‫שיעור ‪ :07‬שיטות מולקולריות לריקומבינציית‪DNA‬‬ ‫‪57‬‬ ‫שיעור ‪ :07‬שיטות מולקולריות לריקומבינציית ‪DNA‬‬ ‫המרצה‪ :‬פרופ' דן כנעני‬ ‫ההיסטוריה של ביולוגיה מולקולרית‬ ‫•‬ ‫‪ – 1956‬גילוי מבנה ה‪ DNA-‬כדו‪-‬סליל על ידי ווטסון וקריק‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1962-1964‬במעבדה של אנפנסנד מתגלה הבסיס לקוד הגנטי המורכב משלשות נוקליאוטידים‪.‬‬ ‫הוא מתאים את הקודונים השונים לחומצות האמינו המתאימות להם‪ .‬ב‪ 1964-‬מגובשת הדוֹגמה‬ ‫המרכזית – כיוון זרימת הידע הוא מ‪ DNA-‬דרך אמצעי הביניים ‪ mRNA‬המיתרגם בסוף לחלבון‪.‬‬ ‫ידוע שיש וירוסים שנושאים ‪ RNA‬ולהם יכולות נוספות של שיעתוק ‪ RNA‬על בסיס ‪.RNA‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1964-1968‬קביעת עקרונות התרגום‪ ,‬מקום הביצוע על גבי הריבוזומים והפוליזומים‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1969‬גנתר סטנט‪ ,‬מדען בקטריופאג'ים‪ ,‬מפרסם את ספרו "תור הזהב נגמר" – המעריך כי תור‬ ‫הזהב של התגליות הגדולות נגמר ונותר לגלות רק הפרטים הקטנים‪ .‬האתגר הבא הוא חקר המוח‬ ‫והוא עוזב את הביולוגיה המולקולרית ועובר לחקר המוח‪ .‬ההערכה הזו התנפצה במהירות‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1970‬שני חוקרים מגלים שבתוך הויריון של ‪ RNA-tumor viruses‬יש אנזים ‪Reverse‬‬ ‫‪ transcriptase‬הפועל הפוך לדוֹגמה המרכזית‪ .‬המהפכה שבגילוי מקבלת אישור בוועדת נובל‬ ‫כמה שנים אחר כך‪ .‬לעובדה זו היה ערך לא רק בהבנת מנגנון השכפול של הויריונים אלא‬ ‫בשימוש באנזים הזה ליצירת ‪ DNA‬קומפלמנטרי של ‪ RNA‬על מנת לשבט אותו לנשא ‪.DNA‬‬ ‫זהו אנזים מפתח בשיבוטים רבים )‪.(cDNA‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1970‬שיטה לחתוך ‪ DNA‬בצורה ספציפית לרצף מסויים על ידי אנזימי הגבלה מסוג ‪.II‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1972-3‬שני חוקרים מצליחים לחבר שני קטעי ‪ DNA‬ממקורות שונים – הוירוס הסרטני‬ ‫‪ SV40‬חובר לבקטריופאג' למבדא )‪ (λ‬ונוצר אלמנט כימרי‪ .‬הניסוי פתחה חלון אתי מאוד פרוץ‬ ‫והתחום נכנס לתרדמת עד שפותח מדריך קווים מנחים בשם ‪ NIH‬על מנת לוודא שלא ייעשה‬ ‫שימוש לרעה בניסויים בסוג זה‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1978‬שארפ ורוברטס מוצאים בניסוי שהגן אינו רציף; יש בו איזורים המיוצגים על ידי ה‪-‬‬ ‫‪ mRNA‬שהם האקסונים והמקשרים ביניהם הם האינטרונים‪ ,‬כאשר השיחבור מאפשר יצירת‬ ‫‪ mRNA‬מאקסונים בלבד‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1978‬ריצוף גנטי‬ ‫•‬ ‫‪ – 1985-1988‬יצירת שיטת ה‪ PCR-‬על ידי מוליס לצורך הגברה של ‪ DNA‬ו‪.RNA-‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1991‬יצירה ראשונה של עכברי ‪ ,knock-out‬עכברים הפגועים בגן או גנים מסויימים‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 1997‬איאן וולמוט יוצר כבשה כתוצאה מתהליך תיכנות מחדש )‪ (reprogramming‬על ידי‬ ‫הפריית ביצית מגרעין של תא סומטי לקבלת עובר כמעט תקין לחלוטין – דולי‪ .‬הדבר נוגד את‬ ‫הטענה שהשינויים החלים בהתמיינות אינם הפיכים – שיש הבדלים משמעותיים בין ‪ DNA‬של‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪58‬‬ ‫עובר ל‪ DNA-‬של תא סומטי‪ ,‬ואין אפשרות להחזיר תא סומטי להיות תא עוברי‪ .‬ניסוי זה הוכיח‬ ‫שהרעיון אינו נכון ושיש דבר מה בציטופלזמה של הביצית – פקטורים התפתחותיים –‬ ‫שמאפשרים את ההיפוך‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬התהליך אינו הפיך בצורה מושלמת‪.16‬‬ ‫•‬ ‫‪ – 2006-2008‬ימנאקה מנסה לבצע תיכנות מחדש עם מרכיבים מוגדרים על ידי בדיקת הגנים‬ ‫המבוטאים בעובר המוקדם ביותר ומבטא אותם בגן בוגר וממויין‪ .‬הוא מגלה שתערובת של ‪27‬‬ ‫גנים מחקים את המצב העוברי ומאפשרים לבצע רה‪-‬דיפרנציאציה‪ .‬בהמשך מצמצמים זאת אף‬ ‫לארבעה גנים בלבד‪ .‬הדבר מעלה תקוות רפואיות ליצירת רקמות ואיברים מתאימים לחולה‬ ‫מתאים סומטיים שמקורם באותו מטופל‪.‬‬ ‫הדוֹגמה המרכזית והתוספות עליה‬ ‫תודות‬ ‫לטכניקות‬ ‫הקיימות‬ ‫היום‪,‬‬ ‫המולקולריות‬ ‫התנועה‬ ‫לאורך‬ ‫הדוֹגמה המרכזית אינה בהכרח חד‬ ‫כיוונית‪.‬‬ ‫המחקר‬ ‫ההפוך‬ ‫מכונה‬ ‫‪ reverse genetics‬והינו תולדה של‬ ‫הטכניקות‬ ‫שפותחו‬ ‫בעשורים‬ ‫האחרונים‪.‬‬ ‫שיבוט – ‪cloning‬‬ ‫השיבוט מבקש לבודד גן בודד מאיזורים שאינם מקודדים – ‪ .spacer DNA‬לאחר השיבוט יש צורך‬ ‫לבצע הגברה‪ .‬על מנת לשבט גן נדרשים מספר דברים‪:‬‬ ‫•‬ ‫חיתוך ה‪ DNA-‬בצורה ספציפית על ידי אנזימי הגבלה‪.‬‬ ‫•‬ ‫נשא שלתוכו ניתן יהיה להכניס את חתיכת ה‪ DNA-‬המבודדת‪ .‬הנשא צריך להיות בעל יכולת‬ ‫רפליקציה – דוגמת פלסמיד שהינו בעל ‪ .OriR‬הפלסמידים המשובטים קטנים‪ ,‬נושאים מעט‬ ‫פונקציות והינם פרזיטים – כמעט כל מערכת הרפליקציה של הפונדקאי נדרשת על מנת שיוכלו‬ ‫להשתכפל‪.‬‬ ‫•‬ ‫פונדקאי מתאים לנשא – חיידק‪ ,‬שמר‪ ,‬תאים הומנים‪.‬‬ ‫‪ 16‬את דולי היה צריך להרוג כשנתיים וחצי לאחר לידתה‪ ,‬כי הזדקנותה הייתה מואצת ככל הנראה כיוון שה‪ DNA-‬שלה היה‬ ‫מבוגר והטלומרים שלה קצרים‪ ,‬והיא אופיינה במחלות הזדקנות המאפיינות את התא ממנו היא יצאה‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :07‬שיטות מולקולריות לריקומבינציית‪DNA‬‬ ‫‪59‬‬ ‫אנזימי הגבלה‬ ‫האנזימים‬ ‫ביותר‬ ‫השימושיים‬ ‫לביולוגיה‬ ‫המולקולארית הם אנזימי הגבלה מסוג ‪ II‬בהם‪,‬‬ ‫בניגוד לאנזימי הגבלה מסוג ‪ ,I‬אתר ההכרה ואתר‬ ‫החיתוך של האנזימים זהים‪ .‬האנזימים היוצרים‬ ‫קצוות דביקים מאופיינים ביצירת ‪5'-overhang‬‬ ‫)שקצה '‪ 5‬הוא זה עם הקצה הדביק( או ‪3'-‬‬ ‫‪ .overhang‬תכונת הקצוות הדביקים יעילה ליצירת‬ ‫התאמה קומפלמנטרית בין המחדר לבין הפלסמיד‬ ‫החתוך‪.‬‬ ‫האנזימים המפורטים בטבלה )שקופיות ‪ ,5-6‬מצגת ‪ (7‬הם אנזימים מסוג ‪ .II‬אנזימי הגבלה מסוג ‪ I‬התגלו‬ ‫ארבע שנים קודם לכן‪ ,‬ובהם אתר החיתוך רחוק כ‪ 300-‬זוגות בסיסים מאתר ההכרה‪ .‬באופן מעשי‬ ‫משתמשים רק בסוג ‪ ,II‬המורכב מלמעלה מ‪ 3,000-‬אנזימים שונים מפרוקריוטים שונים‪ .‬עד כה נוקו‬ ‫בחברות מסחריות למעלה מ‪ 600-‬אנזימים המעניקים יכולת מניפולציה רחבה‪.‬‬ ‫אתר ההכרה המינימלי של סוג ‪ II‬מורכב מ‪ 4-‬זוגות בסיסים‪ ,‬כאשר יש גם שמכירים ‪ 6 ,5‬ומעטים‬ ‫המכירים ‪ 8‬זוגות בסיסים‪ .‬מספר זוגות הבסיסים קובע את שכיחותו ההסתברותית של אתר החיתוך‬ ‫ועקב כך את גודל המקטעים המתקבלים – ככל שאתר החיתוך גדול יותר השכיחות קטנה יותר והמקטעים‬ ‫גדולים יותר‪.‬‬ ‫האנזימים יכולים לחתוך וליצור קצה דביק או קצה קטום )‪ ,blunt‬דוגמת ‪ (SmaI‬כאשר יש לזכור‬ ‫שהגדיל העליון הוא זה שהולך מ‪5'-‬‬ ‫ל‪ .3'-‬שמות האנזימים ניתנים לפי‬ ‫החיידק ממנו בודדו את האנזים‪.‬‬ ‫המספור ניתן בהתאם למספר האנזים‬ ‫שהתגלה‬ ‫באותו‬ ‫חיידק‬ ‫)מבחינה‬ ‫היסטורית(‪.‬‬ ‫האיור מדגים חיתוך פרגמנט נתון בשני‬ ‫אנזימי הגבלה‪ ,‬תחילה בנפרד ואז יחד‪.‬‬ ‫בצורה זו ניתן להבין את מבנה ורצף‬ ‫אתרי ההגבלה על גבי הפרגמנט‪.‬‬ ‫לאנזימי הגבלה מסוג ‪ I‬ורוב סוג ‪ II‬יש‬ ‫פעילות‪ ,‬נוסף על ביקוע‪ ,‬של מתילאז‬ ‫)כחלק מהקומפלקס‪ ,‬תת יחידה נפרדת(‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪60‬‬ ‫אנזימי ההגבלה נתגלו כחלק ממנגנון ההגנה של חיידקים בפני פלישה של ‪ DNA‬זר )למשל של חיידק‬ ‫בקוניוגציה או התקפה של פאג' המזריק ‪ DNA‬ומוביל למחזור ליטי או ליזוגני(‪ DNA ,‬שאינו מהמין‬ ‫שלו‪ .‬פעולת הגנה זו נעשית על ידי אנזימי הגבלה המרטשים את ה‪ DNA-‬הזר‪ .‬הזיהוי מבוסס על כך שה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬העצמי ממותל באתרי ההכרה‪/‬חיתוך של האנזים )שאינו מסוגל לחתוך אתרי הכרה‪/‬חיתוך‬ ‫ממותלים(‪ .‬מתילציה = הגנה מפני אנזימי הגבלה‪.‬‬ ‫מכאן שאותו קומפלקס מקיים תחרות אישית בין תת היחידה החותכת לתת היחידה הממתלת‪ .‬האפיניות‬ ‫של תת היחידה הממתלת לרוב נמוכה מזו של תת היחידה החותכת ולכן היא זו שלרוב מנצחת בתחרות‪.‬‬ ‫תופעה זו נצפתה בניסוי של הרבר‪ ,‬בו מיצו את ה‪ DNA-‬הזר שהוכנס לחיידק מקבל בהצלחה וה‪DNA-‬‬ ‫נבדק לאפיון מסויים; נמצא שה‪ DNA-‬ממותל באתרים זהים לרצפים הממותלים ב‪ DNA-‬של החיידק‬ ‫המארח‪ .‬מכאן שהחיידק גם מגן על ה‪ DNA-‬שלו עצמו מפני אנזימי ההגבלה על ידי המתילציה‪.‬‬ ‫בזמן השכפול של הגנום החיידקי‪ ,‬סיב המקור כבר ממותל וזמן קצר לאחר בניית הסיב החדש מתילאז‬ ‫מזהה אתרים חצי‪-‬ממותלים )כי רק סיב אחד ממותל( ומחבר מתיל לסיב השני‪ .‬באופן זה נשמרת‬ ‫המתילציה של הפונדקאי והוא מוגן בפני אנזימי ההגבלה שלו עצמו‪.‬‬ ‫הדבר השני שהרבר עשה היה לבודד את החיתוך של אנזים הגבלה‪ .‬אולם הוא עבד עם אנזימי הגבלה‬ ‫מסוג ‪ I‬ולכן התקשה לאתר אתר חיתוך לעומת אתר הכרה‪ .‬מדען אחר שעבד עם פאג' סלמונלה ראה‬ ‫שהפאג' מתקשה בהדבקה‪ ,‬בודד את אנזים ההגבלה שפגע בגנום החיידקי והצליח לבודד את האנזים‬ ‫ולהגדיר את רצף הזיהוי‪.‬‬ ‫מדען נוסף שקיבל ממנו את האנזים המנוקה עשה מיפוי גנטי ראשון בעזרת אנזימי הגבלה של ‪– SV-40‬‬ ‫וירוס של קופים המתנהג גם כוירוס מתמיר של תאי עכבר ולכן שימש כמודל לוירוס סרטני‪ .‬הדבר נעשה‬ ‫על ידי קביעת מקומות החיתוך של אנזימי ההגבלה ואז איתור המקטעים המכילים פונקציות שונות –‬ ‫הפוקנציות המוקדמות הנמצאות נגד כיוון השעון ל‪ Ori-‬והפונקציות המאוחרות הנמצאות עם כיוון השעון‬ ‫ל‪.Ori-‬‬ ‫החוקר בודד ‪ DNA‬מתאים מודבקים המוזנים בנוקליאוטידים מסומנים‪ ,‬העביר את התוצרים בג'ל‪ ,‬העביר‬ ‫את זה לנייר וחשף לפילם‪ .‬בזמנים קצרים התקבל סימון רק בפרגמנט שהכיל את ‪ ;Ori‬בזמנים ארוכים‬ ‫יותר התגבל סימון בפרגמנטים נוספים‪ .‬כאשר בדק את ההיברידיזציה של ה‪ DNA-‬למקטעים יכול היה‬ ‫להבין היכן נמצאים הגנים המוקדמים והגנים המאוחרים‪ .‬זה היה המיפוי הראשון שנעשה בעזרת‬ ‫אנזימי הגבלה‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :07‬שיטות מולקולריות לריקומבינציית‪DNA‬‬ ‫‪61‬‬ ‫שיבוט ‪ DNA‬לתוך פלסמיד‬ ‫סטנלי כהן היה חוקר פלסמידים‪ .‬פלסמידים הם וקטורים בעלי יכולת רפליקציה אינטרנית הקיימים באופן‬ ‫טבעי בפרוקריוטים‪.‬‬ ‫בוייר היה הראשון שבודד את ‪ .EcoRI‬בהינתן ‪ DNA‬גנומי הנחתך על ידי אנזימי הגבלה הזהים לאלו‬ ‫שחתכו את הפלסמיד )אנזימים שונים חותכים קצוות שונים(‪ ,‬התוצר הלינארי הפתוח מושלם שוב למעגל‬ ‫על ידי כניסת המחדר בעזרת היברידיזציה לפלסמיד הנובעת מקומפלמנטציה של המחדר לקצוות‬ ‫הדביקים‪.‬‬ ‫הקצוות הפתוחים שנותרים בין המחדר לפלסמיד מחוברים על ידי פעולת אנזים הליגאז )המוכנס יחד עם‬ ‫אספקת ‪ .(ATP‬פעולה זו מבטיחה החדרה כיוונית של המחדר לתוך הפלסמיד ומונעת סגירת הפלסמיד על‬ ‫עצמו )כי הקצוות הדביקים שלו אינם בקומפלמנטציה(‪.‬‬ ‫הדרישות מוקטור פלסמיד‬ ‫•‬ ‫‪ – Ori‬הרפליקון זקוק ל‪ Origin of replication-‬שיקנה‬ ‫יכולת שיכפול פרזיטית בתאים הפונדקאים אליהם מוכנס‬ ‫הפלסמיד‪ .‬בהתאם ל‪ Ori-‬נקבע סוג התא שיוכל לאחסן את‬ ‫הפלסמיד‪.‬‬ ‫•‬ ‫מרקר סלקטיבי‪:‬‬ ‫•‬ ‫מרקר סלקטיבי דומיננטי – מאפשר בידוד חיידקים שקלטו פלסמיד תקין וסגור בעל יכולת‬ ‫רפליקציה‪ .‬הדרישה הזו נובעת מכך שתהליך הטרנספורמציה‪ ,‬החדרת הרפליקון לחיידק‪ ,‬מאוד‬ ‫לא יעיל ולכן יש לבודד את המעטים שעברו טרנספורמציה‪ .‬דוגמה‪ :‬עמידות לאנטיביוטיקה‪.‬‬ ‫•‬ ‫מרקר סלקטיבי רצסיבי – החיידק המקבל יהיה חיידק מוטנט שאינו מסוגל לסנטז חומצה‬ ‫אמינית מסויימת‪ .‬המרקר הסלקטיבי יהיה הגן החסר בחיידק ואז החיידקים שקלטו את הפלסמיד‬ ‫יבודדו על ידי זריעת התרבית במצע שאינו מכיל את חומצת האמינו שהחיידק הקומפטנטי פגוע‬ ‫במסלול הביוסינטטי שלה‪.‬‬ ‫ישנם שני אבטיפוסים של פלסמידים היוצרים מספר עותקים גבוה – ‪ – high copy number‬בכל תא‪.‬‬ ‫בנסיונות הראשונים לשיבוט אנזימים של גנים חשובים רצו שהתא החיידקי ישמש בית חרושת להפקת‬ ‫החלבון‪ ,‬ולכן נדרש מספר עותקים גבוה של הפלסמיד‪ .‬החסרון של חיידקים אלו הוא שכאשר ‪50%‬‬ ‫מהמסה החלבונית של התא היא חלבון זר‪ ,‬הדבר עשו להיות טוקסי לחיידק‪.‬‬ ‫לשם כך יש גם רשימת פלסמידים מסוג ‪ low copy number‬בעלי עותקים בודדים בתא‪ .‬מנגד אפשר‬ ‫להכניס את התוצר תחת פרומוטור חזק המופעל על ידי משרן; בצורה זו אין ביטוי גבוה קונסטיטוטיבית‬ ‫אלא רק בזמנים מבוקשים ונתונים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪62‬‬ ‫טרנספורמציות‬ ‫•‬ ‫‪ – Transformation‬העברת ‪ DNA‬נקי לתוך חיידקים‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Transfection‬החדרת ‪ DNA‬נקי לתוך שמרים ותאים אנימליים‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Infection‬החדרת ‪ DNA‬בעזרת וירוס או פאג'‪.‬‬ ‫וקטור הפלסמיד צריך ‪ Ori‬על מנת שיוכל להשתכפל ואלמנט סלקטיבי; תהליך החדרת ה‪ DNA-‬לחיידק‬ ‫אינו יעיל‪ .‬טיפולים לחירור הממברנה עוזרים ליעילותו‪ ,‬בין שעל ידי פולסים של חום או תוספת יוני סידן‬ ‫הנקשרים ל‪ DNA-‬הטעון שלילית ומחוררים את הממברנה‪.‬‬ ‫הטרנספורמנטים נזרעים על צלחת המתאימה לגן הסלקטיבי שעל הוקטור בכדי לבודד את החיידקים‬ ‫המעטים שהכניסו את הפלסמיד‪ .‬מהרגע שהוקטור נכנס לחיידק הוא יכול להתרבות‪ .‬ההתרבות תלויה‬ ‫ב‪ Ori-‬של הוקטור‪.‬‬ ‫קביעת מספר עותקי הוקטור‬ ‫רפליקון ‪ – Coli1‬הפריימר לרפליקציית ‪ DNA‬הוא ‪ RNA‬קצר; הוקטור מסונטז בפרה‪-‬פריימר‪,‬‬ ‫‪ .RNA2‬יש אפיניות גדולה של ‪ RNA‬ל‪ DNA-‬ולכן ה‪ RNA-‬יכול לסלק מקומית את הגדיל של ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬ותוך השיעתוק נוצר היבריד ‪.RNA-DNA‬‬ ‫אנזים בשם ‪ RNase-H‬רואה את הדופלקס היברידי ומשחרר את מה שיהיה בהמשך הפריימר ליצירת ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬החדש‪ .‬לאחר פילמור ההיבריד הוא ‪ .DNA-DNA‬יחד עם זאת‪ ,‬קיים תהליך מתחרה בו ‪RNA‬‬ ‫רגולטורי שלילי‪ RNA1 ,‬הנמצא בקומפלמנטציה ופולאריות הפוכה ל‪ ,RNA2-‬המסוגל בתחילת תהליך‬ ‫השיעתוק של ‪ RNA primer‬לעבור היברידיזציה עם הפריימר‪ .‬יצירת ההיבריד היציב מונעת יצירת‬ ‫דופלקס ה‪ RNA2-ssDNA-‬ומקטינה את הסיכוי שלו להחתך על ידי ‪.RNAse-H‬‬ ‫זהו אלמנט רגולטורי שלילי המוריד את מספר העותקים‪ .‬התחרות הקיימת בין החיתוך על ידי ‪RNase-H‬‬ ‫וההיברידיזציה על ידי ‪ RNA1‬וחלבון רגולטורי שלילי ‪ ROP‬התורם להורדת מספר העותקים היא‬ ‫שתקבע את מספר העותקים הסופי‪.‬‬ ‫מספר העותקים יכול לנוע בין מספרים נמוכים מאוד )‪ (1-2‬ועד מספרים גדולים מאוד )‪ .(3000‬השימוש‬ ‫הוא בהתאם לצורך בכמויות החלבון – כאשר צריך כמויות חלבון גדולות משכפלים אותו במספר עותקים‬ ‫גבוה; אם החלבון עשוי להיות טוקסי ניתן להשתמש במספר עותקים נמוך או להפעיל אותו תחת‬ ‫פרומוטור מושרה כמו ‪ ,LacZ‬אשר כל עוד לא הוסף המשרן ביטוי החלבון ידוכא‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :08‬שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג'‬ ‫‪63‬‬ ‫שיעור ‪ :08‬שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג'‬ ‫פאג' למבדא יכול להדביק את הפונדקאי‪ ,E.coli ,‬בשני מהלכים‪:‬‬ ‫•‬ ‫תהליך ליטי – גורם לליזיס של הפונדקאי ולמוות‪.‬‬ ‫•‬ ‫תהליך ליזוגני – לאחר ההדבקה‪ ,‬במקום רפליקציה מסיבית הגנום של הפאג' עובר אינקורפורציה‬ ‫למקום מוגדר בגנום החיידק המאחסן‪ .‬במשך הזמן‪ ,‬בהינתן סינגל מסויים‪ ,‬הגנום הנגיפי יכול לעבור‬ ‫הוצאה מדוייקת – ‪ – excision‬מתוך כרומוזום החיידק‪ ,‬להכפיל את עצמו ולעבור למצב ליטי‪.‬‬ ‫אורך המולקולה של ‪ DNA‬הפאג' הוא כ‪49,000-‬‬ ‫בסיסים; נראה שיש בעיה בשימוש בו כאתר שיבוט‬ ‫– מכיל יותר אתרי רסטריקציה‪ .‬מדוע אם כן הפך‬ ‫גנום הפאג' מועדף לשיבוט גנים?‬ ‫כ‪ 20,000-‬הבסיסים הפנימיים אינם מקודדים לפונקציות הכרחיות למהלך הליטי; תוך עבודה עם‬ ‫הזרועות השמאלית והימנית בלבד ניתן לקבל מהלך ליטי מושלם‪ ,‬ולכן גודל איזור השיבוט האפשרי הוא‬ ‫מעט יותר מ‪ .20kb-‬זאת בניגוד לפלסמידים‪ ,‬שאפילו כשמקטינים אותם ל‪ ,3kb-‬טרנספורמציה של ‪10kb‬‬ ‫מעלה בעיית יציבות‪.‬‬ ‫הזרועות השמאלית והימנית מכילות את כל הדרוש למהלך ליטי של הפאג'‪ .‬יחד עם העובדה ש‪EcoRI-‬‬ ‫הוא אחד מאנזימי הרסטריקציה הראשונים שגילו‪ ,‬מתברר שמשני צידי איזור ה"מיותר" של גנום הפאג'‬ ‫נמצאים אתרי ‪ EcoRI‬כך שניתן לחתוך את הגנום באנזים‪ ,‬להפריד בין הזרועות הימנית לשמאלית‪,‬‬ ‫למצות אותן ואז לשבט לתוכן מקטעי ‪ DNA‬עם ‪ EcoRI‬בקצוות‪.‬‬ ‫היתרונות של פאג' למבדא לא מסתכמים בכך‪:‬‬ ‫•‬ ‫הזרוע השמאלית מקודדת לחלבוני הראש שעוברים הרכבה‪-‬מקדימה ספונטנית‪ .‬כמו כן באותו צד‬ ‫נמצאים הגנים לזנב‪ ,‬אשר עובר גם הוא הרכבה ספונטנית‪.‬‬ ‫•‬ ‫למבדא מוזרק לתא דרך הזנב ומתחיל‪ ,‬בעזרת אנזימי התא‪,‬‬ ‫להכפיל עצמו במנגנון ‪ .rolling circle‬הוא מייצר ‪100‬‬ ‫עותקים של הגנום‪ .‬התהליך יוצר כפילויות גנום מחוברות‪,‬‬ ‫כאשר המפריד בין היחידות הוא אתר ‪ COS‬ואנזים מיוחד‬ ‫היודע לבקע אותו‪.‬‬ ‫•‬ ‫אנזימים נוספים ממלאים את ראש הויריון בגנום ולאחר מכן‬ ‫מחובר הזנב‪ .‬כ‪ 10%-‬מהקופסיות אינן מכילות ‪ DNA‬ועדיין‬ ‫הזנב מתחבר אליהן‪ ,‬עובדה המורידה מעט מיעילות‬ ‫התהליך‪.‬‬ ‫תהליך הדבקה בפאג' יעיל פי ‪ 1000‬מתהליך הטרנספורמציה על ידי ‪ DNA‬נקי לחיידק‪ .‬מכאן שיש עוד‬ ‫יתרון‪ :‬נוסף על החדרת ‪ DNA‬גדול יותר ניתנת יעילות הדבקה גבוהה פי ‪.1000‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪64‬‬ ‫ב‪ 1975-‬נעשה ניסיון הכנסת ספריית ה‪human -‬‬ ‫‪ cDNA‬הראשונה לתוך פאג' על ידי תום מניאטיס‬ ‫)‪Maniatis‬‬ ‫‪,(Tom‬‬ ‫שהיה‬ ‫מחלוצי‬ ‫שיטות‬ ‫ריקומבינציית ‪ .DNA‬רוב ה‪ mRNA-‬היונקיים‬ ‫מכילים בקצותיהם זנב פוליאדנילין באורך ממוצע‬ ‫של ‪ 180‬נוקליאוטידים‪ ,‬המוסף לאחר השיעתוק‪.‬‬ ‫ניתן לנצל עובדה זו על מנת לבודד את ה‪mRNA-‬‬ ‫משאר ה‪ RNA-‬שבתא‪ ,‬כיוון שידוע ש‪mRNA-‬‬ ‫מהווים רק ‪ 2-5%‬מכלל ה‪ RNA-‬בתא )הרוב זה‬ ‫‪.(rRNA‬‬ ‫לשם כך מכילים קולונות קצרות המכילות חומר‬ ‫תווך דוגמת צלולוז‪ ,‬אליו הודבקו ‪.oligo-dT‬‬ ‫האוליגומר יוצר היבריד עם ‪ ,Poly-A‬וכאשר‬ ‫מעבירים את כלל ה‪ RNA-‬בקולונה בתנאי מלח‬ ‫גבוה‪ ,‬חומצות הגרעין הנותרות בקולונה הן רק‬ ‫‪ mRNA‬שניתן להסיר בהורדת ריכוז המלח‪.‬‬ ‫)‪ (1‬מניאטיס בודד את ה‪ mRNA-‬והכניס אותם‬ ‫למבחנה עם ‪ oligo-dT‬קצרים )‪ 12‬בסיסים בערך(‪.‬‬ ‫האוליגומר יוצר היברידיזציה בנקודה כלשהי על זנב‬ ‫ה‪ poly-A-‬וכך משמש פריימר לפעילות של ‪RT‬‬ ‫)‪ ,(2‬אשר מסוגל לבנות ‪ DNA‬על ‪ RNA‬ו‪DNA-‬‬ ‫על ‪ DNA‬לאחר ש‪ RNase-H-‬ביקע את הקשר של‬ ‫ההיבריד ‪ DNA-RNA‬וסילק את ה‪.RNA-‬‬ ‫בשלב הבא )‪ (3‬מוסיפים אלקלין ליצירת סביבה‬ ‫בסיסית שמפרקת ‪ DNA) RNA‬עמיד בפניו(‪ .‬כמו‬ ‫כן מוסיפים ‪ poly-G‬בקצה המנוגד ל‪ Poly-T-‬על‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :08‬שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג'‬ ‫‪65‬‬ ‫ידי ‪ ,Terminal Transferase‬המופעל לזמן קצר בנוכחות ‪ dG‬כך שהוא מכניס הרבה פוליגואנין לגדיל‪.‬‬ ‫לאחר מכן )‪ (4‬עושים היברידיזציה עם ‪ oligo-dC‬כפריימר שעובר פולימריזציה )‪ (5‬ומקבלים סיב‬ ‫‪ DNA‬משלים‪ .‬באופן הזה מתקבל ‪ DNA‬דו‪-‬גדילי מסוג ‪ – cDNA‬קומפלמנטרי ל‪.mRNA-‬‬ ‫בשלב הזה יש להכניס את הדו‪-‬גדיל בין שתי הזרועות של למבדא‪ .‬לשם כך צריך אתרי חיתוך –‪EcoRI‬‬ ‫המתקבלים על ידי הכנסת אתרי החיתוך בצורה דו‪-‬גדילית שיחוברו לקצוות ה‪ DNA-‬על ידי ליגאז ו‪-‬‬ ‫‪ .ATP‬אולם‪ ,‬כאן עולה בעיה‪ :‬הגנום האנושי יכול להכיל אתרי חיתוך של ‪ ,EcoRI‬דבר שייפגע בגן‬ ‫עצמו‪ .‬כדי להימנע מכך בודדו את ה‪ ,EcoRI Methylase-‬שממתל )‪ (6‬את הדו‪-‬גדיל )לפני חיבור‬ ‫האתרים הייעודיים לחיתוך‪ (7 ,‬ומקנה עמידות לאתרי הכרה‪/‬חיתוך אקראיים שעשויים להימצא בתוך‬ ‫גדילי ה‪ .cDNA-‬עכשיו ניתן לחתוך בעזרת אנזימי ההגבלה המתאימים )‪.(8a‬‬ ‫היום חברות ביוטכנולוגיות מייצרות ‪) EcoRI adaptor‬או לכל אנזים הגבלה אחר( שהוא כבר מייצג את‬ ‫הקצה החתוך על ידי האנזים‪ ,‬עם הקצוות הדביקים‪ .‬מבצעים ליגציה של האדפטור לקצוות ולא צריך לדאוג‬ ‫להגנה על האתרים בתוך הגן כי לא נעשה חיתוך באנזים ההגבלה בפועל‪.‬‬ ‫בשלב הבא מערבבים את שתי הזרועות המבודדות )‪ (8b‬של למבדא ועושים ליגציה עם תערובת ה‪-‬‬ ‫‪ .(9) cDNA‬תודות לקומפלמנטציה מתקבלות מולקולות שלמות שיכולות להיארז בקופסיות ויריון ריקות‬ ‫)‪ ,(10‬המעדיפות להתחבר לזנב רק לאחר הכנסת ‪.DNA‬‬ ‫מדוע הזרועות הקומפלמנטריות לא חוברות אחת לשניה ישירות ללא ‪ cDNA‬ביניהן? על בעיה זו מתגברים‬ ‫בעזרת שימוש בעודף מולארי של ה‪ cDNA-‬על פני הזרועות‪ .‬לפעולה יש חיסרון כי יכולה להיות‬ ‫ליגציה של ה‪ cDNA-‬לעצמו‪ .‬למניעת מצב זה ניתן לטפל בפוספאטאז‪ ,‬המוריד את ‪ 5'-phosphate‬המונע‬ ‫ליגציה של מולקולות ‪ cDNA‬אחת לשנייה‪ .‬הקשרים הקוולנטים החסרים ייווצרו רק בתוך החיידק‪.‬‬ ‫דרך נוספת שנוצרה עם הזמן היא הקטנת הזרועות לגודל מינימלי של ‪ 78%‬מגודל הפאג'; מתחת ל‪,78%-‬‬ ‫האורך של הזרועות אינו מספיק כדי להיארז לתוך קופסית ולכן זרועות קצרות אלו המחוברות אחת לשנייה‬ ‫לא ייצרו פאג' תקין‪ .‬הדבר מונע יצירת ויריונים עם זרועות בלבד‪.‬‬ ‫את הפאג'ים עם ה‪ cDNA-‬זורעים על צלחת מלאה בחיידקים )‪ .(11‬מכל הדבקה של מולקולת פאג' אחת‬ ‫נוצרים ‪ 100‬תוצרים המפוצצים את מעטפת החיידק ותופסים את החיידקים השכנים; כל אחד מהם יוצר‬ ‫עוד ‪ ;100‬לאחר כמה הדבקות ניתן לראות פלאקים המכילים אלפי פאג'ים‪ .‬זהו תהליך אמפליפיקציה‬ ‫מאוד גבוה של כל אחת מהמולקולות שמבקשים לפתח ולהרבות‪.‬‬ ‫על מנת לגלות האם באחת הפלאקים יש ‪ cDNA‬מעניין‪ ,‬ניתן להשתמש בגלאי רדיואקטיבי‬ ‫קומפלמנטרי‪ .‬אם ידועות ‪ 7‬חומצות אמינו מתוך החלבון‪ ,‬ניתן לסנטז אוליגונוקליאוטידים של ‪ 21‬בסיסים‬ ‫היפותטיים של השילובים השונים של הקודונים היוצרים את רצף חומצות האמינו המוכר; מסמנים‬ ‫רדיואקטיבית את הנוקליאוטידים‪.‬‬ ‫על גבי פילטר צלולוז או ניילון‪ ,‬גורמים לליזיס של הפאג'ים בטיפול באלקלין ופותחים את דו גדיל של ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬במקומו‪ .‬בעזרת הגלאי המסומן‪ ,‬הקומפלמנטרי לגן המבוקש‪ ,‬ניתן לסמן רצפי ‪ DNA‬עם הגן‪ .‬את‬ ‫עודפי האוליגומרים שוטפים ונותרים ה‪ DNA-‬המקובעים והאוליגומרים הקומפלמנטרים הנשארים על‬ ‫גבי הפילטר‪.‬‬ ‫כעת חושפים את הפילטר לפילם ורואים היכן יש חשיפה‪ .‬בתנאי המעבדה‪ ,‬הדבר נעשה על ידי הנחת‬ ‫ניטרוצלולוז על הצלחת של הפלאקים למשך דקה; חלק מהפאג'ים נדבקים ואז מוציאים ומכינים דופליקט‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪66‬‬ ‫באופן דומה‪ .‬כך יש שני דופליקטים של ניטרוצלולוז ועדיין יש מספיק פאג'ים על גבי הצלחת‪ .‬עושים‬ ‫ליזיס של הפאג'ים‪ ,‬פיקסציה של ה‪ DNA-‬על‬ ‫הניטרוצלולוז‪ ,‬חשיפה לאוליגומרים ואז חשיפה‬ ‫לפילם ומוצאים שאחד הגלאים הגיב עם אחד‬ ‫הפלאקים‪ .‬מכאן שהפלאק מכיל רצף קומפלמנטרי‪.‬‬ ‫ניתן לבודד את הפאג'ים ולבחון מקרוב האם זה ה‪-‬‬ ‫‪ cDNA‬הקומפלמנטרי ל‪ 6-7-‬חומצות האמינו‪ .‬אם‬ ‫זהו רצף רפטיטיבי‪ ,‬יש בעיה‪.‬‬ ‫היום לא משתמשים בשיטה זו‪ ,‬כיוון שרוב הגנים‬ ‫ידועים‪ ,‬ולכן נעשה שימוש ב‪.PCR-‬‬ ‫ידוע שישנם כ‪ 25,000-‬גנים הומניים )למרות שבכל‬ ‫תא או רקמה יש גנים ייחודיים(‪ .‬כמה פאג'ים יש‬ ‫לסרוק לגילוי הגן הייחודי מבין ‪ 5,000‬גנים שונים‬ ‫המבוטאים ברקמה כלשהי?‬ ‫לא כל הגנים מייצרים ‪ mRNA‬במידה שווה; ‪10%‬‬ ‫מה‪ mRNA-‬בכל תא מיוצרים בהרבה יותר עותקים‬ ‫מהאחרים‪ .‬משום כך לא מספיק לקחת ‪ 5000‬פאג'ים‬ ‫וגם לא ‪ .10,000‬יש להתחשב גם בפרוססיביות‬ ‫הנמוכה של ה‪ .RT-‬ב‪ mRNA-‬מאוד ארוכים – ‪10-‬‬ ‫‪ 12‬קילובסיסים – אין סיכוי ש‪ RT-‬רגיל ייתן את כל‬ ‫הגן‪ .‬אחד הפתרונות הוא לא להשתמש רק‬ ‫בפוליאדנילין‬ ‫בתור‬ ‫פריימר‬ ‫אלא‬ ‫גם‬ ‫באוליגונוקליאוטידים קצרים של ‪ 6‬בסיסים המוספים‬ ‫לפני ה‪ .RT-‬הם נצמדים לרצפים קומפלמנטרים‬ ‫ומשמשים פריימרים לסינטזת ‪ .RT‬באופן זה ניתן‬ ‫לייצג אזורים שונים של ‪ ,mRNA‬ולא רק איזור ה‪-‬‬ ‫'‪.3‬‬ ‫לגן יכולים להיות גם יותר מאתר ‪ Poly-A‬אחד או‬ ‫שיהיה לו שיחבור חלופי המשנה את הרכב‬ ‫האקסונים; גורמים אלו מגדילים את מספר המושבות‬ ‫שיש לסרוק‪ .‬בסך הכל יש לסרוק כמיליון פאג'ים‪.‬‬ ‫בצלחת גדולה ניתן להכניס עד ‪ 50,000‬פאג'ים‬ ‫)לשם השוואה‪ ,‬ניתן להכיל ‪ 500-1000‬מושבות‬ ‫מבודדות בצלחת לכל היותר – יש הבדל של סדרי‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :08‬שיבוט בפלסמיד לעומת שיבוט בפאג'‬ ‫‪67‬‬ ‫גודל בין מספר המושבות שניתן להציג בצלחת(‪ .‬לא כל ה‪ 50,000-‬יוצרים פלאקים מבודדים – במצב זה‬ ‫כל המשטח עובר ליזיס והפאג'ים מתערבבים אלו באלו‪ .‬דגימה מכילה ‪ 50‬פאג'ים במקום פאג' אחד;‬ ‫הדגימה נמהלת‪ ,‬נזרעת מחדשוממנה מבודדים את הפאג'י הרלוונטי‪ .‬מסיבה זו העובדה שיש צורך במיליון‬ ‫פאג'ים אינה מרתיעה ועדיין יעילה יותר משימוש בחיידקים‪.‬‬ ‫ניסוי‬ ‫ללנד הרטוול היה גנטיקאי שבחר לפצח את מחזור‬ ‫התא בשמרים‪ .‬לשם כך הוא יצר כ‪ 60-‬שמרים‬ ‫מוטנטים הפגועים במחזור התא‪ ,‬שרובם רגישים‬ ‫לטמפרטורה גבוהה‪ .‬העלאת הטמפרטורה עצרה‬ ‫את מחזור התא ובשמרים ניתן לראות מורפולוגית‬ ‫מהו שלב המחזור בו התא נמצא‪.‬‬ ‫התקדמות מחזור התא‪ ,‬כך העלתה ההיפותזה‪,‬‬ ‫מבוססת‬ ‫על‬ ‫קינאזות‪,‬‬ ‫פוספורילציה‬ ‫ודה‪-‬‬ ‫פוספורילציה‪ .‬הרטוול לקח פלסמיד המכונה‬ ‫‪ – shuttle vector‬היכול להיות בשתי סביבות‬ ‫ולעבור שיכפול בחיידקים כמו גם בשמרים )בעזרת‬ ‫‪Ori‬‬ ‫חיידקי‬ ‫ו‪-‬‬ ‫‪[autonomousely‬‬ ‫‪ARS‬‬ ‫]‪ .(replicating sequence‬כדי שהרטוול יכיר את‬ ‫הוקטור הוא מכיל גם גורם סלקציה – עמידות לאמפצילין )חיידקים( ו‪ URA3-‬תקין ההכרחי לבניית‬ ‫נוקליאוטיד ‪) U‬מוכנס לשמר פגוע ‪.(ura3‬‬ ‫הוקטור מכיל ‪ polylinker‬המסוגל להיחתך על ידי ‪ BamHI‬ולקלוט גנום ‪ .cDNA‬הוא חתך את הגנים‬ ‫של השמר בחיתוך חלקי על ידי ‪ Sau3A‬לקבלת פרגמנטים בגודל ‪ 2-3‬קילובסיסים‪ .‬לאחר שמכניסים‬ ‫אותם לתוך הוקטור‪ ,‬מכניסים את הפלסמיד לחיידקים‪ ,‬אוספים את המושבות‪ ,‬ומפיקים מהן ‪ .DNA‬בשלב‬ ‫הבא עושים טרנספקציה של ה‪ DNA-‬המנוקה לתוך שמרים וזורעים אותם על מצע ללא אורציל‪.‬‬ ‫לאחר הזריעה של השמרים מעבירים אותם לנייר ניטרוצלולוז‪ ,‬זורעים רפליקט בצלחת ומעבירים אותה‬ ‫לטמפרטורה גבוהה‪ .‬במצב זה רוב המושבות מתות‪ ,‬כי הם מוטנטים‪ ,‬למעט כמה בודדות‪ .‬הבודדות האלה‬ ‫יכולות להיות כאלה שיש להם את הגן החסר על ‪ cDNA‬או רברטנטים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪68‬‬ ‫שיעור ‪ :09‬איפיון ושימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬ ‫אלקטרופורזה יכולה להיעשות בתווך שונה‪ ,‬כמו אקרילאמיד לעומת אגרוז סטנדרטי או אגרוז ‪pulse‬‬ ‫‪ ,field‬כאשר השוני בין התווכים הוא גודל הנקבוביות בין הגרגרים של התווך‪ .‬ככל שהמקטעים גדולים‬ ‫יותר הם ייתקשו לחדור בין החלקיקים‪ ,‬ולכן גודל המרווחים קובע את גודל ה‪ DNA-‬שיוכל הג'ל‬ ‫להפריד‪ .‬ככל שריכוז האגרוז נמוך יותר‪ ,‬הוא יאפשר הפרדה של מולקולות יותר גדולות‪.‬‬ ‫•‬ ‫אקרילאמיד – ‪ 10-1000‬זוגות בסיסים‬ ‫•‬ ‫אגרוז סטנדרטי – ‪ 500-25,000‬זוגות בסיסים‬ ‫•‬ ‫אגרוז ‪ 10,000-2,000,000 - Pulse Field‬זוגות בסיסים‬ ‫אגרוז בריכוזים נמוכים מ‪ 0.5%-‬לא יהיה קשיח מספיק כדי להוות ג'ל ולכן אינו פרקטי‪.‬‬ ‫ההפרדה משאירה את הפרגמנטים‬ ‫הכבדים למעלה ואת הקצרים למטה‪.‬‬ ‫כאשר מוסיפים את הג'ל לתמיסת‬ ‫אתידיום ברומיד ניתן לצבוע אותו‬ ‫ולראות היכן נמצאים הפרגמנטים‪.‬‬ ‫סאות'רן הציע גם להעביר את הג'ל‬ ‫לנייר ניטרוצלולוז או ממברנת ניילון‬ ‫כך שעל גבי הממברנה מתקבלת‬ ‫תמונת ראי של ה‪ DNA-‬כפי שהוא‬ ‫מצוי בתוך הג'ל‪ .‬הסיבים של ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬הדו‪-‬גדילי ניתקים אחד מהשני‬ ‫בעזרת אלקלין‪ ,‬כך שהם פנויים‬ ‫לעבור היברידיזציה עם גלאי ‪DNA‬‬ ‫מסומן המוצא פרגמט ‪ DNA‬ספציפי‪.‬‬ ‫שיטות הרצה – סאות'רן‪ ,‬נורת'ן‪ ,‬ווסטרן‬ ‫שיטת סאות'רן‪-‬בלוט‬ ‫השיטה פותחה על ידי אד סאות'רן וקרויה על שמו‪.‬‬ ‫לאחר הרצה של הג'ל‪ ,‬מניחים את הג'ל על מגש‬ ‫זכוכית ושמים בקערה המכילה תמיסה אלקלית‪ .‬על‬ ‫גבי הזכוכית מניחים נייר סופג שקצותיו מוספגים‬ ‫בתמיסה האלקלית‪ .‬על גבי הנייר מונח הג'ל ומעליו‬ ‫נייר הניטרוצלולוז או הממברנה‪ .‬על גבי הממברנה‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :09‬איפיון ושימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬ ‫‪69‬‬ ‫מניחים עוד נייר ספוג‪ .‬בכוח הנימיות התמיסה‬ ‫עוברת דרך הנייר הסופג הראשון ואל השני‪ ,‬דרך‬ ‫הג'ל; במעבר בג'ל התמיסה קוטפת את ה‪DNA-‬‬ ‫שעובר לנייר הניטרוצלולוז אך אינה יכולה להתקדם‬ ‫הלאה‪ .‬באופן כזה‪ ,‬בתוך כמה שעות‪ ,‬כל תכולת הג'ל‬ ‫עוברת לנייר הניטרוצלולוז‪.‬‬ ‫הנוכחות של התמיסה האלקלית גרמה להיפרדות ה‪-‬‬ ‫‪ in situ DNA‬לשני הגדילים שלו‪ ,‬כך שהוא במצב‬ ‫חד גדילי על הנייר ומוכן לעבור היברידיזציה עם‬ ‫גלאי בעל רצף בסיסים מתאים‪ .‬בשלב האחרון‬ ‫עורכים את ההיברידיזציה וחשיפה של הנייר לפילם‬ ‫וכך מגלים היכן נמצא הגן המבוקש‪.‬‬ ‫שיטת נורת'רן‪-‬בלוט‬ ‫מדען מסטנפורד ערך מודיפיקציות לשיטה כך שתתאים גם לשימוש עבור גדילי ‪ .RNA‬גדילי ה‪RNA-‬‬ ‫עוברים הפרדה בעזרת פורמלדהיד‪ .‬זוהי שיטה משלימה לסאות'רן אלא שהעבודה בה נעשית עם ‪RNA‬‬ ‫והג'ל מורץ עם גדילים בתנאים דה‪-‬נטורטיבים‪.‬‬ ‫שיטת ווסטרן בלוט‬ ‫בשיטה זו נעשת הפרדה של חלבונים בג'ל ‪ ,SDS-PAGE‬כאשר החלבונים מאותרים על ידי נוגדנים‬ ‫ספציפיים כנגד אפיטופים של החלבון המבוקש‪ .‬גם בשיטה זו יש העתקה של החלבונים שהורצו בג'ל‬ ‫לממברנה אשר כנגדה מופעל הנוגדן‪.‬‬ ‫שיטת ריצוף ה‪DNA-‬‬ ‫ב‪ 1978-‬התפרסמו שני מאמרים עם שתי שיטות שונות לחלוטין לקביעת רצף ‪ .DNA‬השיטה המקובלת‬ ‫היא שיטתו של ‪ ,Fred Sanger‬כימאי אורגני אנגלי שפיתח‬ ‫שיטה לקביעת רצף מרכיבי חומצות האמינו בחלבון )וזכה בנובל(‬ ‫ואז הסב את עניינו לקביעת רצף ה‪.DNA-‬‬ ‫השיטה מכונה ‪ .dideoxy chain termination method‬היא‬ ‫משתמשת בנוקליאוטיד תלת‪-‬פוספט די‪-‬דיאוקסיריבוז )‪,(ddNTP‬‬ ‫כלומר עמדה '‪ 3‬של סוכר הריבוז בנוקליאוטיד אינה מכילה ‪OH‬‬ ‫אלא ‪ .H‬זאת לעומת הנוקליאוטיד הרגיל‪ ,‬שהוא דיאוקסיריבוז‪,‬‬ ‫אשר חסר לו רק חמצן אחד בעמדה ‪.'2‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪70‬‬ ‫כאשר מכניסים בסינטזת ה‪ DNA-‬את ה‪ ,ddNTP-‬הוא יוצר בקשר '‪ 5'-3‬דרך הפוספט אולם אינו מסוגל‬ ‫להמשיך את הארכת השרשר – אי אפשר לקשור עוד נוקליאוטידים כי אין ‪ OH‬בעמדה '‪ .3‬ברגע ש‪-‬‬ ‫‪ ddNTP‬עובר אינקורפורציה לגדיל‪ ,‬נפסקת ההתארכות של הגדיל‪.‬‬ ‫משום כך‪ ,‬כאשר מניחים לפולימראז לסנטז ‪DNA‬‬ ‫עם ריכוז מסויים של ‪ ddNTP‬ספציפי‪ ,‬ניתן יהיה‬ ‫לקבל גדילים קטועים בנקודות שונות כך שניתן יהיה‬ ‫לנתח אילו בסיסים מוספים באיזה סדר‪.‬‬ ‫הדבר נעשה בעזרת ארבע מבחנות שונות‪ ,‬כאשר כל‬ ‫מבחנה מכילה ריכוז נתון של ארבעה ‪ dNTP‬וריכוז‬ ‫‪ 1/100‬או ‪ 1/50‬של אחד מה‪ .ddNTP-‬באופן‬ ‫רנדומלי ‪ ddNTP‬ייכנס במקומות שונים ולכן‬ ‫ייווצרו חד‪-‬גדילי ‪ DNA‬המופסקים בנקודות שונות‬ ‫של אותו ‪.ddNTP‬‬ ‫כאשר יש ארבע מבחנות שבכל אחת ‪ ddNTP‬שונה‪,‬‬ ‫ניתן להריץ את התוצרים בג'ל )עם צביעה בברומיד(‬ ‫והג'לים )אקרילאמיד עם אוראה לצורך דה‪-‬‬ ‫נטורציה(‪ ,‬שיכולים להפריד בין גדילים הנבדלים‬ ‫בבסיסים אחד בטווח שבין ‪ 10-1000‬בסיסים‪,‬‬ ‫מספקים תמונה של מגוון בנדים בכל אחת מהבאריות – בארית ‪,A‬‬ ‫‪ C ,T‬ו‪ .G-‬כאשר מתחילים מהגדיל הקצר ביותר )התחתון( ועולים‬ ‫כל פעם באחד‪ ,‬ניתן לדעת מה היה רצף הנוקליאוטידים‪.‬‬ ‫לצורך שיפור השיטה‪ ,‬התקינו לייזר בתחתית הג'ל שמעורר‬ ‫פלורופורים שונים שמחוברים ל‪ ddNTP-‬ספציפיים )למשל אדום‬ ‫ל‪ ,G-‬ירוק ל‪ T-‬וכן הלאה(‪ .‬בצורה כזו לפי קצב היציאה של ה‪-‬‬ ‫‪ emission‬מהג'ל ניתן לזהות את הנוקליאוטיד שבקצה השרשרת‪,‬‬ ‫וכך מתקבל גרף פיקים אשר בהפרדה אחת – בהרצת בארית אחת‬ ‫– מציג רצף של עד ‪ 700‬בסיסים‪.‬‬ ‫השיטה משתמשת בהרצה של דידיאוקסינוקליאוטידים עם‬ ‫פלואורפורים ייחודיים לכל נוקליאוטיד כך שבהרצה אחת ניתן‬ ‫יהיה להפריד את הגדילים ולזהות עד ‪ 700‬בסיסים‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :09‬איפיון ושימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬ ‫‪71‬‬ ‫‪PCR – Polymerase Chain Reaction‬‬ ‫שיטה זו יצאה לראשונה ב‪ 1985-‬וזכתה תחילה לזלזול בחשיבותה; המהפך חל ב‪ 1988-‬עם שיפור‬ ‫השיטה‪ .‬הממציא של השיטה הוא קארי מוליס‪ ,‬אוסטרלי שעבד בחברת ביוטכנולוגיה ליד ברקלי‪ ,‬ושיטתו‬ ‫ניסתה להפיק כמויות גדולות של ‪ DNA‬ללא שיבוט – באמצעי טכני‪ ,‬לא ביולוגי לכאורה‪.‬‬ ‫הטכנולוגיה הייתה להשתמש בדו‪-‬גדיל של ‪ .DNA‬בשלב הראשון נעשית דה‪-‬נאטורציה על ידי חימום ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬ל‪ 92°C-‬למשך דקה‪ .‬לאחר מכן מוסיפים עודף פריימרים )אוליגומרים קצרים‪ ,‬עד ‪ 18‬בסיסים(‬ ‫הקומפלמנטרים לכל אחד משני הסיבים משני קצותיו של מקטע מבוקש‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬כשמוסיפים‬ ‫פולימראז ונוקליאוטידים מתקבלת הארכה של השרשרת‪ .‬בשלב הבא מתחיל מחזור נוסף‪.‬‬ ‫כל מחזור מורכב משלושה חלקים‪:‬‬ ‫• דה‪-‬נטורציה – פותחת את הגדילים על ידי חימום‪.‬‬ ‫• אנילינג – הפריימרים יעברו היברידיזציה עם המקטעים הקומפלמנטרים שלהם‪.‬‬ ‫• הארכה – הפולימראז משתמש בפריימרים כדי לסנטז את הגדילים‪.‬‬ ‫בתלות בהרכב הבסיסים של‬ ‫הפריימרים‪ ,‬שלב האנילינג נעשה‬ ‫בטמפרטורה של ‪ .50-70°C‬השלב‬ ‫השלישי נעשה לאחר קירור ל‪37°C-‬‬ ‫על מנת שהפולימראז יעבוד‪.‬‬ ‫על מנת להתחיל במחזור חדש יש‬ ‫לחמם שוב לצורך דה‪-‬נטורציה‪ .‬שלב‬ ‫זה‪ ,‬של חימום גבוה מאוד‪ ,‬פגע‬ ‫בפולימראז והרג אותו – ולכן היה‬ ‫צריך להוסיף פולימראז חדש בכל‬ ‫מחזור‪ .‬בשל כך ב‪ 1985-‬הריאקציה היתה לא יעילה והוכרזה כלא עובדת‪.‬‬ ‫ב‪ 1987-‬קארל מוליס הצהיר שיש לחפש פולימראז עמיד לחום על מנת שניתן יהיה לעבוד עם השיטה;‬ ‫פולימראז כזה ניתן יהיה להפיק מאורגניזמים הרגילים לחום‪ ,‬למשל יצורים שחיים בסביבת הגייזרים של‬ ‫ילוסטון‪ .‬הפולימראז שמצאו שם הוא כזה שעמיד לחום ב‪ 92°C-‬ועבד אופטימלית ב‪.72°C-‬‬ ‫מכאן‪ ,‬שבזמן ‪ 0‬כשמתחילים את התגובה ניתן כבר להוסיף את הפולימראז ואפשר להריץ מחזורים רבים‬ ‫ללא הוספת אנזים‪ .‬בצורה זו השיטה הפכה משיטה לא יעיה לשיטה אשר בתוך מחזורים ספורים בלבד‬ ‫ניתן לקבל את הפרגמנטים המוגדרים על ידי הפריימרים בכמויות עצומות‪ .‬האנזים שעשה את ההבדל הוא‬ ‫‪.Taq polymerase‬‬ ‫ה‪ PCR-‬דורש כתחל פרגמנט מאוד קצר – ‪ 18‬נוקליאוטידים‪ .‬כיום מייצרים אנזים ‪ taq‬מאוד פרוססיבי‪,‬‬ ‫כך שניתן לקבל חתיכות של עד ‪ 20kb‬של גנום – גנים שלמים במקרים של שמרים – בפעילות פשוטה‪.‬‬ ‫לפריימרים אפשר להוסיף בקצה '‪ 5‬אתרי רסטריקציה‪ .‬על אף שאין הומולוגיה בין אתרי הרסטריקציה‬ ‫לתבנית‪ ,‬מהר מאוד הרצף המקביל יפלמר את הרצף הזר‪ .‬בצורה זו ניתן יהיה לחתוך את הגדיל הנוצר‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪72‬‬ ‫בריאקציה ולשבט אותו לפלסמידים‪ .‬מניפולציה קטנה זו גרמה לכך שניתן יהיה לשבט בקלות איזורים‬ ‫שהוגברו ב‪.PCR-‬‬ ‫קשה לתאר היום שטחים חשובים במדעי החיים והרפואה ללא ‪:PCR‬‬ ‫•‬ ‫דיאגנוסטיקה רפואית – בעבר היו משתמשים בחתיכת נייר שהועברה על השיניים והונחה במצעי‬ ‫גידול שונים על מנת לזהות חיידקים מזהמים; ‪ PCR‬מאפשר לזהות את החיידקים לפי רצפי ‪DNA‬‬ ‫ידועים של גורם פתוגני‪ ,‬למשל‪.‬‬ ‫•‬ ‫שיטות השיבוט‪ ,‬בימינו‪ ,‬אינן מקובלות בתחום הרפואה כי הגנום היום ידוע; לכן ניתן להשתמש‬ ‫בערכה )קיט( להגברה או לשיבוט על מנת למצוא ולהגביר גן מסויים‪.‬‬ ‫•‬ ‫מעבדות מז"פ וחקר האבולוציה – יש מספיק ‪ DNA‬בשערה אחת על מנת לקבוע את הזהות‬ ‫והשייכות שלה לחשוד‪ .‬גם מציאת ‪ DNA‬קדמוני על מנת לזהות את האבולוציה של מינים שונים‪,‬‬ ‫בכללם האדם‪ ,‬נעזרת ב‪.PCR-‬‬ ‫ריצוף מסיבי מקביל ‪ in situ‬או ‪Deep DNA Sequencing‬‬ ‫כאשר מבקשים לקבוע את רצף הגנום השלם – לא רק הקומפלמנטרי או הגנים אלא כלל הגנום – של‬ ‫אדם‪ ,‬עומדים למעשה בפני משימה אדירה – שכן בבני אדם יש ‪ 3x109‬זוגות בסיסים‪ .‬שיטה זו היא‬ ‫המסייעת בכך‪.‬‬ ‫העקרון הראשון הוא שלא משנה מהי החברה המשתמשת במיחשוב‪ ,‬התוצר המתקבל הוא אוסף רב של‬ ‫מקטעי ‪ .DNA‬במכשירי ‪ Solexa‬מתקבלים ‪ 35‬בסיסים‪ ,‬ב‪ Roche-‬מתקבלים מקטעים של ‪ 120‬בסיסים‪.‬‬ ‫אם רוצים לקבוע רצף של יצור לא מוכר‪ ,‬השיטה אינה טובה – המקטעים קצרים מדי ומקשים על העימוד‬ ‫של הגדילים ללא אבטיפוס או תבנית של הגנום‪.‬‬ ‫לשם כך שוברים גנום מבוקש‪ ,‬למשל של אדם‪ ,‬לחתיכות קצרות; בעזרת ליגאז מוסיפים מולקולות‬ ‫‪ adapter‬בקצה אחד ולאחר שהדבר מושלם מוסיפים ‪ adapter‬שונה לקצה השני‪ .‬בצורה זו מתקבלות‬ ‫מולקולות שיש להן שני מתאמים שונים משני הקצוות‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :09‬איפיון ושימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬ ‫‪73‬‬ ‫בשלב הבא יש לקבע את הרצפים‬ ‫במצב חד‪-‬גדילי לתמוכה )‪.(in situ‬‬ ‫לשם כך משתמשים בסיליקון מיוחד‪,‬‬ ‫עושים דה‪-‬נטורציה של ה‪DNA-‬‬ ‫להפרדת הגדילים ומקבעים את ה‪-‬‬ ‫‪ ssDNA‬דרך אחד מקצותיו לסיליקון‪.‬‬ ‫בנוסף מקבעים על הסיליקון באותו‬ ‫השלב פריימרים – גדילי ה‪adapters-‬‬ ‫– בצפיפות גבוהה יותר מאשר‬ ‫הגדילים‪ .‬כך מתקבל גדיל מקובע‬ ‫וסביבו פריימרים הזהים למתאמים‪.‬‬ ‫בשלב השלישי‪ ,‬מבצעים‬ ‫‪Bridge‬‬ ‫‪ – PCR‬ה‪ ssDNA-‬שבקצהו מתאם‬ ‫מסוגל להכיר ולעבור היברידיזציה עם‬ ‫הפריימר‬ ‫הקומפלמנטרי‬ ‫שמקובע‬ ‫לסיליקון לידו‪ ,‬וכך הגדיל מתכופף על‬ ‫מנת לעבור היברידיזציה‪ .‬בשלב הזה‬ ‫ניתן‬ ‫להוסיף‬ ‫‪polymerase‬‬ ‫‪taq‬‬ ‫לקבלת תוצרי ‪ PCR‬מקושתים על גבי‬ ‫הסיליקון‪.‬‬ ‫לאחר מכן נעשה עוד מחזור דה‪-‬‬ ‫נטורציה להפרדת הקשת; מכיוון שכל גדיל מקובע‬ ‫למשטח דרך אחד מהפריימרים מתקבלת הגברה של‬ ‫עמודי ה‪ ssDNA-‬המקובעים‪ .‬על המחזורים הנ"ל‬ ‫חוזרים שוב ושוב על מנת להגדיל את שכיחות החד‪-‬‬ ‫גדילים על המשטח‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪74‬‬ ‫בסופו של תהליך מתקבלים צברים‬ ‫של ‪ ssDNAs‬שכולם התחילו מגדיל‬ ‫‪ ssDNA‬יחיד‪ .‬השאיפה היא שיהיו‬ ‫כ‪ 1000-‬תוצרים בכל צבר‪ .‬הללו‬ ‫דרושים על מנת להניב סיגנל מספיק‬ ‫חזק‬ ‫בשלב‬ ‫המתקבלים‬ ‫הריצוף‪.‬‬ ‫הצברים‬ ‫בטכנולוגיה‬ ‫התקבלו‬ ‫בהתחלה בשכיחות של ‪ 40‬מיליון‪.‬‬ ‫בהמשך הצליחו לדחוס אף למעלה מ‪-‬‬ ‫‪ 100‬מיליון צברים על משטח‪.‬‬ ‫השלב הבא הוא הריצוף‪ .‬כל צבר‬ ‫מחובר לנקודה מיקרוסקופית על‬ ‫המשטח‪ .‬תחילה מוסיפים את אחד‬ ‫מהפריימרים המתאמים – למשל‬ ‫הסגול – אשר עובר היברידיזציה עם‬ ‫ה‪ ssDNA-‬המכילים את הפריימר‬ ‫הקומפלמנטרי חופשי‪ .‬לאחר מכן‬ ‫מוסיפים ‪ .ddNTP‬הפלמור נמשך‬ ‫לאורך נוקליאוטיד אחד בלבד‪ .‬כעת‬ ‫מערכת לייזרים מקרינה מצד אחד‬ ‫ומערכת דימות מסתכלת על ‪100‬‬ ‫מיליון נקודות הצברים וקובעת באיזו‬ ‫נקודה נכנסה איזה סוג פלורסנציה‬ ‫)דהיינו איזה ‪.(ddNTP‬‬ ‫ה‪ ddNTP-‬והפלורופור שנמצאים בשימוש כאן הם רברסיבילים – מורידים את הפלורופור שחוסם את‬ ‫ה‪ ddNTP-‬כך שהוא הופך לנוקליאוטיד המשכי‪ ,‬מוסיפים שוב ‪ ,ddNTP‬ומקבלים את הנוקליאוטיד הבא‬ ‫שמתחבר בכל אחת מ‪ 100-‬מיליון הנקודות‪.‬‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫מערכת הדימות מחוברת למחשב הקובע מהו הרצף בכל נקודה והם מחפשים הומולוגיה של‬ ‫הרצף המתקבל לרצף ידוע‪.‬‬ ‫הכמויות המדוברות הן קטנות מאוד‪ ,‬ולכן באופן יחסי הריאקציה זולה פי ‪ 100‬מאשר ריאקציות‬ ‫ישנות יותר‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :10‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬ ‫‪75‬‬ ‫שיעור ‪ :10‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬ ‫‪ Deep DNA sequencing‬יכול להגיע לעלויות שבין ‪ $500-4000‬להרצה‪ ,‬ומרצף בהיקף של ‪ 1010‬זוגות‬ ‫בסיסים‪ ,‬פי ‪ 3‬מגודל הגנום האנושי‪ ,‬באחה"צ אחד‪ .‬במכון ברוד בוושינגטון יש ‪ 96‬מכונות כאלה – לשם‬ ‫השוואה למספר מכונים בודדים בארץ יש רק מכשיר אחד‪ .‬המכון הוא שיתוף פעולה ייחודי בין ‪MIT‬‬ ‫והרווארד עם מקדמה של ‪ 600‬מיליון דולר‪ ,‬כך שיש להם האמצעים הכלכליים להפעיל כמות כזו של מכונות‬ ‫ריצוף‪.‬‬ ‫הפיתוח של ריצוף ה‪ DNA-‬הוביל לכך שניתן לקחת את ה‪ RNA-‬שבתא או ברקמה‪ ,‬להפוך אותו ל‪cDNA -‬‬ ‫‪ counterpart‬ולרצף אותם – כך שניתן לקבל את הריצוף של ה‪ mRNA-‬המתורגמים באותה הרקמה‪.‬‬ ‫שיטה זו קיבלה את הכינוי ‪ .RNA-seq‬כיום ניתן לקבוע בהרצה אחת את כל ה‪ RNA-‬הקצרים בתא ביום‬ ‫אחד‪ ,‬עבודה מפרכת שהייתה בלתי אפשרית בעבר‪.‬‬ ‫כשפותחה היכולת לבודד ‪ cDNA‬הומני‪ ,‬חברות‬ ‫מסחריות וחוקרים ייצרו כמויות גדולות של חיידקים‬ ‫המכילים את תוצרי הגנים החשובים – דוגמת ה‪-‬‬ ‫‪ cDNA‬של ‪G-CSF – granulocyte colony‬‬ ‫‪ .stimulating factor‬הם לקחו פלסמיד עם‬ ‫הפרומוטור של ‪ lacZ‬והכניסו במקום ‪ lacZ‬את הגן‬ ‫המבוקש‪ .‬בעזרת המשרן ‪ IPTG‬ניתן לקבל בתמיסה‬ ‫כמויות גדולות של החלבון – עד ‪ 50%‬מתכולת‬ ‫החלבון החיידקי תהיה החלבון המבוקש‪.‬‬ ‫יחד עם זאת‪ ,‬התקוות להתעשרות מייצור מאסיבי‬ ‫של חלבונים אנושיים התבדו‪ .‬הסיבה היא שהסתבר‬ ‫שלצורך פעילותם הנורמלית של החלבונים נדרשות‬ ‫מודיפיקציות המתחוללות באופן אופייני בתאי יונקים ואינן מצויות בחיידקים‪ .‬החלבון המתקבל אינו זהה‬ ‫לחלבון ההומני‪ ,‬למען זהות ברצף חומצות האמינו‪ ,‬דבר המוריד מערך פעילותו‪ .‬לכן החברות החלו‬ ‫לבטא חלבונים אלו במערכות יונקיות‪.‬‬ ‫טרנספקציות לתאים ממליים‬ ‫טרנספקציה זמנית‬ ‫וקטור הביטוי מורכב מפרומוטור ואחריו ‪ cDNA‬של‬ ‫הגן המבוקש‪.‬‬ ‫ה‪ cDNA-‬מכיל רצף של ‪ AAUAAA‬המאותת לתא‬ ‫כי זהו סוף ה‪ .mRNA-‬אנדונוקליאז מגיע לאתר‪,‬‬ ‫מזהה אותו‪ ,‬מוריד ‪ 12-15‬נוקליאוטידים מהקצה של‬ ‫ה‪mRNA-‬‬ ‫ומוסיף‬ ‫במקומם‬ ‫‪polyA‬‬ ‫בתהליך‬ ‫פוליאדנילציה‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪76‬‬ ‫בפועל‪ ,‬לעיתים קרובות התהליך אינו יעיל ולכן מרבית הוקטורים מכילים ‪ PolyA Addition Site‬המכניס‬ ‫באופן סינטטי את אתר ה‪ AAUAAA-‬לתוך ה‪ mRNA-‬המשועתק מגן העניין שהוכנס לוקטור בכדי לוודא‬ ‫התרחשותו של תהליך הפוליאדנילציה‪.‬‬ ‫בוקטור הביטוי אין אינטרון – הניסיון הראה שהכנסה של אינטרון אינה גוררת הבדל‪ ,‬ולמרות שלכמה‬ ‫מהגנים זה עזר לאחרים זה אך הוריד את רמת הביטוי‪ .‬משום כך מעדיפים לעבוד עם גנים ללא אפשרות‬ ‫השיחבור‪ .‬שימו לב שהוספת אינטרון כוללת גם הוספת איזורי זיהוי של אקסון‪.‬‬ ‫הוקטורים מכילים לרוב כם ‪ .Viral origin of replication‬מכיוון שהביטוי בתא היונקי הוא זמני‪,‬‬ ‫בוחנים אותו למשל ‪ 24-96‬שעות‪ .‬לאחר יותר מ‪ 72-‬שעות גורמות ל‪ DNA-‬לעבור אינטגרציה‬ ‫לכרומוזומים בגרעין‪ ,‬והביטוי שלו אבוד‪ .‬הסיבה היא שמאות העותקים המצויים בגרעין עוברים‬ ‫אינטגרציה או דגרגדציה‪ ,‬ולכן יורדת מידת הביטוי‪ .‬על מנת להגביר את מספר הוקטורים בגרעין‪,‬‬ ‫הוסיפו ‪ OriR‬של נגיף כלשהו‪ ,‬דוגמת ה‪ ,SV40-‬אשר בייצור חלבון ויראלי אחד – ‪Large T Antigene‬‬ ‫– מאפשר למערכת התאית להכיר אותו כרפליקון ולספק הגברה של הביטוי‪ .‬הגן הויראלי נמצא באיזור‬ ‫הקידוד המוקדם של הוירוס‪ ,‬ולכן ניתן היה לקחת את הסגמנט ‪ OriR+early‬של הוירוס‪.‬‬ ‫הכנסת ה‪ DNA-‬העירום לתא נעשית על ידי חירור של הממברנה המאפשר למאקרומולקולות להיכנס‬ ‫לתא – בין אם על ידי פריקת קבל חשמלי )אלקטרופוראציה( או טיפול בתמיסה שמצפה את ה‪DNA-‬‬ ‫ומעודדת את איחויו עם המעטפת הליפידית שבין התא והליפוזום שתופס את המאקרומולקולות‪.‬‬ ‫טרנספקציה יציבה‬ ‫גם כאן מתחילים בהחדרת ה‪ DNA-‬העירום לתאים‬ ‫באותן שיטות; אולם כעת יש לבודד את פרקציית‬ ‫התאים הקטנה שלהן חדר ה‪ DNA-‬הפלסמידי ובהן‬ ‫הוא מבוטא‪.‬‬ ‫הישארות ה‪ DNA-‬כאפיזום או לאחר אינטגרציה‬ ‫אקראית לכרומוזום)ים( היונקיים הוא תהליך לא‬ ‫יעיל – ‪ 1‬מתוך ‪ 10,000‬תאים מבטא גנים‬ ‫מהפלסמיד‪ .‬משום כך יש להשתמש בגורם סלקטיבי‬ ‫שייפטר מהתאים האחרים‪ .‬בחיידקים אלמנט זה כונה‬ ‫‪.dominant selective marker‬‬ ‫באיור ניתן לראות עמידות לאנטיביוטיקה ניאומיצין‪-‬‬ ‫סולפאט )‪ ,(neor‬המעכבת את שלב ההארכה )‪ (elongation‬בתרגום‪ .‬האנטיביוטיקה מאבדת פעילות אם‬ ‫היא מזורחנת‪ ,‬והגן לעמידות עושה בדיוק זאת‪ .‬התאים הבודדים שהכניסו את הפלסמיד‪ ,‬חתכו אותו‬ ‫סביב הגן לעמידות לניאומיצין והכניסו אותה באינטגרציה לגנום התא יוכלו לנטרל את‬ ‫האנטיביוטיקה ולשרוד‪.‬‬ ‫זה היה הסמן הסלקטיבי הדומינננטי הראשון‪ .‬אחריו הופיעו אחרים לאנטיביוטיקות אחרות‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :10‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים‬ ‫‪77‬‬ ‫העובדה שיש עמידות לניאומיצין אינה ערובה לביטוי לגן העניין – האינטגרציה של עמידות‬ ‫לניאומיצין נעשית באופן בלתי תלוי לאינטגרציה של גן העניין ואינה מבטיחה אותה‪ .‬להגדלת‬ ‫הסיכוי לתאחיזה בין שתי היחידות מבצעים חיתוך מוקדם של הפלסמיד באיזור הימני לגן הניאומיצין;‬ ‫חיתוך זה יוצר ‪ DNA‬לינארי‪ .‬ה‪ DNA-‬הלינארי מעדיף לעבור אינטגרציה‬ ‫דרך הקצוות שנוצרו – וכך ניתן לכוון את הקצוות החופשיים שיעברו‬ ‫אינטגרציה לגנום )גם אם לא ניתן לכוון את מקום האינטגרציה(‪ .‬כתוצאה‬ ‫עולה פי ‪ 10‬ההסתברות לאינטגרציה של שני הגנים בגנום‪.‬‬ ‫ניתן להשתמש בשיטות אחרות על מנת לקשר בין שני הגנים‪ .‬הוקטור הבא הוא וקטור מאוחר יחסית‪,‬‬ ‫כאשר הגן לעמידות נמצא אחרי הפרומוטור הויראלי החזק ואתר הוספת ‪ .PolyA‬הוקטור מיועד לחקר‬ ‫של פרומוטורים – המוכנסים ל‪ ,MCS-‬ואז מביאים לשיעתוק וביטוי ה‪ GFP-‬הסמוך‪ GFP .‬ניחן ביכולת‬ ‫לאחות אותו לחלבון בקצה הקרבוקסילי‪ ,‬באותה מסגרת קריאה‪ ,‬מבלי לאבד מהפעילות של אף אחד‬ ‫מהחלבונים המאוחים‪ .‬בצורה זו ניתן לראות בעיניים – אפילו לפני בדיקת תפקוד החלבון – האם הוא‬ ‫נכנס לפי בדיקת הזוהר של ה‪.GFP-‬‬ ‫דרך אחת לקבל תאים פעילים היא להצמיד את ה‪ GFP-‬כגן מדווח לגן‪/‬פרומוטור העניין‪ .‬זהו אינו גן‬ ‫סלקטיבי‪ ,‬אלא אם משתמשים בו לצורך מיון בעזרת ‪ .FACS‬לעומת זאת‪ ,‬ה‪ neo-‬הוא הסלקטור‬ ‫הדומיננטי אך אינו יכול להבטיח שמי שמכיל את העמידות מכיל את גן העניין‪.‬‬ ‫על מנת ליצור תאחיזה בין הסמן הסלקטיבי וגן העניין קיים האלמנט התרגומי ‪IRES (internal‬‬ ‫‪ .(ribosome entry site‬ביונקים קיימים ‪ – mRNA monocystron‬גן אחד בכל ‪ .mRNA‬לרוב‪ ,‬ה‪-‬‬ ‫‪ AUG‬הראשון מה‪ 5'-‬הוא ה‪ AUG-‬בו מתחיל התרגום‪ .‬בנגיפים מסוג הפוליו יש אפשרות ל‪– IRES-‬‬ ‫הריבוזום לאו דווקא יכיר את ה‪ AUG-‬הראשון מ‪ 5'-‬אל '‪ ,3‬אלא יהיו לו ‪ 3‬מסגרות קריאה בהן הוא יכול‬ ‫להיכנס סימולטנית באופן בלתי תלוי‪ .‬על ידי משחק בקונפורמציה של ה‪ mRNA-‬ניתן להכווין את‬ ‫הריבוזום לאתרים ספציפיים‪ .‬אלמנט ה‪ IRES-‬מאפשר לריבוזום לראות את מסגרת הקריאה המתאימה‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪78‬‬ ‫היישום המחקרי יצר יחידת תרגום דו‪-‬ציסטרונית הכוללת את החלבון לעמידות ואת הגן המעניין‪ .‬ביניהם‬ ‫יש יחידת ‪ .IRES‬בצורה זו אותו הפרומוטור מאפשר הפעלה של שני הגנים‪ .‬המצב היחיד שבו תהיה‬ ‫הפרדה בין הגנים יהיה אם תהיה שבירה ביניהם ואינטגרציה של הגן לעמידות לצד פרומוטור חזק בגנום‪.‬‬ ‫ה‪ IRES-‬הוא מנגנון יעיל ליצירת ‪ mRNA‬פוליציסטרוני‪ .‬התופעה של אופרונים פוליציסטרונים מוכרת‬ ‫בפרוקריוטים‪ ,‬אך באאוקריוטים זה לכאורה לא קיים; ה‪ IRES-‬יוצר פוליציסטרוניות מלאכותית‪ .‬עם זאת‪,‬‬ ‫ניתן ליצור ‪ mRNA‬עם מסגרת קריאה פתוחה בצמידות לגן אחד‪ ,‬להכניס ‪ AUG‬החופף חלקית את‬ ‫הטרמינטור והנמצא במרחקים הולכים וגדלים ממנו‪ .‬במצבים כאלה רואים שכנראה הריבוזום שנופל לאחר‬ ‫קודון העצירה מסוגל לזחול מעט קדימה ל‪ AUG-‬קרוב שהינו חופף או סמוך לנקודת הטרמינציה‪.‬‬ ‫שיעור ‪ :10‬אנליזה בהיקף‪-‬גנום של ביטוי גנים‬ ‫בסביבות שנת ‪ 2000‬החלו להתפרסם הרצפים השלמים של אורגניזמים ראשונים; הטיוטה של הגנום‬ ‫האנושי התפרסם רק ב‪ 2002-‬ולכן בתחילה חשבו שיש בו יותר גנים ממה שידוע שיש כיום‪ .‬אורגניזמים‬ ‫פשוטים יותר – דרוזופילה‪ ,‬תולעים‪ ,‬ארבידופסיס – אינם נופלים משמעותית מכמות הגנים בגנום‬ ‫האנושי‪ .‬עובדה זו מראה שאין קשר בין מורכבות האורגניזם לכמות הגנים המוכלים בגנום שלו‪.‬‬ ‫כמו כן הדבר העלה את השאלה בנוגע לכמות הגנים שתפקידם ידוע ושהינם פעילים במנגנונים שונים‬ ‫לעומת גנים שאיננו יודעים את תפקידם; לפחות במחצית מהגנים ההומנים התפקוד הוא תעלומה‪ .‬לאחר כ‪-‬‬ ‫‪ 30‬שנות עבודה‪ ,‬אלפי מעבדות שעבדו בהגדרת הגנים האנושיים ידעו יחד את תפקידם של כרבע מהגנים‬ ‫האנושיים‪ .‬הן הגיעו למסקנה שלא ניתן להמשיך באותה שיטת אנליזה שהייתה מבוססת על ‪one gene at‬‬ ‫‪ ,a time‬שאחרת יידרשו שני דורות עד גילוי כל הגנים ההומנים‪ .‬לשם כך חובה לפתח שיטות גנומיות‪.‬‬ ‫פיתוח המיקרואראי )‪(Microarray‬‬ ‫פטריק בראון מאוניברסיטת סטנפורד‪ ,‬וירולוג במקורו‪ ,‬העסיק את עצמו בטכניקות מולקולריות ומחקרים‬ ‫ניסויים בעלי סיכויים נמוכים‪ .‬הוא ביקש להסתכל על ספקטרום הגנים המתבטאים בשמרים בשני מצבי‬ ‫גידול – על גלוקוז ועל אתנול‪ .‬היה‬ ‫ברור שחייבים להיות סטים של גנים‬ ‫המתבטאים באופן דיפרנציאלי‪ .‬לשם‬ ‫כך פיתח את המערכת שבאיור‪.‬‬ ‫הוא גידל את השמרים בארלנמיירים‬ ‫עם מצע גידול רלוונטי ואז הפיק את‬ ‫הגנום מכל תרבית‪ .‬הוא יצר ‪cDNA‬‬ ‫מה‪ ,RNA-‬ותוך כדי הכניס ‪NTP‬‬ ‫מסומן )ירוק בגלוקוז ואדום באתנול(‪.‬‬ ‫כעת ה‪ cDNA-‬מעורבב ביחס ‪1:1‬‬ ‫בין שני תנאי הגידול‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :10‬אנליזה בהיקף‪-‬גנום של ביטוי גנים‬ ‫‪79‬‬ ‫רפי שלון‪ ,‬סטודנט שלו‪ ,‬לקח סלייד מיקרוסקופי – בעזרת מכשיר המניח טיפה מזערית על צלחת בעלת‬ ‫הרבה באריות הוא מכניס דוגמאות מכל ה‪ DNA-‬השמריים )בתקופה שכבר כל ‪ 6000‬הגנים השמריים‬ ‫היו מבודדים וניתן היה לזהות אותם‪ ,‬ובכל בארית היה ‪ DNA‬אחר(‪.‬‬ ‫דה‪-‬נטורציה של הגנים מפרידה את הגדילים‪ .‬לאחר מכן הם מקובעים לזכוכית ואז עוברים היברידיזציה‪.‬‬ ‫לאחר השטיפה בוחנים את הבאריות עם דטקטור של הפלורופור‪ .‬בכל בארית יש תחרות בין תערובת ה‪-‬‬ ‫‪ DNA‬על גן מסויים‪ :‬אם כמות ה‪ RNA-‬של הגן בתנאי גלוקוז גדולה מאשר באתנול‪ ,‬תהיה פלורוסנציה‬ ‫ירוקה; במצב ההפוך תהיה פלורסנציה אדומה; אם הכמות דומה תתקבל פלורסנציה צהובה‪.‬‬ ‫הנסיונות הראשונים היו פשוטים מאוד – בעיקר כי לא ניתן היה להכניס ‪ 6400‬אתרים בזכוכית נושאת‬ ‫אחת – אבל ניסוי זה הדגים את עקרון ההסתכלות על ‪ RNA‬מכמות גדולה של גנים במקביל‪ .‬מאוחר יותר‬ ‫הוכחה גדולת הטכניקה‪ ,‬ששופרה על מנת ליצור את‬ ‫שיטת ה‪ microarray-‬על ידי חבר סגל בסטנפורד‪.‬‬ ‫נסיון אחר שהתפרסם על ידי קבוצתו של בראון‬ ‫השתמש‬ ‫בתאים‬ ‫הומנים‪.‬‬ ‫כאשר‬ ‫מגדלים‬ ‫פיברובלסטים במצע עני והרעבה לפקטורי גידול‪,‬‬ ‫הם נכנסים לעצירה ופעילות מטאבולית נמוכה; זאת‬ ‫לעומת פיברובלאסטים שכאשר יש להם נסיוב‬ ‫נכנסים לפעילות מטאבולית גבוהה וגידול‪.‬‬ ‫בראון רצה לבדוק את נוכחות הגנים המתבטאים‬ ‫בשני התנאים‪ ,‬ולשם כך השתמש בשיטה דומה‪:‬‬ ‫סימן דיפרנציאלית את ה‪ cDNA-‬שהופק מכל‬ ‫אוכלוסיה ואז לקח ‪ cDNA‬הומני מבודד )בתקופה‬ ‫זו היו כמה אלפי ‪ cDNA‬מבודדים( והעביר אותו‬ ‫בעזרת הרובוט של שלון לזכוכית‪ .‬בצורה כזו‬ ‫התקבלה התמונה הבאה‪:‬‬ ‫האיור מציג ציר זמן בן ‪ 24‬שעות )‪ (Y‬שמראה את ההיברידיזציה של ‪ 8600‬גנים )‪ (X‬לאורך הזמן‪ .‬ירוק‬ ‫מסמן ירידה בביטוי ואדום עלייה בביטוי לעומת הרפרנס‪ ,‬שהוא התאים המורעבים‪ .‬ניתן לאפין דמיון‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪80‬‬ ‫התנהגותי של קבוצות גנים מסויימות – גם מבלי לדעת מה זהותם‪ .‬כאשר בחנו לעומק את הגנים בכל‬ ‫קבוצה נמצאה חוקיות ברורה בין הגנים בקבוצות‪ :‬גנים ‪ D‬הם גנים הקשורים לריפוי פציעה של תרבית‬ ‫)המתבטאים כאשר חותכים תרבית‪ ,‬פעולה הפוגעת בצמידות בין התאים(; ‪ B‬הם גנים של מחזור התא‪.‬‬ ‫זהו אחד הנסיונות הראשונים לאנליזה של ה‪ RNA Transcriptom-‬על גבי מיקרואראי‪ .‬האנליזה‬ ‫מתבססת על ההיברידיזציה‪ .‬לשיטה זו קמו הרבה וריאציות – ניתן לבדוק פולימורפיזם על סמך מידת‬ ‫ההיברידיזציה‪ ,‬למשל; השדרוג המרכזי לשיטה היה על ידי חברת אפימטריקס‪ ,‬אשר הציעה לשים את‬ ‫הדגימות לא על זכוכית אלא על סיליקון בשיטות המתפתחות של מוליכים למחצה‪ ,‬כמו ב‪Deep DNA -‬‬ ‫‪ .Sequencing‬כיום כל הגנום האנושי ממופה על גבי ארבעה משטחי סיליקון כאלו‪.‬‬ ‫המיקרואראי אינם ‪ cDNA‬שעובר היברידיזציה אלא אוליגונוקליאוטידים המסונטזים עם רצף קבוע‬ ‫במקום‪ ,‬כאשר בכל נקודה מסונטז אוליגונוקליאוטיד מסויים‪ .‬אפימטריקס ודומותיה התמחו בתחום זה‬ ‫ויצרו את שיטת המיקרואראי שהפכה לשיטה דיאגנוסטית נפוצה ביותר‪.‬‬ ‫האיור הבא )שקופית ‪ ,14‬מצגת ‪ (10‬הוצג במאמר מפתח במחקר סרטן השד‪ ,‬המאופיין בהיותו קל או קשה‬ ‫יותר במופעים מסויימים‪ .‬שיתוף פעולה בין חברת רוזטה ואחד מבתי החולים המרכזיים באמסטרדם‬ ‫השווה בין ‪ RNA‬שהופק מגידול ראשוני של חולות שאובחנו‪ .‬הם עשו היברידיזציה לאלפי גנים ומצאו‬ ‫את הגנים בעלי הסבירות הטובה ביותר לשמש לפרוגנוזה של החולות‪.‬‬ ‫כל שורה במיקרואראי היא חולה וכך קו אנכי הוא גן )‪ 70‬גנים סה"כ(‪ .‬הטענה הייתה שניתן להשתמש‬ ‫בדוגמת ה‪ RNA-‬מהגידול ולהשוות אותה לייצוג ה‪ RNA-‬של כל ‪ 250‬החולות האחרות; אם הכלל היה‬ ‫הומוגני בתחום‪ ,‬לא נראים הבדלים‪ .‬אם הכלל היה הטרוגני רואים הבדלים‪ .‬סימן אדום מציין ייצור גבוה‬ ‫מהכלל‪ ,‬סימן ירוק אומר ייצור נמוך מהכלל‪ .‬החוקרים טוענים שניתן לחלק על סמך תבנית‬ ‫ההיברידיזציה את החולות לשתי קבוצות‪ :‬העליונה והתחתונה‪ .‬העליונה בעלת פרוגנוזה טובה יותר‬ ‫מהתחתונה‪ .‬הטענה מבוססת על כך שאחרי החלוקה במיקרואראי נבדקו התוצאות העובדתיות בנוגע‬ ‫לחולות היום‪ .‬זמן המעקב הוא עד ‪ 12‬שנים אחורה‪.‬‬ ‫החולות המסומנות באדום פיתחו מטסטאזות רחוקות – שהרחיקו ליותר מאשר בלוטות לימפה הסמוכות‬ ‫לשד‪ .‬הנקודה הכחולה היא סוף זמן המעקב והקווים השחורים מראים את חלוקת המטאסטאזות הקרובות‪.‬‬ ‫נראה שאין הבדל בחלוקה של היווצרות גרורות קרובות‪ ,‬אבל בקבוצה החמורה יש יותר גרורות רחוקות‬ ‫ויותר מוות‪ .‬בצורה זו הם טענו שההיברידיזציה ב‪ 70-‬הגנים מספקת ערך פרדקטיבי שנלקח מתוך ה‪-‬‬ ‫‪ RNA‬הראשוני – לא מתוך הגרורות‪ ,‬ונראה גם שהעובדה שיש או אין גרורות קרובות אינה מהווה‬ ‫אינדיקציה לחומרת המחלה או לסיכוי לגרורות רחוקות‪.‬‬ ‫חתימת ‪ 70‬הגנים אינה יחידה ממינה; יש חתימות נוספות של קבוצות גנים אחרות‪ .‬ה‪ FDA-‬לא אישר את‬ ‫המבחן הזה לחברות הביטוח בארה"ב משום שיש ‪ 30%‬סיכוי לתוצאה ‪.false-positive‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :10‬ביטול התפקוד של גנים ספציפיים ביונקים‬ ‫‪81‬‬ ‫שיעור ‪ :10‬ביטול התפקוד של גנים ספציפיים ביונקים‬ ‫יצירת תאי ‪ ES‬הנושאים מוטציית ‪ knockout‬מוכרת‬ ‫השיטה מדגימה מוטגנזה בעזרת ריקומבינציה הומולוגית‪ .‬המחקר מחבר בין שני דברים לכאורה ברורים‪:‬‬ ‫•‬ ‫המרקר לעמידות לניאומיצין )‪;(neor‬‬ ‫•‬ ‫מרקר דומיננטי שלילי )‪.(tkHSV‬‬ ‫כל אורגניזם שמקבל את ‪ tk‬יכול לעבור סלקציה‬ ‫שתמית אותו; זהו הגן לטימידין‪-‬קינאז של וירוס‬ ‫ההרפס‪ .‬בהוספת אנלוג לטימידין רק ההרפס יודע‬ ‫לזרחן את האנאלוג ולהשתמש בו כמו בטימידין –‬ ‫עובר אינקורפורציה – אל בעצם כך עוצר את‬ ‫סינטזת ה‪ .DNA-‬האנלוג הוא ‪Ganciclovir‬‬ ‫שבנוכחותו נעצר השיכפול‪.‬‬ ‫הגן לניאומיצין צריך להכיל פרומוטור וגם רצף לפוליאדנילציה‪ ,‬שכן הגן הוא חיידקי במקורו וללא‬ ‫הפוליאדנילציה לא ייצא ה‪ mRNA-‬מהגרעין‪.‬‬ ‫הגן של הסלקציה החיובית הוכנס בתוך גן עניין והפך‬ ‫אותו למוטנט‪ .‬באינקורפורציה של המחדר לגנום‪,‬‬ ‫האירועים השכיחים הם כניסה לא ספציפית‪-‬‬ ‫הומולוגית לגנום; רק במקרים נדירים של הכרה‬ ‫וריקומבינציה הומולוגית ייכנס הגן שבין שני‬ ‫המרקרים לתוך הגנום ויחליף לחלוטין את הגן‬ ‫המקורי‪ ,‬התקין‪.‬‬ ‫התאים שהכניסו את הגדיל ללא הומולוגיה הכניסו‬ ‫גם את שני המרקרים ולכן ניתן להרוג אותם בעזרת‬ ‫‪ ;Ganciclovir‬אלו שביצעו ריקומבינציה הומולוגית מכילים רק עמידות לניאומיצין ולכן עמידים לאנלוג‪.‬‬ ‫האירוע הזה כה נדיר עד כי רק ‪ 1-10%‬מהמושבות המבודדות יהיו בעלות הגן המוטנטי‪.‬‬ ‫יכולה להיות גם כניסה לא ספציפית ששברה את מחדר לפני הגן השלילי‪ ,‬ולכן זה עדיין לא יהיה ספציפי‪.‬‬ ‫אם התהליך נעשה בתאי גזע של עכבר‪ ,‬ניתן להזריק את התאים המוצלחים לבלסטוציט של עכבר‪ ,‬ליצור‬ ‫עכברים כימרים ולקבל עכברים בעלי גן פגום‪ ,‬להפריד הומוזיגוטים ולהמשיך במחקר הגן על מודל‬ ‫העכבר‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪82‬‬ ‫שיעור ‪ :11‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים – המשך‬ ‫הבהרה‪pIRES-Era-hyg3 :‬‬ ‫ניתן ליצור ‪ mRNA‬פוליציסטרוני ביונקים בעזרת וקטור המכיל את אלמנט ה‪ .IRES-‬תחת‬ ‫פרומוטור חזק הוכנסה ‪ ,Open Reading Frame‬אחריה אינטרון‪ IRES ,‬ומסגרת קריאה פתוחה של‬ ‫גן בקטריאלי לעמידות לסם ‪) hygomicine‬יחד עם ‪ .(PolyA sequence‬בצורה זו נוצר טרנסקריפט‬ ‫אחד שהולך דרך כל מסגרות הקריאה הפתוחות ומסתיים בפוליאדנילציה‪.‬‬ ‫האפשרות של מסגרת הקריאה השנייה ניתנת על ידי ה‪ .IRES-‬סלקציה להיגרומיצין גורמת‬ ‫לתאחיזה עם מסגרת הקריאה שמעל ההיגרומיצין‪ ,‬המבטיחה שרוב המושבות העמידות‬ ‫לאנטיביוטיקה יבטאו את הגן המבוקש כי הפרומוטור מצוי מעליו‪.‬‬ ‫הדבר עשוי להידפק אם תהיה אינטגרציה ללא הגן השלם והחתיכה תנחת ליד פרומוטור שיניע‬ ‫ביטוי של הגן לעמידות‪ .‬הסיכוי לכך קטן‪ ,‬ולכן עושים אנליזה של המושבות שהתקבלו כדי לוודא‬ ‫שזה לא קרה‪.‬‬ ‫יצירת עכברי ‪Knockout‬‬ ‫ניתן לקחת את ה‪ ORF-‬בלבד והאינטרון של הגן שמצומד לניאומיצין כבר יעבור שיחבור ויוסר מהגדיל‪.‬‬ ‫עדיין צריך להוסיף סיגנל לפוליאדנילציה‪ .‬על משקל זה נוצר וקטור בו כיוונו נחיתה של האלמנט ליד‬ ‫פרומוטור‪ ,‬ואז הוא חיפש מצבים שבהם הסרה של האקסון של הגן הביאה עדיין לביטוי הניאומיצין‪.‬‬ ‫כאשר קפקי‪ ,‬שפיתח את השיטה‪ ,‬שלח גראנט של הטכניקה לפני התוצאות‪ ,‬הוא בנה אותו כך שהוא הכיל‬ ‫רצפים בני ‪ 1000‬נוקליאוטידים שיהיו אקסונים; הוועדה דחתה אותו מתוך טענה שאין זה סביר שתהליך‬ ‫ההומולוגיה יעבוד ברצף כל כך קטן – כי הוא מקופל בכרומוזום בצורה מאוד קומפקטית בכרומטין‪ .‬קפקי‬ ‫השיג מימון ממקומות אחרים ועדיין הצליח להראות שהתהליך עובד‪.‬‬ ‫יחד עם זאת היו דברים בגו – התא מתקשה לבצע ריקומבינציה הומולוגית לכל גן ברצפים כל כך קצרים‪,‬‬ ‫ויש גנים רבים החבויים בהטרוכרומטין ובכרומטין‪ .‬החשיפה של הגנים אינה גדולה ולכן ראו שאם הגן‬ ‫מתבטא בתא הסיכוי לעבור ריקומבינציה גדול יותר – כי הכרומטין באיזור יותר פתוח‪.‬‬ ‫השיטה הזו מורכבת לשיבוט גנים – אקסונים המכילים פחותמ‪ 500-‬נוקליאוטידים היא לא עובדת‪ .‬לרוב‬ ‫משתמשים באיזורים גדולים כגבולות עליונים‪ ,‬שוברים את הוקטור בעזרת אנזימים לפני שמחדירים‬ ‫אותם בפריקת קבל‪ .‬בין ‪ 1-10%‬מהמושבות עוברות אירוע של ריקומבינציה הומולוגית‪ ,‬ו‪90-99%-‬‬ ‫המקרים האחרים הם ריקומבינציה אקראית )המסולקים על ידי הסלקציה השלילית(‪.‬‬ ‫קפקי לא נתן לתלמידיו לעשות את התהליך‪ ,‬אלא רק לשלוש טכנאיות מנוסות מאוד‪ ,‬כי התאים הושתלו‬ ‫בהמשך בבלסטולה של עכבר לקבלת עכבר טרנסגני בו אחד מהאללים )בהנחה שזה לא בכרומוזום המין(‬ ‫יהיה מבוטל; צריך לעשות הכלאה הטרוזיגוטית כדי לקבל צאצאים של ‪.double knock-out‬‬ ‫זו הייתה המעבדה הראשונה שיצרה עכברי נוק‪-‬אאוט בגן ספציפי לפי בקשה‪.‬‬ ‫כיצד ניתן לבדוק האם הייתה הכנסה? ניתן לעשות ‪ PCR‬בגבולות של הגן התקין‪ ,‬אם הגן עבר החלפה‬ ‫ייתקבל רק את הגן עם הניאומיצין ואם לא עבר החלפה ייתקבלו שני תוצרים‪ .‬הפריימרים חייבים להיות מחוץ‬ ‫לגן של הניאומיצין‪ ,‬כדי להראות האם הוא בפנים או לא‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :11‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים – המשך‬ ‫‪83‬‬ ‫מהפכת ה‪miRNA-‬‬ ‫האפשלרות לבצע ביטול מכוון של גן – בתרביות או בעכברים – חוללה מהפכה בביולוגיה המולקולרית‪,‬‬ ‫כי נוצרו מודלים למחלות אנושיות גם בעכברים‪ .‬בתוך תקופה קצרה חוקרים וחברות יצרו עכברי נוק‪-‬‬ ‫אאוט ומכרו אותם‪ .‬אולם יש לזכור שלא כל אתר נגיש לריקומבינציה הומולוגית ולכן לא לכל אתר‬ ‫אפשר ליצור עכבר טרנסגני‪.‬‬ ‫הפרוצדורה אינה פשוטה ואינה בטוחה; היא דורשת אינפורמציה רבה על הגן‪ .‬היום יש יותר מידע וניתן‬ ‫לתכנן וקטורי החלפה‪ ,‬אולם זו עדיין נותרת עבודה מורכבת‪ .‬מסיבה זו נובעת חשיבות הגילוי ב‪ 1998-‬של‬ ‫אנדרו פייר וקרייג מלו – אשר הבחינו בתולעים העגולות ‪ C.elegamce‬בתופעה הבאה‪:17‬‬ ‫ב‪ 1975-‬בדקו האם כשמכניסים לתאים הומנים או עכבריים )‪ anti-sense RNA (asRNA‬לאיזשהו‬ ‫‪ ,mRNA‬הוא יכול לעבור היברידיזציה בציטופלזמה‪ .‬ה‪ asRNA-‬יהיה באיזור ה‪ AUG-‬וכך הריבוזום לא‬ ‫יוכל להתקשר לגדיל והתרגום של החלבון ייעצר‪ .‬המאמר פורסם ב‪ Cell-‬והראה תוצאות שנראו מתאימות‬ ‫להיפותזה – ‪ asRNA‬מונע תרגום ומאפשר חקירת הגן‪.‬‬ ‫על הניסיון ניסו לחזור אלפי מדענים‪ ,‬כל אחד מגן המעניין אותו‪ .‬לא היה ספק שבגן של החוקר וכמה גנים‬ ‫נוספים האפקט התקבל והתוצאות היו נכונות; אך מדענים אחרים ראו שזה לא עבד‪ .‬היאוש החל לחלחל‪,‬‬ ‫והמחשבה הייתה שזה עבד לחוקר הראשון מתוקף מזל בלבד‪.‬‬ ‫בתולעים העגולות‪ ,‬פייר בודד גן מסויים והחליט‬ ‫לנסות ללמוד על הגן בעזרת ‪ .asRNA‬הוא הזריק‬ ‫אותו לגונדות של העובר והסתכל באמצעות נוגדנים‬ ‫או ‪ RNA‬מסומן שעובר היברידיזציה ל‪mRNA-‬‬ ‫כדי לראות האם יש ביטוי של החלבון‪.‬‬ ‫השיטה היא הכנסת גדיל ‪ Sense‬של גן העניין על גבי וקטור חיידקי המכיל גם ‪RNA polymerase‬‬ ‫מתאים‪ .‬לאחר מכן הופכים את ה‪ cDNA-‬ובאוריינטציה הפוכה של הגן ניתן לקבל תחת אותו‬ ‫פרומוטור את ה‪ .asRNA-‬הוא הכניס את שני הוקטורים – הראשון כביקורת והשני כניסוי – לתולעים‬ ‫וראה שיש ירידה קלה בביטוי שהתקבלה על ידי שני הוקטורים יחד‪ .‬לפיכך החליט לעשות ביקורת‬ ‫נוספת על ידי ‪ :double strand RNA‬הוא לקח את שני הוקטורים‪ ,‬עשה להם אנילינג‪ ,‬והזריק את ה‪-‬‬ ‫‪ .dsRNA‬התוצאה הייתה ירידה דרסטית בביטוי החלבון‪.‬‬ ‫פייר היה זהיר מספיק ואמר שייתכן שהתופעה נובעת מאינטרפרונים‪ .‬ידוע היה ש‪ dsRNA-‬מעודד ביטוי‬ ‫אינטרפרונים ולכן יכול להיות שהתופעה טריוויאלית‪ ,‬והאינטרפרונים הם שמעכבים את הסינטזה של‬ ‫החלבונים‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬ידוע גם שאם מקצרים את ה‪ dsRNA-‬ל‪ 30-‬זוגות בסיסים התופעה נעלמת;‬ ‫ואילו גם כאשר הקטין את גודל המחדר התופעה‬ ‫נמשכה‪ .‬לפיכך‪ ,‬הוא ביקש לראות כמה ‪ mRNA‬יש‬ ‫לאחר ההזרקה‪ .‬הוא סימן אותו וראה כי אין כלל‬ ‫‪ mRNA‬בתא‪.‬‬ ‫‪ 17‬אנדרו פייר ערך נסיון בסיסי וקיבל תוצאות בלתי צפויות‪ .‬הגדולה של פייר הייתה במחשבה על הפתרון לבעיה‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫‪84‬‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫ההנחה הייתה שה‪ dsRNA-‬גורם לדגרדציה של ה‪ .mRNA-‬התופעה הזו הופיעה גם בגנים אחרים וזכתה‬ ‫לכינוי )‪ .RNA interference (RNAi‬הממצא הזה פורסם ב‪ 1998-‬ומייד תפס – חוקרים משטחים‬ ‫שונים שראו תופעות של ‪ RNA‬שלא יכלו לפענח‪ ,‬קיבלו את התשובה לשאלותיהם דרך ההסבר הזה‪.‬‬ ‫תופעת ה‪ RNAi-‬הגורם לדגרדציה יכלה לשמש כאלמנט סופרסורי‪ .‬באותו זמן כבר לא השתמשו‬ ‫בפלסמידים פשוטים‪ ,‬אלא היה אתר קשירה של ‪ RNA‬פולימראז מנוקה שאוחה מצידו השני של‬ ‫הפלסמיד‪ .‬בצורה זו לא צריך להפוך את המחדר – במבחנה אחד עובד פולימראז מנוקה מסוג אחד שנקשר‬ ‫לאתר הקישור ב‪ Sense-‬ובמבחנה שנייה פולימראז אחר שנקשר לאתר שיוצר ‪.Antisense‬‬ ‫מדוע הרמות היו דומות עם כל אחד מהוקטורים? מסתבר שפעילות הפולימראז לא ספציפית‪ ,‬ולכן כאשר‬ ‫מכניסים פולימראז אחד הוא נקשר גם לאתר הקישור של הפולימראז השני‪ ,‬כך שנוצר קצת ‪antisense‬‬ ‫שנתן תוצאה דומה גם בוקטור ה‪ sense-‬וההיפך‪.‬‬ ‫לאחר פרסום המאמר נפתרו תעלומות רבות; אחת מהן הייתה שבטבע נפוצות יחסית מולקולות בעלות‬ ‫תפקיד זהה ל‪ .RNAi-‬מולקולות אלו מכונות )‪ .miRNA (micro-RNA‬במהלך שיעתוק של גדיל אחד‬ ‫מאיזור של ‪ ,miRNA‬משועתק רצף שחוזר על עצמו באוריינטציה הפוכה )‪(Inverted Repeat, IR‬‬ ‫היוצר התקפלות עוד בגרעין‪ .‬ה‪ 5’-‬עובר ‪ ,capping‬ובין שני ה‪ IR -‬יש לולאה במבנה ‪.stem & loop‬‬ ‫אנשי ה‪ C.elegance-‬הבחינו שה‪ miRNA-‬עובר‬ ‫שני חיתוכים‪ :‬חיתוך ראשון בגרעין שיוצר את‬ ‫האיזורים ‪ ;Drosha & DGCR58‬הקומפלקס‬ ‫החלבוני חותך ב‪ 5'-‬של ה‪ .IR-‬הוא עובר בחורי‬ ‫הגרעין‪ ,‬שם החלבון ‪ Exportin5‬מעביר אותה‬ ‫החוצה‪ .‬בציטופלזמה מתלבש עליו קומפלקס ‪Dicer‬‬ ‫שחותך אותו ליד הלולאה‪ ,‬דבר שגורם לשחרור ה‪-‬‬ ‫‪ .dsRNA‬האורך שלו הוא ‪ 23‬נוקליאוטידים ובקצה‬ ‫ה‪ '3-‬יש שני נוקליאוטידים בולטים מכל צד‪ .‬הוא‬ ‫נלקח על ידי קומפלקס שמסלק את ה‪ Sense-‬ושומר‬ ‫רק את ה‪.Antisense-‬‬ ‫זהו תוצר טבעי בתאים של עכבר‪ ,‬אדם‪ ,‬תולעת; הוא אינו קיים בשמרים‪ .‬כאשר ביואינפורמטיקאים‬ ‫הסתכלו על הגנום האנושי לחיפוש אפשרויות ל‪ ,IR-‬נמצאו לפחות ‪ 5000‬אתרים שמסוגלים ליצור תוצר‬ ‫כזה‪ .‬היום ידוע שיש לפחות ‪ ,miRNA 1000‬וכנראה יותר‪ .‬ל‪ miRNA-‬אין הומולוגיה מלאה ל‪-‬‬ ‫‪ mRNA‬או ל‪ .RNA-‬מכיוון שכך‪ ,‬לכל ‪ miRNA‬יש יותר מאשר סובסטרט אחד – וחלק גדול מהמחקר‬ ‫מאתר אילו גנים הם סובסטורטים של ‪ miRNA‬נתון‪ .‬מניחים כיום שכשליש מהגנים ההומנים נתונים‬ ‫תחת בקרת ‪ ,miRNA‬עובדה המסבכת מאוד את כל מה שהובן עד כה לגבי בסיס של מחלות – נכנס‬ ‫אלמנט רגולציה לא צפוי ומאוד משפיע‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :11‬שימוש במקטעי ‪ DNA‬משובטים – המשך‬ ‫‪85‬‬ ‫וגם ‪siRNA‬‬ ‫ה‪ IR-‬עובר חיתוך ראשון בגרעין‬ ‫וחיתוך שני בציטופלזמה )‪(Dicer‬‬ ‫ויוצר ‪ dsRNA‬עם קצוות ‪ '3‬בולטים‪.‬‬ ‫המקטע קיבל את השם – ‪siRNA‬‬ ‫‪ .short interfereing‬בציטופלזמה‬ ‫נוצר קומפלקס ‪RISC = RNA-‬‬ ‫‪.induced silencing Complex‬‬ ‫הוא נקשר לקומפלקס חלבוני המחפש‬ ‫גדיל ‪ mRNA‬קומפלמנטרי מלא או‬ ‫חלקי‪ .‬כאשר הוא מוצא אותו‪ ,‬הוא‬ ‫מסוגל לעשות אחד משני דברים‪:‬‬ ‫•‬ ‫אם‬ ‫יש‬ ‫קומפלמנטציה‬ ‫מלאה‬ ‫בין‬ ‫‪ siRNA+mRNA‬הקומפלקס יוכר על ידי‬ ‫האנזים ‪ ,Slicer‬המכיר רצף בין הנוקליאוטידים‬ ‫‪ 2-7‬וחותך בקצה '‪ 3‬של הרצף בגדיל אחד –‬ ‫דבר שחושף אותו לאנדונוקליאזות ולפירוק‪.‬‬ ‫•‬ ‫אם יש קומפלמנטציה חלקית‪ ,‬הרצפים‬ ‫הקומפלמנטרים יהיו ב‪ .‘3-UTR-‬הנוכחות‬ ‫שלו‪ ,‬למרות שהיא בקצה '‪ 3‬ולא '‪ ,5‬תעכב את‬ ‫התרגום של ה‪.mRNA-‬‬ ‫הידע הזה היווה מכשיר ללימוד תפקידי גנים מכיוון‬ ‫שכל מה שצריך הוא אחד משניים‪ :‬לקנות ‪dsRNA‬‬ ‫מוכן כנגד ה‪ mRNA-‬המעניין‪ ,‬שעובר היברידיזציה; או לחילופין ליצור פריקורסור ‪ RNA‬שיעבור את‬ ‫החיתוך באופן מלא או חלקי כך שייצור ‪ siRNA‬בתוך התא‪.‬‬ ‫לשם כך‪ ,‬מכניסים את ה‪ IR-‬המתוכנן תחת פרומוטור של ‪ RNA‬פולימראז חזק בתאים הומנים‪ ,‬כדי‬ ‫לייצר כמויות גדולות של ה‪ .siRNA-‬התוצר יסנטז את ה‪ ,IR-‬יעבור חיתוך ראשון בגרעין וייתקבל‬ ‫‪ siRNA‬בכמויות גדולות‪ .‬היתרון שלו לעומת ‪ dsRNA‬הסינטטי הוא שבסינטטי צריך להוסיף את חומצת‬ ‫הגרעין למדיום ואז בתנאי טרנספקציה לחורר את הממברנה ולהכניס את מולקולות המדיום; שיפור קל‬ ‫של תהליך הטרנספקציה הלא‪-‬יעיל מתקבל אם כולאים את ה‪ RNA‬בתוך ליפוזומים שיאוחו עם התאים‪.‬‬ ‫החסרון הוא שה‪ siRNA-‬יכול לפעול לאורך זמן רק אם כל שלושה ימים יוצרים הדבקה מחדש עם‬ ‫‪ – siRNA‬כלומר בניסוי של ‪ 10‬ימים יש להחליף אותו ‪ 3‬פעמים‪ .‬הדבר הופך את הניסויים לזמניים‬ ‫ויקרים מאוד‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪86‬‬ ‫קבוצות מסויימות עדיין עושות זאת ותיכננו ‪ siRNA‬לכל הגנים ההומנים‪.‬‬ ‫הגישה המשלימה היא לייצר עצמאית את ה‪ siRNA-‬בתא‪ ,‬בצורה יציבה‪ .‬בעזרת הפלסמיד ווירוס ניתן‬ ‫להכניס אותו לגנום – אלמנטים של ‪ Long Terminal Repeats‬שנמצאיםן בשני צידי הגן מבטיחים‬ ‫שהמחדר יישאר שלם – ולקבל גנים כרומוזומלים שבעזרת פרומוטור אינדוסיבילי )בנוכחות משרן‬ ‫בלבד( יתבטא ה‪ siRNA-‬ויאפשר לבדוק מה קורה לפנוטיפ של התאים‪.‬‬ ‫ה‪ RNA-‬הוכח ככלי הזול והטוב ביותר בהפרעה של גנים ולימוד שלהם ‪ ,in vitro & in vivo‬על ידי‬ ‫הדבקת חיות בעזרת הוירוסים‪.‬‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫•‬ ‫תופעת ה‪ RNAi-‬תורמת לדגרדציה של ‪ RNA‬ועיכוב בתרגום‪.‬‬ ‫בדיעבד מתברר שיש להם עוד פעילויות‪ :‬דגרדציה של ‪ DNA‬בגרעין‪ ,‬תגלית שעוררה מהפכה‬ ‫במחקר‪ ,‬וכן שיעתוק והטרוכרומטין‪.‬‬ ‫‪ dsRNA‬קושר את הכרומטין ומעכב את השיעתוק‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫‪/‬שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬ ‫‪87‬‬ ‫שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬ ‫בבחינת מחזור התא בצורה סכמטית‪ ,‬בהנחה שהוא‬ ‫אורך ‪ 24‬שעות‪ ,‬יש בו ארבע פאזות ושני אירועים‬ ‫מרכזיים‪ :‬הכפלת ה‪ (S-Phase) DNA-‬האורכת כ‪-‬‬ ‫‪ 10‬שעות וחלוקת התא עצמה – ‪ – M-Phase‬חלוקת‬ ‫האינפורמציה הגנטית‪ ,‬הציטופלזמה והאברונים לשני‬ ‫תאי הבת‪ .‬החלוקה מכונה מיטוזה ואורכת ‪ 30‬דקות‬ ‫בלבד‪.‬‬ ‫בין שני האירועים ישנן שתי פאזות של מרווחים או‬ ‫אתנחתות – ‪ .Gaps, G-Phase‬התא מנצל אותם‬ ‫להכנות לשלב הבא – כמו יצירת פריקורסורים של‬ ‫‪ DNA‬ו‪ RNA-‬בשלב ‪.G1‬‬ ‫פקטורים להכתבת מצב מחזור התא‬ ‫בשלב‬ ‫המיטוזה‬ ‫ומעט‬ ‫לפניו‬ ‫יש‬ ‫דחיסה‬ ‫)‪ (condensation‬של הכרומוזומים‪ .‬לעומת זאת‬ ‫במצב ‪ G1‬לא ניתן לראות את הדחיסה הזו‪ .‬בשנות‬ ‫ה‪ ,60-‬מדען בשם האריס מאוקספורד פיתח שיטה‬ ‫לאיחוי של תאים ויצירה של ‪.HeteroCaryones‬‬ ‫שני חוקרים מקיימברידג' השתמשו בשיטה שלו כדי‬ ‫לאחות בעזרת מעטפת וירוס שני תאים שונים‪.‬‬ ‫החוקרים תהו מה יקרה אם יקחו תאים מפאזות‬ ‫שונות ממחזור התא ויאחו ביניהן – לאן התאים‬ ‫ילכו? להפתעתם גילו שאם לוקחים תא במיטוזה‬ ‫ומאחים עם תא במצב ‪ ,G1‬הכרומוזומים בגרעין ‪G1‬‬ ‫יעברו דחיסה‪ .‬מכאן הם הניחו שיש פקטור)ים(‬ ‫חלבוניים דיפוזיים בציטופלזמה או בגרעין התא‬ ‫המיטוטי )מכיוון שהממברנה של הגרעין מפורקת‬ ‫בתא המיטוטי אין הבדל(‪ ,‬אשר גורמים לתא שב‪-‬‬ ‫‪ G1‬להתנהג כאילו היה במיטוזה‪.‬‬ ‫הם המשיכו לשלב צירופים שונים‪ ,‬המסוכמים באיור‪:‬‬ ‫יש לציין את האינטרפאזה – המורכבת משלושת הפאזות שאינן מיטוזה‪ ,‬ושלא ניתן להבחין בהם‬ ‫מיקרוסקופית ולהבדיל ביניהם‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪88‬‬ ‫•‬ ‫בהכלאה של תאים מיטוטיים עם תאים בשלבי האינטרפאזה השונים‪ ,‬התא הראשוני מתחלק; כל אחד‬ ‫משלושת התאים האחרים מתחלק גם כן – או עושה הכנות לחלוקה‪ ,‬כמו דחיסת הכרומוזומים‪ .‬מכאן‬ ‫שהפקטורים למיטוזה דומיננטים על כל אחת מהפאזות האחרות‪.‬‬ ‫•‬ ‫הכלאה של תא בשלב ‪ S‬מעוררת חלוקה על שלב ‪ G1‬אך לא על ‪ – G2‬הפקטורים הרפליקטיבים‬ ‫אינם מתגברים על הפקטורים או מנגנוני הדגרדציה הקיימים עבורם בשלב שאחריהם‪ ,G2 ,‬אך‬ ‫פעילים בשלב ‪ G1‬בו כנראה אין להם עדיין מעכבים‪.‬‬ ‫•‬ ‫בתא כזה שמצוי ב‪ ,G1-‬האם הפקטורים עברו אליו לאחר סיום החלוקה? כאשר מכליאים תא כזה‬ ‫לתא במצב ‪ ,G2‬האם יידחוף אותו לחלוקה? התשובה היא לא – התא ההיברידי מחכה‪ .‬מכאן‬ ‫שהפקטורים של המיטוזה הדומיננטים עוברים דגרדציה או אינאקטיבציה ואינם נשארים בשלב‬ ‫‪ .G1‬הפקטורים האלה זכו לכינוי ‪.M-Phase Prooting Factors‬‬ ‫כיצד ניתן לזהות תאים בשלבים שונים של מחזור התא? בשנות ה‪ 60-‬פותחו שיטות ראשונות לסינכרוניזציה‬ ‫של מחזור התא‪ .‬אחת הדרכים הפשוטות היא להרעיב תאים בתרבית על ידי הוצאת הסרום מהמדיום‪ .‬התאים‬ ‫אינם מסוגלים להכין פריקורסורים לסינטזת ‪ DNA‬ולכן אלו הנמצאים בשלבים שונים של מחזור התא ייעצרו‬ ‫בשלב ‪ 24 .G0‬שעות לאחר ההרעבה ניתן להוסיף את הסרום ולגרום להם להתחיל במסלול בצורה‬ ‫מסונכרנת‪ .‬בעזרת הדבקה בוירוס ה‪ Sendai-‬שעבר אינאקטיבציה גרמו לאיחוי‪ ,‬שכן ממברנות הוירוס עוררו‬ ‫איחוי של הממברנות התאיות‪.‬‬ ‫מחקרים ביוכימיים באאוציטים‪ ,‬ביציות ועוברים‬ ‫ניסויים אלו נעשו על תאים סומטיים ולא על תאי המין‪ .‬ניסויים בתחום הזה התחילו על ידי ‪.Masui‬‬ ‫בהמשך התקדמו לעבוד עם תאי ביצה של צפרדע‪ ,‬שהן תאים בודדים ענקיים שניתן לעבוד איתם גם ללא‬ ‫תנאי הסתכלות מחמירים‪.‬‬ ‫מסוי מצא את פקטור קידום ההבשלה )‪ (MPF‬שאחד מהם הציקלין )‪ .(Cdk‬בחלוקה מיוטית‪ ,‬לפני‬ ‫החלוקה המיוטית הראשונה מתבצעת הכפלת ה‪ ;DNA-‬כל תא מכיל בשלב זה ‪ 4n‬כרומוזומים‪ .‬החלוקה‬ ‫הראשונה מניבה שני תאים עם ‪ 2n‬כרומוזומים ובחלוקה השנייה – שנעשית ללא שיכפול נוסף של הגנום‬ ‫– מניבה ארבעה תאים שבכל אחד ‪ 1n‬כרומוזומים‪.‬‬ ‫האאוציט‪ ,‬ביצית הצפרדע‪ ,‬עצור בשלב ‪ .G2‬התאים המקיפים את האאוציט משחררים פרוגסטרון‪ ,‬הורמון‬ ‫המעודד את שתי החלוקות המיוטיות‪ .‬התאים עוצרים בסוף החלוקה המיוטית השנייה‪ .‬החלוקה אינה‬ ‫מושלמת‪ ,‬והביצית ממתינה לזרע – שלב ההפריה‪ .‬כניסת הזרע לביצית גורמת להשלמת תהליך המיוזה‬ ‫ולאחר מכן מתחילות ‪ 13‬חלוקות סינכרוניות מהירות של העובר‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫‪/‬שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬ ‫‪89‬‬ ‫אחד התאים שנוצרים בחלוקה המיוטית הראשונה ממתנוון‪ .‬גם לאחר החלוקה השנייה אחד התאים‬ ‫מתנוון‪ .‬שני התאים המנוונים יוצרים שני ‪) Polar bodies‬ראשון ושני(‪ .‬תהליך ההכפלה של תא שעצור‬ ‫בשלב ‪ G2‬מכונה ‪ – Maturation‬הבשלה‪.‬‬ ‫מסוי שאל את עצמו האם משהו בשתי חלוקות ההפחתה של הביצית ולפני האיחוי עם הזרע הגורם לשינוי‬ ‫קבוע לעומת התא שהתחיל עם ‪ 4n‬כרומוזומים? האם ניתן לקחת ציטופלזמה של ביצית גדולה‪ ,‬להזריק‬ ‫אותה לתא העצור ב‪ G2-‬וללא פרוגסטרון לעורר אותו לעבור חלוקות מיוטיות? מסואי חיפש פקטורים‬ ‫בציטופלזמה שחיקו את פעולת הפרוגסטרון‪.‬‬ ‫כשעשה את ההזרקה הזו‪ ,‬הבחין בנדידה של הגרעין והכרומוזומים‬ ‫למקום קרוב לדופן‪ ,‬המאפיין את תהליך החלוקה‪ ,‬וניתן להבחנה‬ ‫כיוון שהתנועה גורמת לבהרה בתאים‪.‬‬ ‫הפקטור שמסוי מצא כגורם לתהליך ההבשלה זכה לכינוי‬ ‫)‪ .Maturation Promoting Factor (MPF‬ההשראה של‬ ‫החלוקה המיוטית הייתה תהליך חדשני שתפס חוקרים רבים‪ .‬הנסיון לאתר את הפקטור הכשיל תלמידים‬ ‫רבים‪ ,‬עד שב‪ 1988-‬הוא הצליח תודות לכך שהתגלה‪ ,‬בין היתר‪ ,‬שזהו אינו חלבון בודד כי אם קומפלקס‪.‬‬ ‫מציאת קומפלקס ההבשלה‬ ‫ג'ון גרהארט )‪ (1983-4‬ניסה לבדוק מהי הפעילות במערכת ביצי הצפרדע לאורך זמן מבחינת רמת ה‪-‬‬ ‫‪ .MPF‬על מנת לבדוק את רמת ה‪ ,MPF-‬בהיעדר הידע מהו בדיוק‪ ,‬היה צריך להזריק בנקודות זמן שונות‬ ‫ציטופלזמה ולוודא האם היא עדיין גורמת למיוזה‪.‬‬ ‫ניתן לראות שבחלוקה המיוטית הראשונה ה‪ MPF-‬עולה ואז יורד; גם לפני החלוקה השנייה יש עלייה‬ ‫הנותרת יציבה עד ההפרייה‪ .‬עם ההפריה יש ירידה דראסטית בפעילות‪ .‬גם בחלוקות הראשונות של‬ ‫העובר יש עליה תלולה וירידה לקראת כל מיטוזה של תאי העובר‪.‬‬ ‫מכאן רואים של‪ MPF-‬יש פעילות מחזורית‬ ‫הקשורה בחלוקה המיוטית כמו גם בחלוקה‬ ‫המיטוטית‪.‬‬ ‫סטודנט מהרווארד מקבוצתה של ג'ואן רודרמן‬ ‫שעובדת בקפודי ים ורכיכות דיווח באותה תקופה על‬ ‫פעילות קבוצתו‪ .‬לאחר הפרייה‪ ,‬בדומה לצפרדע‪,‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫‪90‬‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫מסמנים את העובר על ידי הזרקת חומצת אמינו‬ ‫רדיואקטיבית‪ .‬כמו כן מפיקים חלבונים בזמנים‬ ‫שונים מהתא ומסתכלים בכל נקודת זמן על תבנית‬ ‫החלבונים המסתמנים בתא‪ .‬ניתן לראות בג'ל‬ ‫שקיימים כמה חלבונים המסונטזים קונסטיטוטיבית‬ ‫ושני חלבונים בעלי התנהגות מחזורית‪ :‬מופיעים‬ ‫ונעלמים‪.‬‬ ‫בקהל בהרצאתו של הסטודנט מהרווארד יושב‬ ‫סטודנט של טים האנט‪ ,‬העובד במערכת דומה‪.‬‬ ‫הסטודנט חוזר ללונדון ומספר על נסיון זה להאנט‪.‬‬ ‫הם מעמידים את המערכת ומוצאים את החלבון בעל‬ ‫ההתנהגות הציקלית – לו הוא קורא ציקלין‪ .‬אם‬ ‫מסמנים את ההתנהגות של סינטזת הציקלין )אדום(‬ ‫כפונקציה של מה שניתן לראות כחלוקה של התא‪,‬‬ ‫העלייה בציקלין תמיד קודמת לחלוקה‪.‬‬ ‫השיא של ציקלין מגיע לפני החלוקה של התא‪.‬‬ ‫ב‪ 1984-‬יש את הרצף ו‪ mRNA-‬של הציקלין; ב‪-‬‬ ‫‪ 1988‬מתפרסם גם רצף של חלבון מוטנט בשמרים‬ ‫המעודד חלוקה‪ ,‬וזוכה לכינוי ‪.CDC28‬‬ ‫במקביל‪ ,‬סטודנט של מסוי מבודד ב‪ 1988-‬קומפלקס בעל פעילות של ‪ MPF‬העשוי משני חלבונים‪ .‬הוא‬ ‫קובע את הרכב חומצות האמינו של כל חלבון ורואה ששני המרכיבים האלו כבר ידועים – החלבון האחד‬ ‫אנלוגי ל‪ CDC28-‬השמרי‪ ,‬שמבנהו התפרסם באותה שנה; השני זהה לציקלין של טים האנט‪ .‬מכאן‬ ‫שסרין טריאונין‪-‬קינאז יחד עם הציקלין מניע את מחזור התא על ידי פעילות של ‪.MPF‬‬ ‫היחידה הקטליטית שמורה בצורה מופלאה בין היצורים הנחותים ועד לאדם‪ .‬אותו הדבר גם לגבי הציקלין‬ ‫– אחד ממשפחה שלמה של ציקלינים הדומים ברצפי חומצות האמינו ושמורים דיים שניתן אפילו לבצע‬ ‫החלפות בין חלבון הומני שיעבוד בשמר ולהיפך‪.‬‬ ‫קומפלקס הציקלין ו‪ Cdk-‬הוא אחד הקומפלקסים השמורים ביותר באבולוציה‪.‬‬ ‫הגרפים הבאים מציגים נסיון של קירשנר )‪ ,(1989‬אשר עבד במערכות הביצים של הצפרדע והקים‬ ‫מערכת מדהימה לאותן שנים‪ :‬הוא לקח גרעינים מהזרע והכין תמצית ביציות‪ .‬הוא הוסיף את הגרעין עם‬ ‫התמצית של הביצית והראה שניתן לגרום למספר חלוקות במבחנה – ‪ 3-4‬הכפלות וחלוקות‪.‬‬ ‫קירשנר יכול היה לעקוב אחר המדדים של ‪ ,MPF‬שכבר היה ידוע שנה קודם‪ ,‬הוא הראה שהיסטון ‪H1‬‬ ‫הוא סובסטרט של קומפלקס ‪ Cdk‬ולכן בציר ‪ Y‬הוא מודד כפונקציה של הזמן את פעילות ‪ MPF‬על ידי‬ ‫זירחון של ‪.H1‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫‪/‬שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬ ‫‪91‬‬ ‫כמו כן הוא יכול לראות מיקרוסקופית את הגרעין של הזרע‪ ,‬הנותר בשלמותו בתהליך – הוא אינו‬ ‫מתפורר‪ ,‬למרות שיש שלבים בהם הממברנה מתחררת והוא יכול לעקוב במשך ‪ 3-4‬מחזורי השלבים‬ ‫המוקדמים והשלבים המאוחרים של המיטוזה‪.‬‬ ‫הוא מדד גם את ריכוז הציקלין‪ B-‬באותו האופן שבו נמדד לראשונה בג'לים כשמצאו נוכחות של החלבון‪.‬‬ ‫ביצית הקסילופוס מכילה ‪ 2‬או ‪ 3‬ציקלינים והוא בחן את ביטוי הציקלין ‪ B‬כפונקציה של זמן‪ .‬הקו האדום‬ ‫מתאר זירחון ‪ H1‬והכחול את כמות הציקלין‪ .B-‬ניתן לראות עלייה וכמו שגרהארט הראה לפניו העלייה‬ ‫נעצרת ומתחוללת ירידה ב‪ MPF-‬ודגרדציה של ציקלין ‪ .B‬התנועה של שני הקווים מסונכרנת‪ .‬הכניסה‬ ‫למיטוזה מתרחשת בתחילת המיטוזה והיציאה ממיטוזה מתרחשת עם סיום הדגרדציה‪.‬‬ ‫כאשר מטפלים בתמצית בעזרת ‪ RNase‬מתבטלת התנועה של ציקלין ‪ ,B‬ולכן הוא הסיק שהחלבון ציקלין‬ ‫‪ B‬אינו יציב ועל מנת לספק אותו התא צריך להכיל את ‪ mRNA‬של החלבון‪ .‬מכיוון שבודדו כבר את ה‪-‬‬ ‫‪ mRNA‬של ציקלין ‪ ,B‬ניתן היה לטפל במערכת ב‪ RNAse-‬ולהוסיף רק את ה‪ .mRNA-‬בתנאים אלו‬ ‫המערכת עבדה‪ ,‬מכאן שה‪ RNase-‬לא פוגע באלמנטים חיוניים אחרים‪.‬‬ ‫הטיפול ב‪ RNAae-‬עדין‪ ,‬אחרת היה פוגע גם באלמנטים אחרים של מערכת סינטזת החלבונים – ‪tRNA,‬‬ ‫‪ .rRNA‬כמו כן הריבוזום מגן על רוב ה‪ rRNA-‬וה‪ tRNA-‬בעל מבנה קומפקטי המגן עליו מפני ‪.RNAse‬‬ ‫בריצוף חלבון הציקלין‪ B-‬נמצא איזור של ‪ 8‬חומצות אמינו החוזרות על עצמן בקצה ‪ C‬של חלבונים לא‬ ‫יציבים‪ .‬מכיוון שידוע שהציקלין מתפרק‪ ,‬הניחו שזהו סיגנל לדגרדציה של הציקלין‪ .‬האלמנט זכה לכינוי‬ ‫)‪ .D-Box (destruction‬קירשנר ייצר ‪ mRNA‬שאינו מסנטז את שמונה חומצות האמינו של סיגנל‬ ‫ההרס‪ ,‬וכך ערך את ניסוי ‪ – D‬הכנסה של ציקלין ‪ B‬שחסר את תיבת ההרס‪ ,‬כלומר הוא אינו ניתן‬ ‫לדגרדציה‪ .‬בתהליך זה יש ביטוי ועלייה בציקלין‪ ,‬יש כניסה למיטוזה אך התהליך נתקע בשלבים‬ ‫המוקדמים ואינו מסוגל לצאת מהמיטוזה‪ .‬הפעילות של ‪ mMPF‬המוטנטי יציבה‪ .‬מכאן הגיעו למסקנה‬ ‫שהדגרדציה של הציקלין ‪ B‬היא הכרח על מנת שתא מיטוטי יסיים את המיטוזה‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪92‬‬ ‫מכאן שיש כוח מניע המורכב מציקלינים ו‪ Cdk-‬המופיעים בשלבים שונים של מחזור התא – כאלה‬ ‫המכינים את התא לשלב ‪ .M ,S ,G1‬מרכיב אחד של מחזור התא הוא סדרה של זירחונים על ידי ‪.Cdk’s‬‬ ‫ידוע שבתאים הומנים קיימים מאות סובסטרטים שעוברים זירחון בתהליכי מחזור התא וכי הזירחון הזה‬ ‫מהווה מנגנון לקידום מחזור התא‪.‬‬ ‫מערכת הדגרדציה במחזור התא‬ ‫ישנם כמה חלבונים שחייבים לעבור דגרדציה ספציפית במחזור התא‪ .‬המערכת קשורה במערכת‬ ‫היוביקוויטין שהתגלתה על ידי הרשקו וקבוצתו במכון וויצמן‪ .‬הציקלין‪ B-‬עובר דגרדציה במערכת זו‪.‬‬ ‫בעוד שהדגרדציה מתבצעת במעין שק ציטופלזמטי המכיל אנזימים לדגרדציה של חלבונים‪ ,‬הקומפלקס‬ ‫המיועד לדגרדציה צריך להיות מסומן ספציפית ולהגיע למתחם הדגרדציה‪ .‬במקרה של ציקלין‪ B-‬מדובר‬ ‫בקומפלקס בשם ‪ APC – Anaphase Promoting Complex‬ופקטור של ספציפיות המזהה את‬ ‫ציקלין‪ .B-‬הפקטור הוא תוצר של ‪.Cdh1‬‬ ‫במהלך האנאפאזה הציקלין עובר פולי‪-‬יוביקוויטינציה ואז הפרוטאוזום לוקח את המולקולה המסומנת‬ ‫ביוביקוויטין ועורך דגרדציה לאוליגופפטידים קצרים‪ .‬הפעילות הקונסטיטוטיבית של הקומפלקס המפרק‬ ‫מופסקת על ידי קומפלקס של ‪ Cdk+G1-Cyclin‬הרואים את מולקולת ‪ Cdh1‬ומזרחנים אותה‪ .‬הזירחון‬ ‫מנתק אותו מהקומפלקס של ‪APC‬‬ ‫ומנטרל אותו מפעילות עד לשלב‬ ‫המיטוזה המוקדם בו פוספאטאז‬ ‫)תוצר של ‪ (Cdc14‬מוריד את הזרחן‬ ‫ומאפשר שוב בנייה של קומפלקס‬ ‫‪ APC‬המשופעל‪.‬‬ ‫הסימון‬ ‫של‬ ‫‪Cyclin-Cdk‬‬ ‫‪G1‬‬ ‫והפעלת הדגרדציה ועצירה היא‬ ‫מחזוריות שעוקבת אחר מחזור התא –‬ ‫מכאן שמחזו רהתא אינו רק מחזוריות‬ ‫של קינאזות אלא גם של פוספאטאזות‬ ‫ושל דגרדציות‪.‬‬ ‫באיור הבא ניתן לראות שלמעט בקרה בדגרדציה‪ ,‬גם תת היחידה הקטליטית – ‪ – Cdk‬יכולה להיות‬ ‫נתונה לבקרה‪ .‬הבקרה נעשית על ידי סדרת קינאז ופוספואטאזות‪ .‬באיור מצויין ‪ ,CDC28‬הדומה ל‪Cdk-‬‬ ‫ההומני‪.‬‬ ‫בשלב הראשון נעשה זירחון של טירוזין בעמדה ‪ 15‬המעכבת את המבנה‪ .‬לאחר מכן קינאז אחר – ‪Cdk-‬‬ ‫‪ activating Kinaze‬מזרחן את טריאונין ‪ ,161‬שהיא פעולה מאקטבת‪ .‬אחריו‪ Cdc25 ,‬מוריד את הזרחן‬ ‫מהעמדה המעכבת וכך נוצר ה‪ Cdk-‬האקטיבי‪ .‬בתוך הכיס שנוצר בין שני החלבונים ניתן לקלוט את‬ ‫הסובסטרטים‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫‪/‬שיעור ‪ :11‬פיענוח מחזור התא‬ ‫‪93‬‬ ‫גם היחידה הקטליטית של ה‪ MPF-‬נתונה לרגולציה על ידי קינאזות ופוספאטאזות‪.‬‬ ‫נקודות בקרה – ‪Checkpoints‬‬ ‫במחזור התא קיימות נקודות בקרה הבודקות האם התא מוכן לעבור לשלב הבא‪ .‬אחת מהנקודות החשובות‬ ‫– אם לא החשובה ביותר – היא נקודת ה‪ Restriction point-‬ביונקים או )‪ Start (S point‬בשמרים‬ ‫)ידועה גם כנקודת ה‪ commitement-‬בה התא מתחייב לחלוקה(‪.‬‬ ‫כאשר מוסיפים פקטורים לתאיםן מורעבים‪ ,‬התאים יוצאים ממצב ‪ G0‬אליו נכנסו בהרעבה וחוזרים ל‪-‬‬ ‫‪ .G1‬אם ירעיבו שוב את התאים‪ ,‬הם ייעצרו בנקודת ה‪ chceckpoint-‬ולא ימשיכו הלאה; אם עברו את‬ ‫הנקודה הם ימשיכו בתהליך בכל מקרה‪.‬‬ ‫המאפיין של תאים סרטניים לעומת תאים סומטיים ורגילים הוא שיש בהם התגברות )‪ (overriding‬על‬ ‫נקודת הביקורת הזו‪.‬‬ ‫שנים רבות ביקשו לבדוק מה קורה בנקודת ההגבלה‬ ‫הזו; התשובה נמצאת באיור הבא‪ :‬חלבון הגן ‪.Rb‬‬ ‫החלבון יוצר קומפלקס לא פעיל של ‪ ,E2F‬פקטור‬ ‫שיעתוק הכרחי מסוג ‪ Master TF‬האחראי על‬ ‫סוללות של גנים הומנים‪ .‬משפחת ‪ Rb‬מורכבת‬ ‫משלושה חלבונים ו‪ E2F-‬הוא חלבון שפעולתו‬ ‫מועצמת על ידי היותו קומפלקס של ‪ 5‬חלבונים‪.‬‬ ‫קומפלקס ‪ E2F‬הכרחי למעבר שלב ‪ G1‬עקב הפעלה‬ ‫של כל מיני חלבונים‪ .‬הקומפלקס עם ‪ Rb‬מעכב את‬ ‫‪ E2F‬ואת ביטוי ה‪ early genes-‬שהוא מפעיל‬ ‫)דוגמת צקלין‪E-‬ו‪.(Cdk2-‬‬ ‫העיכוב מבוטל על ידי קומפלקס ‪ Cyclin D+ lie‬המזרחן את ‪ Rb‬ומביא לשינוי קונפורמציה המשחרר‬ ‫את ‪E2F‬לשיעתוק‪ .‬החלבונים המופעלים על ידי ‪ E2F‬מוסיפים להגברת המעבר מ‪ Mid G1-‬ל‪Late -‬‬ ‫‪.G1‬‬ ‫סוג נוסף של פעילות ‪ tumor-suporessor gene‬מוצג באיור הבא‪ .‬חלבון ‪) p16‬בעל מסה של ‪ (16S‬הינו‬ ‫בעל תאום ‪ .p15‬דיוויד ביץ' החליט לחקור מלנומות דרך איזורי אינאקטיבציה ספציפית במחלה‪ .‬הוא‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫ביוכימיה ב' ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪94‬‬ ‫בודד איזור מסויים שלעיתים קרובות היה מחוק במלנומה וראה שתי מסגרות קריאה פתוחות‪ ,‬המקדדות‬ ‫לשני חלבונים‪ 15S :‬ו‪ .16S-‬אולם הרצף לא נתן רמז לפעילות של החלבונים‪.‬‬ ‫זאת עד שבודדו קומפלקס בו נמצא ‪ .Cdk4, CycD & p16‬ששני הציקלין והקינאז הם קומפלקסים של‬ ‫השלב המיטוטי המוקדם‪ .‬החלבון ‪ p16‬הוא אינהיביטור שמונע את פעילות הקומפלקס‪ .‬אם ‪p15+p16‬‬ ‫מסולקים‪ ,‬מתאפשרת פוספורילציה של ‪ Rb‬ולכן העובדה שהחלבונים עוברים מחיקה בסרטן עוזרת‬ ‫לתא הסרטני לעבור את נקודת ההגבלה כך שייקל עליו לזרחן את ‪.Rb‬‬ ‫זהו מנגנון של מדכאי גידול היוצרים קומפלקס לעיכוב ‪.Cdk‬‬ ‫צ'יפים‬ ‫החלבונים ‪ p15‬ו‪ p16-‬נמצאו כמעכבים של ‪ Cdk‬המכונים ‪ ;INK4‬בקבוצה זו יש יותר משני סוגים אלו‬ ‫בלבד‪ .‬יש קבוצת מעכבי ‪ Cdk‬נוספת המכונים ‪ .CIP – Cdk Inhibition Protein‬שם החלבון ניתן לפי‬ ‫משקלו המולקולרי‪ .‬החלבון ‪ p21‬נחשב כמעכב אוניברסלי כי הוא נקשר לכל קומפלקס כמעט‪.‬‬ ‫האיור מראה את נקודות העצירה )ורוד(‪ .‬החלבון ‪ P21‬נקשר לקומפלקס ומונע התקדמות; בשלבים שונים‬ ‫יש אקטיבציות או עיכובים של ‪ Cdk‬בתור רגולציה על ידי נקודת הבידוק‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬