טריפסין שמקורו מסויה בריכוז .4 mg/ml ההזרקה נעשתה בשש נקודות שונות ) 5מסביב 1 ,מתחת לפפילה( תחת מיקרוסקופ בינוקולרי .לאחר תהליך ההזרקה ,הלשון הודגרה בתמיסת TGPPתוך בעבוע אוויר במשך 15דקות בטמפרטורה של 30 . °Cלאחר מכן ריבוע של אפיתל הכולל את הפפילה נגזר בעזרת מספריים עדינות ,הופרד ע"י משיכה עם פינצטה עדינה )מספר (5ונשטף בתמיסת TGPPקרה ).(4°C ריבוע האפיתל הונח על צלחת בתוך תמיסת TGPPקרה כך שצינורות ההפרשה (von Ebner gland ) ductsפונים כלפי מעלה .הצינורות הוסרו בעזרת מספריים עדינות והפפילה הופרדה מרקמת האפיתל הלא סנסורי ע"י גזירה ,כך שהתקבל מבנה פרסה המכיל את פקיעיות הטעם והוא הפפילה )איור .(2.1 איור - 2.1בידוד פפילת CVמלשון חולדה. א -אפיתל הלשון עם פפילת ה CV -לאחר טיפול בקולגנאז והסרתה מן הלשון השלמה. ב -הסרת צינורות ההפרשה. ג -חיתוך פפילת ה CV -משטח האפיתל. ד -פפילת ה CV -אשר מכילה את האיברונים הסנסוריים מופרדת מן האפיתל הלא-סנסורי. לקוח מתוך ).(163 - 2.2.3הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת CVוקביעת כמות חלבון פפילות CVאשר בודדו כמתואר בסעיף 2.2.2עברו הדגרה עם הטעמנים השונים ,נשטפו בבופר TGPP חמש פעמים ,ופוצצו ע"י סידרה של ארבע הקפאות והפשרות ב .-20°C -ממברנות התאים הושקעו ע"י סרכוז בצנטריפוגת אפנדורף ב 20,000g -בטמפרטורה של 4°Cלמשך 45דקות .הנוזל העליון שהכיל 33 את תוכן התאים הופרד ,הוקפא ,יובש בהקפאה ונשמר בטמפרטורה של -20°Cעד לקביעה כמותית ב- .HPLC המשקע שהתקבל אחרי סרכוז הכיל את ממברנות תאי הפפילה ושימש לקביעת כמות החלבון בשיטת .(17) Bradfordלמשקע הוספו 50 μlשל תמיסת NaOH 5 Mוהתמיסה הודגרה במשך 45דקות בטמפרטורה של .60°Cלאחר מכן הוספו 450 μlמים מזוקקים ,התמיסה עורבבה ונלקחו שלוש דגימות של 50 μlלבדיקה .לכל דוגמא הוסף נפח של 250 μlמתמיסת ,Bradfordוכמות החלבון נקבעה בעזרת קריאת בליעה באורך גל של 595 nmבמכשיר ,(Bio-Tek®Instruments, Inc., USA) Elisaכאשר BSAשימש לעקום כיול. - 2.2.4חדירת הטעמן לתוך תאי הטעם של פפילת (in vivo) CVבחולדות מורדמות חולדות הורדמו ע"י הזרקת 0.5 mLפנטוברביטל ) 60 mg/kgמשקל גוף( לתוך חלל הבטן והונחו על משטח מיוחד שאיפשר הטיה נוחה של הגוף בזווית של 30°כלפי מטה ,כך שניתן היה לשמור על חלל הפה פתוח בעזרת פינצטה )איור (2.2ולהזרים לסירוגין נפח של 10מ"ל של הטעמן בעזרת פיפטת פסטר למשך 90שניות ללא גרימת חנק לחיה .ריכוזי הטעמנים היו כדלקמן-D :טריפטופן - CLT ,30 mM - ,2 mMכינין 2 mM -וקפאין .10 mM -לאחר מכן החיות הומתו ופפילת ה CV -הופרדה בעזרת קולגנאז )כמתואר בסעיף .(2.2.2הפפילה המופרדת העשירה בפקיעיות טעם הוכנסה ל 100 μL -מים מזוקקים פעמיים ) (DDWונשמרה ב -70°Cעד להמשך הטיפול .הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת ה- CVנעשתה כמתואר בסעיף .2.2.3חיות הביקורת טופלו באופן דומה ,אך התמיסה שהוזרמה לתוך חלל הפה של החיה לא כללה את הטעמן. מאחר והטיפול בקולגנאז להוצאת פפילת ה CV -מן הלשון ארך כ 25 -דקות ,נעשה ניסיון להעריך את כמות הטעמן אשר זרמה החוצה מתאי הטעם ) (effluxבמהלך טיפול זה .למטרה זו ,בוצעו ניסויים נוספים בהם פפילות CVהופרדו כמתואר בסעיף ,2.2.2נחתכו לשני חצאים שווים וכל חצי פפילה הודגר בשלב ראשון 2דקות ב 100 μLתמיסת TGPPב 30°C -ולאחר מכן עם טעמן למשך 30 שניות באותה טמפרטורה .בתום 30השניות ,חצי פפילה אחד נשטף 5פעמים בתמיסת ,TGPPהוכנס ל 100 μLמים מזוקקים והוקפא ב .-70°C -לעומתו ,חצי הפפילה השני הועבר לתוך 100 μLתמיסת TGPPלמשך 25דקות ב ,30°C -בניסיון לחקות את זמן ההמתנה אותו עוברת פפילת ה CV -בטיפול קולגנאז לאחר ניסויי ה .in vivo -רק לאחר המתנה זו חצי הפפילה נשטף ונשמר בדומה לחצי הפפילה הראשון עד להמשך הטיפול של הפרדת תוכן התאים מרקמת פפילת ) CVסעיף .(2.2.3 לאחר הפרדת תוכן התאים כמתואר בסעיף ,2.2.3כמות הטעמן נקבעה בשיטת ה HPLC -כמתואר בסעיף .2.2.5שיעור בריחת הטעמן החוצה בזמן הטיפול בקולגנאז הוערך ע"י השוואת כמות הטעמן שנמצאה בחצי הפפילה אשר נשטף 25דקות לאחר הדגרה עם הטעמן יחסית לכמות הטעמן שנמצאה בחצי הפפילה שלא עבר את שלב "ההמתנה" .לניסוי זה שימשו טעמנים בעלי אופי פלואורסצנטי או לחילופין בעלי בליעה גבוהה באור UVאשר אפשרה סף זיהוי נמוך במערכת ה.HPLC- 34 איור - 2.2הזרמת תמיסת טעמנים לתוך פיה של חולדה מורדמת לצורכי בחינת יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור לתוך פפילת CVבתנאי .in vivo - 2.2.5קביעה כמותית של טעמנים בתוך תאי טעם מפפילת CVבעזרת שיטת HPLC לאחר ייבוש תוכן התאים כמתואר בסעיף ,2.2.3כמות הטעמן שנכנסה לתוך תאי הטעם נמדדה בעזרת כרומטוגרפיה נוזלית .HPLCהבדיקה נעשתה במערכת מתוצרת Merck-Hitachi (Darmstadt, ) Germanyהמצוידת במשאבה , L-7100גלאי פלואורסצנטי F-1050 וגלאי L-7455 UV ) (UltraViolet-visible diode-arrayהמחוברים בטור .ההפרדה נעשתה בקולונה ארוכה )) (LiChroCart® 250-4 LiChrospher® 100 RP-18 (5 μmאו בקולונה קצרה ®(LiChroCart )) 55-4 Purospher Star RP-18 (3 μmבתוספת פרקולונה מתאימה של .(186 ,132) RP-18 הטעמנים המתוקים סכרין ו ,(NHD) neohesperidin dihydrochalcone -והטעמנים המרים קפאין ונרינגין הופרדו בקולונה ארוכה וזוהו בגלאי .UVלעומתם ,שלושת הטעמנים -Dטריפטופן ,כינין והפפטיד ) cyclo (Leu-Trpהופרדו בקולונה קצרה ונבדקו בגלאי הפלואורסצנטי כל אחד לפי אורכי גל עירור ופליטה מתאימים .הטעמנים זוהו על פי זמני שהייה של כל אחד מהם בקולונה (RT - Retention ) , Timeוכומתו על בסיס עקומת כיול והשוואת שטחי פיקים שהתקבלו בדוגמאות לאותה עקומה. הפרדת סכרין נעשתה בהרצה איזוקרטית עם פאזה נעה המורכבת ממתנול ומחומצה אצטית (v/v) 1.5% ביחסים של (v/v) 20:80בהתאמה ,בקצב זרימה של .0.45 ml/minבליעת סכרין נמדדה באורך גל של .268 nm -Dטריפטופן הופרד בקולונה קצרה ביחסים משתנים של חומצה אצטית (v/v) 1.5%ומתנול בגרדיאנט: יחסם של שני הסולבנטים ) (v/vבזמן 0היה ,5:95השתנה תוך 4דקות ל ,25:75 -חזר תוך 4דקות 35 ליחס התחלתי של 5:95ונשאר כך עוד 4דקות ,סה"כ 12דקות הרצה .קצב הזרימה היה .1 ml/min אורך הגל לעירור היה 280 nmולפליטה .345 nm NHDהופרד בהרצה איזוקרטית בעזרת פאזה נעה המורכבת מאצטוניטריל ומחומצה אצטית )(v/v 0.5%ביחסים של (v/v) 65:35בהתאמה ,בקצב זרימה של .0.75 ml/minבליעת ה NHD -נמדדה באורך גל של .282 nm נרינגין הופרד בקולונה ארוכה בהרצה איזוקרטית בסולבנט המורכב מאצטוניטריל ומים ביחסים של (v/v) 80:20בהתאמה ,בקצב זרימה של .1.0 ml/minבליעת הנרינגין נמדדה באורך גל של .280 nm הפאזה הנעה ששימשה להפרדת קפאין הייתה מורכבת ממתנול ומים ביחסים של (v/v) 50:50בהתאמה, בקצב זרימה של .0.7 ml/minבליעתו של הקפאין נמדדה באורך גל של .268 nm כינין הופרד בקולונה קצרה בהרצה איזוקרטית עם פאזה נעה המורכבת מאצטוניטריל ובופר פוספאט שהכיל SDS 25 mM ,tetrabutylammonium bromide 3 mMו KH2PO4 10 mM -והותאם ל- pH 2.3ע"י חומצה אורתוזרחתית .שני הסולבנטים היו ביחסים של (v/v) 50:50וקצב הזרימה היה 0.6 .ml/minאורך הגל לעירור היה 343 nmולפליטה .395 nm הפאזה הנעה אשר שימשה להפרדת הפפטיד ) (CLT) cyclo (Leu-Trpהייתה מורכבת מאצטוניטריל ומים אשר הכילו ) 1% (v/vאצטוניטריל ו 0.02% (v/v) -חומצה טריפלואורואצטית ) (TFAביחסים של (v/v) 70:30בהתאמה ,בהרצה איזוקרטית ,בקצב זרימה של .0.4 ml/minאורך הגל לעירור היה 280 nmולפליטה .345 nm זמני שהייה ) (RTשל הטעמנים היו 5.0 ,5.8 ,4.5 ,10.2 ,4.25 ,4.39 ,7.05דקות עבור סכרין-D , טריפטופן ,NHD ,נרינגין ,קפאין ,כינין ו CLT -בהתאמה. RT-PCR - 2.2.6 "א כללי ) (total RNAמתוך פפילת CVואפיתל לא סנסורי - 2.2.6.1הפקת רנ פפילות CVמ 7 -חולדות הופרדו מאפיתל הלשון ע"י טיפול בקולגנאז כמתואר בסעיף ,2.2.2אוחדו והוקפאו במבחנת אפנדורף ב -80 °C -עד להפקת הרנ"א .דגימות מן האפיתל הלא-סנסורי אשר בסמוך לפפילת ה ,CV -בגודל 1x1x1מ"מ בקירוב )שטח דומה לזה של הפפילה( ,נלקחו גם כן ואוחסנו בתנאים זהים .הרנ"א הכללי הופק בסביבה סטרילית ככל האפשר בעזרת Rneasy Protect Starter kit ) ,(Qiagen, Germanyעל פי הוראות היצרן. Reverse Transcription (RT) - 2.2.6.2 שלב ה RT -נעשה מיידית לאחר הפקת הרנ"א הכללי בעזרת Reverse-iT 1st Strand Synthesis Kit ) (ABgeneעל פי הוראות היצרן :בשלב הראשון 0.5 μg ,של RNAמתוך ה total RNA -הוספו למבחנת אפנדורף ביחד עם oligo-dTומים והודגרו למשך 5דקות ב 70°C -ולאחר מכן הועברו לקרח. 36 למבחנות הוספו dNTPs ,first standard bufferוהאנזים .Reverse Transcriptaseהראקציה התבצעה ב 47°C -למשך 50דקות וסיום התגובה נעשתה ע"י הדגרה ב 75°C -למשך 10דקות .הנפח הסופי במבחנה היה .20 μlתוצרי ה cDNA -נשמרו ב -80°Cעד שישמשו כתבנית בריאקצית ה- .PCRדוגמת RNAמקורית ללא שלב ה RT -נשמרה על מנת להוכיח בשלב מאוחר יותר כי לא נותרו שאריות DNAבעת הפקת ה) RNA -ביקורת שלילית(. Polymerase Chain Reaction (PCR) - 2.2.6.3 תגובת ה PCR -להגברת מקטעי ה DNA -של הגנים השונים אשר ביטוים נבדק נעשתה בעזרת )) ReddyMix PCR Master Mix (ABgeneערכה מוכנה ל PCR-אשר מכילה בופר ובו הוכנסו מראש כל המרכיבים הדרושים ל .(PCR -עבור כל גן נבדק עורבבו 1 μl ,cDNA 2.5 µlתחלים ייחודים לאותו גן ) 0.5 µlמכל אחד בריכוז ,10 μMראה סעיף (2.2.6.4ו 12.5 μl -של בופר ה- ReddyMixוהנפח הושלם ל 25 μl -עם מים סטריליים .תוכנית ה PCR -כללה 5שלבים .שלב א'5 : דקות ב ,94°C -שלב ב' :דנטורציה של גדילי התבנית דקה ב ,94°C -שלב ג' :היברידיזציה של התחל עם התבנית דקה ב ,52°C -טמפרטורה שהינה נמוכה מטמפרטורת ההיתוך של התחלים ושלב ד' :סינטזה של התוצר על ידי הדגרה למשך דקה ב 72°C -ואז חזרה לשלב ב' לשלושים מחזורים נוספים )שלבים ב'-ד'( ,שלב ה' 10 :דקות ב .72°C -בתום שלב זה ,הדוגמאות נשמרו ב .4°C -תוצרי ה PCR -נבדקו על ידי הפרדת 10 μlמכל דוגמה בג'ל אגרוז ) (w/v) 1.5%צפיפות המתאימה לגודל המקטעים של 300-800בסיסים( ,כאשר הבופר להכנת הג'לים היה TAEבתוספת אתידיום ברומיד. ביקורת לשלילת זיהום דנ"א גנומי לתוך הרנ"א המופק נעשה ע"י ביצוע תגובת PCRכפי שתואר קודם לכן על דגימת רנ"א אשר לא עברה את שלב ה ,RT -בנוכחות התחלים של .GRK2 - 2.2.6.4בחירת תחלים התחלים ששמשו לקבלת תבנית ה DNA -עבור ה GRKs -והקולטנים לטעם הוזמנו מחברת HyLabs )רחובות ,ישראל( .התחלים עבור GAPDHהתקבלו מהמעבדה של דר' אורן תירוש .הרצפים מבוססים על רצפי mRNAמחולדה המפורסמים בבנק הגנים .GenBankעבור כל גן תוכננו שני תחלים ,אחד עבור הקצה ה (sense) 5' -והשני עבור הקצה ה) (antisense) 3' -ראה טבלה .(2.1 - 2.2.6.5קביעת רצף חומצות הגרעין )(sequences לאחר שנקבע כי גודלם של תוצרי ה RT-PCR -תואמים את הצפוי ,הדוגמאות נוקו בעזרת PCR ) Purification Kit (Qiagen, Germanyונשלחו לקביעת רצף נוקלאוטידים בחברת .HyLabs השוואת רצפי האנליזה וזיהוי סופי של התוצרים בוצעו על ידי תוכנת BLASTתוך שימוש במאגר הנתונים של .GenBank 37 לגניםGenBank - גודל התוצר הצפוי וקוד הרצף ב, רשימת התחלים הייחודיים- 2.1 טבלה מס .RT-PCR - נבחן בשיטת הCV -שביטוים בפפילת ה Gene Product Primers GRK1 GRK2 GRK3 GRK5 GRK6 size (bp) Sense 5' TTTCCTGCGGTTTCTTCAGT 3' Antisense 5' CACGTTCTCTGGCTTGAGGT 3' Sense 5’ CTTTGACATTGGCTCCTTTGA 3’ Antisense 5' GTGGCTTGTTCTTCATCTTGG 3' Sense 5'ACTGGCTTTGAACGAGAGGA 3' Antisense 5' GTCGATGCCCTTGAAGAAGA 3' Sense 5’CTGGCTTTGAGGAAGAACGA 3’ Antisense 5' GTTTTGATGCTGACGCCTGA 3' Sense 5'AGGTGACCCCAGATGAGAAA 3' Antisense 5' TCTCGGCAGCATAGAAGACA 3' Sense 5’ CCACACATACTTACCTTTGGA 3’ T2R4 Antisense 5' GAGTAGGTTGTTTTGTGGCAG 3' Sense 5’ CATGACCTCTCACCCAAGGTA 3’ T1R3 Antisense 5' CATAGCAGCAGGAATGAAAGC 3' GAPDH Sense 5' TCCGCCCCTTCCGCTGATG 3' Antisense 5' CACGGAAGGCCATGCCAGTGA 3' GenBank # 460 NM_031096 559 NM_001619 670 NM_012897 841 NM_030829 612 NM_031657 560 AF227142 705 AF456324 350 NM_017008 עי צביעת חתכים " CV בפפילתGRK - קביעת נוכחות קינאזות ממשפחת ה- 2.2.7 (מרקמות לשון )אימונוהיסטוכימיה הכנת חתכים מלשון- 2.2.7.1 - הכולל פרפוזיה דרך חדר, in-vivo fixation ועברו תהליך של2.2.1 חולדות הורדמו כמתואר בסעיף ולאחר מכן, לשטיפת הדם החוצה ומניעת קרישהHank’s מ"ל בופר פזיולוגי50 - הזרמת כ,הלב השמאלי - ו0.1 M ( אשר הומס בבופר פוספט בריכוז שלw/v) 3% paraformaldehyde מ"ל של תמיסת40 -כ שעות16 הלשון הוצאה והודגרה למשך, לאחר הפרפוזיה.(77) לקיבוע כללי של גופת החיה,pH 7.4 במטרה למנוע נזקי קור בהמשך,4°C - ב0.1 M ( בבופר פוספט בריכוז שלw/v) 20% בתמיסת סוכרוז בתוך-70°C - לאחר מכן לשון החולדה הוקפאה ב.הטיפול ולשמור על רקמות הלשון גם בתנאי הקפאה (Optimal Cutting OCT הלשונות הקפואות נעטפו בחומר.איזופנטן עד להמשך הטיפול 38 ) Temperatureונחתכו באזור פפילת CVבמכשיר קריוסטט לחתכים בעובי של .10 μmהחתכים הונחו על זכוכיות נושאות מסוג ,(Menzel-Glazer, Germany) SuperFrost Plusכאשר חתכים עוקבים הונחו על זכוכיות שונות על מנת שחתכי הביקורת וגם אלו שעברו טיפול ייצגו את אותו אזור של הפפילה. החתכים יובשו באוויר במשך 30דקות והוקפאו ב -20°C -עד להמשך הטיפול. - 2.2.7.2צביעת חתכי פפילת CVבעזרת נוגדנים החתכים שהתקבלו כמתואר בסעיף הקודם הודגרו למשך שעה אחת עם תמיסת Blockingאשר הכילה (v/v) 10% goat serumו (v/v) 0.3% Triton X-100 -בתוך בופר פוספט בריכוז של pH 0.1 M 7.3בטמפרטורת החדר ,כדי למנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדן .לאחר מכן ,הודגרו החתכים עם נוגדן ראשוני ספציפי כנגד GRK5 ,GRK3 ,GRK2או GRK6למשך 24שעות בתא סגור ולח ב .4°C -כל הנוגדנים נמהלו ביחס 1:100ב .PBS X1 -לבדיקת ספציפיות הצביעה ,חתכים נוספים נחשפו לנוגדן הראשוני ביחד עם החלבון החוסם הייחודי לו ) .(25 µg/mlלאחר תגובה עם נוגדנים ראשוניים הזכוכיות הנושאות נשטפו 3פעמים עם PBS X1ונחשפו לשעה אחת נוספת בטמפרטורת החדר לנוגדן שניוני הקשור למולקולה פלואורסצנטית ,(FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)) FITCמהול 1:200ב .PBS X1 -החתכים נשטפו שוב 3פעמים עם , PBS X1וטיפה מתמיסת mountingטופטפה על החתכים אשר כוסו בזכוכית מכסה .נוכחות פלואורסצנציה נבדקה במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי. התמונות נשמרו בפורמאט TIFFועובדו בעזרת התוכנות Image-Pro Plus Media Cybernatics ו.Adobe Photoshop - - 2.2.7.3בדיקת ספציפיות של נוגדנים בשיטת Western blot מוחות של חולדות שימשו כמקור ל GRKs -השונים .המוחות הומגנו בבופר RIPAוסורכזו ב20,000g - למשך 15דקות ב 4oC -בצנטריפוגת אפנדורף .הנוזל העליון אשר התקבל מהסרכוז הורתח עם sample bufferב 95 oC -למשך 5-10דקות .עשרה מיקרוליטרים מן הנוזל העליון נלקחו לפני הרתחה ושימשו לקביעת כמות חלבון כמתואר בסעיף .2.2.3עשרים מיקרוגרם חלבונים מן המיצוי הוטענו בכל באר של ג'ל -SDSאקרילאמיד ,12%ולאחר ההרצה הועברו לממברנת ניטרוצלולוז .הממברנות הודגרו עם תמיסת blockingאשר הכילה 2% (w/v) BSAמומס בבופר TBSTבמשך שעה ובהמשך הודגרו למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר עם הנוגדן ראשוני כנגד ) GRK2מיהול GRK5 ,(1:5000או ) GRK6מיהול (1:1000בהיעדר או בנוכחות ) blocking peptide (1µg/mlיחודי לנוגדן הנבדק .הממברנות נשטפו שלוש פעמים 20 ,דקות כל פעם ,בבופר TBSTנקי והודגרו שעה בטמפרטורת החדר עם הנוגדן השניוני ) .Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+Lלאחר שלוש שטיפות נוספות של 20דקות כל אחת ,הממברנות נחשפו לתמיסת ECLבמשך 2דקות והוצמדו בחדר חושך לפילם Fuji, ) X-ray .(Japan 39 - 2.2.8קביעת חדירת טעמנים אמפיפטיים בתאי HeLa - 2.2.8.1החזקת תאים תאי HeLaגודלו במצע (DMEM) Dulbecco's Modified Eagle's Mediumבתוספת 10% Fetal ) ,2 mM glutamine ,Bovine Serum (FBSושתי אנטיביוטיקות 100 U/ml penicillinו100 - - µg/ml streptomycinאשר ייקרא להלן .10% DMEMהתאים פוצלו כל 3ימים )או לאחר שהגיעו לצפיפות של (90%ע"י שטיפה עם PBS X1סטרילי ,הוספת טריפסין )אנזים אשר מנתק את התאים מצלחת הגידול( והעברת התאים לצלחות חדשות לצפיפות הרצויה .התאים הוחזקו באינקובטור בתנאים של 37 °Cו.5% CO2 - – 2.2.8.2הכנת תמיסות סטוק של הטעמנים וקביעת חדירתם לתאי HeLa התאים פוצלו לצלחות בקוטר 60 mmבצפיפות של 50-60%וגודלו ל 24-48 -שעות נוספות16-18 . שעות לפני הניסוי ,הוחלף המצע למצע "הרעבה" אשר הכיל 0.1% FBSבלבד – ייקרא להלן 0.1% .DMEM חשיפת התאים לטעמנים השונים נעשתה ע"י הוספת תמיסה מרוכזת )סטוק( של כל טעמן ישירות אל מצע התאים .הטעמנים סכרין D-TRP ,וקפאין הומסו במדיום DMEMנקי ,בריכוז הגבוה פי 10 מהריכוז הסופי לו נחשפו התאים .הטעמן NHDהומס אף הוא ב ,DMEM -אך בריכוז גבוה פי 2 מהריכוז הסופי .הטעמנים כינין ונרינגין הומסו קודם באתנול ו DMSO -בהתאמה ,ורק לאחר מכן ב- .DMEMריכוזי הסטוקים חושבו כך שהתאים לא נחשפו לאחוזי ממס )אתנול או (DMSOהעולים על .0.1%כל הסטוקים הובאו ל pH 7-7.5 -לפני הוספתם לתאים. התאים הודגרו עם הטעמנים השונים באינקובטור למשך 10דקות )חוץ מכינין – 3דקות( .בתום זמן זה, התאים נשטפו 5פעמים עם PBS X1קר 250 µl ,של מים הוספו לכל צלחת והתאים נקצרו והועברו למבחנה קרה .התאים פוצצו ע"י סידרה של שלוש הקפאות והפשרות ב -20°C -וממברנות התאים הושקעו ע"י סרכוז בצנטריפוגת אפנדורף ב 20,000g -בטמפרטורה של 4°Cלמשך 30דקות .הנוזל העליון שהכיל את תוכן התאים הופרד ,הוקפא ,יובש בהקפאה ונשמר בטמפרטורה של -20°Cעד לקביעה כמותית ב ,HPLC -כמתואר בסעיף .2.2.5ריכוז הטעמנים בתאים חושב על פי מספר התאים בכל דוגמא ונפח תאי ה HeLa -שחושב להיות בממוצע ) 0.7 pLמכיוון שלתאי HeLaאין צורה אחידה, נפח התאים חושב עבור מספר "צורות" על בסיס מדידות שנלקחו במיקרוסקופ קונפוקלי(. 40 - 2.2.9מדידת שינויים ברמות cAMP - 2.2.9.1ביטוי מלאכותי )טרנספקציה( של הקולטן ה β2AR -בתאי HeLa תאי HeLaגודלו כמתואר בסעיף .2.2.8.1למטרות טרנספקציה ,התאים פוצלו ביום אשר קדם לה לצפיפות של 60-70%בצלחות בקוטר .100 mmהטרנספקציה בוצעה בעזרת החומר ™MaxFect ) (Molecula Research Labs, USAבעיקר על פי הוראות היצרן .בקצרה ,הפלסמיד עורבב ביחד עם החומר ™ MaxFectביחסים MaxFect 25 µl) 1:2.5עורבבו עם 10 µgפלסמיד עבור צלחת בקוטר (100 mmבתוך 400 µlבופר (Gibco, USA) Opti-MEM® Iוניתנה השהייה של 25דקות בטמפרטורת החדר .תאי ה HeLa -נשטפו פעמיים עם מדיום DMEMנקי ונפח מינימלי של מצע זה ) 5.5-6מ"ל ,מספיק על מנת לכסות את התאים( הוסף לצלחת .בתום ה 25 -דקות השהייה ,הפלסמיד ביחד עם ה MaxFect™ -טופטפו מעל המצע והתאים הוחזרו לאינקובטור ל 5-7 -שעות ,בסופן הוסף מצע המכיל ,20% FBSעל מנת להגיע למצב של .10% DMEMלאחר שמונה עשרה שעות ,המצע הוחלף ל 10% DMEM -חדש או שהתאים פוצלו לצלחות חדשות .התאים "הורעבו" במשך 16-18 שעות לפני כל ניסוי על ידי החלפת מצע התאים ל.0.1% DMEM - - 2.2.9.2הכנת הדוגמאות תאי HeLaעברו טרנספקציה עם פלסמיד pcDNA3המכיל את הקולטן ה-β2 -אדרנרגי )להלן (β2AR כמתואר בסעיף .2.2.9.1שמונה עשרה שעות לאחר סיום הטרנספקציה ,התאים פוצלו לתוך פלטות של 24בארות בצפיפות של כ 60% -וגודלו ל 30-36 -שעות נוספות .שמונה עשרה שעות לפני ביצוע הניסוי הוחלף המצע מ 10% DMEM -ל) 0.1% DMEM -מצע הרעבה( .ביום הניסוי התאים הודגרו למשך 10דקות בנוכחות או בהיעדר טעמן ולאחר מכן עם ) 10 μM isoproterenol (ISOלזמנים שבין 30שניות ל 5 -דקות ,לגירוי הקולטן האדרנרגי .סיום הראקציה והמשך הניסוי בוצעו לפי ):(185 ,56 הוספו 450 μlחומצת ) 5% TCA (v/vקרה לכל באר ,ולאחר 30דקות ב ,4ºC -הנוזלים נאספו לתוך מבחנות זכוכית קרות והוספו TCA 5% 450 μlנוספים לכל באר .לאחר 30דקות הדגרה נוספות, אוחדו הנוזלים מכל דוגמא וסילוק החומצה אשר בתוכם נעשה ע"י שתי הוספות של 4.5 mlשל אתר קר, ערבוב חזק ושאיבת האתר במשאבת וואקום .הדוגמאות הוקפאו ויובשו בליופילייזר תחת וואקום .לאחר הייבוש כל דוגמא הורחפה ב 250-500 μl -בופר סודיום אצטט ,pH 6.2 ,0.05 Mלקביעת רמות .cAMPלשם קביעת חלבון הוספו מייד לאחר הוצאת ה 5% TCA -האחרון 500 μlשל NaOH 0.1 Mלכל באר למשך שעה .בתום זמן זה ,הועברו הדוגמאות למבחנת אפנדורף ,הוקפאו ונשמרו ב-20ºC - עד לקביעת חלבון. 41 - 2.2.9.3קביעת כמות cAMPבשיטת ה(RIA) radioimmunoassay - כל שלבי הניסוי בוצעו בקרח לפי ) .(185 ,56ראשית הדוגמאות המומסות בבופר סודיום אצטט עברו אצטילציה ע"י הוספת 20 μlשל ,triethylamineערבוב בעזרת וורטקס והוספה מידית של 10 μlשל .acetic anhydrideתהליך האצטילציה נועד להגדיל את הרגישות של שיטת ה RIA -מאחר והאפיניות של acetyl-cAMPלנוגדן הינה פי 20גבוהה יותר בהשוואה ל cAMP -עצמו .קביעת cAMPנעשתה במבחנות פוליסטירן שהכילו 50 μlשל הדוגמא הנבדקת ו 50 μl -של נוגדן כנגד cAMPהמומס ב- .(w/v) 0.1% BSAלאחר ערבוב ,המבחנות הועברו להשהיה בקור למשך 4שעות ובתום זמן זה הוספו 200 μlשל תמיסת [125I]-cAMPאשר נמהלה בעזרת בופר אצטט בריכוז ,pH 6.2 0.05 Mלקבלת קריאה של .3000-4000 cpmלאחר הדגרה של 18-22שעות בקור ,סיום התגובה בוצע ע"י הוספת 100 μlשל ,10% (w/v) BSAערבוב כפול בוורטקס והשקעת הקומפלקס ע"י הוספת 2מ"ל של אתנול קר .הדוגמאות עורבבו פעמיים בוורטקס וסורכזו למשך 15דקות במהירות של .4,000gבתום הסרכוז הנוזל העליון נשאב במשאבת וואקום והמשקע נמנה במונה גמא .חישוב כמות ה cAMP -נעשה כנגד עקומת כיול של נוקלאוטיד נקי אשר הוכנה באותם תנאים .הערכים בוטאו ביחידות של fmole .cAMP/μg protein - 2.2.9.4קביעת חלבון בשיטת ברדפורד חמישים מיקרוליטרים מן הדוגמה המהולה ב 0.1 M NaOH -הועברו לפלטה בעלת 96בארות להם הוספו 250 μlשל תמיסת ברדפורד .כל באר עורבבה היטב ולאחר 15דקות השהיה בטמפרטורת החדר נמדדה הבליעה במכשיר Bio-Elisaבאורך גל של .595 nmחישוב כמות החלבון נעשה מול עקומת סטנדרט של BSAאשר הוכנה באותם תנאים. - 2.2.10קביעת רמת הזרחון של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי - 2.2.10.1הכנת הדוגמאות תאי HeLaאשר גודלו בצלחות בקוטר 100 mmעברו טרנספקציה עם פלסמיד pcDNA3המכיל את הקולטן ה-β2 -אדרנרגי הקשור לסמן ) HAלהלן ,(β2HAכמתואר בסעיף 48 .2.2.9.1שעות לאחר הטרנספקציה ,התאים הורעבו ע"י החלפת המדיום מ 10% DMEM -ל 0.1% DMEM -למשך שמונה עשרה שעות לפני ביצוע הניסוי. ביום הניסוי ,התאים הודגרו קודם בהיעדר או בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו עם (10 μM) ISOלזמנים שבין 5ל 25 -דקות .בתום הגירוי המדיום נשאב והתאים נשטפו פעמיים עם PBS X1קר על קרח. לאחר השטיפה ,הוספו לתאים 400 μlשל בופר RIPAאשר מכיל בנוסף ,NaF 25 mMהפועל כמעכב .serine phosphatasesהתאים נקצרו והנוזלים הועברו לתוך מבחנות אפנדורף קר .המבחנות סורכזו 42 15דקות ב 15,000g -ב ,4ºC -והנוזל העליון הועבר למבחנת אפנדורף נפרדת אשר הכילה חרוזים הקשורים לנוגדן כנגד הסמן .HA - 2.2.10.2קשירת החרוזים לנוגדן כנגד HA כל הכמויות המפורטות בסעיף זה הותאמו לטיפול ב 6 -צלחות בהן התאים טופלו כמתואר בסעיף .2.2.10.1מאה עשרים מיקרוליטרים של חרוזים מסוג אגרוז אליהם קשור חלבון (proteinG-plus G ) agarose beads, Santa-Cruzנשטפו שלוש פעמים עם PBS X1קר כאשר כל שטיפה הסתיימה בסרכוז של דקה ב 12,000g -ב 4ºC -ושאיבת הנוזל העליון .בסוף הסרכוז האחרון החרוזים הורחפו ב- 500 μlשל PBS X1ו 12 μl -של נוגדן הוספו .לאחר ערבוב בצורה של end-to-endכל הלילה בחדר קור ,החרוזים נשטפו פעמיים ב PBS X1 -קר ,פעם נוספת בבופר ,RIPAולבסוף הורחפו ב300 µl - RIPAוחולקו ל 6-מנות שוות במבחנות אפנדורף קרות. - 2.2.10.3השקעה אימונית ) (immunoprecipitationשל הקולטן הבטא-אדרנרגי הנוזל העליון שהתקבל לאחר סרכוז תמצית התאים )כמתואר בסעיף (2.2.10.1הועבר למבחנת אפנדורף המכילה את החרוזים הקשורים לנוגדן כנגד ) HAכמתואר בסעף .(2.2.10.2המבחנות עורבבו בצורה של end-to-endלמשך שעתיים בקור .בסוף זמן זה ,החרוזים הושקעו ע"י סרכוז למשך דקה ב 10,500g -ב- 4ºCונשטפו פעמיים עם תמיסת LiCl 0.5 mMע"י סרכוזים זהים ושאיבת הנוזל העליון במשאבת וואקום .לאחר השאיבה האחרונה הדוגמאות הורחפו ב 50 μl -של sample bufferוהורתחו ב95ºC - למשך 5דקות .הדוגמה כולה הורצה לבסוף בג'ל -SDSאקרילאמיד .10%לאחר סיום ההרצה ,החלבונים הועברו לממברנת ניטרוצלולוז ע"י אלקטרוטרנספר .לאחר קיבוע הממברנה בעזרת 2% (w/v) BSA מהול ב ,TBST -זוהתה נוכחות הקולטן ה β2HA -ע"י שימוש בנוגדן המכוון כנגד הפפטיד ,HAמהול 1:1000ב .TBST -לעומת זאת ,נוכחות של קולטן מזורחן נבדקה ע"י שימוש בנוגדן ראשוני יחודי ,בשם ,anti-phosphoSer(355-356) β2-adrenergic receptorהמכוון כנגד שתי חומצות אמינו סרין המזורחנות ספציפית ע"י .GRK2/5הממברנות טולטלו עם נוגדן ראשוני זה ,מהול 1:600ב,TBST - למשך 18שעות בחדר קור .לאחר שלוש שטיפות של 20דקות כל אחת עם בופר ,TBSTהממברנה הודגרה שעה בטמפרטורת החדר עם נוגדן שניוני Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG ) (H+Lאשר נמהל 1:10,000ב .TBST -לאחר שלוש שטיפות נוספות של 20דקות כל אחת ,הממברנות נחשפו לתמיסת ECLבמשך 2דקות והוצמדו בחדר חושך לפילם .X-rayעוצמת הכתמים היחסית בכל טיפול נקבעה ע"י שימוש בתוכנת .ImageJ 43 - 2.2.11מדידת אינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי לאחר גירוי תאי HeLaאשר עברו טרנספקציה לביטוי הקולטן ה) β2AR -סעיף (2.2.9.1פוצלו 24שעות לאחר הטרנספקציה לתוך פלטות של 12בארות שבתוכן הוכנסו זכוכיות מכסות בקוטר 18מ"מ .לאחר 30-36 שעות נוספות התאים הורעבו ע"י החלפת המצע מ 10% DMEM -ל 0.1% DMEM -ל 18 -שעות נוספות .ביום הניסוי ,התאים עברו פראינקובציה בנוכחות או היעדר טעמן למשך 10דקות ולאחר מכן גירוי הקולטן האדרנרגי ע"י .(10 μM) ISOבתום הגירוי התאים נשטפו פעמיים עם PBS X1וקובעו ע"י 3% (w/v) PFAלמשך 20דקות .ה PFA -נשטף 3פעמים עם PBS X1והתאים הודגרו עם תמיסת blockingאשר הכילה 3% (w/v) BSAו 0.3% (v/v) Triton X-100 -המומסים בבופר פוספט בריכוז pH 7.3 0.1 Mלמשך 1-2שעות בטמפרטורת החדר. הנוגדן הראשוני כנגד הקולטן הבטא-אדרנרגי הומס בתמיסת ה blocking -והדגרה עם הזכוכיות הנושאות נעשתה ל 18 -שעות בקור בתא לח .לאחר מכן התאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS X1 והודגרו עם נוגדן שניוני הקשור לסמן הפלואורסצנטי FITCלעוד שעה בטמפרטורת החדר .לבסוף התאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS X1והועברו לזכוכית נושא עליה טופטפה טיפה של תמיסת .mounting הפלואורסצנציה נמדדה במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי ) (BioRadבעזרת עדשה ×60המצריכה שמן מינרלי ,ותמונות נלקחו בעזרת תוכנת ) .LaserSharp 2000 software (BioRadעיבוד התמונות נעשה בעזרת תוכנת .(Adobe) Photoshop 7.0 להשוואת מידת האינטרנליזציה של הקולטן הבטא-אדרנרגי בהיעדר מול נוכחות טעמן אמפיפטי נעשתה ספירה של מספר התאים בהם הקולטן נראה על הממברנה הפלסמטית מול מספר התאים בהם הקולטן נראה אך ורק בווסיקולות תוך תאיות. - 2.2.12מידור )פרקציונציה( של התא שיטת מידור התאים התבססה לרוב על ) .(37לאחר טרנספקציה של הקולטן ה β2HA -בתאי HeLa )סעיף ,(2.2.9.1התאים גודלו בצלחות בקוטר 60 mmל 48 -שעות נוספות בסופן הורעבו ב0.1% - DMEMלמשך 16-18שעות .ביום הניסוי ,התאים הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן במשך 10דקות )חוץ מכינין 3 ,דקות( והקולטן גורה עם (10 µM) ISOלזמנים שונים ) 15 ,10 ,5 ,0ו 20 -דקות(. בתום זמן הגירוי ,התאים נשטפו עם PBS X1קר פעמיים ,לאחר מכן עם בופר Aקר פעם אחת ,ולבסוף 150 µlשל בופר Hאשר הכיל סוכרוז בריכוז של 0.25 Mהוספו לכל צלחת .התאים נקצרו ביחד עם הבופר ,וכל דוגמא )צלחת( הועברה למבחנת סרכוז קרה נפרדת וסורכזה בשלושה שלבים :סרכוז ראשון ב 3,000g -למשך 10דקות ב ;4 °C -המשקע אשר הכיל את גרעיני התאים הושלך והנוזל העליון הועבר למבחנת סרכוז קרה חדשה וסורכז ב 10,000g -למשך 10דקות ב ; 4 °C -המשקע החדש אשר הכיל אורגנלות גדולות )גולג'י (...ER ,הושלך והנוזל העליון הועבר למבחנת סרכוז עבות (Beckman, 44 ) Germanyוסורכז בצנטריפוגת Ultraבמהירות של 100,000gלמשך 45דקות ב .4 °C -הנוזל העליון מכל דוגמא ,אשר הכיל את התוכן הציטוזולי ,הועבר למבחנה חדשה ולאחר הוספת sample bufferהורתח ב 95 °C -ל 5 -דקות .המשקע מכל דוגמא ,אשר הכיל את הממברנה הפלסמטית ,הומס ב 120 µl -בופר RIPAולאחר הוספת sample bufferהורתח אף הוא ב 95 °C -ל 5 -דקות60 µl . מכל דוגמה הורצו בג'ל -SDSאקרילאמיד ) 12% (v/vוהחלבונים הועברו לממברנת ניטרוצלולוז באלקטרוטרנספר .לאחר קיבוע עם ,2% (w/v) BSAהממברנה הודגרה עם נוגדן כנגד HAבמיהול 1:1000למשך 16-18שעות ב 4 °C -ולאחר מכן עם נוגדן שניוני קשור ל HRP -במשך שעה בטמפרטורת החדר .הממברנות נחשפו לתמיסת ECLוהוצמדו בחדר חושך לפילם .X-ray - 2.2.13קביעת שפעול של ERK לאחר טרנספקציה של הקולטן ה β2AR -בתאי ) HeLaסעיף ,(2.2.9.1התאים גודלו ל 48 -שעות נוספות בסופן הורעבו ב 0.1% DMEM -למשך 16-18שעות .ביום הניסוי ,התאים הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן במשך 10דקות )חוץ מכינין 3 ,דקות( והקולטן גורה עם (10 µM) ISOלזמנים שונים ) 20 ,10 ,5 ,2 ,0או 30דקות( .בתום זמן הגירוי ,התאים נשטפו עם PBS X1קר פעמיים ונקצרו על קרח בנוכחות בופר .RIPAהתאים ביחד עם הבופר הועברו למבחנות סרכוז קרות וסורכזו בצנטריפוגת אפנדורף במהירות 17,000gלמשך 15דקות ב .4 °C -הנוזל העליון הועבר למבחנה חדשה ,ולאחר הוצאת דגימה לצורכי קביעת חלבון ,הוסף sample bufferוהדוגמה הורתחה ב 95 °C -ל 5 -דקות25 . µgמכל דוגמה הורצו בג'ל -SDSאקרילאמיד ) 12% (v/vולאחר מכן החלבונים הועברו לממברנת ניטרוצלולוז באלקטרוטרנספר .לאחר קיבוע עם ,2% (w/v) BSAזיהוי חלבון ה ERK -וזיהוי ה- ERKהמזורחן נעשו ע"י שימוש בשני נוגדנים שונים :זיהוי הכמות הכללית של ERKבכל דוגמה נעשה ע"י נוגדן אשר מזהה את הקצה ה C -טרמינלי של (gERK) ERKונמהל 1:40,000ב .TBST -לעומת זאת זיהוי ה ERK -המזורחן נעשה ע"י נוגדן מכוון כנגד אתרי טירוזין מזורחנים ב,(pERK) ERK - ונמהל 1:30,000ב .(154) TBST -ממברנות הניטרוצלולוז נחשפו למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחד מן הנוגדנים האלו ,ולאחר שלוש שטיפות של 20דקות כל אחת ,נחשפו לנוגדן שניוני הקשור ל- HRPבמשך שעה בטמפרטורת החדר .לאחר שלוש שטיפות נוספות ,הממברנות נחשפו לתמיסת ECL והוצמדו בחדר חושך לפילם .X-rayעוצמת הכתמים היחסית בכל טיפול חושבה ע"י שימוש בתוכנת .ImageJ - 2.2.14ניתוח סטטיסטי של התוצאות ניתוח סטטיסטי של התוצאות וקביעת מובהקות סטטיסטית בין הטיפולים השונים בכל ניסויי המחקר נעשו בעזרת תוכנת (SAS Institute, Cary, NC) JMP statistical softwareע"י שימוש במבחן Student's t-testזוגי דו -כיווני. 45 .3תוצאות - 3.1חדירת טעמנים אמפיפטיים לפפילות CVשלמות - 3.1.1מעקב אחר חדירת הטעמנים במיקרוסקופ קונפוקלי לאחר הוצאתה של פפילת ה CV -בצורה שלמה מתוך הלשון ,הפפילה הונחה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כך שבתמונות אשר צולמו כפי שנראה באיור 3.1מתגלה הצד הדורסלי שלה .החיצים באיור מציינים את מיקומה של התעלה הפנימית של הפפילה ) (inner trenchשם ממוקמות רוב פקיעיות הטעם .בתנאי הניסוי הנוכחיים ,הצד האפיקלי בלבד של תאי פקיעיות הטעם נחשף לסביבה )במקרה זה לטעמנים הפלואורסצנטים( בדומה לתנאים פיזיולוגיים .ניתן לראות באיור 3.1שלאחר חשיפה של פפילות הCV - לטעמנים אמפיפטיים שונים ,סכרין ) ,(SACCהפפטיד המר ) (CLTוקפאין ) ,(CAFFמבחינים בהופעתה של פלואורסצנציה בעיקר באזור התעלה ,ובהתעצמותה עם הזמן .פלואורסצנציה נראתה לעין כבר לאחר דקה של חשיפה ,אך זמני חשיפה מ 0 -עד 6דקות נבחרו על מנת להראות את התגברותה של רמת הפלואורסצנציה עם הזמן .תוצאות אלו מעידות לכאורה על חדירה והצטברות של אותם הטעמנים לתוך פקיעיות הטעם עצמן .על מנת להוכיח שאכן העלייה ברמת הפלואורסצנציה נבעה מחדירת הטעמנים לתוך תאי הפקיעיות ולשלול ספיחה חיצונית לאפיתל הלשון ,נעשו שני ניסויים נוספים .ראשית ,נעשה שימוש במלח אשלגן יודיד ) (KIאשר פועל כמדעיך פלואורסצנציה :משמעות הדבר שחומר זה גורם לדעיכה של כל מולקולה פלואורסצנטית אשר יפגוש KI .איננו חודר ממברנות שלמות של תאים ולכן צפוי לגרום לדעיכה של כל מולקולה פלואורסצנטית אשר נמצאת מחוץ לתאי הפפילה .ניתן לראות באיור 3.1שהוספת KIלפפילת ה CV -לאחר 6דקות חשיפה לטעמנים לא גרמה לירידה בעוצמת הפלואורסצנציה שהתקבלה .תוצאות אלו מעידות על חדירה עמוקה של הטעמנים האמפיפטיים לתוך ציטוזול תאי פקיעיות הטעם או לכל הפחות לצד הפנימי של הממברנה הפלסמטית ,שם אין ל KI -גישה. כביקורת נוספת ,נעשה ניסוי דומה כאשר הפעם פפילת ה CV -נחשפה לפרופידיום יודיד ) ,(PIחומר אשר משמש בניסויים ביולוגיים רבים כמולקולה פלואורסצנטית החודרת ממברנות מפורקות של תאים מתים .מכיוון שתאי הפפילה נשארים חיים במהלך ניסוי זה PI ,אינו צפוי לחדור לתוכם .באיור ,ניתן לראות שכתוצאה מחשיפת פפילת ה CV -ל PI -התגלתה הופעה של פלואורסצנציה אשר התגברה במידה מסוימת עם זמן החשיפה ,אך הוספת KIגרמה לדעיכה כמעט מוחלטת שלה .תוצאה זו מעידה על כך שמולקולות ה ,PI -בניגוד לטעמנים האמפיפטיים ,לא חדרו לתוך תאי הפפילה אך נספחו חיצונית אל האפיתל ,ולכן חשיפתן ל KI -גרמה במקרה זה לדעיכת הפלואורסצנציה שלהן. 46 איור – 3.1הסתכלות במיקרוסקופ קונפוקלי על הצטברותם של טעמנים אמפיפטיים פלואורסצנטיים בתעלה הפנימית של פפילת .CV פפילות CVשלמות הונחו מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי ונחשפו לטעמנים אמפיפטיים פלואורסצנטיים .תמונות של הצד הדורסלי של הפפילה מאפשרות לעקוב אחר הופעת פלואורסצנציה בתעלה הפנימית )מצויינת ע"י חיצים( בה ממוקמות רוב פקיעיות הטעם של הפפילה .התמונות נלקחו לאחר חשיפת הפפילות לתמיסות של 10 mMסכרין ) 10 mM ,(CLT) cyclo(Leu-Trp) 1 mM ,(SACCקפאין ) (CAFFאו בהיעדר טעמן במקרה של הביקורת ) .(CONבזמן 0תמיסת הטעמנים טופטפה על הפפילה ורמת הפלואורסצנציה נמדדה כל דקה )כאן הזמנים 2 ,0ו- 6דקות מוצגים( .המלח ,(500 mM) KIצורף לתמיסה לאחר 6דקות ותמונות נלקחו 2דקות לאחר מכן .ניתן לראות שהוספת KIלא השפיעה על רמת הפלואורסצנציה שהתקבלה לאחר חשיפתה של הפפילה לטעמנים השונים .פרופידיום יודיד ) ,(50 µg/ml) (PIשימש כביקורת חיובית לניסוי .כל תמונה מייצגת חזרה מתוך 4 חזרות שנעשו לאותו ניסוי .ה scale bar -הינו של 100 µmורוחב הפפילה נמצא קרוב ל) 0.6 mm -נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו(. - 3.1.2חדירת טעמנים אמפיפטיים במודל של חיות על מנת לבחון את יכולתם של הטעמנים האמפיפטיים לחדור לתוך פפילות טעם בתנאי ,in-vivoנעשה ניסוי בו טופטפו לסירוגין תמיסות טעמנים שונות לפיהן של חולדות מורדמות במשך 90שניות ,ולאחר ניתוח להוצאת פפילת ה CV -מתוך אפיתל הלשון ,נבחנו נוכחות וכמות הטעמנים בציטוזול התאים בשיטת .HPLCעל מנת לאמוד את הריכוז התוך תאי של הטעמנים השונים בתוך תאי פקיעיות הטעם, 47 נעשה בנוסף חישוב בו נלקחה בחשבון בריחתם של הטעמנים החוצה מן הפפילה במשך 25הדקות של טיפול הקולגנאז להוצאת הפפילה מתוך אפיתל הלשון ,כמתואר בסעיף .2.2.4כפי שרואים בטבלה ,3.1 השטף של הטעמנים השונים החוצה נאמד בין 64%ל .86% -ניתן לראות שהריכוז התוך תאי הסופי של הטעמנים הגיע לרמות גבוהות של מילימולרים ) (mMואף נראתה תופעה של הצטברות כנגד מפל הריכוזים עבור כינין וקפאין ,תופעה אשר תוארה גם בתאי טעם מבודדים ).(132 טבלה מס' - 3.1חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתוך פקיעיות טעם של פפילת CV שלמה. Intracellular conc. (mM) after 90 s of oral stimulation Efflux (%) during 25 min of collagenase treatment Extracellular conc. (mM) during 90 s of oral stimulation 6.4** ± 1.0 86* ± 9.5 30 D-Tryptophan 5.5** ± 0.8 75* ± 5.6 2 Quinine 0.96** ± 0.1 64* ± 3.0 2 )Cyclo(Leu-trp 13.7* ± 3.6 70* ± 2.5 10 Caffeine Tastant תמיסת הטעמנים בריכוזים המצויינים טופטפה לתוך פיהן של חולדות מורדמות במשך 90שניות ,שבסופן החיות הוקרבו .תוכן התאים הופרד והורץ ב) HPLC -כמתואר סעיף (2.2.5במטרה לזהות נוכחות טעמנים אלה ולקבוע את ריכוזם התוך תאי .דליפת הטעמנים החוצה מן התאים שהתרחשה במשך הוצאת הפפילה מן הלשון שימשה כפקטור תיקון לחישוב הריכוז התוך תאי הסופי .הערכים הינם ממוצע ±שגיאת תקן של 4-9חזרות * .ו** - מציינות ערכים מובהקים סטטיסטית ) p<0.03ו ,p<0.001 -בהתאמה( )נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו(. - 3.2נוכחות ודפוס התבטאות של קינאזות ממשפחת הGRKs - בפפילת CVבחולדות -3.2.1ביטוי GRKsשונים בפפילת ה CV -בשיטת הRT-PCR - לאחר בידוד רקמת פפילת ה CV -משאר הרקמות הלא סנסוריות העוטפות אותה )כמתואר בסעיף ,(2.2.2נבחן ביטוין של הקינאזות GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,GRK1ו GRK6 -בשיטת .RT-PCR GRK4אשר מתבטא בעיקר באשכים ו GRK7 -אשר משתייך למערכת הראייה אך איננו מתבטא בחולדות ,לא נבדקו .התוצאות המסוכמות באיור 3.2מראות שתוצרים בגודל המצופה התקבלו עבור GRK5 ,GRK3 ,GRK2ו GRK6 -ברקמת הפפילה ) ,(CVאך גם באפיתל לא סנסורי )GRK1 .(EP אשר מתבטא גם הוא באופן ספציפי ב rod segments -שבמערכת הראייה לא התבטא באף אחת מהרקמות .הקולטן המר T2R4והקולטן המתוק T1R3נמצאו כצפוי רק ברקמת הפפילה ,דבר אשר מוכיח את הצלחת בידודה של רקמת הפפילה מן האפיתל הלא סנסורי הסובב אותו ,GAPDH .חלבון המתבטא באופן אחיד ותמידי בכל הרקמות ,שימש ביקורת חיובית .היעדר תוצר ריאקציה בביקורת השלילית ) ,(CONשלא עברה את שלב ה ,reverse transcription -שולל את האפשרות של זיהום 48 דנ"א גנומי במערכת .כל התוצרים של ריאקצית ה RT-PCR -הובאו ל sequencing -לזיהוי וודאי של התוצרים. איור - 3.2זיהוי ביטוין של קינאזות ממשפחת ה GRKs -בפפילת ה CV -ובאפיתל הלא-סנסורי בלשון בשיטת ה.RT-PCR - cDNAסונתז מרקמת פפילת CVומאפיתל לא-סנסורי מן הלשון ) (EPוביטוי הגנים השונים נבחן ע"י שימוש בפריימרים יחודיים GAPDH .שימש כביקורת חיובית .כביקורת שלילית ) (CONשימשה דוגמא שעברה PCR ללא שלב ה .RT -תוצרי ה RT-PCR -הורצו בג'ל אגרוז )כמתואר בסעיף .(2.2.6.3גודלם הצפוי של התוצרים היו 460 bpעבור 559 bp ,GRK1עבור 670 bp ,GRK2עבור 841 bp ,GRK3עבור 612 bp ,GRK5 עבור 560 bp ,GRK6עבור 705 bp ,T2R4עבור T1R3ו 350 bp -עבור .GAPDHמעקובת הבסיסים של כל התוצרים נקבעה על מנת לוודא את זהותם. – 3.2.2קביעת מיקומם של ה GRKs -השונים בשיטת immunostaining על מנת לבחון את מיקום התבטאותם של ה GRKs -השונים בתוך הפפילה ,משמע בתאי פקיעיות הטעם עצמם או בתאי האפיתל שבה ,לשון של חולדה נחתכה לרוחב באזור פפילת ה CV -בעזרת מכשיר קריוסטט ,והחתכים בעובי של 10 µmהודגרו עם נוגדנים ספציפיים כנגד כל אחד מה.GRKs - באיור 3.3Aניתן לראות בבירור בחתכים את פקיעיות הטעם בעלות צורת אגס )מודגשות ע"י חיצים(. ניתן לראות שלאחר הדגרה של החתכים עם נוגדנים כנגד GRK5 ,GRK2או ,GRK6התקבלה צביעה חזקה של החתכים ,כאשר GRK2נראה גם בתוך פקיעיות הטעם אך גם בתאי האפיתל הלא סנסוריים העוטפים אותן GRK5 ,נראה בעיקר בפקיעיות הטעם עצמן ו GRK6 -נראה בעיקר באפיתל הלא סנסורי .נוגדן כנגד GRK3גרם לצביעה חלשה במיוחד ולכן התוצאות אינן מופיעות כאן .צביעת החתכים נמנעה כמעט לחלוטין בנוכחות החלבון החוסם ) ,(25 µg/mlדבר אשר מעיד על הספציפיות של הנוגדנים והצביעה. במטרה לבחון בדרך נוספת את הספציפיות של כל אחד מהנוגדנים אשר שימשו בניסוי זה ,מיצוי של מוח חולדה הורץ בג'ל אקרילאמיד ,החלבונים הועברו לממברנת ניטוצלולוז וכל פס הודגר עם נוגדן אחר, בהיעדר או בנוכחות חלבון חוסם .כפי שנראה באיור ,3.2Bהתקבלו פסים יחידים וספציפיים בעלי משקל מולקולרי צפוי ) GRK2בעל משקל של ∼ 80 kDaו GRK5 -ו GRK6 -בעלי משקל של ∼ .(65 kDa 49 בנוסף ,קשירתם של הנוגדנים השונים נחסמה לחלוטין )במקרה של GRK2רק נחלשה( בנוכחות החלבון החוסם הספציפי ).(1 µg/ml A B איור – 3.3מיקום התבטאות של ה GRKs -בפפילת ה CV -בחולדה. ) (Aצביעת חתכים של פפילת CVע"י נוגדנים ספציפיים כנגד GRK5 ,GRK2ו .GRK6 -חתכים של פפילת CVבעובי של 10 µmהודגרו בבופר בהיעדר ) (CONאו בנוכחות נוגדן ספציפי ) (Abהמכוון כנגד כל אחד מן ה .GRKs -מיקומן של פקיעיות הטעם מצויין ע"י חיצים לבנים .קשירתם של הנוגדנים נבחנה גם בנוכחות חלבון חוסם ) (BP - binding proteinיחודי לכל נוגדן Bar scale .של .20 µm ) (Bספציפיותם של הנוגדנים השונים נבחנה ע"י הרצת מיצוי ממוח חולדה ב ,SDS-PAGE -העברת החלבונים לממברנת ניטרוצלולוז )כמתואר בסעיף (2.2.7.3והגבה עם אותם הנוגדנים אשר שימשו ב ,(A) -בהיעדר ) (-או בנוכחות ) (+חלבון חוסם) .נעשה בשיתוף עם מר אלכסנדר אלילויקו(. 50 -3.3חקר השפעת הטעמנים על מנגנון הדסנסיטיזציה של קולטני GPCRsבעזרת מודל בתאי HeLa -3.3.1חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתאי HeLa ישנן עדויות בספרות על יכולתם של טעמנים אמפיפטיים לחדור לתוך ציטוזול של תאי טעם מבודדים ותאי מלנוציטים בתרבית ) .(185 ,132לאחר בדיקת מספר שורות תאים בתרבית ),HEK293 ,HeLa ,(HCT/116נמצא ששלושת הטעמנים המתוקים )סכרין D-TRP ,ו (NHD -ושלושת הטעמנים המרים )קפאין ,נרינגין וכינין( ,אמפיפטיים כולם ,חדרו לציטוזול התאים במידה הרבה ביותר בתאי .HeLa ריכוזי הטעמנים להם נחשפו התאים תאמו ריכוזים המצויים במזון ) .(172 ,158 ,129 ,27 ,7זמני החשיפה היו לרוב 10דקות חוץ מאשר לכינין ,עבורו זמן החשיפה קוצר ל 3 -דקות על מנת שלא לפגוע בחיות התאים .ניתן לראות בטבלה 3.2שלאחר החשיפה התקבלו עבור כל הטעמנים ריכוזים תוך תאיים גבוהים מאוד ,אשר הגיעו במקרה של קפאין ,סכרין ו D-TRP -לרמות של עשרות מילימולרים .שוב נראתה כאן תופעה של הצטברות כנגד מפל הריכוזים ,בדומה למה שנצפה בניסויי ה) in vivo -סעיף ,(3.1.2תופעה אשר תוארה בתאי טעם מבודדים אך גם בסוגי תאים נוספים. טבלה – 3.2חדירת טעמנים אמפיפטיים מרים ומתוקים לתוך תאי .HeLa תאי HeLaהודגרו עם כל אחד מחמשת הטעמנים הראשונים במשך 10דקות או במשך 3דקות עם הטעמן המר כינין )כמתואר בסעיף .(2.2.8.2בסוף החשיפה ,התאים נשטפו 3פעמים ,נקצרו ופוצצו במטרה לבודד את התוכן התוך-תאי .נוכחות וריכוז הטעמנים בציטוזול נקבעו בעזרת מכשיר .HPLCהתוצאות מייצגות את הממוצע ± שגיאת התקן של 3חזרות של ניסוי אשר בוצע פעמיים. -3.3.2השפעת טעמנים אמפיפטיים על היווצרות השליח המשני cAMPלאחר גירוי הקולטן הβ2AR - על מנת להעריך את השפעת הטעמנים חודרי ממברנות על פעילות הקולטן ה ,β2AR -תאי HeLaאשר ביטאו את הקולטן הודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן ,בריכוזים שונים ולזמנים שונים ,ואח"כ גורו ע"י 51 ) ,10 µM isoproterenol (ISOליגנד ספציפי ל ,β2AR -לזמנים שונים .מסלול העברת האותות של הקולטן ה β2AR -כולל הפעלה של חלבון Gמסוג Gsושפעול האנזים אדניליל ציקלאז (Adenylyl ) cyclaseאשר מייצר את השליח המשני .cAMP -3.3.2.1הטעמנים האמפיפטיים גורמים להגברה תלוית ריכוז ביצירת ה cAMP -בתגובה לגירוי עי ISO הקולטן ה" β2AR - מתוך התוצאות )איור ,(3.4Aניתן לראות שגירוי הקולטן ה β2AR -ע"י ISOגורם להיווצרות מהירה מאוד של cAMPשמגיעה לשיא תוך 30שניות ,אחריהן נצפית ירידה הדרגתית ,בעיקר הודות לשפעול הפוספודיאסטראזות ) .(PDEהדגרה מוקדמת של התאים עם טעמנים השונים למשך 10דקות )או 3 דקות עבור כינין( גרמה לעלייה מובהקת סטטיסטית ברמת ה cAMP -כבר לאחר 30שניות של גירוי )עלייה של פי ,1.3-1.8בהתאם לטעמן( .ניתן היה לצפות בהבדלים מובהקים גם לאחר 2דקות של גירוי, ואף לאחר 5דקות בחלק מן המקרים. עקומת ה cAMP -מתנהגת שונה במקרה של קפאין ) ,(CAFFבשל הוספת מעכב הפוספודיאסטראזות IBMXלמערכת .קפאין ידוע ומשמש במחקרים רבים כמעכב פוספודיאסטראזות ,ובשל כך ,מעלה את רמות ה cAMP -בהקשר שונה מזה הנידון במחקר הנוכחי .על מנת לנטרל השפעה זו בניסויים שלנו ולבחון את השפעת הקפאין על פעילות הקולטן עצמו ,הודגרו תאי ה HeLa -עם מעכב פוספודיאסטראזות אחר ,IBMX ,בטרם נחשפו לקפאין וגורו עם .ISOההדגרה המוקדמת עם IBMXגרמה לעלייה משמעותית ברמות ה cAMP -אשר הגיעו לאחר גירוי הקולטן למאות fmole/µg proteinלעומת עשרות בלבד בנוכחות הטעמנים האחרים .ובכל זאת ניתן לראות שבנוכחות קפאין נצפתה עלייה מובהקת ברמת ה cAMP -בהשוואה לביקורת שהכילה IBMXבלבד .יכולתם של הטעמנים להגביר את רמות cAMPלאחר גירוי הקולטן נמצאה גם תלוית ריכוז ,כפי שניתן לראות באיור .3.4B - 3.3.2.2הטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים אנדוגניים (185) Zubare-Samuelov et al.דיווחו בעבר על יכולתם של מספר טעמנים אמפיפטיים כגון נרינגין וסכרין לשמש ליגנדים לקולטנים שונים מסוג ,GPCRובכך להשפיע על רמות cAMPבתא .על מנת לשלול בעבודה זו אפשרות של גירוי קולטנים אנדוגניים ב ,HeLa -ושל הקולטן ה β2AR -בפרט ,ע"י הטעמנים ,נבחנו רמות בסיסיות של cAMPבהיעדר ובנוכחות טעמן בלבד ללא גירוי של הקולטן ה- β2ARעצמו ע"י .ISOהתוצאות באיור 3.5Aמראות שלטעמנים ,NHDסכרין ,D-TRP ,נרינגין וכינין לא הייתה שום השפעה על הרמות הבסיסיות של .cAMPבמקרה של קפאין התקבלה עלייה של כ- ,45%שנגרמה בשל השפעתו על פעילות ה.PDE - 52 A B איור – 3.4טעמנים אמפיפטיים מגבירים את רמות השליח המשני cAMPלאחר גירוי הקולטן ה- עי .ISO " β2AR ) (Aהגברת רמות ה cAMP -ע"י הטעמנים השונים לאחר גירוי הקולטן ע"י ISOהינה תלויה בזמן .תאי HeLa אשר ביטאו את הקולטן ה β2AR -הודגרו בהיעדר )סמנים מלאים( או בנוכחות )סמנים ריקים( כל אחד מחמשת הטעמנים ,לזמנים וריכוזים המצוינים בטבלה .3.2במקרה של קפאין ,התאים הודגרו קודם לכן עם (150 IBMX ) µMלמשך 20דקות לעיכוב פוספודיאסטראזות .בהמשך גורה הקולטן ה β2AR -עם (10 µM) ISOלזמנים שונים של עד 5דקות ,בסופן ה cAMP -התוך תאי מוצה וכומת בשיטת ה .RIA -התוצאות הינן ממוצע ±שגיאת התקן של לפחות 6חזרות מתוך ניסוי אשר בוצע 2-3פעמים. ) (Bהשפעת הטעמנים על רמות cAMPהינה תלוית-ריכוז .תאים נחשפו לריכוזים שונים של הטעמנים לזמנים המצויינים בטבלה 3.2ולאחר מכן ל (10 µM) ISO -במשך דקה .כמות ה cAMP -התוך תאי נקבעה כמתואר ב- ) .(Aגם כאן ,התאים נחשפו ל (150 µM) IBMX -למשך 20דקות לפני שהודגרו עם קפאין .התוצאות מובאות כאחוז יחסי לביקורת המתאימה כאשר הביקורת מהווה ,100%ומייצגת רמות cAMPבהיעדר טעמנים .התוצאות הינן ממוצע ±שגיאת תקן של לפחות 6חזרות של ניסוי אשר בוצע 2-3פעמים * .ו ** -מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית ) p<0.05ו ,p<0.01 -בהתאמה( ברמות ה cAMP -בין הביקורת לטיפול. 53 - 3.3.2.3פראינקובציה של הטעמן עם התאים הינה הכרחית להשפעתו על יצירת cAMPבתגובה לגירוי הקולטן הβ2AR - בהמשך ,נבחנה יכולתם של הטעמנים האמפיפטיים להגביר את רמות ה cAMP -לאחר גירוי הקולטן ה- β2ARע"י ISOכתלות בזמן החשיפה של התאים לאותם הטעמנים .לשם כך התאים הודגרו עם הטעמנים השונים למשך דקה 5 ,דקות ו 10 -דקות ,בטרם גורו עם ISOלמשך דקה .על פי התוצאות המסוכמות באיור ,3.5Bפראינקובציה של לפחות 5דקות עם הטעמנים הייתה הכרחית על מנת לראות את השפעתם על רמות ה cAMP -מאחר ולחלק ניכר מן הטעמנים לא נראתה כלל השפעה לאחר חשיפה של דקה בלבד )חוץ מנרינגין( .בנוסף ,ככל שזמן החשיפה לטעמן היה ארוך יותר כך התעצמה השפעתו. A B איור – 3.5טעמנים אמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים לקולטני ה β2AR -והשפעתם על רמות cAMPלאחר גירוי ה β2AR -תלויה בחדירתם לתא. ) (Aהטעמנים האמפיפטיים אינם פועלים כליגנדים לקולטן ה .β2AR -תאי HeLaאשר מבטאים את הקולטן ה- β2ARהודגרו בהיעדר ) ( או בנוכחות ) ( הטעמנים השונים לזמנים וריכוזים המצויים בטבלה ) 3.2מלבד ,(1.25 mM ,NHDללא גירוי נוסף ע"י .ISOלאחר מיצוי תוכן התאים ,הרמות הבזליות של cAMPנקבעו בשיטת ) RIAכמתואר בסעיף .(2.2.9.3 ) (Bהשפעת הטעמנים על יצירת cAMPלאחר גירוי הקולטן ה β2AR -ב ISO -תלויה במשך ההדגרה המוקדמת של התאים עם הטעמנים .תאים אשר מבטאים את הקולטן ה β2AR -הודגרו בהיעדר )ביקורת( או בנוכחות הטעמנים האמפיפטיים לזמנים שונים ) 5 ,1ו 10 -דקות( .לאחר גירוי הקולטן עם ISOלמשך דקה ,תוכן התאים מוצה וכמות ה cAMP -נקבעה בשיטת .RIAהתוצאות הינן ממוצע ±שגיאת תקן של לפחות 6חזרות בכל טיפול. * ו ** -מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית ) p<0.05ו ,p<0.01 -בהתאמה( ברמות ה cAMP -יחסית לביקורת. 54 - 3.3.2.4השפעת הטעמנים איננה תלויה ב PDE -או ב.PKA - מטרה מרכזית בעבודה זו היא חקר יכולתם של טעמנים חודרי ממברנות להשפיע על מסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן ה .β2AR -מאידך ,ייתכן והשפעת הטעמנים על רמות cAMPנובעת מעיכוב של פוספודיאסטראזות ע"י הטעמנים עצמם ,בדומה לקפאין ,וזאת למרות שבניגוד לקפאין ,הטעמנים ,NHDסכרין ,D-TRP ,נרינגין וכינין לא השפיעו על הרמות הבסיסיות של .cAMPמצד שני ,עיכוב פעילות PDEנצפה בעיקר לאחר גירוי הקולטן והיווצרות ה.cAMP - A B איור – 3.6השפעת הטעמנים על היווצרות cAMPבעקבות גירוי ה β2AR -אינה תלויה בפעילותם של פוספודיאסטראזות ) (PDEאו ב.PKA - ) (Aהשפעת הטעמנים אינה תלויה ב .PDE -רמות ה cAMP -הבזליות ולאחר גירוי הקולטן ע"י ISOנבחנו בהיעדר או בנוכחות מעכב פוספודיאסטראזות (150 µM) IBMXבשילוב עם היעדר או נוכחות טעמן. ) (Bהשפעת הטעמנים אינה תלויה ב .PKA -רמות ה cAMP -לאחר גירוי הקולטן ע"י ISOנבחנו בהיעדר או בנוכחות מעכב ,(20 µM) H89 ,PKAבשילוב או בהיעדר טעמן * .ו ** -מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית ) p<0.05ו ,p<0.01 -בהתאמה( ברמות ה cAMP -יחסית לביקורת המתאימה. 55 במטרה לשלול את האפשרות הזו ,נבחנה השפעתם של הטעמנים בהיעדר ובנוכחות .IBMXתאי HeLa אשר ביטאו את הקולטן ה β2AR -הודגרו עם (150 µM) IBMXלמשך 20דקות בטרם נחשפו למשך 10דקות לטעמן ) 3דקות לכינין( ואחר כך ל ISO -במשך דקה .מן התוצאות )איור (3.6Aניתן לראות שבכל המקרים ,ההגברה ברמות ה) cAMP -לאחר גירוי הקולטן( התקבלה גם בהיעדר וגם בנוכחות .IBMXנוכחותו של מעכב הפוספודיאסטראזות אומנם גרמה לקפיצה משמעותית ברמות ה ,cAMP -אך מידת ההגברה שהתקבלה בעקבות חשיפת התאים לטעמנים האמפיפטיים נשארה דומה לזו שבהיעדר המעכב )פי .(1.5-2 מכיוון שמסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן ה β2AR -מערב קינאזות מסוג GRKsאך גם ,PKAנשאלה השאלה אם לא מסתתר מאחורי השפעת הטעמנים עיכוב של קינאז ה .PKA -על מנת לברר נקודה זו, נבחנה השפעתם של הטעמנים על רמות cAMPבהיעדר ובנוכחות מעכב PKAבשם .H89כצפוי, נוכחות (20 µM) H89גרמה לעלייה ברמות ה cAMP -לאחר גירוי עם ) ISOאיור ,(3.6Bבשל עיכוב מסלול הדסנסיטיזציה של הקולטן ,אשר כולל בין היתר שפעול חלבון Giועיכוב אדניליל ציקלאז ),32 .(123למרות זאת הדגרה של התאים עם הטעמנים השונים גרמה להגברה ברמות ה cAMP -בתגובה לגירוי הקולטן ע"י ,ISOבין אם H89היה נוכח לבין אם לא. "י "י GRK2/5בעקבות גירוי ע - 3.3.3השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה β2AR -ע ISO על מנת לבחון את השערת העבודה לפיה טעמנים אמפיפטיים מעכבים את מסלול הדסנסיטיזציה של קולטני GPCRע"י עיכוב אינטרצלולרי של הקינאזות ממשפחת ה ,GRKs -נעשו ניסויים נוספים בהם נבדקה השפעת הטעמנים על זרחון הקולטן ה GRK2 .β2AR -ו ,GRK5 -שתי הקינאזות העיקריות האחראיות על הדסנסיטיזציה של הקולטן ה ,β2AR -מתבטאות אנדוגנית בתאי .HeLaבניסויים המתוארים להלן נעשה שימוש בקולטן ה β2AR -אשר קשור לסמן ) HAלהלן .(β2HAלאחר גירוי הקולטן ע"י ISOלזמנים שונים בהיעדר או בנוכחות טעמן ,התאים נקצרו בבופר איזוטוני RIPA לשמירה על שלמותם של חלבונים ממברנליים )כגון קולטנים( .לאחר השקעה אימונית של הקולטן ,זיהוי הקולטנים המזורחנים נעשה ע"י שימוש בנוגדן אשר מזהה ספציפית עמדות המזורחנות ע"י GRK2ו- .GRK5באיור ,3.7Aניתן לראות שקולטני ה β2HA -מזורחנים בתנאים רגילים ) (CONבמהירות, כאשר שיא הזרחון נראה בערך לאחר 5-10דקות לאחר תחילת הגירוי .בהמשך נצפית ירידה ברמת הזרחון ,כנראה הודות לשפעול פוספטאזות ,כך שלאחר 20דקות רוב הקולטנים נמצאים בצורה הלא- מזורחנת שלהם .להפתעתנו ,חשיפה של התאים לכל אחד מששת הטעמנים השונים גרמה לא רק לירידה ברמת הזרחון של הקולטן אלא גם לאיחור בהופעתו .זרחון הקולטן נצפה רק לאחר 15דקות בנוכחות ,NHDסכרין ,כינין וקפאין ולאחר 20דקות בנוכחות D-TRPונרינגין. עיבוד התוצאות ע"י תוכנת ImageJלכימות עוצמת הכתמים בכל נקודת זמן )איור (3.7Bמראה בצורה גרפית את השהיית הופעת הזרחון מ 5 -דקות עבור הביקורת ל 10-20 -דקות בנוכחות ששת הטעמנים. 56 איור – 3.7טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הופעתו של זרחון הקולטן ה β2AR -לאחר גירוי עם .ISO ) (Aתאים אשר מבטאים את הקולטן ה β2AR -אשר קשור לחלבון מזהה (β2HA) HAהודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו עם ISOלזמנים שונים )כמתואר בסעיף .(2.2.10.1התאים נקצרו והקולטן ה- β2HAנוקה משאר חלבוני התאים .הדוגמאות הורצו בג'ל -SDSאקרילאמיד ,10%הועברו לממברנת ניטרוצלולוז וזיהוי הקולטנים המזורחנים ) (pβ2ARבוצע ע"י שימוש בנוגדן מכוון כנגד עמדות סרינים המזורחנות על ידי ) ,anti-phosphoSer(355-356) ,GRK2/5מיהול .(1:600זיהוי כמויות כלליות של β2HAנעשה ע"י שימוש בנוגדן מכוון נגד ) HAמיהול .(1:1000 ) (Bכימות עוצמת הכתמים מתוך ) ,(Aבכל נקודת זמן עבור כל טיפול ,נעשה בעזרת תוכנת ImageJומאפשר לדמיין את העיכוב בהופעתו של הזרחון בנוכחות הטעמנים יחסית לביקורת ) .(CONהערכים הינם הממוצע ± שגיאת התקן ביחידות שרירותיות של שלוש חזרות של ).(A 57 - 3.3.4השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן הβ2AR - אם אכן טעמנים אמפיפטיים מעכבים את זרחון הקולטן ע"י עיכוב ,GRKsקיימת סבירות גבוהה שתהליכים ביולוגיים התלויים בזרחון זה יימצאו מעוכבים גם הם .אחד מהם הינו מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן אשר תלוי בקשירת β-arrestinלקולטן המזורחן .במטרה לבחון את השפעת הטעמנים על תהליך האינטרנליזציה נעשתה טרנספקציה של β2ARבתאי ,HeLaולאחר הדגרה של התאים בהיעדר או בנוכחות טעמן ,הקולטן גורה עם ISOלזמנים שונים ,התאים קובעו ומיקומם של הקולטנים )ממברנלי או ציטוזולי( נבדק במיקרוסקופיה קונפוקלית .ניתן לראות )איור (3.8Aשלפני גירוי )זמן ,(0הקולטן ה- β2ARנראה בצורה ברורה וחדה על גבי הממברנה הפלסמטית של התאים. A B "י קפאין איור -3.8מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה β2AR -בעקבות גירוי עם ISOמעוכב ע וסכרין. ) (Aתאים אשר ביטאו את הקולטן ה ,β2AR -הודגרו במשך 10דקות בהיעדר או בנוכחות קפאין ) (5 mMאו סכרין ) (10 mMואז גורו עם ISOלזמנים שונים .התאים צולמו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר קיבוע וצביעת התאים עם נוגדן כנגד הקולטן ה -ה) β2AR -כמתואר בסעיף .(2.3.11התמונות מייצגות את מצבם של רוב התאים אשר נצפו בנקודת הזמן הספציפית. 58 ) (Bתאים אשר ביטאו את הקולטן ה β2AR -נחשפו לשני ריכוזים של קפאין או סכרין בטרם גורו ע"י ISO לזמנים שבין 0ל 15 -דקות .לאחר קיבוע התאים ,מיקומם של הקולטנים )ממברנלי או ציטוזולי( נקבע תחת מיקרוסקופ קונפוקלי .התוצאות מובאות כאחוז התאים אשר הכילו קולטן ממברנלי יחסית לביקורת )זמן (0 שמהווה .100%התוצאות הינן ממוצע ±שגיאת התקן של 3חזרות ,כל אחת של כ 300 -תאים ,מתוך ניסוי אשר נעשה לפחות פעמיים * .ו ** -מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית ) p<0.05ו ,p<0.01 -בהתאמה( באחוז התאים המכילים קולטן ממברנלי יחסית לביקורת המתאימה. לעומת זאת ,כבר לאחר 5דקות מתחילת הגירוי )ביקורת (CON ,ניתן להבחין בהופעתן של נקודות בתוך הציטוזול המייצגות את ה clathrin coated pits -באמצעותן הקולטן עובר אינטרנליזציה .הווזיקולות הציטוזוליות נהיות יותר ויותר משמעותיות במספרן ככל שמתארך הגירוי כך שאחרי 15ו 20 -דקות לא ניתן יותר להבחין בקולטן ממברנלי ברוב התאים ) 70-80%מהתאים נמצאו עם קולטן ציטוזולי בלבד, איור .(3.8Aלעומת זאת בנוכחות קפאין או סכרין ,נצפה אחוז גדול יותר של תאים אשר מכילים קולטן ממברנלי גם לאחר 15ו 20 -דקות. על מנת להעריך זאת נספרו תאים אשר מכילים קולטן ציטוזולי בלבד מול תאים בהם נמצא קולטן ממברנלי ,בעקבות חשיפתם לסכרין ולקפאין ,בריכוזים שונים ולאורך הזמן .ניתן לראות באיור 3.8Bאת הירידה ההדרגתית במספר התאים המכילים קולטן ממברנלי לאורך הזמן בביקורת .בנוכחות כל אחד מן הטעמנים ,נצפה עיכוב בירידה זו ,המתורגם בעלייה באחוז התאים עם קולטן ממברנלי .עלייה זו נמצאה תלוית ריכוז עבור קפאין וסכרין )איור (3.8Bאך גם עבור כל אחד משאר הטעמנים )איור ,(3.9כך שמתקבלים בערך פי 2-2.5תאים עם קולטן ממברנלי אחרי 15דקות גירוי. איור -3.9השפעת הטעמנים על מנגנון האינטרנליזציה של הקולטן ה β2AR -הינה תלוית ריכוז. תאים אשר ביטאו את הקולטן ה β2AR -נחשפו במשך 10דקות לטעמנים NAR ,D-TRP ,SACC ,NHDאו CAFFאו במשך 3דקות ל ,QUIN -בריכוזים שונים טרם גורו ע"י ISOל 15 -דקות .לאחר קיבוע התאים, מיקומם של הקולטנים )ממברנלי או ציטוזולי( נקבע תחת מיקרוסקופ קונפוקלי .התוצאות הינן ממוצע ±שגיאת התקן של 3חזרות ,כל אחת המייצגת ספירה של כ 300 -תאים ,מתוך ניסוי אשר נעשה לפחות פעמיים. 59 דרך נוספת להעריך את השפעתם של טעמנים אמפיפטיים על מנגנון האינטרנליזציה היא בעזרת פרקציונציה של התא .בשיטה זו מופרדת הפרקציה הציטוזלית מן הפרקציה הממברנלית ,ונוכחות ו/או כמות חלבון מסוים )במקרה זה הקולטן ה (β2AR -נבדקות בשיטת Western blotושימוש בנוגדן ספציפי .באיור ,3.10ניתן לראות בפרקציה הממברנלית של הביקורת ) (CONאת הירידה ההדרגתית בכמות הקולטן ככל שמתארך הגירוי ע"י ,ISOלעומת עלייה הדגרתית מקבילה בפרקציה הציטוזולית. לעומת זאת ,הדגרה מוקדמת של התאים עם כל אחד מששת הטעמנים בטרם גורו עם ISOגרמה לירידה הרבה יותר מתונה בכמות הקולטן בפרקציה הממברנלית ,במיוחד במקרים של קפאין ונרינגין ,כך שלאחר 20דקות נוכחותו של הקולטן בפרקציה זו הייתה עדיין ברורה. A B איור -3.10הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את הופעתו של הקולטן ה β2AR -בפרקציה הציטוזולית של התאים בעקבות גירוי עם .ISO ) (Aלאחר הדגרה של התאים בהיעדר או בנוכחות טעמנים וגירוי הקולטן ה β2HA -עם ISOלזמנים שונים, הממברנה הפלסמטית של התאים הופרדה מן התוכן הציטוזולי בעזרת שרשרת של סרכוזים במהירויות שונות )כמתואר בסעיף .(2.2.13בסוף הסרכוז האחרון הפרקציה הציטוזולית הופרדה והמשקע הורחף בבופר RIPA להמסת הממברנות .שתי הפקרציות הורתחו בנוכחות sample bufferודוגמה מכל פרקציה הורצה על ג'ל -SDS אקרילאמיד .12%נוכחות הקולטן נקבעה ע"י שימוש בנוגדן המכוון כנגד ) HAמיהול 1:1000ב.(TBST - ) (Bכימות עוצמת הכתמים מתוך ) ,(Aבכל נקודת זמן עבור כל טיפול ,נעשה בעזרת תוכנת .ImageJהירידה ההדרגתית בכמות הקולטן הממברנלי אשר נראית בביקורת ) (CONככל שמתארך הגירוי ,מעוכבת בנוכחות כל אחד מהטעמנים האמפיפטיים .התוצאות המובאות מייצגות ניסויים אשר נעשו לפחות פעמיים. 60 – 3.3.5השפעת חשיפת התאים לטעמנים על מסלול העברת האותות של ERK בתגובה לגירוי עם .ISO מחקרים רבים בשנים האחרונות מצביעים על יכולתו של הקולטן ה β2AR -לעורר מספר מסלולי העברת אותות נוספים לזה העובר דרך החלבון ,Gsוביניהם מסלול ה .(100 ,99 ,92) (ERK) MAPK -ישנן שתי דרכים בהן β2ARגורם לשפעול של :ERKלאחר זרחון ע"י PKAבטווח זמנים של 2-5דקות ולאחר זרחון ע"י GRKsבטווח זמנים ארוך יותר של 10-30דקות .מכיוון שהתוצאות שלנו מהניסויים הקודמים מצביעות על יכולתם של הטעמנים לעכב את פעילותן של ,GRKsבשלב זה נבחנה השפעתם של הטעמנים על שפעולו של .ERKלאחר שתאים המבטאים את הקולטן β2ARהודגרו בהיעדר או בנוכחות טעמן ולאחר מכן גורו ע"י ISOלזמנים שבין 2ל 30 -דקות ,רמת הזרחון של ERKנבדקה בשיטת Western blotע"י שימוש בנוגדן ספציפי .כפי שנראה באיור ,3.11Aהטעמנים לא השפיעו על רמת הזרחון הבסיסית של ) ERKללא גירוי הקולטן( ,חוץ מקפאין אשר נראה בעל השפעה מעכבת .דבר זה מצביע על כך שלפחות לטעמנים סכרין ,D-TRP ,NHD ,נרינגין וכינין אין השפעה על מסלול ה- MAPKעצמו .על מנת לוודא שחוסר התגובה של ERKלטעמנים אינו נובע מחוסר תפקודו מסיבה כלשהי בתאים ,תאי ה HeLa -גורו עם (Epidermal Growth Factor) EGFאשר משפעל את הקולטן האנדוגני (EGF Receptor) EGFRבתאים אלה ,ו ERK -ידוע כאחד ממסלולי העברת האותות העיקרי שלו .ואכן ניתן לראות באיור 3.11Aאת השפעול החזק של ERKבתגובה ל .EGF -לאחר גירוי הקולטן ה β2AR -ע"י ,ISOהתקבל שפעול חזק יחסית של ERKבטווח הזמנים הקצר )2-5 דקות( ונמוך יותר בטווח הזמנים הארוך יותר ) 10עד 30דקות( בדומה לדיווחים קודמים מהספרות ) .(155בנוכחות הטעמנים ,השפעול של ERKבטווח הזמנים של 2-5דקות לא נראה מושפע )חוץ מקפאין( .לעומת זאת ,הדגרה של התאים עם כל ששת הטעמנים גרמה לעיכוב של ERKבטווח הזמנים של 10-30דקות ,אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ) GRKאיור .(3.11Bקפאין עיכב בצורה משמעותית של השפעול של ERKגם בטווח הקצר וגם בטווח הארוך ,דבר אשר מעיד על יכולתו של טעמן זה לעכב את שני מסלולי הדסנסיטיזציה. 61 איור -3.11הטעמנים האמפיפטיים מעכבים את שפעול ERKאשר תלוי בזרחונו של הקולטן ה- עי .GRKs " β2AR ) (Aהטעמנים האמפיפטיים אינם משפעלים את .ERKתאי HeLaהמבטאים את הקולטן ה β2AR -נחשפו לטעמנים השונים במשך 10דקות )כינין – 3דקות( ומיד לאחר מכן ,תוכן התאים מוצה 20 µg .הורצו בכל באר של ג'ל -SDSאקרילאמיד 12%וזיהוי נוכחות ERKמזורחן ) ,pERKמיהול (1:40,000מול כמות הERK - הכללית ) ,gERKמיהול (1:30,000נעשה ע"י שימוש בנוגדנים ספציפיים. ) (Bהטעמנים האמפיפטיים מעכבים את מסלול שפעולו של ERKאשר תלוי ב .GRKs -לאחר הדגרה של התאים בהיעדר או בנוכחות טעמן ושפעול הקולטן ה β2AR -ע"י ISOלזמנים שונים ,נמדדה רמת השפעול של ERK בכל נקודת זמן כמתואר ב .A -התוצאות המובאות מייצגות ניסויים אשר נערכו לפחות שלוש פעמים .בצד ימין, מוצגים גרפית ההבדלים בעוצמת הכתמים בכל נקודת זמן ,בהיעדר )□( או בנוכחות )■( טעמן ,כאשר זמן 0הוגדר שרירותית כ ∗ .1-ו # -מציינות עלייה מובהקת סטטיסטית ) ,p<0.05במבחן t-testדו-כיווני וחד כיווני, בהתאמה( ברמות הזרחון של ERKיחסית לביקורת המתאימה) .נעשה בשיתוף עם גברת עינב מלאך(. 62 .4דיון ומסקנות תגליות חשובות בעשור האחרון הביאו לפריצת דרך אדירה בהבנת התהליכים הביולוגיים שמאחורי חישת הטעם .הוכח שקולטנים ממשפחת ה GPCRs -הינם אחראים על קשירת הטעמנים המרים, המתוקים והאוממים שבמזון ) .(119 ,118 ,24למרות שמסלולי העברת אותות אפשריים נחקרו שנים רבות קודם לכן ,שימוש בביולוגיה מולקולרית ועכברים מהונדסים גנטית אפשר לשפוך אור על המרכיבים החיוניים לחישת שלושת הטעמים האלו ) .(183בנוסף ,מנגנון העברת המידע מתא הטעם הלאה למערכת העצבית התגלה כשונה מרוב המערכות הידועות ) .(143 ,28בניגוד למנגנונים האחראים על העברת המידע מהקולטן הלאה ,מנגנון סיום העברת המידע לא נחקר כלל בספרות .בנוסף ,לא הוסברו עד כה תופעות כגון השאריתיות המורגשת לאחר טעימת טעמנים מרים או ממתיקים לא סוכריים .על בסיס מספר מחקרים שנערכו ,נראה שתופעת השאריתיות בטעם נובעת מהעברת אינפורמציה ממושכת מהרגיל מתאי הטעם אל תאי העצב ) .(160 ,59ההשערה אשר הועלתה מציעה שמסיבה כלשהי מנגנון כיבוי העברת האותות של קולטני הטעם )דסנסיטיזציה( אינו מתפקד במלואו ולכן העברת האינפורמציה מתמשכת לתקופה ארוכה יותר .טעמנים מרים וממתיקים לא סוכריים רבים הינם מולקולות אמפיפטיות. השערת העבודה הנוכחית הינה שהודות לתכונת האמפיפטיות שלהן ,מולקולות אלו מסוגלות לעבור את הממברנה הפלסמטית של תאי הטעם ומרגע שהגיעו לתוך ציטוזול התאים ,מעכבות את תהליך הדסנסיטיזציה של קולטני GPCRsכולל אלה של הטעם .על מנת להוכיח השערה זו ,הוצבו שלוש מטרות (1 :להוכיח שטעמנים אמפיפטיים ,מרים ומתוקים ,מסוגלים לחדור לתוך ציטוזול תאי הטעם בתנאים פיזיולוגיים )תנאי הכרחי על מנת שיוכלו להשפיע על תהליכים ציטוזוליים( (2 ,לבחון את נוכחותן של קינאזות ממשפחת ה GRKs -בתאי פקיעית הטעם ,בידיעה שקינאזות אלו מהוות מרכיב חיוני לקיום מנגנון הדסנסיטיזציה ההומולוגית של קולטני ה (3 ,GPCRs -לבחון את השפעתם של טעמנים אמפיפטיים על תפקודה והתקדמותה של הדסנסיטיזציה ההומולוגית של קולטני הGPCRs - במערכת תאית אשר תהווה מודל לתאי הטעם וקולטני הטעם. - 4.1חדירת טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי הטעם במחקרים קודמים הוכח שטעמנים אמפיפטיים חודרים ממברנות של ליפוזומים וגם לתוך תאי טעם מפקיעיות טעם מבודדות או פפילות טעם מבודדות ) .(132הבעיתיות המרכזית בניסויים אשר נערכו עד כה הינה שתנאי הניסוי אינם תואמים תנאים פיזיולוגיים .כאשר פפילת הטעם מעוגנת בתוך הלשון ,הצד האפיקלי בלבד של תאי הטעם נמצא באינטראקציה עם הטעמנים ,דרך ה .taste pore -בנוסף ,נוכחותם של tight junctionsהמחברים בין התאים בצד האפיקלי של הפקיעית מהווים מחסום ,כך שתאי הפקיעית אינם צפויים לפגוש בשום מקרה את מרכיבי המזון )טעמנים( בצד הבזולטרלי שלהם .תנאים 63 אלו אינם נשמרים כאשר פפילת הטעם מופרדת מרקמות חיבור ושריר לאחר טיפול אנזימטי .לכן השלב הראשון של עבודה זו הוקדש לבחינת חדירתם של טעמנים אמפיפטיים לתוך תאי פקיעית הטעם בתנאים פיזיולוגיים .מעקב דינמי אחר חדירת טעמנים אמפיפטיים תוך כדי הדגרתם עם פפילת CVשלמה במיקרוסקופ קונפוקלי היתה אחת השיטות לחקור את מידת חדירתם לתוך פפילת הטעם .העלייה עם הזמן ברמת הפלואורסצנציה בדיוק באזור ה inner trench -של פפילת ה) CV -איור (3.1מעידה על חדירה והצטברות הדרגתית של הטעמנים לתוך תאי פקיעיות הטעם עצמן .נוכחות פלואורסצנציה גם ברקמה האפיתליאלית המקיפה את פפילת הטעם מעידה על יכולתם של אותם הטעמנים לחדור גם לתוך תאים לא סנסוריים .שימוש ב ,KI -אשר פועל כמדעיך פלואורסצנטי אך אינו חודר ממברנות ,הוכיח כי העלייה ברמת הפלואורסצנציה נובעת מחדירה אמיתית של הטעמנים לתוך פקיעיות הטעם ולא מתוך הצטברות חיצונית לתוך תעלת הפפילה או ספיחה חיצונית על פני האפיתל .העובדה ש KI -גרם לדעיכה מיידית ומוחלטת של ) PIאשר אינו חודר ממברנות( אך לא שינה את רמת הפלואורסצנציה של הטעמנים הוכיחה שהטעמנים אכן נמצאים בתוך ציטוזול התאים או לפחות עמוק בתוך הממברנה הפלסמטית שלהם ,שם אין ל KI -גישה .קינאזות ה ,GRKs -שפעילותן בנוכחות טעמנים נחקרה בעבודה זו ,נמצאות חלקן מעוגנות בתוך הממברנה הפלסמטית הודות להוספת חומצות שומן בקצה ה-C -טרמינלי שלהן ,או לפחות ממוקמות בסמוך לצד הציטוזולי של המבברנה הודות לאפיניות שלהן לפוספוליפידים או חלבונים אחרים כגון תת- היחידה βγשל חלבון ה .G -לכן ייתכן והטעמנים מסוגלים לבוא במגע עם אותן ה GRKs -גם מבלי לחדור עמוק לתוך ציטוזול התא אלא גם כאשר הם פונים כלפי הצד הציטוזולי של הממברנה הפלסמטית. מנגנון חדירת הטעמנים לתוך תאי הטעם איננו ידוע .בהיותם מולקולות אמפיפטיות ,ההשערה הראשונה שהועלתה הייתה שטעמנים אלו חודרים בעזרת דיפוזיה פסיבית דרך הממברנה הפלסמטית .ייתכן שהודות לשילוב של קבוצות הידרופוביות וקבוצות הידרופיליות שבתוכן ,מולקולות הטעמנים מסוגלות להתקרב ולהיצמד לממברנה הפלסמטית ואף לנוע בתוכה ולעבור לצד הציטוזולי שלה .תמיכה לתיאוריה זו מראה שטעמנים אמפיפטיים אכן מסוגלים לחדור לתוך ליפוזומים המורכבים מפוספוליפידים וכולסטרול בלבד ) .(132למרות שתיאוריה זו אפשרית ,קצב חדירת הטעמנים נמצא מהיר יותר מזה שמאפשרת דיפוזיה פסיבית .מצד שני ,נראה שלא מדובר גם כן בניצול של תעלה אקטיבית ע"י הטעמנים .למרות שמעכב האנרגיה CCCPעיכב את כניסתם של סכרין ו D-TRP -לתוך תאי טעם מפפילה מבודדת ,נמצא שהסיבה לכך הייתה בגלל שינוי בפוטנציאל הממברנה ולא בגלל חוסר במולקולות ATPבתא .ואכן, מעכב האנרגיה oligomycinלא עיכב את חדירתם של הטעמנים סכרין ,D-TRP ,כינין והפפטיד ) .(117) cyclo(Leu-Trpיחד ,תוצאות אלו פסלו את האפשרות של ניצול נשא אקטיבי )(transporter להחדרת טעמנים אלו פנימה אל הציטוזול. ייתכן וחדירתם של הטעמנים דרך הממברנה מתאפשרת הודות לתופעה בה מספר מולקולות מתארגנות יחד ליצירת פורות ) ,(poresכאשר הקבוצות ההידרופיליות פונות לצד אחד והקבוצות ההידרופוביות פונות לצד שני .כך ,מולקולות אמפיפטיות "בונות" לעצמן דרך מעבר בתוך הממברנה הליפידית ועוברות אותה. 64 אם אכן הטעמנים חודרים לתוך תאי הטעם בכוחות עצמם )דרך דיפוזיה או בניית פורות( ולא דרך תעלה אקטיבית ,איך ניתן להסביר את הצטברות הטעמנים כנגד מפל הריכוזים אשר נראתה גם בעבודה זו בניסויי ה in-vivo -עבור כינין וקפאין )טבלה (3.1ותוארה גם עבור טעמנים אמפיפטיים אחרים בעבודות אחרות ) ?(185 ,132ייתכן והסבר אפשרי טמון ביכולתם של הטעמנים לחדור ולהצטבר גם בתוך אורגנלות התא כגון הגרעין ) .(132חדירת הטעמנים לתוך אורגנלות התא יכולה לגרום למצב בו הריכוז הציטוזולי עצמו אינו עולה על הריכוז החוץ תאי ולכן הטעמן ממשיך לחדור פנימה ,וכך מצטבר בהדרגתיות בתוך התא. מטרת ניסויי ה in-vivo -בחולדות מורדמות הייתה לחקות מצב של שתייה המתמשכת כ 90 -שניות, ולבחון בסופן נוכחות של טעמנים בתאי פפילת ה .CV -על מנת להפריד את התוכן הציטוזולי של תאי הטעם בתום ה 90 -שניות ,היה צורך להפריד את פפילת ה CV -מן הלשון בעזרת ניתוח וטיפול אנזימטי בקולגנאז אשר ארך כ 25 -דקות .לאורך כל זמן הניתוח ,הלשון ולאחר מכן הפפילה עצמה נמצאו בתמיסת .TGPPמכיוון שה TGPP -לא הכיל בעצמו טעמן ,ניתן לצפות שחלק מהטעמנים אשר היו בתאי הפפילה "יברחו" החוצה כתוצאה מהפיכת מפל הריכוזים או ע"י שפעול טרנספורטרים ממשפחת ה- .(multidrug resistance protein) mdrטרנספורטרים ממשפחה זו אחראים על הוצאת תרכובות זרות או רעילות מתוך ציטוזול התא ,ומחקרים הראו כי mdr1מתבטא בפפילת ה .(71) CV -לפיכך חושב עבור כל טעמן פקטור אשר יהווה אומדן למידת הבריחה של הטעמנים השונים בזמן הניתוח .בריחה זו הוערכה בין 64%ל ,86% -ולפיה חושב הריכוז התוך תאי של הטעמנים לאחר 90שניות שתייה. הריכוזים התוך תאיים אשר נמצאו בניסוי זה הרבה יותר נמוכים משל אלה אשר דווחו בניסויים שנערכו בפפילות מבודדות .למשל ,ריכוזו התוך תאי של D-TRPהוערך כ 6.4 mM -בניסוי ה in-vivo -במקום 60-65 mMבפפילה מבודדת .ריכוזו של כינין נמצא 5.5 mMבמקום 20 mMוהפפטיד המר ) 0.96 mM cyclo(Leu-Trpבמקום .3.5 mMתוצאות אלו היו צפויות מאחר ובתנאי הניסוי הנוכחיים ,תאי הטעם אינם חשופים לתמיסת הטעמנים אלא מהצד האפיקלי בלבד ,דרך ה,taste pore - אזור בעל שטח מצומצם מאוד .מכל מקום ,ניסויי ה in-vivo -הוכיחו כי טעמנים אמפיפטיים מסוגלים בתנאים פיזיולוגיים לחדור לתוך תאי פקיעית הטעם ואף להצטבר בהם כנגד מפל הריכוזים )במקרה של כינין וקפאין( .מעבר לכך ,נראה שטעמנים חודרים לכל סוגי התאים ,סנסוריים או לא ,מאחר והם נמצאו גם בתאי האפיתל שמסביב לפפילת ה .CV -בנוסף ,יש להניח כי הטעמנים חודרים במידה שווה בכל התאים המרכיבים את פקיעית הטעם ולכן הריכוזים התוך תאיים שחושבו נחשבים לנכונים בכל סוגי התאים שבפקיעית הטעם ,וביניהם תאי הטעם עצמם ).(taste receptor cells 65 - 4.2איפיון ביטוי קינאזות ממשפחת ה GRKs -בתאי פפילת ה- CVבחולדה השערת העבודה הינה שמרגע הגעתם אל ציטוזול התאים ,הטעמנים האמפיפטיים משבשים את מהלך מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם ,ובכך גורמים למסלול העברת האותות להימשך זמן רב יותר. מכיוון שהקולטנים לטעם המר ) (T2Rsוהמתוק ) (T1Rsמשתייכים למשפחת ה ,GPCRs -סביר להניח שמנגנון הדסנסיטיזציה שלהם יהיה דומה לזה של שאר הקולטנים ממשפחה זו ,כלומר באמצעות זרחון של הקצה ה-C -טרמינלי ע"י לפחות אחת מהקינאזות ממשפחת ה .GRKs -ידוע ממחקרים קודמים כי GRK5זוהה באפיתל הלשון ) .(136מכיוון שמטרתנו לחקור את השפעת הטעמנים על פעילותם של ה- ,GRKsנרצה קודם לאפיין אילו איזופורמים מהמשפחה הזו מתבטאים בתאי הטעם. ראשית ,נבדק ביטויים של GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,GRK1ו GRK6 -בפפילת ה CV -מחולדה בשיטת ,GRK7 .RT-PCRאשר אינו מתבטא בחולדה ו ,GRK4 -אשר מתבטא בעיקר במוח ואשכים, לא נבדקו .תוצאות ה RT-PCR -הראו שהקינאזות GRK5 ,GRK3 ,GRK2ו GRK6 -מתבטאות בפפילת ה ,CV -אך גם באפיתל הלא סנסורי ) (EPהסמוך לפפילת ה CV -בלשון )איור GRK1 .(3.2 אשר מתבטא באופן ייחודי במערכת הראייה לא היה צפוי להתבטא בפפילת ה ,CV -ואכן לא נמצא בה. על מנת לוודא כי פפילת ה CV -אכן בודדה באופן נקי מרקמת האפיתל הלא סנסורי של הלשון ,נבדקו גם ביטויים של הקולטנים למר ) (T2R4ולמתוק ) .(T1R3הקולטנים נמצאו אכן רק ברקמת ה CV -ולא באפיתל הלא סנסורי. ארבעת הקינאזות GRK5 ,GRK3 ,GRK2 ,ו ,GRK6 -מתבטאות בכלל אברי הגוף ) (48ולכן לא מפתיע למצוא אותן גם ברקמה הסנסורית והלא סנסורית .סביר גם להניח שלחלק מהן תפקיד שונה בשתי רקמות אלו .מציאת הקולטנים למר ולמתוק יחד עם ארבעת ה GRKs -בשיטת ה RT-PCR -אינה עדות לכך שכל החלבונים האלו אכן מתבטאים יחד באותם התאים .בניסוי מסוג זה ביטוים של החלבונים השונים נבדק בכלל התאים שבפפילת ה .CV -ידוע כיום כי הקולטנים למר והקולטנים למתוק מתבטאים בתאי טעם שונים ) ,(183 ,114 ,62ובאותה מידה ייתכן וה GRKs -השונים מתבטאים גם הם בסוגים שונים של תאים מתוך הפפילה ופקיעית הטעם .בנוסף ,פפילת הטעם אינה מורכבת אך ורק מפקיעיות טעם :תאי אפיתל לא סנסוריים מקיפים את פקיעיות הטעם ויוצרים את רקמת הפפילה .חלק מהרנ"א אשר הופק לאחר ריסוק רקמת הפפילה מקורו מתאים אפיתליאלים לא סנסוריים אלו .על מנת לוודא את מיקומם של ה GRKs -השונים בתוך פפילת ה ,CV -נעשתה צביעה אימונית של חתכי פפילת CVעם נוגדנים ייחודים אשר סונתזו כנגד כל אחד מן ה) GRKs -איור .(3.3מצביעה זו נראה שGRK5 - מתבטא בעיקר בתוך פקיעית הטעם .לעומתו GRK2 ,נראה גם בפקיעיות הטעם וגם באפיתל הלא סנסורי המקיף אותן ,אך GRK6נראה בעיקר מחוץ לפקיעיות הטעם .תוצאות אלו ממקדות בעיקר את GRK5 אך גם GRK2כקינאזות פוטנציאליות המעורבות במנגנון הדסנסיטיזציה של תהליכים אשר קורים בתאי פקיעיות הטעם ,וביניהם תאי הטעם .תוצאה זו מתנגשת קצת עם פרסומים אחרונים אשר דיווחו כי 66 GRK2בלבד נמצא בפקיעיות הטעם של פפילת ה CV -בעכברים ) ,(103אך ייתכן שמקור השוני בין התוצאות נובע משונות בין בעלי חיים )עכבר מול חולדה(. נוגדן כנגד GRK3לא גרם לצביעה הנראית לעין של חתכי פפילת ה .CV -מכיוון שעל פי שיטת ה- GRK3 ,RT-PCRמתבטא ברקמה זו ,ייתכן כי התוצאה השלילית בצביעה האימונית נובעת מרמת ביטוי נמוכה במיוחד של ,GRK3מתחת לסף רגישות השיטה .על מנת לקבוע במדויק אלו GRKsמתבטאים יחד באותו תא עם קולטנים למר או למתוק ,יידרשו ניסויים נוספים כגון in-situ hybridizationבהם נבדקת נוכחותם של רנ"א מגנים שונים בתאים .ניסויים מסוג זה שימשו על מנת לקבוע שחלבונים כגון PLCβ2 ,gustducinאו TRPM5מתבטאים יחד עם קולטנים למר או למתוק ) .(183נראה כי צביעה של רנ"א הינה יותר ספציפית ומאפשרת צביעה והבחנה של תאים בודדים מתוך מצבור התאים שבפקיעית הטעם .לחילופין RT-PCRשל תא בודד יכול לספק מידע על גנים המתבטאים בכל סוג תא בפקיעית הטעם .למרות רגישותן הגבוהה של שתי שיטות אלו ,חסרון מסוים נעוץ בכך שהבדיקה נעשית ברמת הרנ"א וידוע מכמה מערכות שרנ"א אינו תמיד אומדן נאמן לרמת החלבון בתא. - 4.3טעמנים אמפיפטיים מעכבים את הדסנסיטיזציה של קולטני ה GPCRs -על ידי עיכוב פעילותן של קינאזות ה.GRKs - לאחר שנמצא כי טעמנים אמפיפטיים יכולים לחדור בתנאים פיזיולוגיים לתוך תאי הטעם ושקיימות קינאזות ממשפחת ה GRKs -באותם התאים ,מטרת חלק זה של העבודה הייתה לבחון האם ביכולתם של אותם הטעמנים האמפיפטיים לעכב את תהליך הדסנסיטיזציה של קולטנים ממשפחת ה GPCRs -ע"י אינטראקציה עם מרכיבים ציטוזוליים כגון קינאזות ה .GRKs -על מנת להוכיח טענה זו ,התעורר הצורך לעבוד במערכת מודל עם קולטן אחר מקולטני הטעם ,וזאת ממספר סיבות .ראשית ,תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם ,מר או מתוק ,לא נחקר עד כה .בניגוד לרוב קולטני ה ,GPCRs -זהותם ותפקודם של הקולטנים לטעם התבררו רק בשנים האחרונות ומנגנון הדסנסיטיזציה שלהם אינו ידוע עדיין .שנית, ולמרות השיפורים הטכנולוגיים בשנים האחרונות ,לא נמצאה עד כה שיטה המאפשרת לגדל תאי טעם בתרבית מבלי לגרום עיוות לתאים או מוות לאחר זמן קצר ) .(126 ,85מסיבה זו ,חקירת תפקודם של הקולטנים לטעם דורשת ביטוי מלאכותי שלהם בשורות תאים )טרנספקציה( .אומנם ביטוי שכזה נעשה במספר רב של עבודות ,ע"י שימוש בתאים כגון תאי HEK293או ,COS-7אך ידוע כי שיטה זו מביאה בעיקר לביטוי ציטוזולי של הקולטן ) ,(24 ,18ומכאן לקולטן לא פונקציונלי לרוב ,דבר אשר מהווה מחסום משמעותי עבורנו. ובכל זאת ,מכיוון שהקולטנים לטעם המר והמתוק משתייכים למשפחת ה ,GPCRs -סביר להניח כי מנגנון הדסנסיטיזציה עבורם יהיה דומה לזה אשר תואר בסעיף ,1.6זאת אומרת דרך זרחון ע"י קינאזה מסוג GRKולאחר מכן אינטרנליזציה .מסיבות אלו ,נבחר הקולטן ה β2AR -לשמש מודל במערכת שלנו β2AR .הינו קולטן GPCRאשר מנגנון הדסנסיטיזציה שלו נחקר בהרחבה שנים רבות ,מרכיביו 67 אופיינו והשפעותיו על תהליכים תוך תאיים אחרים הינם בעצמם מקור למחקרים רבים נוספים ),99 ,48 .(175 ,174 ,155 ,153 ,100בנוסף ,ידוע כי קולטן זה מזורחן ע"י GRK2ו ,GRK5 -שתי הקינאזות אשר זוהו בתוך תאי פקיעית הטעם של פפילת ה) CV -סעיף ,(4.2ולכן השפעה אפשרית של הטעמנים במערכת כזו רלוונטית גם למערכת חישת הטעם. על מנת להשתמש בקולטן ה β2AR -ככלי במחקר זה ,היה צורך לבטא אותו בתאים הגדלים בתרבית. תאי ה HeLa -נבחרו למטרה זו ממספר סיבות :ראשית אלה תאים ממקור אפיתליאלי ,בדומה לתאי הטעם בפקיעית הטעם .בנוסף ,על מנת להוכיח השפעה אפשרית של הטעמנים האמפיפטיים על מרכיבים תוך תאיים ,ישנו צורך להשתמש בתאים שלתוכם טעמנים אמפיפטיים חודרים במידה הדומה לזו אשר נמצאה בתאי הטעם .נמצא שאכן טעמנים אמפיפטיים חודרים במידה הרבה ביותר לתוך תאי הHeLa - )בהשוואה לתאי COS7 ,HEK293או .(HCT/116בדומה למה שדווח בתאי טעם ,הטעמנים האמפיפטיים הצטברו גם כאן כנגד מפל הריכוזים .למרות זאת ,התברר כי קצב החדירה של הטעמנים לתוך תאי HeLaהרבה יותר נמוך מזה שבתאי טעם 10 .דקות חשיפה עם תאי ה HeLa -נדרשו על מנת לקבל ריכוזים הדומים לאלו אשר נמצאו לאחר 30שניות חשיפה בלבד בתאי הטעם מפקיעיות טעם מבודדות ) .(132בנוסף תאי ה HeLa -נמצאו הרבה יותר רגישים לתרכובת כינין מאשר תאי הטעם. כינין ידוע כחומר רעיל לתאים ) .(184 ,120אך בניגוד לתאי הטעם אשר יכלו להיחשף לריכוזים של 1- ) 2 mMטבלה ,((132) ,3.1תאי ה HeLa -לא שרדו ריכוזים העולים על .50 µMלכן ריכוזי הכינין בחלק זה של העבודה הינם בטווח של ,10-50 µMוזמן החשיפה לתאים לפני גירוי הקולטן לא עלה על 3דקות )טבלה .(3.2ריכוזי חמשת הטעמנים האחרים הינם ריכוזים המצויים במזון. על מנת לבחון את השפעת הטעמנים על תהליך הדסנסיטיזציה של הקולטן ה ,β2AR -נבחנה תחילה פעילותו של הקולטן לאחר גירוי עם ליגנד ספציפי בשם ,(ISO) isoproterenolכאשר התאים נחשפו קודם לכן לטעמנים אמפיפטיים .במידה ולטעמנים השפעה מעכבת על התקדמותו של תהליך הדסנסיטיזציה ,היינו מצפים לפעילות ארוכה יותר של הקולטן ,אשר תתורגם ברמות שליחים משניים גבוהות יותר לזמנים ארוכים יותר .מידת הפעילות של הקולטן נבחנה כאן ע"י מדידת רמות השליח המשני cAMPאשר נוצר כתוצאה משפעול חלבון Gsואדניליל ציקלאז ע"י הקולטן ה .β2AR -ואכן נמצא שחשיפה מוקדמת של התאים לטעמנים האמפיפטיים השונים גרמה לעלייה משמעותית ברמות הcAMP - שנוצרו בתגובה ל ISO -והמשיכה גם 2דקות לאחר גירוי הקולטן .הגברה זו ברמות ה cAMP -הייתה תלויה בריכוז הטעמן )איור .(3.4תוצאות אלו היוו אינדיקציה ראשונית לכך שטעמנים אמפיפטיים אכן גורמים לקולטן להיות "פעיל יותר". מחקרים קודמים הראו שטעמנים אמפיפטיים יכולים להשפיע על מערכות אשר אינן קשורות לטעם ,בין היתר ע"י קשירה לקולטנים שאינם קולטני טעם והפעלתם .למשל ,הטעמן NHDנמצא מסוגל לפעול כליגנד לקולטן האדרנרגי מסוג ,(α2AR) α2לעומת טעמנים כגון סכרין ו D-TRP -אשר פועלים כליגנדים לקולטן המלטונין ) .(185) (MT1/2לעומת זאת ,הטעמן המר כינין נמצא פועל כאנטגוניסט לקולטן לסרוטונין .(166) 5-HT3לאור עובדות אלו ,נעשו מספר ניסויים על מנת להוכיח כי השינוי 68 ברמות ה cAMP -נבע מפעילות ציטוזולית של הטעמנים ולא בגלל קשירה חוץ תאית לקולטן הβ2AR - באופן אשר יידמה ליגנד .הניסויים הראו כי בהיעדר ,ISOאין לטעמנים עצמם כל השפעה על רמות ה- cAMPהבזליות בתא ,ויותר מכך ,שמידת השפעתם על רמות ה cAMP -לאחר גירוי הקולטן עם ISO הינה תלויה בזמן החשיפה של התאים אליהם )איור .(3.5תוצאות אלו מוכיחות כי הטעמנים אינם פועלים כליגנדים לקולטן ה ,β2AR -או לכל קולטן אחר ממשפחת ה GPCR -אשר מתבטא בצורה אנדוגנית בתאי HeLaוקשור לחלבוני Gsאו .Giגם אם סביר להניח כי קולטני α2ARלמשל יתבטאו בתאי ,HeLaנראה כי רמת הביטוי שלהם נמוכה מכדי שטעמנים כגון NHDישפיעו במידה משמעותית על רמות ה .cAMP -התלות באורך החשיפה של תאים לטעמנים מוכיחה כי חדירתם ונוכחותם של הטעמנים בתוך ציטוזול התא בריכוז גבוה מספיק הינם חיוניים על מנת שתתקבל הגברה בפעילות הקולטן ,כלומר שהשפעת הטעמנים הינה תוך תאית ולא רצפטורלית. בנוסף לקשירתם לקולטנים שונים ,ידוע כי תרכובות אמפיפטיות מסוגלות גם להשפיע על פעילותם של מרכיבים ציטוזולים כגון פוספודיאסטראזות )קפאין ) ,((64פקטורי שעתוק )פלבונואידים ) ,((108או חלבונים ממברנליים כגון תעלות )נרינגין ) ,(156 ,6כינין ) .((170 ,31לכן נדרשו צעדים נוספים על מנת להוכיח כי ההגברה שנראתה ברמות ה cAMP -אכן נובעת מהשפעת הטעמנים על פעילות הקולטן ולא בדרך עקיפה על מרכיבים ציטוזולים אשר עיכובם יגרום גם הוא לעלייה ברמת ה cAMP -בתא .שני שחקנים אשר יכלו להשפיע על רמות שליחים משניים היו ,PDEאשר אחראי על פירוק שליחים משניים ו PKA -אשר מעורב בדסנסיטיזציה ההטרולוגית של הקולטן ה .β2AR -ואכן ,נוכחותם של מעכב PDE בשם IBMXאו מעכב PKAבשם H89במערכת גרמו ,לאחר גירוי הקולטן ,לרמות cAMPגבוהות פי 10-15מאשר בתנאים זהים בהיעדרם .אך התוצאות הראו כי ההגברה ברמות ה cAMP -לאחר חשיפת התאים לטעמנים קרתה גם בנוכחות IBMXאו ,H89ובמידה דומה לזו שבהיעדר המעכבים )איור ,(3.6 ומהוות הוכחה לכך שההשפעה של הטעמנים על רמות ה cAMP -לא נבעה מהשפעה כלשהי על PDEאו ,PKAבהתאמה. הטעמן היחיד אשר התנהג שונה היה קפאין .קפאין הינו תרכובת הידועה כמשפיעה על פעילותם של מגוון רחב ביותר של אנזימים ,תעלות וקולטנים .קפאין פועל כאנטגוניסט ל,78) adenosine receptor - ,(138גורם לשחרור סידן תוך תאי ) ,(177מעכב תעלות אשלגן ) ,(55מעכב PKCו(139) ATM - והרשימה עוד ארוכה .אך אחת מההשפעות הידועות ביותר של קפאין )כמו של המטבוליט שלו תאופילין( הינה עיכוב .PDEזו הסיבה לכך שבנוכחותו ,רמות ה cAMP -לאחר גירוי הקולטן ה β2AR -ע"י ISO גבוהות בהרבה )בערך פי (5ושהירידה ברמות ה cAMP -אשר נראית במצב רגיל לאחר 30שניות אינה מתקיימת .לכן ,במטרה לבחון את השפעת קפאין על פעילות הקולטן בלבד ,הוסף למערכת הניסוי .IBMXואכן נמצא כי השפעתו של קפאין על רמות ה cAMP -שנוצרו בעקבות גירוי הקולטן ה- β2ARאינה תלויה ב .PDE -למרות זאת ,ניתן לראות כי אם קפאין לבד גורם לאחר גירוי הקולטן להגברת רמות cAMPפי ,5השפעתו על פעילות הקולטן עצמו )ז"א בנוכחות (IBMXיורדת לפי 1.5- 2בלבד ,בדומה לשאר הטעמנים שנבדקו. 69 בכדי לבחון אם השפעתם של הטעמנים על רמות cAMPנובעת מעיכוב מנגנון הדסנסיטיזציה ההומולוגית של הקולטן ,נבחנה מידת הזרחון של הקולטן לאחר גירוי בנוכחות הטעמנים. לשם כך ,השתמשנו בנוגדן אשר פותח בשנים האחרונות ומזהה אתרי סרינים המזורחנים ספציפית ע"י GRK2/5לאחר גירוי הקולטן ,והן העמדות Ser355ו Ser356 -בקצה ה-C -טרמינלי של הקולטן ) .(153נוגדן זה שימש במספר מחקרים והוכח כספציפי ) GRK2 .(168ו GRK5 -מתבטאים בצורה אנדוגנית בתאי HeLaולכן לא נדרשה טרנספקציה נוספת להפעלת מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטן בתאים אלו .מן התוצאות ניתן לראות כי זרחון הקולטן אכן הושפע מנוכחות טעמנים אך באופן לא צפוי. בנוסף לירידה ברמת הזרחון של הקולטן ,התקבלה דחייה בזמן הופעתו :אם במצב רגיל )ביקורת( הקולטן נמצא מזורחן בעיקר 5-10דק' לאחר הגירוי ,בנוכחות הטעמנים זרחון זה הופיע רק לאחר 10-20דק' )איור .(3.7תופעה זו איננה שגרתית במובן זה שעיכוב של אנזים מתורגם בירידה בפעילותו ואילו במקרה שלנו ,פעילותם של ה GRK2/5 -נראית כמושהית ל 5-10 -דק' ומתחדשת לאחר מכן .ניסויים של in-vitro kinase assayהראו כי עיכוב פעילותם של GRK2ו GRK5 -ע"י הטעמנים אינו נובע מתחרות על אתר הקשירה לסובסטרט או על אתר הקשירה ל ,(186) ATP -ומנגנון העיכוב לא פוענח עד כה .אבל הסבר אפשרי לדחייה בזמן הופעת הזרחון של הקולטן יכול להיות בכך שלאחר הצטברותם לתוך ציטוזול התאים ,הטעמנים "נעלמים" בדרך כלשהי .פירוק אנזימטי לא נראה סביר ולא ידוע על פעילות cytochrome P450בתאי .HeLaלעומת זאת ,מנגנון ידוע אשר מוציא החוצה תרכובות "זרות" המצטברות בציטוזול התא הינו שפעול טרנספורטרים ממשפחת ה(multi-drug resistance mdr - ) .transportersמשפחה זו של טרנספורטרים ,הקיימת בתאים אאוקריוטים ) (130כמו פרוקריוטים ) ,(76אחראית על הוצאת תרופות או חומרים רעילים מתוך התאים ומונעת בדרך זו את מותם. טרנספורטרים אלו פעילים במיוחד בתאי סרטן )וגורמים כך לעמידות לתרופות אנטי-סרטניות ),((125 ומתבטאים גם בתאי .(165) HeLaניתן לחשוב כי בזמן גירוי הקולטן )אשר ארך עד 20דק'( ,הטעמנים המשיכו להצטבר בתוך ציטוזול התא מעבר לריכוזים אשר דווחו בטבלה .3.2ייתכן כי ריכוזים כה גבוהים הפעילו את הטרנספורטרים מסוג mdrובכך גרמו להוצאתם של הטעמנים מהציטוזול .תוצאה ישירה תהיה ירידה מתמדת בריכוז הטעמנים בציטוזול .מרגע זה ,העיכוב שהפעילו הטעמנים על ה- GRKsנעלם ולכן הקינאזות מסוגלות לפעול מחדש ולזרחן "באיחור" את הקולטן. אם אכן הטעמנים מעכבים את זרחון הקולטן ע"י ,GRK2/5ישנה סבירות גבוהה כי תהליכים אשר תלויים בזרחון זה יימצאו גם הם מעוכבים ,וביניהם קשירה של מולקולת β-arrestinלקולטן המזורחן. כתוצאה מקשירה זו מופעלים מספר תהליכים :הראשון הינו אינטרנליזציה של הקולטן לתוך ציטוזול התא והשני שפעול מסלולי העברת אותות חדשים .לכן השפעת הטעמנים על שני תהליכים אלה נבחנה בהמשך. מידת האינטרנליזציה של הקולטן ה β2AR -לאחר גירוי עם ,ISOבהיעדר או נוכחות טעמנים ,נבחנה קודם כל במיקרוסקופיה פלואורסצנטית .התוצאות הראו כי בעקבות פראינקובציה של התאים עם הטעמנים וגירוי הקולטן ה β2AR -ב ISO -חלה עלייה באחוז התאים אשר הכילו קולטן ממברנלי )איור .(3.8תוצאות אלו ביחד עם תוצאות השהייה בהופעת הזרחון )איור (3.7מתארות יפה את התהליך אשר 70 עובר הקולטן :בהיעדר טעמן ,הקולטן מזורחן כבר לאחר 5דק' של גירוי ובמקביל ניתן לראות את תחילת האינטרנליזציה שלו לתוך הציטוזול .אחרי 15דק' ,רוב התאים מכילים קולטן ציטוזולי .בתוך הציטוזול, הקולטן עובר תהליך של דה-פוספורילציה )הורדת זרחנים ע"י פוספטאזות( ,אשר מתבטא בירידה בעוצמת הפסים המתקבלים עם הנוגדן ה .anti-phosphoSer(355-356) β2AR -לעומת זאת בנוכחות הטעמנים ,הקולטן אינו מזורחן באופן בולט גם לאחר 10דק' גירוי ,דבר המתבטא בכך שרוב התאים עדיין מכילים קולטן ממברנלי בזמן זה .הזרחון מופיע בעיקר לאחר 15דק' גירוי וכך גם מתחיל להופיע אחוז גבוה יותר של אינטרנליזציה .השפעת הטעמנים על קצב האינטרנליזציה של הקולטן נמצאה גם כן תלוית-ריכוז )איור .(3.9מכיוון שהסתכלות על תאים דרך מיקרוסקופ אינה מאפשרת להעריך את כמות הקולטן אשר נמצא עדיין על ממברנת התא ,נעשתה פרקציונציה של התא ונבדקה נוכחות הקולטן בממברנה הפלסמטית ובתוכן הציטוזולי והוכיחה שוב כי חלה ירידה בקצב תהליך האינטרליזציה בנוכחות הטעמנים )איור .(3.10 התהליך השני אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י GRKsוקשירת β-arrestinלקולטן הינו שפעול מסלול ה- .(92) MAPKמסלול זה מאופיין בקיום תגובת שרשרת בה קינאזה אחת מזרחנת את השנייה ובכך משפעלת אותה .התגלו מספר רב של מסלולי MAPKאשר מפעילים אפקטורים שונים ,הידועים מביניהם הינם JNK ,p38ו .ERK1/2 -ישנן שתי דרכים דרכן הקולטן ה β2AR -משפעל את מסלול ה :ERK -הדרך הראשונה תלויה בזרחון הקולטן ע"י ) PKAקורה בטווח של 2-5דק' אחרי גירוי הקולטן( והשנייה תלויה ביצירת הקומפלקס קולטן) β-arrestin/קורה בטווח של 5-45דק' לאחר גירוי הקולטן( ) .(155לכן בשלב הבא ,נבחנה השפעתם של הטעמנים על שפעול .ERKראשית ,ללא גירוי הקולטן ,לא הייתה לטעמנים כל השפעה על רמת הזרחון הבזלית של ,ERKדבר אשר מעיד על כך שלטעמנים אין כל השפעה על קולטנים מסוג ה tyrosine kinase receptor -כגון קולטן הEGF - ) ,(EGFRאך גם לא על מרכיבים ציטוזולים אשר יכולים לשפעל את מסלול ה ,MAPK -כגון .PKC נראה שלטעמנים השפעה מעכבת על שפעול ERKרק בטווח של 10-30דק' .לעומת זאת שפעול ה- ERKבזמנים של 2-5דקות לא נראה מושפע כלל .תוצאה זו מעידה על כך שלטעמנים אין השפעה מעכבת על ,PKAדבר אשר תומך בתוצאות שהתקבלו בניסויי מדידות ה cAMP -כאשר הטעמנים הגבירו את רמות השליח המשני גם בנוכחות ) H89איור .(3.6לעומת זאת ,ובהתאם לציפיותינו, הטעמנים עיכבו את המסלול אשר תלוי בזרחון הקולטן ע"י ה GRKs -וקשירת β-arrestinלקולטן המזורחן .קפאין היה שוב במקרה זה הטעמן היחיד אשר התנהג אחרת מכל האחרים .קפאין לא רק עיכב את שפעול ה ERK -התלוי ב β-arrestin -אלא גם את השפעול התלוי ב .PKA -קיימים בספרות דיווחים רבים על השפעת קפאין על מסלולים התלויים ב ,PKA -אך עובדה מפתיעה ביותר הינה כי על פי סוג התאים או סוג המערכת נמצאו לקפאין השפעות הפוכות .מספר מאמרים דיווחו על שפעול PKA ע"י קפאין ) ,(63 ,3לעומת מחקרים אחרים אשר דיווחו על השפעה מעכבת על .(186 ,148) PKA מתוצאות המחקר הנוכחי ,נראה כי קפאין פעל כמעכב .PKAזו יכולה גם להיות הסיבה לכך שקפאין הינו הטעמן היחיד מבין השישה אשר גרם לירידה ברמת הזרחון הבזלית של .ERK 71 לסיכום תוצאות הניסויים בחלק זה מצביעות על כך שכתוצאה מחדירתם לתוך ציטוזול התאים ,הטעמנים האמפיפטיים גורמים לקולטן ה β2AR -להיות פעיל לתקופה ארוכה יותר ע"י עיכוב קינאזות הGRKs - האחראיות על תהליך הדסנסיטיזציה ההומולוגית שלו. הטעמנים מצטיירים כמעכבים פחות ספציפיים ורגישים ממעכבים הידועים עבור קינאזות אחרות ממשפחת ה) serine/threonine kinases -כגון H89עבור (PKAואף קינאזות ממשפחת הtyrosine - ) kinasesכמו imatinibעבור .(bcr/ablריכוזי הטעמנים אשר נדרשו על מנת לקבל השפעה היו ברמות המילימולרים ,לעומת רמות של µMהדרושות עבור רוב המעכבים המשווקים מסחרית .מצד שני ,לא נמצאו עד כה מעכבים ספציפים ל GRKs -וחקר פעילותה הייחודית של כל אחת מן הקינאזות הללו נעשה עד היום ע"י פגיעה בביטוי הקינאזה ,למשל ע"י שימוש ב .siRNA -בנוסף ,בהשוואה למעכבים אחרים הדורשים זמן חשיפה ממוצע לתאים של 20עד 45דקות )אך יכול להגיע גם לשעות( ,הטעמנים האמפיפטיים חודרים במהירות לתוך ציטוזול התאים ומגיעים לריכוזים אפקטיביים תוך זמן קצר יחסית ) 10דקות בלבד(. מכיוון ש GRK2 -ו GRK5 -הינן שתי הקינאזות האחראיות על הדסנסיטיזציה ההומולוגית של הקולטן ה ,β2AR -התוצאות שתוארו כאן מתייחסות לשתי הקינאזות האלו בלבד .בחינת יכולתם של הטעמנים להשפיע בתנאי in-vivoעל קינאזות אחרות מתוך המשפחה תדרוש שימוש במודלים אחרים .בנוסף, תוצאות המחקר אינן מאפשרות לדעת אם הטעמנים השפיעו במידה שונה על כל אחת משתי הקינאזות. ולמרות זאת ,שתי הקינאזות GRK2ו GRK5 -מעורבות במנגנון הדסנסיטיזציה של המגוון הרחב ביותר של קולטנים ולכן ,על אף שהקולטן ה β2AR -שימש במחקר זה מודל בלבד לקולטני הטעם ,תוצאות המחקר הן בעלות משמעות רחבה יותר. רשימה ארוכה של קולטנים אשר משתייכים למשפחת ה GPCR -התגלו בתאי פקיעית הטעם :בין היתר הקולטנים לנוירוטרנסמיטורים סרוטונין ) ,(67) (5-HTאצטילכולין ) ,(122) (mAChR1וגלוטמאט ) (25) (mGluR4בעלי חשיבות רבה בתקשורת בין תאית .הקולטן לכולציסטוכינין )(61) (CCK-A מתבטא אף הוא בתאי פקיעית הטעם ומשחק כנראה תפקיד בתחושת השובע .מספר קולטנים אדרנרגים α ו ,β -וביניהם הקולטן ה ,(60) β2AR -מתבטאים גם בתאי פקיעית הטעם ,ותפקידם שם עדיין מעורפל. כל הקולטנים הללו משתייכים למשפחת ה GPCRs -וברובם התגלה כי GRK2ו/או GRK5מעורבים בתהליך הדסנסיטיזציה שלהם ) .(54 ,50 ,33לכן ניתן להניח כי לטעמנים האמפיפטיים יכולת להשפיע על תיפקודם של כל אחד מהקולטנים הללו במידה ותהיה להם גישה לציטוזול התאים בהם הם מתבטאים. רבים מן הקולטנים אשר הוזכרו כאן מתבטאים לא רק בתאי הטעם ) ,(type IIאלא גם בתאים מסוג III ) ,(type IIIאשר אחראים על פי מחקרים אחרונים על שחרור נוירוטרנסמיטור ותקשורת עם תאי העצב. הטעמנים האמפיפטיים צפויים לחדור לתוך כל סוגי התאים שבתוך פקיעית הטעם באותה מידה ,ולכן גם לתוך תאים אשר מבטאים את הקולטנים הללו .על פי תוצאות המחקר הנוכחי ,ייתכן והטעמנים האמפיפטיים משפיעים על תחושת הטעם לא רק ע"י שיבוש מנגנון הדסנסיטיזציה של הקולטנים לטעם 72 עצמם אלא גם בדרך עקיפה ע"י השפעה על תפקודם של קולטני GPCRsאחרים האחראים על תהליכים פיזיולוגים מגוונים כגון העברת המידע מתא הטעם הלאה. על פי אותו היגיון ,ניתן להניח כי לטעמנים האמפיפטיים יכולת להשפיע על כל תהליך פיזיולוגי התלוי בקולטני GPCRsבמידה ובאפשרותם לחדור לתוך ציטוזול התאים המבטאים אותם .ידוע כי תרכובות אמפיפטיות רבות ,כגון סכרין ,נרינגין או קפאין ,אינן מפונות מהגוף ביעילות לאחר צריכתן ,וניתן למצוא אותן בריכוזים שונים בין היתר במערכת העיכול ,במערכת השתן ואף בדם .סכרין למשל נספג תוך 15 דקות בתוך המעי ) (105וניתן למצוא אותו כמעט בכל איבר בגוף שעה לאחר הצריכה ) .(93קפאין גם הוא מגיע לדם ע"י ספיגה מהירה מאוד דרך המעי ) ,(83ומכאן מגיע לכל אברי הגוף ) .(11לכן ייתכן כי לטעמנים האלה גישה לתאים מאיברים שונים בגוף .בגלל אופיים האמפיפטי ,ישנה סבירות לפיה הטעמנים האלו חודרים לתוך ציטוזול התאים של איברים שונים ,שם הם יכולים להשפיע על מערכות אשר אינן קשורות כלל למערכת חישת הטעם .אחד האיברים אשר יכול להיות מושפע יותר מאחרים הינו המעי ,אשר אחראי על ספיגת תרכובות מהמזון .מעניין לציין כי מחקרים הראו לאחרונה שהקולטנים לטעם המתוק וחלבון ה gustducin G -מתבטאים בתאי המעי ונראה שהם מווסתים שם את תהליך ספיגת הסוכרים ותחושת השובע ) .(102 ,72בקרה לא נכונה של תהליכים אלו ידועה במחלות כגון סכרת והשמנת יתר .ייתכן כי הטעמנים ,בתוך ציטוזול תאי המעי ,יכולים להשפיע על התהליכים להם קולטני הטעם אחראים בתאים אלו ,ובכך להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים כגון רמות סוכר בדם, התכווצויות המעי ותחושת השובע. 73 רשימת ספרות 1. Abaffy T, Trubey KR, and Chaudhari N. Adenylyl cyclase expression and modulation of cAMP in rat taste cells. Am J Physiol Cell Physiol 284: C1420-1428, 2003. 2. Adler E, Hoon MA, Mueller KL, Chandrashekar J, Ryba NJP, and Zuker CS. A novel family of mammalian taste receptors. Cell 100: 693-702, 2000. 3. Al-Wadei HA, Takahashi T, and Schuller HM. Caffeine stimulates the proliferation of human lung adenocarcinoma cells and small airway epithelial cells via activation of PKA, CREB and ERK1/2. Oncol Rep 15: 431-435, 2006. 4. Avenet P, Hofmann F, and Lindemann B. Signalling in taste receptor cells: cAMP-dependent protein kinase causes depolarization by closure of 44 pS Kchannels. Comp Biochem Physiol A 90: 681-685, 1988. 5. Bachmanov AA, Li X, Reed DR, Ohmen JD, Li S, Chen Z, Tordoff MG, de Jong PJ, Wu C, West DB, Chatterjee A, Ross DA, and Beauchamp GK. Positional cloning of the mouse saccharin preference (Sac) locus. Chem Senses 26: 925-933, 2001. 6. Bailey DG, Dresser GK, Leake BF, and Kim RB. Naringin is a major and selective clinical inhibitor of organic anion-transporting polypeptide 1A2 (OATP1A2) in grapefruit juice. Clin Pharmacol Ther 81: 495-502, 2007. 7. Barone JJ, and Roberts HR. Caffeine consumption. Food Chem Toxicol 34: 119-129, 1996. 8. Behrens M, Brockhoff A, Kuhn C, Bufe B, Winnig M, and Meyerhof W. The human taste receptor hTAS2R14 responds to a variety of different bitter compounds. Biochem Biophys Res Commun 319: 479-485, 2004. 9. Bernhardt SJ, Naim M, Zehavi U, and Lindemann B. Changes in IP3 and cytosolic Ca2+ in response to sugars and non-sugar sweeteners in transduction of sweet taste in the rat. J Physiol 490 (Pt 2): 325-336, 1996. 10. Bezencon C, le Coutre J, and Damak S. Taste-signaling proteins are coexpressed in solitary intestinal epithelial cells. Chem Senses 32: 41-49, 2007. 11. Biaggioni I, Paul S, and Robertson D. A simple liquid-chromatographic method applied to determine caffeine in plasma and tissues. Clin Chem 34: 23452348, 1988. 12. Bo X, Alavi A, Xiang Z, Oglesby I, Ford A, and Burnstock G. Localization of ATP-gated P2X2 and P2X3 receptor immunoreactive nerves in rat taste buds. Neuroreport 10: 1107-1111, 1999. 13. Boguski MS, and McCormick F. Proteins regulating Ras and its relatives. Nature 366: 643-654, 1993. 14. Bohn LM, Gainetdinov RR, Sotnikova TD, Medvedev IO, Lefkowitz RJ, Dykstra LA, and Caron MG. Enhanced rewarding properties of morphine, but not cocaine, in beta(arrestin)-2 knock-out mice. J Neurosci 23: 10265-10273, 2003. 15. Bohn LM, Lefkowitz RJ, Gainetdinov RR, Peppel K, Caron MG, and Lin FT. Enhanced morphine analgesia in mice lacking beta-arrestin 2. Science 286: 24952498, 1999. 16. Boughter JD, Jr., Pumplin DW, Yu C, Christy RC, and Smith DV. Differential expression of alpha-gustducin in taste bud populations of the rat and hamster. J Neurosci 17: 2852-2858, 1997. 74 17. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254, 1976. 18. Bufe B, Hofmann T, Krautwurst D, Raguse JD, and Meyerhof W. The human TAS2R16 receptor mediates bitter taste in response to beta-glucopyranosides. Nat Genet 32: 397-401, 2002. 19. Caicedo A, Kim KN, and Roper SD. Individual mouse taste cells respond to multiple chemical stimuli. J Physiol 544: 501-509, 2002. 20. Caicedo A, Pereira E, Margolskee RF, and Roper SD. Role of the Gprotein subunit alpha-gustducin in taste cell responses to bitter stimuli. J Neurosci 23: 9947-9952, 2003. 21. Caicedo A, and Roper SD. Taste receptor cells that discriminate between bitter stimuli. Science 291: 1557-1560, 2001. 22. Castaing M, Brouant P, Loiseau A, Santelli-Rouvier C, Santelli M, Alibert-Franco S, Mahamoud A, and Barbe J. Membrane permeation by multidrug-resistance-modulators and non-modulators: effects of hydrophobicity and electric charge. J Pharm Pharmacol 52: 289-296, 2000. 23. Chandrashekar J, Hoon MA, Ryba NJP, and Zuker CS. The receptors and cells for mammalian taste. Nature 444: 288-294, 2006. 24. Chandrashekar J, Mueller KL, Hoon MA, Adler E, Feng L, Guo W, Zuker CS, and Ryba NJP. T2Rs function as bitter taste receptors. Cell 100: 703711, 2000. 25. Chaudhari N, Landin AM, and Roper SD. A metabotropic glutamate receptor variant functions as a taste receptor. Nat Neurosci 3: 113-119, 2000. 26. Cho EY, Cho DI, Park JH, Kurose H, Caron MG, and Kim KM. Roles of protein kinase C and actin-binding protein 280 in the regulation of intracellular trafficking of dopamine D3 receptor. Mol Endocrinol 21: 2242-2254, 2007. 27. Chou KH, and Bell LN. Caffeine content of prepackaged national-brand and private-label carbonated beverages. J Food Sci 72: C337-342, 2007. 28. Clapp TR, Medler KF, Damak S, Margolskee RF, and Kinnamon SC. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biol 4: 7, 2006. 29. Cong M, Perry SJ, Lin FT, Fraser ID, Hu LA, Chen W, Pitcher JA, Scott JD, and Lefkowitz RJ. Regulation of membrane targeting of the G protein-coupled receptor kinase 2 by protein kinase A and its anchoring protein AKAP79. J Biol Chem 276: 15192-15199, 2001. 30. Conn PJ, and Pin JP. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate receptors. Annu Rev Pharmacol Toxicol 37: 205-237, 1997. 31. Cummings TA, and Kinnamon SC. Apical K+ channels in Necturus taste cells. Modulation by intracellular factors and taste stimuli. J Gen Physiol 99: 591-613, 1992. 32. Daaka Y, Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. Switching of the coupling of the beta2-adrenergic receptor to different G proteins by protein kinase A. Nature 390: 8891, 1997. 33. Dale LB, Bhattacharya M, Anborgh PH, Murdoch B, Bhatia M, Nakanishi S, and Ferguson SS. G protein-coupled receptor kinase-mediated desensitization of metabotropic glutamate receptor 1A protects against cell death. J Biol Chem 275: 38213-38220, 2000. 34. Damak S, Rong M, Yasumatsu K, Kokrashvili Z, Perez CA, Shigemura N, Yoshida R, Mosinger B, Jr., Glendinning JI, Ninomiya Y, and Margolskee 75 RF. Trpm5 null mice respond to bitter, sweet, and umami compounds. Chem Senses 31: 253-264, 2006. 35. Day PW, Carman CV, Sterne-Marr R, Benovic JL, and Wedegaertner PB. Differential interaction of GRK2 with members of the G alpha q family. Biochemistry 42: 9176-9184, 2003. 36. DeFazio RA, Dvoryanchikov G, Maruyama Y, Kim JW, Pereira E, Roper SD, and Chaudhari N. Separate populations of receptor cells and presynaptic cells in mouse taste buds. J Neurosci 26: 3971-3980, 2006. 37. DerMardirossian C, Rocklin G, Seo JY, and Bokoch GM. Phosphorylation of RhoGDI by Src regulates Rho GTPase binding and cytosol-membrane cycling. Mol Biol Cell 17: 4760-4768, 2006. 38. Deshpande DA, Pascual RM, Wang SW, Eckman DM, Riemer EC, Funk CD, and Penn RB. PKC-dependent regulation of the receptor locus dominates functional consequences of cysteinyl leukotriene type 1 receptor activation. Faseb J 21: 2335-2342, 2007. 39. DeSimone JA, Callaham EM, and Heck GL. Chorda tympani taste response of rat to hydrochloric acid subject to voltage-clamped lingual receptive field. Am J Physiol 268: C1295-1300, 1995. 40. DeSimone JA, Heck GL, and DeSimone SK. Active ion transport in dog tongue: a possible role in taste. Science 214: 1039-1041, 1981. 41. Doolin RE, and Gilbertson TA. Distribution and characterization of functional amiloride-sensitive sodium channels in rat tongue. J Gen Physiol 107: 545554, 1996. 42. Dulac C. The physiology of taste, vintage 2000. Cell 100: 607-610, 2000. 43. Elorza A, Sarnago S, and Mayor F, Jr. Agonist-dependent modulation of G protein-coupled receptor kinase 2 by mitogen-activated protein kinases. Mol Pharmacol 57: 778-783, 2000. 44. Fan G, Shumay E, Malbon CC, and Wang H. c-Src tyrosine kinase binds the beta 2-adrenergic receptor via phospho-Tyr-350, phosphorylates G-protein-linked receptor kinase 2, and mediates agonist-induced receptor desensitization. J Biol Chem 276: 13240-13247, 2001. 45. Finger TE, Danilova V, Barrows J, Bartel DL, Vigers AJ, Stone L, Hellekant G, and Kinnamon SC. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science 310: 1495-1499, 2005. 46. Gainetdinov RR, Bohn LM, Sotnikova TD, Cyr M, Laakso A, Macrae AD, Torres GE, Kim KM, Lefkowitz RJ, Caron MG, and Premont RT. Dopaminergic supersensitivity in G protein-coupled receptor kinase 6-deficient mice. Neuron 38: 291-303, 2003. 47. Gainetdinov RR, Bohn LM, Walker JK, Laporte SA, Macrae AD, Caron MG, Lefkowitz RJ, and Premont RT. Muscarinic supersensitivity and impaired receptor desensitization in G protein-coupled receptor kinase 5-deficient mice. Neuron 24: 1029-1036, 1999. 48. Gainetdinov RR, Premont RT, Bohn LM, Lefkowitz RJ, and Caron MG. Desensitization of G protein-coupled receptors and neuronal functions. Annu Rev Neurosci 27: 107-144, 2004. 49. Galindo-Cuspinera V, Winnig M, Bufe B, Meyerhof W, and Breslin PA. A TAS1R receptor-based explanation of sweet 'water-taste'. Nature 441: 354-357, 2006. 76 50. Gates LK, Ulrich CD, and Miller LJ. Multiple kinases phosphorylate the pancreatic cholecystokinin receptor in an agonist-dependent manner. Am J Physiol 264: G840-847, 1993. 51. Gilbertson TA. The physiology of vertebrate taste reception. Curr Opin Neurobiol 3: 532-539, 1993. 52. Gilbertson TA, Boughter JD, Jr., Zhang H, and Smith DV. Distribution of gustatory sensitivities in rat taste cells: whole-cell responses to apical chemical stimulation. J Neurosci 21: 4931-4941, 2001. 53. Gilbertson TA, Fontenot DT, Liu L, Zhang H, and Monroe WT. Fatty acid modulation of K+ channels in taste receptor cells: gustatory cues for dietary fat. Am J Physiol 272: C1203-1210, 1997. 54. Gray JA, Sheffler DJ, Bhatnagar A, Woods JA, Hufeisen SJ, Benovic JL, and Roth BL. Cell-type specific effects of endocytosis inhibitors on 5hydroxytryptamine(2A) receptor desensitization and resensitization reveal an arrestin, GRK2-, and GRK5-independent mode of regulation in human embryonic kidney 293 cells. Mol Pharmacol 60: 1020-1030, 2001. 55. Harinath S, and Sikdar SK. Inhibition of human TREK-1 channels by caffeine and theophylline. Epilepsy Res 64: 127-135, 2005. 56. Harper JF, and Brooker G. Femtomole sensitive radioimmunoassay for cyclic AMP and cyclic GMP after 2'0 acetylation by acetic anhydride in aqueous solution. J Cyclic Nucleotide Res 1: 207-218, 1975. 57. He W, Danilova V, Zou S, Hellekant G, Max M, Margolskee RF, and Damak S. Partial rescue of taste responses of alpha-gustducin null mice by transgenic expression of alpha-transducin. Chem Senses 27: 719-727, 2002. 58. Heck GL, Mierson S, and DeSimone JA. Salt taste transduction occurs through an amiloride-sensitive sodium transport pathway. Science 223: 403-405, 1984. 59. Hellekant G, af Segerstad CH, Roberts T, van der Wel H, Brouwer JN, Glaser D, Haynes R, and Eichberg JW. Effects of gymnemic acid on the chorda tympani proper nerve responses to sweet, sour, salty and bitter taste stimuli in the chimpanzee. Acta Physiol Scand 124: 399-408, 1985. 60. Herness S, Zhao FL, Kaya N, Lu SG, Shen T, and Sun XD. Adrenergic signalling between rat taste receptor cells. J Physiol 543: 601-614, 2002a. 61. Herness S, Zhao FL, Lu SG, Kaya N, and Shen T. Expression and physiological actions of cholecystokinin in rat taste receptor cells. J Neurosci 22: 10018-10029, 2002b. 62. Hoon MA, Adler E, Lindemeier J, Battey JF, Ryba NJP, and Zuker CS. Putative mammalian taste receptors: a class of taste-specific GPCRs with distinct topographic selectivity. Cell 96: 541-551, 1999. 63. Horrigan LA, Kelly JP, and Connor TJ. Caffeine suppresses TNF-alpha production via activation of the cyclic AMP/protein kinase A pathway. Int Immunopharmacol 4: 1409-1417, 2004. 64. Howell LL, Coffin VL, and Spealman RD. Behavioral and physiological effects of xanthines in nonhuman primates. Psychopharmacology (Berl) 129: 1-14, 1997. 65. Huang AL, Chen X, Hoon MA, Chandrashekar J, Guo W, Trankner D, Ryba NJP, and Zuker CS. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature 442: 934-938, 2006. 66. Huang L, Shanker YG, Dubauskaite J, Zheng JZ, Yan W, Rosenzweig S, Spielman AI, Max M, and Margolskee RF. Ggamma13 colocalizes with gustducin 77 in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nat Neurosci 2: 1055-1062, 1999. 67. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D, and Roper SD. Mouse taste buds use serotonin as a neurotransmitter. J Neurosci 25: 843-847, 2005a. 68. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, Plonsky I, Baur JE, Wu D, and Roper SD. Using biosensors to detect the release of serotonin from taste buds during taste stimulation. Arch Ital Biol 143: 87-96, 2005b. 69. Huang YJ, Maruyama Y, Lu KS, Pereira E, and Roper SD. Mouse taste buds release serotonin in response to taste stimuli. Chem Senses 30 Suppl 1: i39-i40, 2005c. 70. Jaber M, Koch WJ, Rockman H, Smith B, Bond RA, Sulik KK, Ross J, Jr., Lefkowitz RJ, Caron MG, and Giros B. Essential role of beta-adrenergic receptor kinase 1 in cardiac development and function. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 12974-12979, 1996. 71. Jakob I, Hauser IA, Thevenod F, and Lindemann B. MDR1 in taste buds of rat vallate papilla: functional, immunohistochemical, and biochemical evidence. Am J Physiol 274: C182-191, 1998. 72. Jang HJ, Kokrashvili Z, Theodorakis MJ, Carlson OD, Kim BJ, Zhou J, Kim HH, Xu X, Chan SL, Juhaszova M, Bernier M, Mosinger B, Margolskee RF, and Egan JM. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 15069-15074, 2007. 73. Jiang P, Cui M, Zhao B, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Osman R, Margolskee RF, and Max M. Lactisole interacts with the transmembrane domains of human T1R3 to inhibit sweet taste. J Biol Chem 280: 15238-15246, 2005a. 74. Jiang P, Cui M, Zhao B, Snyder LA, Benard LM, Osman R, Max M, and Margolskee RF. Identification of the cyclamate interaction site within the transmembrane domain of the human sweet taste receptor subunit T1R3. J Biol Chem 280: 34296-34305, 2005b. 75. Jiang P, Ji Q, Liu Z, Snyder LA, Benard LM, Margolskee RF, and Max M. The cysteine-rich region of T1R3 determines responses to intensely sweet proteins. J Biol Chem 279: 45068-45075, 2004. 76. Johnson R, Streicher EM, Louw GE, Warren RM, van Helden PD, and Victor TC. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Curr Issues Mol Biol 8: 97-111, 2006. 77. Johnston PV, and Roots BI. Fixation of the central nervous system by perfusion with aldehydes and its effect on the extracellular space as seen by electron microscopy. J Cell Sci 2: 377-386, 1967. 78. Karcz-Kubicha M, Antoniou K, Terasmaa A, Quarta D, Solinas M, Justinova Z, Pezzola A, Reggio R, Muller CE, Fuxe K, Goldberg SR, Popoli P, and Ferre S. Involvement of adenosine A1 and A2A receptors in the motor effects of caffeine after its acute and chronic administration. Neuropsychopharmacology 28: 1281-1291, 2003. 79. Kawai M, Okiyama A, and Ueda Y. Taste enhancements between various amino acids and IMP. Chem Senses 27: 739-745, 2002. 80. Kaya N, Shen T, Lu SG, Zhao FL, and Herness S. A paracrine signaling role for serotonin in rat taste buds: expression and localization of serotonin receptor subtypes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 286: R649-658, 2004. 81. Kim DJ, and Roper SD. Localization of serotonin in taste buds: a comparative study in four vertebrates. J Comp Neurol 353: 364-370, 1995. 78 82. Kim MR, Kusakabe Y, Miura H, Shindo Y, Ninomiya Y, and Hino A. Regional expression patterns of taste receptors and gustducin in the mouse tongue. Biochem Biophys Res Commun 312: 500-506, 2003. 83. King LA. Absorption of caffeine from beverages. Lancet 1: 1313, 1973. 84. Kinnamon SC, Dionne VE, and Beam KG. Apical localization of K+ channels in taste cells provides the basis for sour taste transduction. Proc Natl Acad Sci U S A 85: 7023-7027, 1988. 85. Kishi M, Emori Y, Tsukamoto Y, and Abe K. Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes. Neuroscience 106: 217-225, 2001. 86. Kitagawa M, Kusakabe Y, Miura H, Ninomiya Y, and Hino A. Molecular genetic identification of a candidate receptor gene for sweet taste. Biochem Biophys Res Commun 283: 236-242, 2001. 87. Kobayashi H, Narita Y, Nishida M, and Kurose H. Beta-arrestin2 enhances beta2-adrenergic receptor-mediated nuclear translocation of ERK. Cell Signal 17: 1248-1253, 2005. 88. Krizhanovsky V, Agamy O, and Naim M. Sucrose-stimulated subsecond transient increase in cGMP level in rat intact circumvallate taste bud cells. Am J Physiol Cell Physiol 279: C120-125, 2000. 89. Kuhn C, Bufe B, Winnig M, Hofmann T, Frank O, Behrens M, Lewtschenko T, Slack JP, Ward CD, and Meyerhof W. Bitter taste receptors for saccharin and acesulfame K. J Neurosci 24: 10260-10265, 2004. 90. Kumazawa T, and Kurihara K. Large synergism between monosodium glutamate and 5'-nucleotides in canine taste nerve responses. Am J Physiol 259: R420426, 1990. 91. Kumazawa T, Nakamura M, and Kurihara K. Canine taste nerve responses to umami substances. Physiol Behav 49: 875-881, 1991. 92. Lefkowitz RJ, and Shenoy SK. Transduction of receptor signals by betaarrestins. Science 308: 512-517, 2005. 93. Lethco EJ, and Wallace WC. The metabolism of saccharin in animals. Toxicology 3: 287-300, 1975. 94. Li X, Staszewski L, Xu H, Durick K, Zoller M, and Adler E. Human receptors for sweet and umami taste. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 4692-4696, 2002. 95. Lin W, Finger TE, Rossier BC, and Kinnamon SC. Epithelial Na+ channel subunits in rat taste cells: localization and regulation by aldosterone. J Comp Neurol 405: 406-420, 1999. 96. Lush IE. The genetics of tasting in mice. VI. Saccharin, acesulfame, dulcin and sucrose. Genet Res 53: 95-99, 1989. 97. Luttrell LM, Ferguson SS, Daaka Y, Miller WE, Maudsley S, Della Rocca GJ, Lin F, Kawakatsu H, Owada K, Luttrell DK, Caron MG, and Lefkowitz RJ. Beta-arrestin-dependent formation of beta2 adrenergic receptor-Src protein kinase complexes. Science 283: 655-661, 1999. 98. Luttrell LM, Hawes BE, van Biesen T, Luttrell DK, Lansing TJ, and Lefkowitz RJ. Role of c-Src tyrosine kinase in G protein-coupled receptor- and Gbetagamma subunit-mediated activation of mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem 271: 19443-19450, 1996. 99. Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. The role of beta-arrestins in the termination and transduction of G-protein-coupled receptor signals. J Cell Sci 115: 455-465, 2002. 100. Ma L, and Pei G. Beta-arrestin signaling and regulation of transcription. J Cell Sci 120: 213-218, 2007. 79 101. Mace OJ, Affleck J, Patel N, and Kellett GL. Sweet taste receptors in rat small intestine stimulate glucose absorption through apical GLUT2. J Physiol 582: 379-392, 2007. 102. Margolskee RF, Dyer J, Kokrashvili Z, Salmon KS, Ilegems E, Daly K, Maillet EL, Ninomiya Y, Mosinger B, and Shirazi-Beechey SP. T1R3 and gustducin in gut sense sugars to regulate expression of Na+-glucose cotransporter 1. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 15075-15080, 2007. 103. Masuho I, Tateyama M, and Saitoh O. Characterization of bitter taste responses of intestinal STC-1 cells. Chem Senses 30: 281-290, 2005. 104. Matsunami H, Montmayeur JP, and Buck LB. A family of candidate taste receptors in human and mouse. Nature 404: 601-604, 2000. 105. Matthews HB, Fields M, and Fishbein L. Saccharin: distribution and excretion of a limited dose in the rat. J Agric Food Chem 21: 916-919, 1973. 106. Max M, Shanker YG, Huang L, Rong M, Liu Z, Campagne F, Weinstein H, Damak S, and Margolskee RF. Tas1r3, encoding a new candidate taste receptor, is allelic to the sweet responsiveness locus Sac. Nat Genet 28: 58-63, 2001. 107. McLaughlin SK, McKinnon PJ, and Margolskee RF. Gustducin is a tastecell-specific G protein closely related to the transducins. Nature 357: 563-569, 1992. 108. Min YD, Choi CH, Bark H, Son HY, Park HH, Lee S, Park JW, Park EK, Shin HI, and Kim SH. Quercetin inhibits expression of inflammatory cytokines through attenuation of NF-kappaB and p38 MAPK in HMC-1 human mast cell line. Inflamm Res 56: 210-215, 2007. 109. Misaka T, Kusakabe Y, Emori Y, Arai S, and Abe K. Molecular cloning and taste bud-specific expression of a novel cyclic nucleotide-gated channel. Ann N Y Acad Sci 855: 150-159, 1998. 110. Montmayeur JP, Liberles SD, Matsunami H, and Buck LB. A candidate taste receptor gene near a sweet taste locus. Nat Neurosci 4: 492-498, 2001. 111. Montmayeur JP, and Matsunami H. Receptors for bitter and sweet taste. Curr Opin Neurobiol 12: 366-371, 2002. 112. Moore CA, Milano SK, and Benovic JL. Regulation of receptor trafficking by GRKs and arrestins. Annu Rev Physiol 69: 451-482, 2007. 113. Mori K, Nagao H, and Yoshihara Y. The olfactory bulb: coding and processing of odor molecule information. Science 286: 711-715, 1999. 114. Mueller KL, Hoon MA, Erlenbach I, Chandrashekar J, Zuker CS, and Ryba NJP. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature 434: 225-229, 2005. 115. Naim M, Ronen T, Striem BJ, Levinson M, and Zehavi U. Adenylate cyclase responses to sucrose stimulation in membranes of pig circumvallate taste papillae. Comp Biochem Physiol B 100: 455-458, 1991. 116. Naim M, Seifert R, Nurnberg B, Grunbaum L, and Schultz G. Some taste substances are direct activators of G-proteins. Biochem J 297 ( Pt 3): 451-454, 1994. 117. Naim M, Shaul ME, Spielman AI, Huang L, and Peri I. Permeation of amphipathic sweeteners into taste-bud cells and their interactions with post-receptor signaling components: possible implications for sweet-taste quality. In: Sweetness and Sweeteners: Biology, Chemistry and Psychophysics, edited by Weerasinghe DK, and DuBois GE. Washington, DC: American Chemical Society, 2007, p. In press. 118. Nelson G, Chandrashekar J, Hoon MA, Feng L, Zhao G, Ryba NJP, and Zuker CS. An amino-acid taste receptor. Nature 416: 199-202, 2002. 119. Nelson G, Hoon MA, Chandrashekar J, Zhang Y, Ryba NJP, and Zuker CS. Mammalian sweet taste receptors. Cell 106: 381-390, 2001. 80 120. Nilkaeo A, Bhuvanath S, Praputbut S, and Wisessombat S. Induction of cell cycle arrest and apoptosis in JAR trophoblast by antimalarial drugs. Biomed Res 27: 131-137, 2006. 121. Ninomiya Y, Mizukoshi T, Nishikawa T, and Funakoshi M. Ion specificity of rat chorda tympani fibers to chemical and electrical tongue stimulations. Brain Res 404: 350-354, 1987. 122. Ogura T. Acetylcholine increases intracellular Ca2+ in taste cells via activation of muscarinic receptors. J Neurophysiol 87: 2643-2649, 2002. 123. Okamoto T, Murayama Y, Hayashi Y, Inagaki M, Ogata E, and Nishimoto I. Identification of a Gs activator region of the beta 2-adrenergic receptor that is autoregulated via protein kinase A-dependent phosphorylation. Cell 67: 723730, 1991. 124. Oliet SH, and Bourque CW. Steady-state osmotic modulation of cationic conductance in neurons of rat supraoptic nucleus. Am J Physiol 265: R1475-1479, 1993. 125. Ozben T. Mechanisms and strategies to overcome multiple drug resistance in cancer. FEBS Lett 580: 2903-2909, 2006. 126. Ozdener H, Yee KK, Cao J, Brand JG, Teeter JH, and Rawson NE. Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem Senses 31: 279-290, 2006. 127. Ozeck M, Brust P, Xu H, and Servant G. Receptors for bitter, sweet and umami taste couple to inhibitory G protein signaling pathways. Eur J Pharmacol 489: 139-149, 2004. 128. Penn RB, Pronin AN, and Benovic JL. Regulation of G protein-coupled receptor kinases. Trends Cardiovasc Med 10: 81-89, 2000. 129. Pérez-Ruiz T, Martínez-Lozano C, Tomás1 V, Sanz A, and Bravo E. Quantitative assay for neohesperidin dihydrochalcone in foodstuffs by capillary electrophoresis. Chromatographia 51: 385-389, 2000. 130. Perez-Tomas R. Multidrug resistance: retrospect and prospects in anti-cancer drug treatment. Curr Med Chem 13: 1859-1876, 2006. 131. Perez CA, Huang L, Rong M, Kozak JA, Preuss AK, Zhang H, Max M, and Margolskee RF. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat Neurosci 5: 1169-1176, 2002. 132. Peri I, Mamrud-Brains H, Rodin S, Krizhanovsky V, Shai Y, Nir S, and Naim M. Rapid entry of bitter and sweet tastants into liposomes and taste cells: implications for signal transduction. Am J Physiol Cell Physiol 278: C17-25, 2000. 133. Porcar I, Codoner A, Gomez CM, Abad C, and Campos A. Interaction of quinine with model lipid membranes of different compositions. J Pharm Sci 92: 4557, 2003. 134. Prawitt D, Monteilh-Zoller MK, Brixel L, Spangenberg C, Zabel B, Fleig A, and Penner R. TRPM5 is a transient Ca2+-activated cation channel responding to rapid changes in [Ca2+]i. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 15166-15171, 2003. 135. Premont RT, and Gainetdinov RR. Physiological roles of G protein-coupled receptor kinases and arrestins. Annu Rev Physiol 69: 511-534, 2007. 136. Premont RT, Koch WJ, Inglese J, and Lefkowitz RJ. Identification, purification, and characterization of GRK5, a member of the family of G proteincoupled receptor kinases. J Biol Chem 269: 6832-6841, 1994. 137. Pronin AN, Tang H, Connor J, and Keung W. Identification of ligands for two human bitter T2R receptors. Chem Senses 29: 583-593, 2004. 81 138. Quarta D, Ferre S, Solinas M, You ZB, Hockemeyer J, Popoli P, and Goldberg SR. Opposite modulatory roles for adenosine A1 and A2A receptors on glutamate and dopamine release in the shell of the nucleus accumbens. Effects of chronic caffeine exposure. J Neurochem 88: 1151-1158, 2004. 139. Ravi D, Muniyappa H, and Das KC. Caffeine inhibits UV-mediated NFkappaB activation in A2058 melanoma cells: an ATM-PKCdelta-p38 MAPKdependent mechanism. Mol Cell Biochem 2007. 140. Ribas C, Penela P, Murga C, Salcedo A, Garcia-Hoz C, Jurado-Pueyo M, Aymerich I, and Mayor F, Jr. The G protein-coupled receptor kinase (GRK) interactome: role of GRKs in GPCR regulation and signaling. Biochim Biophys Acta 1768: 913-922, 2007. 141. Richter TA, Caicedo A, and Roper SD. Sour taste stimuli evoke Ca2+ and pH responses in mouse taste cells. J Physiol 547: 475-483, 2003. 142. Rinner O, Makhankov YV, Biehlmaier O, and Neuhauss SC. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron 47: 231-242, 2005. 143. Roper SD. Cell communication in taste buds. Cell Mol Life Sci 63: 14941500, 2006. 144. Rosenzweig S, Yan W, Dasso M, and Spielman AI. Possible novel mechanism for bitter taste mediated through cGMP. J Neurophysiol 81: 1661-1665, 1999. 145. Rossler P, Boekhoff I, Tareilus E, Beck S, Breer H, and Freitag J. G protein betagamma complexes in circumvallate taste cells involved in bitter transduction. Chem Senses 25: 413-421, 2000. 146. Rossler P, Kroner C, Freitag J, Noe J, and Breer H. Identification of a phospholipase C beta subtype in rat taste cells. Eur J Cell Biol 77: 253-261, 1998. 147. Ruiz-Avila L, McLaughlin SK, Wildman D, McKinnon PJ, Robichon A, Spickofsky N, and Margolskee RF. Coupling of bitter receptor to phosphodiesterase through transducin in taste receptor cells. Nature 376: 80-85, 1995. 148. Sahir N, Mas C, Bourgeois F, Simonneau M, Evrard P, and Gressens P. Caffeine-induced telencephalic vesicle evagination in early post-implantation mouse embryos involves cAMP-dependent protein kinase (PKA) inhibition. Cereb Cortex 11: 343-349, 2001. 149. Sainz E, Cavenagh MM, Gutierrez J, Battey JF, Northup JK, and Sullivan SL. Functional characterization of human bitter taste receptors. Biochem J 403: 537-543, 2007. 150. Saito Y, Tetsuka M, Li Y, Kurose H, and Maruyama K. Properties of rat melanin-concentrating hormone receptor 1 internalization. Peptides 25: 1597-1604, 2004. 151. Sarnago S, Elorza A, and Mayor F, Jr. Agonist-dependent phosphorylation of the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) by Src tyrosine kinase. J Biol Chem 274: 34411-34416, 1999. 152. Sato T, and Beidler LM. Broad tuning of rat taste cells for four basic taste stimuli. Chem Senses 22: 287-293, 1997. 153. Seibold A, Williams B, Huang ZF, Friedman J, Moore RH, Knoll BJ, and Clark RB. Localization of the sites mediating desensitization of the beta(2)adrenergic receptor by the GRK pathway. Mol Pharmacol 58: 1162-1173, 2000. 154. Shaul YD, and Seger R. ERK1c regulates Golgi fragmentation during mitosis. J Cell Biol 172: 885-897, 2006. 82 155. Shenoy SK, Drake MT, Nelson CD, Houtz DA, Xiao K, Madabushi S, Reiter E, Premont RT, Lichtarge O, and Lefkowitz RJ. beta-arrestin-dependent, G protein-independent ERK1/2 activation by the beta2 adrenergic receptor. J Biol Chem 281: 1261-1273, 2006. 156. Shim CK, Cheon EP, Kang KW, Seo KS, and Han HK. Inhibition effect of flavonoids on monocarboxylate transporter 1 (MCT1) in Caco-2 cells. J Pharm Pharmacol 59: 1515-1519, 2007. 157. Simon SA, Holland VF, Benos DJ, and Zampighi GA. Transcellular and paracellular pathways in lingual epithelia and their influence in taste transduction. Microsc Res Tech 26: 196-208, 1993. 158. Soares NFF, and Hotchkiss JH. Bitterness reduction in grapefruit juice through active packaging. Packaging Technol Sci 11: 9-18, 1998. 159. Spielman AI, Mody I, Brand JG, Whitney G, MacDonald JF, and Salter MW. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells. Brain Res 503: 326-329, 1989. 160. Spielman AI, Nagai H, Sunavala G, Dasso M, Breer H, Boekhoff I, Huque T, Whitney G, and Brand JG. Rapid kinetics of second messenger production in bitter taste. Am J Physiol 270: C926-931, 1996. 161. Stevens DR, Seifert R, Bufe B, Muller F, Kremmer E, Gauss R, Meyerhof W, Kaupp UB, and Lindemann B. Hyperpolarization-activated channels HCN1 and HCN4 mediate responses to sour stimuli. Nature 413: 631-635, 2001. 162. Stewart RE, DeSimone JA, and Hill DL. New perspectives in a gustatory physiology: transduction, development, and plasticity. Am J Physiol 272: C1-26, 1997. 163. Striem BJ, Naim M, and Lindemann B. Generation of cyclic AMP in taste buds of the rat circumvallate papilla in response to sucrose. Cell Physiol Biochem 1: 46-54, 1991. 164. Striem BJ, Pace U, Zehavi U, Naim M, and Lancet D. Sweet tastants stimulate adenylate cyclase coupled to GTP-binding protein in rat tongue membranes. Biochem J 260: 121-126, 1989. 165. Takara K, Obata Y, Yoshikawa E, Kitada N, Sakaeda T, Ohnishi N, and Yokoyama T. Molecular changes to HeLa cells on continuous exposure to cisplatin or paclitaxel. Cancer Chemother Pharmacol 58: 785-793, 2006. 166. Thompson AJ, Lochner M, and Lummis SC. The antimalarial drugs quinine, chloroquine and mefloquine are antagonists at 5-HT3 receptors. Br J Pharmacol 151: 666-677, 2007. 167. Torii K, and Cagan RH. Biochemical studies of taste sensation. IX. Enhancement of L-[3H]glutamate binding to bovine taste papillae by 5'ribonucleotides. Biochim Biophys Acta 627: 313-323, 1980. 168. Tran TM, Friedman J, Qunaibi E, Baameur F, Moore RH, and Clark RB. Characterization of agonist stimulation of cAMP-dependent protein kinase and G protein-coupled receptor kinase phosphorylation of the beta2-adrenergic receptor using phosphoserine-specific antibodies. Mol Pharmacol 65: 196-206, 2004. 169. Trubey KR, Culpepper S, Maruyama Y, Kinnamon SC, and Chaudhari N. Tastants evoke cAMP signal in taste buds that is independent of calcium signaling. Am J Physiol Cell Physiol 291: C237-244, 2006. 170. Tsunenari T, Hayashi Y, Orita M, Kurahashi T, Kaneko A, and Mori T. A quinine-activated cationic conductance in vertebrate taste receptor cells. J Gen Physiol 108: 515-523, 1996. 83 171. Ugawa S, Minami Y, Guo W, Saishin Y, Takatsuji K, Yamamoto T, Tohyama M, and Shimada S. Receptor that leaves a sour taste in the mouth. Nature 395: 555-556, 1998. 172. Valenti LP. Liquid chromatographic determination of quinine, hydroquinine, saccharin, and sodium benzoate in quinine beverages. J Assoc Off Anal Chem 68: 782-784, 1985. 173. Varkevisser B, and Kinnamon SC. Sweet taste transduction in hamster: role of protein kinases. J Neurophysiol 83: 2526-2532, 2000. 174. Vaughan DJ, Millman EE, Godines V, Friedman J, Tran TM, Dai W, Knoll BJ, Clark RB, and Moore RH. Role of the G protein-coupled receptor kinase site serine cluster in beta2-adrenergic receptor internalization, desensitization, and beta-arrestin translocation. J Biol Chem 281: 7684-7692, 2006. 175. Violin JD, Ren XR, and Lefkowitz RJ. G-protein-coupled receptor kinase specificity for beta-arrestin recruitment to the beta2-adrenergic receptor revealed by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem 281: 20577-20588, 2006. 176. Wong GT, Gannon KS, and Margolskee RF. Transduction of bitter and sweet taste by gustducin. Nature 381: 796-800, 1996. 177. Wright DC, Hucker KA, Holloszy JO, and Han DH. Ca2+ and AMPK both mediate stimulation of glucose transport by muscle contractions. Diabetes 53: 330335, 2004. 178. Xu H, Staszewski L, Tang H, Adler E, Zoller M, and Li X. Different functional roles of T1R subunits in the heteromeric taste receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 14258-14263, 2004. 179. Yan W, Sunavala G, Rosenzweig S, Dasso M, Brand JG, and Spielman AI. Bitter taste transduced by PLC-beta(2)-dependent rise in IP(3) and alphagustducin-dependent fall in cyclic nucleotides. Am J Physiol Cell Physiol 280: C742751, 2001. 180. Yang R, Crowley HH, Rock ME, and Kinnamon JC. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. J Comp Neurol 424: 205-215, 2000. 181. Ye Q, Heck GL, and DeSimone JA. Voltage dependence of the rat chorda tympani response to Na+ salts: implications for the functional organization of taste receptor cells. J Neurophysiol 70: 167-178, 1993. 182. Zamah AM, Delahunty M, Luttrell LM, and Lefkowitz RJ. Protein kinase A-mediated phosphorylation of the beta 2-adrenergic receptor regulates its coupling to Gs and Gi. Demonstration in a reconstituted system. J Biol Chem 277: 31249-31256, 2002. 183. Zhang Y, Hoon MA, Chandrashekar J, Mueller KL, Cook B, Wu D, Zuker CS, and Ryba NJP. Coding of sweet, bitter, and umami tastes: different receptor cells sharing similar signaling pathways. Cell 112: 293-301, 2003. 184. Zhou Q, McCracken MA, and Strobl JS. Control of mammary tumor cell growth in vitro by novel cell differentiation and apoptosis agents. Breast Cancer Res Treat 75: 107-117, 2002. 185. Zubare-Samuelov M, Peri I, Tal M, Tarshish M, Spielman AI, and Naim M. Some sweet and bitter tastants stimulate inhibitory pathway of adenylyl cyclase via melatonin and alpha 2-adrenergic receptors in Xenopus laevis melanophores. Am J Physiol Cell Physiol 285: C1255-1262, 2003. 186. Zubare-Samuelov M, Shaul ME, Peri I, Aliluiko A, Tirosh O, and Naim M. Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and 84 sweet tastants: potential role in taste signal termination. Am J Physiol Cell Physiol 289: C483-492, 2005. 85 רשימת פרסומים ותקצירים 1. Zubare-Samuelov M, Shaul ME, Peri I, Aliluiko A, Tirosh O, Naim M (2005). Inhibition of signal termination-related kinases by membrane-permeant bitter and sweet tastants: potential role in taste signal termination. Am J Physiol Cell Physiol 289: C483-492. 2. Naim M, Shaul ME, Spielman AI, Huang L, Peri I (2007). Permeation of amphipathic sweeteners into taste-bud cells and their interactions with post-receptor signaling components: possible implications for sweet-taste quality. In: Sweetness and Sweeteners: Biology, Chemistry and Psychophysics; ACS Symposium Series 979; Weerasinghe, D.K. and DuBois, G.E. Eds; American Chemical Society, Washington DC. In press. 3. Naim M, Huang L, Spielman AI, Shaul ME, Aliluiko A (2006). Stimulation of taste cells by sweet taste compounds: receptors, downstream signal transduction components, and the implications to sweet taste quality. In: Optimizing Sweet Taste in Food, Spillane, W. Ed., Woodhead Publishing, Ltd. Cambridge, UK. 4. Shaul ME, Peri I, Malach E, Huang L, Spielman AI, Seger R, Naim M (2008). Intracellular inhibition by some sweet and bitter tastants of β2-adrenergic receptor (β2AR) desensitization. Keystone Symposia, Alberta, Canada. Abstract. 5. Naim M, Zubare-Samuelov M, Peri I, Shaul ME (2004). Amphipathic sweet and bitter tastants are inhibitors of G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) in vitro: possible implication for delayed taste termination. FASEB J, 18(4): A313. Abstract. 6. Naim M, Zubare-Samuelov M, Peri I, Shaul ME, Aliluiko A (2004). Amphipathic sweet and bitter tastants permeate cells in vivo and are inhibitors of G-protein-coupled receptor kinases (GRKs) in vitro: possible implication for delayed taste termination. ECRO, Dijon, France. Abstract. 7. Shaul ME, Rodin S, Tarshish M, Nir S, Naim M (2003). Active and passive transport of sweet and bitter amphipathic tastants into taste cells. The Annual Meeting 2003 ISBMB (The Isreali Society for Biochemistry and Molecular Biology), Tel-Aviv University, Tel-Aviv April 2003. Abstract. 86
© Copyright 2024