Ny, viktig kunnskap om torskens tidligste faser
NFE N° 1 - 2015 / årgang 40 Biologi - CODE En spesialutgave av Norsk Fiskeoppdrett Foto: Terje van der Meeren www.kyst.no Ny, viktig kunnskap om torskens tidligste faser I samarbeid med kunnskapsplattformen «En god start er avgjørende for å få en robust fisk» HAVBRUK - FREMTIDENS OLJENÆRING Bærekraftig havbruk Besøk oss på cermaq.no cermaq.com Lingavegen 206 - 5630 Strandebarm Tlf: 56 55 94 28 www.lingalaks.no C hr. Mic hels ens gt. 6B , 5012 B ergen Telefon: 55361100 www.erkos eafood.no Telefon: 95 45 10 04 Fax: 74 39 40 30 1- 2015 - BIOLOGI - CODE TOPPTEKST www.liftup.no LiftUP Sentralpumping - Dødfisk direkte fra merden til kvern - Økt biologisk sikkerhet - Båt eller kran er unødvendig - Forbedret HMS. - Gjør dødfiskhåndtering mer behagelig - Røktes fra flåten. - Fungerer like godt i dårlig vær Se video på 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 3 www.liftup.no TOPPTEKST Innhold www.kyst.no Besøks - og postadresse Skoltegrunnskaien 1 Postboks 4084 Sandviken 5835 Bergen Telefon Web Telefaks Adm./Red. 55541300 www.kyst.no 5551301 55541300 ABONNEMENT ANSVARLIG REDAKTØR 55541300/05 Gustav-Erik Blaalid REDAKTØR Pål Mugaas Jensen JOURNALIST Øyvind Sjøthun Røen JOURNALIST Linn Therese Skår Hosteland SALG CHILE Erich Guerrero SALGSSJEF Laila Indrebø redaksjon@kyst.no gustav@kyst.no 55541309/98283345 palmj@kyst.no 555413211/98283345 oyvind@kyst.no 41313211 linn@kyst.no 40617342 erich@kyst.no +5665349324 +56956895259 Ny, viktig kunnskap om torskens tidligste faser KEY ACCOUNT MANAGER Jorge Piazza Cangas KEY ACCOUNT MANAGER IngerJo Tellefsen Gjennom å ta i bruk nye molekylære analysemetoder, har en fullstendig revolusjonert mulighetene til å beskrive torskens utvikling, finne grunnleggende biologiske mekanismer og å få en dypere forståelse av cellulare og molekylære prosesser. Man kan dermed nå identifisere de underliggende faktorene som bestemmer yngelkvalitet og hva som skal til for å produsere en robust fisk. I dette særnummeret av Norsk Fiskeoppdrett presenteres nye og spennende resultater fra det store Forskningsrådsfinansierte prosjektet Cod Development (CODE). REGNSKAP Accountor Kommentar Redox Leder: En god start er av avgjørende Oksidativt stress forårsaket av taurinmangel - årsak til redusert vekst?............................... 25 Temperatur Appetitt laila@kyst.no jorge@kyst.no ingerjo@kyst.no UTGITT AV GRAFISK PRODUSKJON TRYKK BANKGIRO ORG. NR. ABONNEMENT 2015 ISSN 90111558 91540693 55541302/45208234 Norsk Fiskeoppdrett AS Rodrigo Orrego Borge Grafisk AS 6511.05.23232 979496354 kr.3850,00 0332-7132 betydning........................................7 Høyere temperatur i tidlige livsstadier kan forbedre torskens vekst og kvalitet............. 8 Byttedyrtype Forfatteroversikt Effekter av byttedyrtype på vekst hos torskelarver:..................................................... 10 Fettfordøyelse © Norsk Fiskeoppdrett. Koplering av artikler og annonser er Ikke tillat uten samtykke fra Norsk Fiskeoppdrett. Ved oppsigelse av abonnement kun skriftlige henvendelser. Norsk Fiskeoppdrett gjør oppmerksom på at Innsendt Stoff også gjøres tilgjengelig elektronisk. Norsk Fiskeoppdrett tar ikke ansvar for innsendte bilder uten at det er gjort avtale om bruk disse. Stadier Norskfiskeoppdrett er et fritt og polistik uavhengig fagtidsskrift. Vi følger «Vær-varsom-plakaten» og «Redaktørplakaten» og er medlem av Mediebedriftenes Landsforening. Kontrollert godkjent årlig opplag. Metabolisme M IL J T 69 9 24 1 ØM E R K E T r yk ks a k 4 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Hvordan kan appetitt og fôrinntak stimuleres hos torskelarver?............................................. 28 Utviklingsstadier i torsk basert på beindannelse.................................................... 14 Ernæring Liste over alle bidragsyterne med adresser.. 31 Fettfordøyelse i torskelarver.......................... 32 Beinutvikling Skjelettutvikling og beinmetabolisme i tidlige livsstadier hos torsk........................................34 Næringsstoffer som begrenser vekst hos torskelarver fôret med hjuldyr....................... 17 Osmoregulering Effekt av temperatur og ernæring på utvikling av torskelarver i tidlige stadier:.... 20 Synsutvikling RNA-sekvensering Fra planktonfangst til fiskepredator; endring av syn gjennom utvikling............................... 39 Hvilke faktorer gir en rasktvoksende fiskelarve av god kvalitet?..............................22 Langtidseffekt Langtidseffekter av ulike startfôr.................42 Utvikling av osmoregulering hos torskelarver - rotatorier vs naturlig zooplankton............ 36 27 NetKem notimpregnering reduserer begroing Netwax produktene er godt dokumenterte og bidrar også til å lette rengjøring, hindre uttørring og beskytte mot UV-stråling. 10 Naturlig dyreplankton versus hjuldyr og saltkreps Det har lenge vært kjent at naturlig dyreplankton gir god vekst hos torskelarver. I tidligere forsøk har larver som spiser plankton økt vekten med mellom 14 og 22% daglig fra dag 4 etter klekking til de er ca 5 uker gamle. Forsøket i CODE viser at dette mest sannsynlig skyldes god ernæring. Underliggende faktorer som gir en rasktvoksende fiskelarve av god kvalitet 22 Selv om fordelen med å startfôre en rekke fiskearter med naturlig dyreplankton er beskrevet i tallrike studier, har de underliggende mekanismene som skaper forskjellene i vekst og utvikling ikke vært forstått. I CODE er vi kommet et langt skritt videre med å beskrive disse mekanismene. Foto: Per Eide Studio Netwax NI 3 Fortsatt på topp etter mer enn 25 år. Norges mest solgte notimpregnering. Netwax E4 Greenline Utviklet for “grønne” konsesjoner. Kan med fordel brukes til alle typer notposer. Netwax NI Gold Gir optimal beskyttelse mot groe. 39 Fra planktonfangst til fiskepredator; endring av syn gjennom utvikling Hvordan oppfatter torsken fargen på sluken, og hvordan den er i stand til å se omgivelsene rundt seg? Ved å studere synet til torsken kan vi finne svar på dette, samt finne ut om synet er likt gjennom hele livet. Langtidseffekter av ulike startfôr 42 Torsk som ble startfôret enten på naturlig dyreplankton eller med rotatorier etterfulgt av Artemia, ble fulgt frem til kjønnsmodning ved to års alder. Selv om fisken økte i vekt fra 10 g til 1 kg, kunne vi spore effekten av ulikt fôr i larvestadiene hos den kjønnsmodne fisken to år senere. Netpolish NP Super Coating som beskytter mot mekanisk slitasje ved gjentatt spyling av nøter i sjøen. Kontakt din forhandler for mer informasjon Telefon: 66 80 82 15 www.netkem.no 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 5 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Leder Av professor Ivar Rønnestad og professor Kristin Hamre, hhv leder og nestleder av CODE Ivar.Ronnestad@bio.uib.no kha@nifes.no Foto: Norges Sjømatråd/Per Eide Studios En god start er av avgjørende betydning Forskningen på torskens tidlige utvikling har lange og stolte tradisjoner i Norge. Noen av våre mest kjente havforskere, bl.a. G.O. Sars, startet for over 100 år siden med og systematisk beskrive torskens utvikling og biologi fra det befruktede egget. I dag arbeider vi fremdeles med mange av de samme spørsmål og problemstillinger, men verktøyene vi har til rådighet blir stadig bedre og åpner helt nye muligheter. I løpet av det siste tiåret har vi tatt i bruk molekylære analysemetoder som fullstendig har revolusjonert våre muligheter til å beskrive torskens utvikling, finne grunnleggende biologiske mekanismer og få en dypere forståelse av cellulære og molekylære prosesser. Dette har gjort oss i stand til å etablere en mer helhetlig forståelse for torskens fysiologi og biologi. Vi kan dermed for eksempel identifisere de underliggende faktorene som bestemmer yngelkvalitet og hva som skal til for å produsere en robust fisk. I dette særnummeret av Norsk Fiskeoppdrett vil vi presentere nye og spennende resultater fra prosjektet Cod Development (CODE). Prosjektet er nylig avsluttet og har hatt som mål å bygge langsiktig kompetanse og grunnleggende kunnskap om tidlige livsstadier hos torsk. Den brede kunnskapen vi nå har fått er viktig ikke bare for fremtidig torskeoppdrett, men er også overførbar til mange av de andre marine fiskeartene i oppdrett, bl. a. berggylt. Internasjonalt er oppdrett av marin fisk mer utbredt enn oppdrett av laksefisk og selv om aktiviteten i oppdrett av marine arter i Norge for tiden er lav, vil dette trolig ta seg opp igjen. Torsken har en unik stilling i norsk marin fauna og for norske fiskerier, og CODE har etablert kunnskap om grunnleggende utviklingsbiologi som er relevant for forvaltning av ville bestander og hvordan torsken påvirkes av miljøendringer. Resultatene i CODE kan også brukes i praktisk oppdrett. Vi har vist at temperatur og ernæring i de tidlige livsstadier har betydning for hele livsløpet. De samlede miljøbetingelsene i de tidlige stadiene hos fisk kan derfor ha langtidseffekter som holder stand senere i livssyklusen og som vil ha betydning for fiskens produksjonsegenskaper i oppdrett. Vi har dessuten vist at feilernæring gir store forskjeller i vekst på larvestadiet og identifisert næringsstoffer som er for lave i fôrorganismene som brukes i intensivt oppdrett, og som trolig kan forklare disse vekstforskjellene. Oversikt over alle bidragsyterne og deres adresser, finnes på side 31. CODE - Torskens utvikling • Cod Development – CODE er et prosjekt som har vært finansiert (med 21 mill. kr) av Havbruksprogrammet i Norges Forskningsråd, og har hatt med deltagere fra ni ulike forskningsmiljøer i Norge. • Prosjektet er nettopp avsluttet • CODE har vært en strategisk satsing på grunnforskning, en såkalt kunnskapsplattform, og har hatt som mål å bygge langsiktig kompetanse og grunnleggende kunnskap av utviklingsprosesser i torsk, samt hvordan miljøfaktorer (ernæring og temperatur) påvirker utviklingen. • En viktig del av arbeidet har bestått i å identifisere mekanismene som forklarer forskjeller i larvekvalitet og utvikling. • Norske partnere har vært Universitetet i Bergen, Nifes, Havforskningsinstituttet, Nofima Marin, Sintef, NTNU, Universitetet i Nordland, Universitetet i Tromsø og Uni Research Miljø. • CODE har vært ledet fra Universitetet i Bergen. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 7 Temperatur Epigenetikk Epigenetikk betyr «over genetikk» og refererer til endringer i genuttrykk uten endringer av den underliggende DNA-sekvensen. Epigenomet regulerer hvordan genene uttrykkes. Forandringer i epigenomet kan skje på grunn av ytre faktorer slik som temperatur og ernæring og kan være forbigående eller permanente og refereres ofte til som epigenetisk programmering. Slik programmering er en viktig del av embryoutvikling fra befruktning til utvikling av vev og organer. For å studere sammenhengen mellom eksterne temperaturfaktorer og epigenetisk programmering hos torsk analyserte vi graden av metylering i genomet. Det ble gjort ved hjelp av en metode som heter RRBS (Reduced Representation Bisulphite sequencing). Høyere temperatur i tidlige livsstadier kan forbedre torskens vekst og kvalitet Det er en vanlig oppfatning at høye temperaturer under inkubasjon av egg vil resultere i mer misdannelser, lavere overlevelse og lavere vekst hos torsk sammenliknet med lave temperaturer. Nye resultater fra Nofima viser imidlertid at yngel som i eggfasen ble utsatt for relativt høye temperaturer faktisk hadde mindre misdannelser, høyere overlevelse og bedre vekst enn de som gikk på lave temperaturer. To andre forsøk har også bekreftet disse resultatene. Derfor kommer vi til å innføre protokollen (høy temperatur inkubasjon) i avlsprogrammet for torsk. Velmurugu Puvanendran, Hilde Toften, Helge Tveiten, Ingrid Lein, Bjørn-Steinar Sæther & Hanne Johnsen Velmurugu.Puvanendran@nofima.no Oppdrett av torsk vokste raskt tidlig på 2000-tallet, men siden opplevde man en nedgang på grunn av flere biologiske, teknologiske og økonomiske flaskehalser. Dårlig egg-, larve- og yngelkvalitet har blitt identifisert som de største biologiske problemområdene. I plattformprosjektet CODE har en jobbet med disse problem- områdene gjennom å studere funksjon, mekanismer og prosesser i torskens tidlige livsstadier, spesielt knyttet til ernæring og miljøforhold. Økt kunnskap om dette er ikke bare en forutsetning for en vellykket utvikling av akvakulturnæringen, men kan FIGUR 1 Torskeyngel holdt ved lav (A) og høy temperatur (B) fra eggstadiet. Ved dag 135 etter klekkingen var fisk holdt ved høyere temperaturer større og hadde langt mindre deformiteter enn yngel holdt ved lavere temperaturer (Bilder av Hege Lysne). 8 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Temperatur FIGUR 2 Nivåer av tyroksin (T4) i torskeembryoer (A) og kortisolnivåer i yngel etter akutt temperaturstress (B). også bidra i forskingen på naturlige torskebestander. Kunnskapen kan i tillegg brukes til å bedre forståelsen av biologien til andre marine fiskearter. Vi vet at fiskelarver gjennomgår mange utviklingsendringer i løpet av en meget kort tidsperiode og at denne prosessen kan påvirkes av mange ytre faktorer slik som endringer i diett og miljø. Det er imidlertid lite konkret kunnskap om hvordan slike forandringer kan påvirke torskens utvikling og funksjonsnivå på kort og lang sikt. Temperaturens rolle i tidlig livsutvikling Temperatur påvirker hvor hurtig fiskeembryoer og larver utvikler seg og hvordan fiskens utseende, vevsfunksjon og stoffskifte blir. Temperaturskapte forandringer kan trolig også påvirke fiskens fysiologi og dermed fiskens evne til å takle miljømessige utfordringer senere i livet. Inkubasjonstemperatur på tidlige livsstadier kan gi langtidseffekter på fiskens ytelsesevne senere i livet gjennom noe som kalles en programmeringseffekt og epigenetikk. Vi vet lite om langtidseffekten av slike tidlige programmeringseffekter hos torsk. I CODE har vi derfor studert temperaturens rolle i forhold til livshistorieprogrammering. Vi så på fiskens tilpasning til temperatur på kort sikt og om eventuelle forskjeller ville vedvare til senere livsstadier. I forsøket ble torskeegg og larver holdt ved både lave (4-5 °C) og høye (9-12 °C) temperaturer. Vekst, overlevelse og misdannelser ble registrert fra larvestadiet til slakting (~2.4 kg). Resultatene viste at torskelarver holdt ved høyere temperatur var tyngre både som yngel ved 6 måneder og som voksne ved slakting. Selv om andre studier har vist negative effekter av høy temperatur på eggkvalitet, har disse til forskjell fra vårt vært korttidsstudier som ikke gir hele bildet. Vi fant også at temperaturforskjeller gjennom de tidlige livsstadiene påvirket nivåene av tyroideahormoner (THs- triiodothyronin og tyroksin). Disse hormonene spiller en viktig rolle under embryoutviklingen og organutviklingen. Vi har studert uttrykket av gener relatert til stress-aksen i løpet av torskens tidlige livsstadier. I samme tidsrom ble også nivået av stresshormonet kortisol undersøkt. THs og kortisol virker sammen med andre hormoner (f.eks. prolaktin og veksthormon) under fiskens utvikling. Dermed kan endringer i disse komponentene påvirke vekst og utvikling av torsk og være viktig i produksjonssammenheng. Resultatene fra epigenetiske analyser viste signifikante forskjeller i metyleringsmønster mellom larver fra alle temperaturbehandlinger, noe som tyder på at temperaturforskjeller på tidlige tidspunkt i livet kan forandre epigenomet. Det gjenstår å se om slike forandringer vil vedvare og eventuelt ha transgenerasjonseffekt. Implikasjoner for oppdrettsnæringen Høyere vanntemperatur i klekkeriet og under startfôringen vil redusere produksjonstiden av egg og yngel og vil tillate mer effektiv bruk av anlegget. Det er noen indikasjoner på forskjeller i stressaksens utvikling når torsk har blitt holdt ved forskjellig temperatur i løpet av tidlige utviklingsstadier. I tillegg ble evnen til å mestre akutt stress bedre i høy-temperaturgruppa, noe som kan reflektere økende robusthet hos yngelen. Det trengs imidlertid mer forskning før vi kan dra sikre konklusjoner. Videre viste data fra epigenetiske analyser en klar sammenheng mellom temperatur og metyleringsmønster. Viktigheten av dette, samt mulige trans-generasjons effekter, bør studeres videre. Det er kjent at epigenetisk programmering kan forandre individets fenotype, og det kan igjen ha innvirkninger på produksjon i akvakultur. Det er sannsynligvis et stort potensial for oppdrettsnæringen å kunne bruke informasjon fra studier på epigenetikk for å bedre produksjonspraksis. Våre resultater kan også gi innsikt til oppdrettsnæringen om hvordan best tilpasse seg klimaendringer. Spørsmålet om temperatureffekt er også svært relevant i forhold til hvilken framtidig rolle klimaendringer (global oppvarming) kan tenkes å ha på villfisk. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 9 Byttedyrtype Oppdrettsmetoder for torskeyngel og bruk av ulike typer levende byttedyr. Effekter av byttedyrtype på vekst hos torskelarver: Naturlig dyreplankton versus hjuldyr og saltkreps Det har lenge vært kjent at naturlig dyreplankton gir god vekst hos torskelarver. I tidligere forsøk ved Havforskningsinstituttets forskningsstasjon i Austevoll har larver som spiser plankton økt vekten med mellom 14 og 22% daglig fra dag 4 etter klekking til de er ca 5 uker gamle. I ett tilfelle var vektøkningen faktisk hele 37% daglig hos 7 uker gamle torskelarver. Alle disse forsøkene ble utført i store poser (5,2 m3) der fôret bestod av ulike stadier av hoppekreps (copepoder) samlet inn fra et pollsystem. Samlet har forsøkene vist at torskelarver har et stort vekstpotensial når ernæring og oppdrettsmiljø er optimale. Terje van der Meeren, Ørjan Karlsen, Anders Mangor-Jensen, Ivar Rønnestad og Kristin Hamre terjem@imr.no Produksjon av torskeyngel i industriell skala skjer imidlertid med hjuldyr (rotatorier) og saltkreps (Artemia) som byttedyr i den perioden larvene må ha levendefôr. Det benyttes ”grønt vann” (alger eller 10 1- 2015 - BIOLOGI - CODE algepasta), og oppdrettet foregår innendørs i kar av ulike størrelser. Metoden kalles intensivt oppdrett i motsetning til oppdrett i poll der yngelen produseres ved en ekstensiv metode. Yngel produsert med den intensive metoden har oftest betydelig mer skjelettdeformiteter enn ved ekstensivt oppdrett i poll. En del av arbeidspakkene i CODE-prosjektet ble derfor etablert for å kartlegge effekter av ernæring på torskelarvers vekst og utvikling, helt ned til et molekylært nivå. Det er klare forskjeller i innhold av essensielle næringsstoffer hos rotatorier, Artemia og copepoder, og det er også forskjeller i størrelse på disse byttedyrene. Et sentralt spørsmål her var hvordan Byttedyrtype FIGUR 1 disse byttedyrtypene ville påvirke vekst og utvikling hos torskelarver drettet opp under samme miljøforhold som ved den intensive metoden. Copepoder fra Svartatjern For å skaffe nok copepoder til et slikt forsøk ble det tidligere pollsystemet ”Svartatjern” i Austevoll gjenoppbygget. I Svartatjern produseres copepoder fra hvileegg som overvintrer i sedimentet. Eggene klekker når bassenget fylles med sjøvann i mars, og da blir det store mengder copepodelarver (nauplier) tilgjengelig samtidig med at torsken gyter. Nauplier er den viktigste maten til fiskelarver i sjøen, og fiskelarvers fordøyelse, metabolisme, ernæring og utvikling er trolig tilpasset disse byttedyrene gjennom mange millioner år med evolusjon. Et hjulfiltersystem i Svartatjern både konsentrerer og fraksjonerer copepodene i ulike størrelser. Etter at dødt organisk materiale er skilt fra det levende planktonet kan copepodene ytterligere konsentreres og enkelt bringes til oppdrettskarene med torskelarver. Startfôring med ulike byttedyr Lengde hos torskelarver med ulike fôrregimer i de to forsøkene. Pilene i figuren til venstre angir tidspunkt for tilvenning til formulert fôr. og det ble gitt byttedyr i overskudd slik at det alltid var en liten rest igjen ved neste fôring. Det ble tatt prøver av torskelarvene og byttedyrene for analyse av biokjemisk innhold. Videre ble det tatt prøver for andre arbeidspakker i CODE-prosjektet for blant annet å undersøke regulering av gener og biologiske prosesser som appetitt, fordøyelse, metabolisme, vekst, vann- og ionebalanse, utvikling av syn, samt bein- og muskelutvikling hos larvene. Prøvetakingen ble tilpasset larvenes Det ble gjennomført to forsøk ved Austevoll forskningsstasjon der fordøyelse, ernæring, vekst og utvikling hos torskelarver ble undersøkt. I begge forsøkene fikk en larvegruppe nauplier og siden umodne copepoder av økende størrelse (copepoditter), mens en annen larvegruppe ble fôret med rotatorier fulgt av Artemia når larvene ble eldre. Disse to byttedyrregimene var den eneste behandlingen i det første forsøket (Forsøk-1), mens i det andre forsøket (Forsøk-2) ble en tredje larvegruppe kun tilbudt små copepodstadier (hovedsakelig nauplier som var like store eller mindre enn rotatoriene). Dette ble gjort for å undersøke om byttedyrstørrelse kunne forklare observerte forskjeller i vekst i det første forsøket. Omfattende innsamling av prøver Forsøk-1 ble gjennomført i 12 stk. 500 liters kar, med 50.000 torskelarver satt ut i hvert kar på dag 4 etter klekking. Det ble brukt grøntvann (algepasta) til larvene var 5 uker gamle, og i halvparten av karene ble ulike stadier av copepoder benyttet som fôr (planktongruppen) mens den andre halvparten kun fikk rotatorier og Artemia (intensivgruppen). Fôring ble gjennomført som tre måltider om dagen: formiddag, ettermiddag og kveld. Mengde av byttedyr ble vurdert ut fra torskelarvenes størrelse, 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 11 Byttedyrtype FIGUR 2 Sammenligning av torskelarver som er fôret med copepoder (nauplier/copepoditter) og rotatorier/Artemia (fra Forsøk-1). Tabell 1: Vekstdata beregnet fra standardlengde og tørrvekt for torskelarvene i ulike faser av Forsøk-1. Periode Fôr (dag etter klekking) Lengdeøkning Vektøkning (%/døgn) (%/døgn) Kondisjon* Copepoder gir raskere vekst Intensivgruppen: 4 - 22 Rotatorier 2,4 13,9 0,61 22 - 53 Rotatorier/Artemia 2,4 8,6 1,43 53 -84 Formulert fôr 4,0 11,6 1,52 4 - 22 Nauplier 2,5 14,3 0,64 22 - 36 Nauplier/Copepoditter 4,5 15,2 1,24 36 - 73 Formulert fôr 4,0 11,9 1,64 Planktongruppen: * Kondisjon = 1000 x Vekt (mg)/Lengde (mm)3 12 størrelse i hvert av de to fôrregimene, og på denne måten kunne sammenligninger gjøres ved noenlunde like utviklingstrinn hos larvene. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Resultatene viste at begge gruppene av torskelarvene vokste omtrent like bra frem til dag 22 etter klekking (Figur 1). Deretter var daglig vekst i lengde og vekt hos larvene som fikk nauplier nesten dobbelt så høy som i gruppen som fikk rotatorier (Tabell 1), og i samsvar med tidligere observasjoner fra pollene. Larvene som fikk copepoder var også kraftigere pigmentert enn rotatorielarvene (Figur 2). Vekstforskjellene førte til at tilvenning til formulert fôr Byttedyrtype startet på dag 36 i planktongruppen, mens i intensivgruppen skjedde dette først på dag 57. Etter tilvenning til formulert fôr økte lengdeveksten hos larvene som hadde fått rotatorier og Artemia og ble den samme som i planktongruppen. Samtidig ble den daglige økningen i vekt noe redusert i planktongruppen, mens intensivgruppen økte veksten til samme nivå som planktongruppen (Tabell 1). Kondisjonsfaktoren, som var minst i planktongruppen etter dag 22 i perioden med levendefôr, ble jevnet ut mellom de to fôrregimene etter overgangen til formulert fôr. Endringer i kondisjon gjennom larvefasen skyldes for øvrig også at vanninnholdet i larvene synker med økende alder og at veksten ikke er isometrisk (lik i alle kroppsretningene). være at de eldre torskelarvene ikke klarte å spise nok rotatorier, mens larvene som spiste copepoder fikk dekket energibehovet sitt ved tilførsel av stadig større byttedyr gjennom en økende andel copepoditter i fôret. For å teste effekten av byttedyrstørrelse ble derfor Forsøk-2 gjennomført i 12 stk. 50 liters kar med tre ulike fôrregimer. To av disse var de samme som i Forsøk-1, mens det tredje fôrregimet bestod hovedsakelig av nauplier. Nauplier finnes i seks stadier som er like store eller mindre enn rotatoriene. På dag 4 etter klekking ble det satt ut 1900 larver i hvert kar, og algepasta ble benyttet frem til dag 33 etter klekking. Som i Forsøk-1 ble tre måltider gitt pr. dag, og forsøket ble avsluttet på dag 47 før tilvenning til formulert fôr. Er byttedyrstørrelse viktig? Næringsinnholdet er viktigst En mulig forklaring på vekstforskjellene mellom de to gruppene i Forsøk-1 kunne Resultatene fra dette forsøket viste akkurat det samme som i Forsøk-1. Torskelarvene i de tre fôrregimene vokste nesten likt frem til dag 20 (Figur 1). Deretter hadde gruppen som fikk rotatorier og Artemia betydelig dårligere vekst enn begge copepodgruppene. Det mest interessante var at gruppen som kun fikk nauplier vokste nesten like godt som gruppen med økende byttedyrstørrelse. Av dette kan man slutte at det ikke er byttedyrstørrelse som fører til de observerte vekstforskjellene hos torskelarvene. Den mest nærliggende forklaringen er derfor at dette skyldes forskjeller i næringsinnhold i de ulike byttedyrtypene. Utfordringen er å avdekke hvilke ernæringsmessige faktorer som er viktige i denne sammenheng, og hvordan disse påvirker torskelarvenes utvikling og vekst. De etterfølgende artiklene vil belyse noe av dette med utgangspunkt i materialet som er samlet inn fra Forsøk-1. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 13 Stadier Utviklingsstadier i torsk basert på beindannelse Opp gjennom årene er det gjennomført en rekke studier der et bredt spekter av torskens tidlige biologi er karakterisert i forhold til f.eks temperatur, ernæring, både i felt og i laboratorier. Vi ser imidlertid at det kan være vanskelig å sammenligne data fra mange av disse forsøkene siden utviklingshastigheten og vekst varierer sterkt avhengig av en rekke faktorer bl.a. i miljø. Alder er de fleste enige om gir dårlig sammenligningsgrunnlag. I CODE forsøket har vi derfor definert og karakterisert utviklingsstadier som gir mulighet til å ta prøver fra ulike grupper med svært ulik behandling og sammenligne og beskrive forskjeller mellom dem. Øystein Sæle, Trine Haugen, Ørjan Karlsen, Terje van der Meeren, Kristin Hamre, Ivar Rønnestad og Kai K. Lie. oyse@nifes.no Det finnes over 30 000 arter av beinfisk, men utviklingsstrategien kan i hovedsak deles opp i to hovedtyper: direkte og indirekte utvikling. Hos arter med direkte utvikling ligner det nyklekte individet på en liten voksen, mens hos arter med indirekte utvikling skjer mye av utviklingen etter at embryoet er klekket, også etter at larven har begynt å spise. Torsk er en typisk art med sistnevnte strategi. Først når den er blitt en yngel (juvenil) ligner den på en liten voksen. Når plommesekken er oppbrukt og larvene begynner å spise krepsdyr nauplier er larven kun litt over 4 mm og gjennomsiktig, bortsett fra pigmen- terte øyne den trenger for å se. Skjelettet består på dette tidspunktet kun av brusk, ikke ett eneste mineralisert bein. Men det varer ikke lenge, bare dager etter at larvene begynner å spise starter forbeiningen (mineraliseringen) av de første knoklene. Og det er nettopp rekkefølgen på knokler som blir forbeinet som er spennende. En rekke studier viser at rekkefølgen de forskjellige knoklene i hodet blir forbeinet er mer eller mindre den samme i all fisk som er beskrevet. Vi har tidligere brukt denne forbeiningsrekkefølgen i hodet på kveite til å definere utviklingsstadier, og nå har vi gjort det samme på torsk. Ved å farge bein røde med alizarin mens resten av fiskelarven er gjennomsiktig kan vi gi hodebeina en karakter fra 1 til 3, der 1 betyr begynnende forbeining, 2 betyr at knokkelen kan gjenkjennes på form og 3 betyr at knokkelen har en ferdig «juvenil» form. Karakterer på larver fôret med rotatorier etterfulgt av Artemia og så tørrfôr, er gitt i figur 1. Beskrivelse av stadiene er som følger: Stadium 1: Plommesekken er absorbert, tarmen har formet en løkke og hele finnefolden er på plass. Ryggstrengen er tykkere enn musklene i halen. Få spredte pigmentceller kan sees på ryggsiden av hodet og på halen. Skulderbuen er den første strukturen som forbeines, men da den ikke er en del av kraniet er den ikke med i figur 1. I dette stadiet vil også knokkeldannelsen starte i kjeven. Stadium 2: Musklene i halen er nå tykkere enn ryggstrengen. Forbeiningen i hodet er dominert av kjeveknoklene, mens FIGUR 2 Det delvise forbeinede kraniet på en torskelarve i stadium 4. Navn på knokler som er navngitt i teksten er indikert. 14 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Stadier FIGUR 1 Karakterer gitt til larver med økende størrelse, alder er også oppgitt. Larvene ble fôret rotatorier fulgt av Artemia før tørrfôr. Fargefeltene illustrerer de forskjellige utviklingsstadiene fra 1 til 5. Yngel (juvenil) er gitt til sist i mørk blå. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 15 Stadier FIGUR 3 HAVBRUK FREMTIDENS OLJENÆRING Torsk ved ulike utviklingsstadier. Fargekoden på hvert stadium er den samme som i figur 1. noen av knoklene i hyoidbuen vil starte å forbeine i dette stadiet. Begynnende forbeining kan også observeres i gjellebuene, samt i deler av neurocraniet (spenoid beinet og i occipital gruppen). Stadium 3: Muskler er det dominerende vevet i halen nå, og pigmentceller er spredt over det meste av larvens overflate, men ikke på finnefolden. I dette stadiet vil finnefolden starte forvandlingen fra en fold til differensierte finner. Hos enkelte individer kan røde blodceller observeres i hjerteog gjelle regionen. Enkelte bein i kjeven har nå kommet så langt i forbeiningen at de kan identifiseres basert på form, og ikke bare hvor i kroppen de befinner seg. Flere av de neurocraniale knoklene blir forbeinet i dette stadiet. Mot slutten av stadium 3 vil ryggstrengen i haletippen bøyes oppover (flexion). Stadium 4: I dette stadiet vil den spredte forekomsten av pigmentceller tette seg til, men finnene forblir upigmenterte og halen vil fortsatt være gjennomsiktig. Finnene er utviklet, til torskens karakteristiske tre ryggfinner og to gattfinner. Flexion er nå på plass. De fleste bein i hodet er påbegynt/delvis forbeinet. De flate knoklene i gjellelokket har også startet å forbeine. Stadium 5: Dette stadet er best karakterisert av at de neurokraniale beinplatene vokser sammen. Det er den økte forbeiningen av den otiske knokkelgruppen som er viktigst her. Ser man larvens hode fra siden så er snutens profil svakt kurvet (litt oppstoppernese) i stadium 4. I stadium 5 16 1- 2015 - BIOLOGI - CODE forsvinner oppstoppernesen, og profilen fra ”pannen” til nesen blir rettere. Dette skyldes veksten av en gruppe bein som heter ethmoid gruppen, samt et bein som heter nasale. Pigmentcellene er fortsatt ikke tett nok samlet til å forhindre at indre strukturer som ryggraden kan sees, og finnene er fortsatt ikke pigmentert. Juvenil fisk: Nå er pigmenteringen av fisken komplett, med mørk rygg, hale og finner og lys buk. Ethmoid knoklene og nasale beinet er fullt utviklet, noe som gir torsken rund snute i profil. Forbeining er godt kriterium for stadiuminndeling Vi har vist at rekkefølgen av forbeining av knokler i hodet hos torsk følger det samme mønsteret som vi ser hos andre beinfiskarter. Dette viser at forbeining av kraniet er et godt kriterium for stadiuminndeling. Som tidligere nevnt er denne inndelingen svært viktig for å analysere og ikke minst sammenligne resultater fra ulike forsøk og behandlinger. Veksten i ernæringsforsøket (van der Meeren m.fl. annet sted i bladet) viser at de to ulike fôrene ga svært ulik vekst. Imidlertid viste beinfarging av larver fra de to gruppene at forbeiningen av skjelettet var den samme i larver på samme størrelse og at de to behandlingene gjør at fisken når samme utviklingsstadium til forskjellig tid. Dette illustrerer at det lite hensiktsmessig å sammenligne effekten av behandling med hensyn på alder. Ernæring Næringsstoffer som begrenser vekst hos torskelarver fôret med hjuldyr Det er allment kjent at naturlig dyreplankton gir bedre vekst hos torskelarver enn hjuldyr (rotatorier) og saltkreps (Artemia) selv om årsakene har vært en gåte. I CODE prosjektet har vi nå vist at forskjellene i vekst hovedsakelig skyldes ernæring, og mest sannsynlig store forskjeller i innhold av protein og taurin i fôrdyrene. I tillegg kan innholdet av sink, jod, fettsyrer, fosfolipider og pigmenter ha vært begrensende for vekst hos hjuldyr-fôrede larver, men nivåene her lå over antatt behov. Larvens proteinsammensetning er bestemt av den genetiske koden og er tilnærmet konstant. Mangel på protein eller enkelte aminosyrer vil derfor i første omgang gi redusert vekst. Taurin blir ofte gruppert som aminosyre, men er egentlig en sulfonsyre som er løst i kroppsvæskene og som ikke inngår som en bestanddel i proteiner. Taurin er nødvendig for dannelse av galle, for osmoregulering og for funksjon av mitokondrier, cellenes energikraftverk. Taurinmangel fører bl.a. til oksidativt stress. Kristin Hamre, Ørjan Karlsen, Terje van der Meeren og Ivar Rønnestad kha@nifes.no Før oppstart av CODE prosjektet hadde vi på NIFES studert ernæringsmessige forskjeller mellom rotatorier og naturlig zooplankton (som består hovedsakelig av copepoder) og funnet at spesielt når det gjaldt mikromineraler, hadde rotatoriene lave nivåer. Fettsyrer og vitaminer var stort sett til stede i riktige mengder i de kommersielle rotatoriefôrene. Det ble etablert anrikningsmetoder for mikromineraler hos rotatorier slik at man kunne kjøre behovsforsøk. Disse forsøkene viste at mineralbehovene hos torskelarver lå langt under det høye innholdet som finnes i copepoder, men ofte litt høyere enn innholdet i rotatorier. Denne kunnskapen ble brukt da en skulle designe dyrknings- og anrikningsprosedyrer for rotatorier (se faktaboks) i ernæringsforsøket i CODE (van der Meeren m.fl. annet sted i bladet). Det ble kjørt en pilotproduksjon av rotatorier før forsøket startet og analysene viste antatt riktig sammensetning for de næringsstoffene vi hadde kunnskap om og kunne kontrollere. Innhold av næringsstoffer i byttedyr Som vist i en annen artikkel i bladet (van der Meeren m.fl.) var det likevel stor forskjell i vekst mellom torskelarver fôret med rotatorier og copepoder, noe som i hovedsak ser ut til å skyldes forskjellen i byttedyrenes næringsinnhold. Tabell 1 angir nivået av de næringsstoffene som potensielt kan ha begrenset veksten hos larver fôret med rotatorier og Artemia. Innholdet av de Dyrkning og anrikning av rotatorier i CODE prosjektet • Dyrkning 7-dager batch-kultur, 2m3 kar med kon, 24˚C, 850.-2600 hjuldyr/ml, fôring 4 ganger per time: Tørrgjær 0,11-0,18 g/million hjuldyr, Rotifer Diet® (Reed Mariculture Inc.) 0,3-1,5 g/ million hjuldyr • Anrikning 1000-2000 hjuldyr/ml, fôring 1 gang per time, 0,6 mg Sel-Plex® (Alltech Inc.) + 0,2 g Larviva Multigain (Biomar) per million hjuldyr. FIGUR 1 Fôrdyr for marine fiskelarver 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 17 Ernæring FIGUR 2 Torskelarvens sammensetning av kroppsprotein er bestemt av den genetiske koden og kan ikke påvirkes gjennom fôring. Hvis larven får for lite protein, eller den mangler en eller flere aminosyrer, vil dannelsen av protein og dermed veksten begrenses. Fiskelarver ser ut til å kompensere for lavt proteininnhold i byttedyrene ved å spise mer. Dette vil uansett føre til ubalanse i inntak av de ulike næringsstoffene. Et lavt totalt proteinnivå, kan øke larvenes sårbarhet for mangel på enkeltaminosyrer, for eksempel er metionin kjent å være lav i rotatorie-protein sammenlignet med andre animalske protein. Taurin – viktig for fettmetabolisme og osmoregulering Næringsstoffanalyser – NIFES. næringsstoffene som ikke er inkludert i tabellen var omtrent som i copepoder eller litt høyere. Totalt fettinnhold og innhold av omega3 fettsyrer var noenlunde likt i rotatorier og copepoder. Arachidonsyre var noe lavere i copepoder enn i rotatorier, men ikke nok til å gi den store forskjellen i vekst. Heller ikke forskjellen i pigmentinnhold er forventet å gi en så stor vekstforskjell. Når det gjelder jod, har vi funnet at behovet ligger på ca 3,5 mg/kg tørrstoff og burde derfor være dekket av innholdet i rotatoriene. Det var stor forskjell i innhold av sink i byttedyrene, men torskelarvene hadde likevel ganske likt sinkinnhold. Siden sinknivået er strengt regulert i de fleste dyr, er det sannsynlig at rotatorier inneholdt tilstrekkelige mengder sink til å dekke behovet, og at overskuddet ble skilt ut i de larvene som fikk copepoder. Forskjellig nivå av polart lipid kan ha gitt en forskjell i vekst, men siden rotatoriene inneholdt mer enn 20% av fetter som fosfolipid er det lite sannsynlig at forskjellen ville blitt så stor som i dette forsøket. Protein og taurin kan forklare vekstforskjeller Lave nivå av protein og taurin i rotatorier er den mest sannsynlige årsaken til vekstforskjellen. Proteininnholdet i hjuldyr var bare ca 2/3 av nivået i copepoder. Protein er det viktigste av hovednæringsstoffene og danner grunnlaget for alle biologiske prosesser. Det består av aminosyrer som i tillegg til å gi proteinene sine unike funksjoner har en rekke andre roller i metabolismen. Tabell 1. Nivå av næringsstoffer i byttedyr brukt i ernæringsforsøket i CODE (TS: tørrstoff; TFS: totale fettsyrer; TL: total lipid; Asterixer angir signifikante forskjeller mellom rotatorier og copepoder: * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001) Protein (g/100 g TS) Taurin (µmol/g TS) Pigmenter (mg/kg TS) Canthaxanthin Astaxanthin Mineraler (mg/kg TS) Jod Zink Fett og fettsyrer 20:4n-6 ARA (% TFS) 20:5n-3 EPA (% TFS) 22:6n-3 DHA (% TFS) EPA/ARA Sum totale fettsyrer (g/kg TS) Sum PL (% TL) 18 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Rotaorier Artemia copepoder 37 ± 4 0,8 ± 0,3 39 ± 0 29 ± 1 60 ± 2*** 50 ± 6*** 32 ± 4 11,1 ± 1,0 86 ± 28 n.d. 10 ± 1*** 141 ± 15*** 2,6 ± 0,8 41 ± 6 3.9 ± 0.9 120 ± 14 35 ± 13* 517 ± 75*** 1,9 ± 0,1 4,4 ± 0,2 32 ± 3 2,3 98 ± 18 2,4± 0,0 4,1 ± 0,3 19 ± 3 1,7 116 ± 15 0,6 ± 0,1* 10,8 ± 1,9** 22 ± 4* 18,0 95 ± 39 22 ± 2 25 ± 0 29 ± 2* Taurin var mer enn 50 ganger lavere i rotatorier sammenlignet med copepoder. Taurin er kjent som en viktig komponent i galle, og lavt taurin kan derfor føre til dårlig fettfordøyelse. Taurin er også en osmolytt, og er derfor viktig for larvens osmoregulering. En velbalansert osmoregulering er kritisk for små fiskelarver som lever i sjøvann som er saltere enn kroppsvesken, og som også har svært stor overflate i forhold til volum. En annen viktig funksjon av taurin er som buffer i mitokondrier- cellenes energikraftverk. Aktiv inn-transport av taurin skaper et høyt osmotisk trykk i mitokondriene, noe som er en forutsetning for energiproduksjonen. Hvis denne funksjonen forsvinner vil mitokondriene begynne å produsere frie radikaler og forårsake oksidativt stress og celledød. Det er interessant å se at fôring av rotatorier anriket med taurin til larver av en flyndre (Rock sole) førte til en tilvarende vekststimulering som med dyreplankton i vårt forsøk (Hawkyard et al 2014). Anrike hjuldyr med protein og taurin Kan man anrike hjuldyr med protein og taurin? Proteinanrikning er vanskelig fordi rotatoriene har sin egen metabolisme og vil lage sitt kroppsprotein kun basert på sin genetiske kode. Ekstra protein i tarmen som kan imidlertid øke totalproteinet, og i våre forsøk er 45 % av tørrstoff det høyeste proteinnivå som er oppnådd. Under oppbevaring av rotatoriene vil anrikningen dessverre forsvinne etter kort tid. Man kan imidlertid kanskje utvikle fôrings-strategier der man gir ekstra protein som et tørt fôr ved siden av rotatoriene, for å bedre proteintilførselen til fiskelarver. Ernæring Taurin er vannløselig. Man kan anrike rotatorier med taurin ved å løse det i vannet i anrikningstanken, men det kreves store mengder for å få riktig nivå. Det er kanskje mindre kostnadskrevende å anrike partikler med taurin som hjuldyrene kan filtrere ut av vannet. Slike metoder er under utvikling (Hawkyard et al., 2014). Tabell 2. Antatt optimale nivå av endel næringsstoffer i hjuldyr som skal brukes til torskelarver. Tallene er estimater, og hjuldyrene kan fungere også med store avvik fra anbefalingen. Dette er imidlertid et første forsøk på å anslå noen behov hos fiskelarver. (TS: tørrstoff; TFS: totale fettsyrer; TL: total lipid) A Analyser rotatoriene før bruk Hvordan kan man vite om man har et riktig sammensatt rotatorie ernæringsmessig sett? Mange ulike dyrknings- og anrikningsdietter kan gi rotatorier som har en god ernæringsmessig sammensetning for marine fiskelarver, men valg av dietter er et sjansespill fordi ulike dietter har ulike nivåer av mange av næringsstoffene. Det man kan gjøre er å analysere rotatoriene for kritiske næringsstoffer før man bruker dem i produksjonen. Ved eventuelle mangler kan man så tilsette ekstra av det aktuelle næringsstoffet i dyrknings- eller anrikningsfôret. Antatt optimale nivå av en del kritiske næringsstoff er gitt i Tabell 2. Anbefalt nivå Protein (g/100 g TS) Taurin (µmol/g TS) Vitaminer (mg/kg TS) A C E (α-tokoferol.) Tiamin Mineraler (mg/kg TS) Jod Selen Fett og fettsyrer 4 20:4n-6 ARA (% TFS) 20:5n-3 EPA (% TFS) 22:6n-3 DHA (% TFS) Sum fatty acids (g/kg TS) 60 1 50 1 2,4 2 500 5 300 5 >15 4 3,5 3 0,3-2 3 0,6-2,4 4-12 >20 8-12 1 Basert på innhold I naturlig plankton i dette studiet. Ikke oppnåelig med dagens metoder 2 Basert på forsøk med kveite postlarver (Moren m.fl., 2004) 3 Basert på forsøk med torskelarver (Penglase m.fl., 2010; 2013) 4 Basert på innhold i copepoder. 5 Basert på erfaring • Fiskestørrelse fra 0.2g - 400g • Over 99% nøyaktighet • Opp til 200.000 smolt i timen • Snittvekt og størrelsesfordeling • Database med bilde av hver fisk • Tellerapport • En til fire kanaler • Spesial brønnbåt versjon vaki.is 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 19 Metabolisme NMR OG METABOLOMICS Kjernemagnetisk resonans spektroskopi (NMR) brukes for å studere atomkjerner som spinner i et sterkt magnetfelt. Metoden kan brukes til å studere bl.a. 1H og 13C, som forekommer i organiske molekyler. Signalene fra ulike kjerner endrer seg dersom de kjemiske omgivelsene endrer seg, så man kan se på forandringer i kjemiske prosesser. NMR-analyse gir store datasett som kan analyseres ved hjelp av statistikk for å hente ut informasjon, og metoden brukes til å studere opprinnelse og kvalitet i f.eks. olivenoljer, vindruer, juice, eller til å studere kvalitet/nedbrytning i fiskefilet el tran. Metoden brukes i medisin for å se etter tegn til sykdom i urin- eller plasmaprøver fra pasienter, og man kan avdekke f.eks. endringer i stoffskiftet eller ulike kreftformer. Magnet-resonans-signaler kan også avleses i bilder, og magnet resonans imaging (MRI) brukes i forskning og medisin for å avbilde organismer og se etter skader eller endringer i vev og strukturer. Alle levende organismer har et stoffskifte (metabolisme), der ulike "byggesteiner" bygges opp eller brytes ned. Metabolomics er studiet av de stoffene som inngår i dette stoffskiftet. NMR er godt egnet til å studere metabolisme og dynamiske prosesser, og man kan rette analysen mot spesifikke deler av et svært komplekst system. Det er mulig å analysere hele celler eller små organismer som f.eks. larver eller biller uten å dele de opp, men ofte brukes ekstrakter for å få bedre oppløsning eller mer spesifikk informasjon om visse byggesteiner eller molekyler. Effekt av temperatur og ernæring på utvikling av torskelarver i tidlige stadier: Hvordan påvirkes metabolismen? I alle levende organismer foregår et stoffskifte, eller metabolisme, som betegner kjemiske prosesser der stoffer brytes ned til enklere forbindelser eller nye forbindelser bygges opp. Stoffskiftet pågår hele tiden, og det er svært mange prosesser som må fungere for at organismen skal vokse og utvikle seg normalt. Prosessene er tilpasset en gitt kroppstemperatur og hos beinfisk som torsk reguleres kroppstemperatur i takt med omgivelsene. Endringer i vanntemperatur vil derfor kunne påvirke stoffskifteprosesser. Det samme gjelder for ernæring, fordi mange prosesser må tilføres «byggesteiner» fra maten som torskelarvene spiser, og kostholdet har innvirkning fra det øyeblikket larvene begynner å spise. Matilde S. Chauton matilde.skogen.chauton@sintef.no Kjernemagnetisk resonans spektroskopi (NMR) er en metode der man studerer visse atomer i forskjellige forbindelser, og man kan observere isotoper av H, C, P, Si og N, for å nevne noen. Analysen fanger opp mange ulike forbindelser i en prøve, og gir stort datautbytte som kan bearbeides videre ved hjelp av statistiske analyser. Metoden brukes til å studere metabolomet (de stoffene som inngår stoffskiftet) hos mange ulike organismer, og det er mulig å studere hele celler eller organismer uten å ødelegge dem1. Det er imidlertid en del utfordringer med å studere hele celler, så vanligvis ekstraheres vevsprøver før man foretar NMR-analysen. Hvordan påvirker metabolomet torskelarvene? Torskeyngel i ernæringsforsøk. Foto: Ivar Rønnestad 20 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Vi vet en del om enkeltprosesser i fiskens stoffskifte, og moderne analysemetoder gir oss mulighet til å analysere prøver for å få "øyeblikksbilder" av mange stoffskif- teprosesser eller deler av dem for å utvide kunnskapen. I CODE-prosjektet har vi brukt NMR til å analysere ekstrakt fra hele torskelarver, og analysen gir oss informasjon om mange viktige forbindelser som inngår i stoffskiftet: aminosyrer, energiforbindelser, laktat, eller osmolytter. Analysene av stoffskifte hos torskelarver i temperatur- og ernæringsforsøkene i CODE-prosjektet har gitt viktig informasjon om hvordan disse variablene påvirker torskelarvene. Et eksempel fra ernæringsforsøket er gitt i figur 1, og NMR-dataene viser larver som er fra hhv stadium 1, 2, 3, 4 og 5. Man ser at det er forskjeller i metabolismen ettersom larvene blir eldre og får ulik diett (hjuldyr vs. copepoder). Fordi metabolomet påvirkes av mange faktorer må man tolke dataene både som følge av eksperimentelt oppsett og som følge av utvikling. Noen endringer skyldes forskjeller som følge av kostholdet (eksperimentelt oppsett) mens andre forskjeller kan skyldes f.eks. økt muskelaktivitet i eldre larver (biologisk variabel). Metabolisme FIGUR 1 Score plott basert på NMR-data fra torskelarver i temperaturforsøket i CODE-prosjektet. Prøvene er fra larver som er hhv stadium 1 (4 og 10 i figuren, rød triangel og grønn stjerne), 2 (20, blå firkant), 3 (30, lyseblått kryss), 4 (45, svart rombe) og 5 (60, røde stjerner med grønt omriss), og man ser at det er en endring i metabolismen ettersom larvene blir eldre. De eldste larvene deler seg i to grupper, og det kan skyldes forskjeller som følge av kostholdet (hjuldyr eller copepoder). Endringer ettersom larvene blir eldre kan også skyldes f.eks. økt muskelaktivitet i eldre larver. I neste steg av analysearbeidet kan man gå inn i dataene og se hvilke metabolske endringer som fører til at larvene grupperes ulikt i score plottet. Organismer i saltvann må regulere salt/væskebalansen, og de inneholder derfor mange forbindelser som fungerer i osmoregulering. Vi observerte bl.a choline og betaine/TMAO i torskelarvene, og disse forbindelsene inngår i osmoregulering. Creatin er en energiforbindelse som inngår i muskelaktivitet, og forbindelsen lages av aminosyrene arginin og glycin. Alanin og laktat er også forbundet med muskelaktivitet, og i våre data så vi at eldre larver som har økende muskelaktivitet, inneholder mer alanin og laktat enn de nyklekkede larvene. Taurin er en forbindelse som har kommet i fokus fordi man har blitt klar over betydningen av taurin i kosten hos oppdrettsfisk 2. Fiskelarvene er avhengige av å få taurin gjennom kosten, og i våre data så vi at eldre torskelarver som ble fôret med copepoder inneholdt mer taurin. Det er vist at copepoder inneholder mer taurin enn hjuldyr (se artikkel av Hamre m.fl. i dette nummeret), og det kan være en viktig årsak til at copepoder har høyere næringsverdi enn hjuldyr3. Taurin er viktig i stoffskiftet, og den kan inngå i osmoregulering, membranstabilisering, muskelutvikling og signalisering. Temperaturforsøket i CODE-prosjektet viste forskjeller i stoffskiftet hos larver Totalleverandør av finansielle løsninger som ble utsatt for ulik temperatur før klekking, og denne effekten så ut til å prege larvene videre mht vekst og utvikling. Vekst og muskelutvikling går raskere ved høyere temperaturer, så egg og larver som utsettes for lav temperatur vokser saktere og bruker lengre tid på utvikling. Vi så også forskjeller i stoffskiftet mellom unge larver og eldre larver i temperaturforsøket, og forskjellen var relatert til et høyere innhold av creatin, taurin, alanin og laktat i de eldre larvene. Det reflekterer at de unge larvene har et mindre utviklet stoffskifte, lavere muskelaktivitet og muligens et mindre utviklet osmoreguleringssystem. Hvis larvene i tillegg vokser sakte og har sakte muskelutvikling på grunn av lav temperatur så er det stor fare for at noe går galt underveis i utviklingen mot voksen fisk. Resultatene fra NMR-analysene kan videre kobles sammen med data fra de andre arbeidene som er gjort i prosjektet, f.eks. vekst og utviklingsanalyser, muskelutvikling og genuttrykksanalyser, og bidrar til å øke forståelsen av hvordan torskelarvene påvirkes i den tidlige fasen av livet. Referanser 1 Chauton, MS. 2005. "Metabolic profiling and species discrimination from High-Res. Magic Angle Spinning NMR analysis of whole-cell samples". PhD thesis, NTNU. 2 Espe, M. og Holen, E. "Taurin – en gammel kjenning med ny aktualitet", Norsk Fiskeoppdrett 10-2013 3 Hamre, K., M. Yufera, et al. (2013). "Fish larval nutrition and feed formulation: knowledge gaps and bottlenecks for advances in larval rearing." Reviews in Aquaculture 5: S26-S58 Banktjenester Kaste på nytt eller gå til havn og levere? I Nordea vil du få tilgang til et unikt nettverk, med allsidig og komplett tilbud av finansielle tjenester og skreddersydde løsninger. Trade Finance Markets - valuta, rente og verdipapirer Leasing Factoring Pensjon nordea.no Private Banking Corporate Finance Gjør det mulig 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 21 RNA-sekvensering Kan vi forklare de underliggende faktorer som gir en rasktvoksende fiskelarve av god kvalitet? I dag er produksjon av torsk og de fleste andre marine fisk i oppdrett avhengig av anrikede rotatorier (hjuldyr) og Artemia (saltkreps) i startfôringsfasen. Bedre metoder for anriking har de siste årene redusert andelen yngel med feilutvikling og i tillegg også forbedret veksten for de fleste arter. Imidlertid viser erfaring fra torsk, kveite og mange andre fiskearter, at både utvikling og vekst kan ytterligere bedres ved å bytte ut rotatorier og Artemia med naturlig dyreplankton slik som hoppekreps (copepoder). Selv om fordelen med å startfôre en rekke fiskearter med naturlig dyreplankton er beskrevet i tallrike studier, er de underliggende mekanismene som skaper forskjellene i vekst og utvikling ikke forstått. Av Ivar Rønnestad, Kristin Hamre, Tomazs FIGUR 1 Furmanek, Ørjan Karlsen, Terje van der Meeren, Øystein Sæle, Rolf B. Edvardsen Ivar.Ronnestad@bio.uib.no I de siste årene har nye sett av verktøy i form av molekylære metoder nærmest revolusjonert muligheten til å studere årsakssammenhenger ved å se hvordan aktiviteten til tusenvis av gener blir påvirket av forsøksbetingelsene (se faktaboks). Vi kan derfor starte med å identifisere og forstå kritiske faktorer som begrenser eller stimulerer genene som styrer vekst og utvikling. Vi har analysert larver av torsk der det var store forskjeller i vekst, utvikling og ernæringsstatus (se artikler av van der Meeren, og Hamre m fl. i dette nr.). En gruppe torsk var startfôret med anrikede rotatorier, senere Artemia, og en annen gruppe startfôret og dyrket på naturlig dyreplankton (for det meste copepoder). Forskjellene i vekst skjedde i hovedsak i stadium 3 og 4 (se artikkel av Sæle m.fl. annet sted i bladet for stadiebeskrivelser) der den daglige lengdeveksten av larver fôret med copepoder var nesten dobbelt så høy som hos larver fôret med rotatorier og Artemia. Tilstrekkelig nivå av bl.a taurin og protein er viktig Analyser viste at rotatoriene hadde lavere innhold av protein, taurin, sink, fettsyrene ARA, EPA og fosfolipider sammenlignet med copepodene. Ellers virket rotatoriene å ha tilstrekkelig nivå av øvrige næringsstoffer, inkludert DHA, vitaminer og mineraler. Protein og taurin ble vurdert som de mest sannsynlige kandidatene for å forklare den lave veksten i rotatoriefisken. Etter at torskelarvene var tilvendt tørrfôr og begge gruppene hadde gått på dette i litt 22 1- 2015 - BIOLOGI - CODE A: Fôringsregime. Diett 1 besto av copepoder opp til stadium 4. Det var en kort periode med både copeoder og tørrfôr før dietten bestod av bare formulert fôr . Diet 2 startet med anrikede rotatorier til stadium 3 etterfulgt av et kort overlapp med Artemia. Deretter bare Artemia til stadium 4. Etter en kort overgangsperiode bestod dietten av bare formulert fôr. B: Antall gener som er uttrykt forskjellig i larver fôret med de to diettene. C: Antall dager det tok fisken å nå de forskjellige størrelsesstadiene med de to diettene. Larver fôret med copepoder vokser raskere. I perioden fra stadium 2 til stadium 4 er det stor forskjell i vekst mellom diettene. Det er i denne perioden at forskjellene i antall uttrykte gener er størst. mer enn to uker, hadde larvene fôret med rotatorier / Artemia høyere fettinnhold enn fisk fôret med hoppekreps. Dette på tross av at fôrene hadde omtrent samme innhold av fett. På basis av denne kunnskapen har vi endret råd om sammensetningen til fôret for marine fiskelarver (se artikkel av Hamre m. fl. i dette nr) For å forsøke å beskrive mekanismene for forskjellene i vekst og utvikling RNA-sekvensering RNA sekvensering Alle celler i kroppen inneholder en fullstendig kopi av dyrets arvemateriale (DNA). Syntese av proteinene foregår ved at utvalgte gen i arvematerialet kopieres til mRNA som er oppskriften for hvordan proteinet skal være sammensatt. Mengden mRNA-kopier av ett gen utgjør genets uttrykk og jo mer mRNA fra et gen som fins i cellen, jo høyere er det uttrykt eller regulert. Ved å sammenligne mRNA uttrykket i larver som har fått ulik behandling, kan man få informasjon om hvilke biologiske prosesser som er ulikt regulert som følge av forskjellen i behandling. ISO-SertIfISert Kvalitet i alle ledd? Kravene til kvalitet, system og sporbarhet blir bare viktigere i en stadig mer profesjonell næring. Vel. Det er kanskje ikke helt slik det er. Men vi bruker enormt med ressurser på å forstå groen enda bedre - og på å utvikle stadig bedre produkter. Vi er glad for å ha oppnådd en milepæl: Steen-Hansen fikk sertifisert sitt kvalitets- og miljøstyringssystem i henhold til ISO-standardene desember 2014. Vi er nå ISO-sertifisert - mht kvalitet (ISO 9001:2008) og miljø (ISO 14001:2004) Les mer om Steen-Hansen og ISO på www.steen-hansen.no/akkrediteringer Design: Artgarden / Illustrasjon/ 3D: NAGELLd Til nytte for deg. Og til glede for fisken din. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 23 RNA-sekvensering Konklusjon mellom larvegruppene, analyserte vi fem av utviklingsstadiene ved hjelp av RNA sekvensering (se faktaboks). De to larvegruppene hadde svært like genuttrykk frem til dag 20, men det var store forskjeller i genuttrykk i fasen der veksten var mest forskjellige. Etter at de to gruppene ble tilvendt samme formulerte fôr ble forskjellene i genuttrykk mindre igjen (Figur 1). Sæle og medarbeidere i dette nr.). Videre var mange gener knyttet til produksjon og frisetting av galle høyere uttrykt i disse larvene. Det er her interessant å merke seg at taurin er en viktig bestanddel av gallesalter som igjen er viktig i fettfordøyelsen. Forskjellene i energiomsetning og fettmetabolisme kan ha sammenheng med ulik fettdeponering i de to larvegruppene. Signalveier og metabolismen endres, men ikke alltid slik vi forventer God vekst og utvikling krever tilstrekkelig protein og sunne mitokondrier i balanse Oppsummert ser det ut til at den den raske veksten som karakteriserer høykvalitets torskelarver i dette forsøket har sin bakgrunn i tilstrekkelig nivå av protein i fôret som tillater oppregulering av anabolske metabolske reaksjonsveier, samt et tilstrekkelig nivå av taurin som gjør at larven unngår å aktivere cellenedbrytende prosesser knyttet til oksidativt stress, betennelse, og celledød. Det lavere innholdet av protein i rotatoriene resulterte ikke i store forandringer i uttrykk av gener knyttet til proteinfordøyelse og absorpsjon, bortsett fra chymotrypsin-nivå (et enzym som er involvert i proteinfordøyelse) som var klart lavere i rotatoriefisken. Gener knyttet til proteinog aminosyreomsetningen var til en viss grad påvirket, men forskjellene var små. Noe uventet fant vi ikke så klare forskjeller i utrykk av gen som koder for veksthormon (GH eller IGF-1), men en rekke gener knyttet til vekst og cellesyklus (cellefornyelse) var høyere uttrykt i de rasktvoksende larvene. Det var en del forskjeller i sentrale omsetningsveier for energi i larven, inkludert sukker- og fettomsetningen, sitronsyresyklus og forbrenningen i mitokondriene. Flere av systemene som er involvert i omsetning og transport av fett både i tarm og lever, var høyere uttrykt i rotatoriefisken enn i copepodefisken (se også artikkel av Forskjeller i taurin-nivå mellom fôrene resulterte i noen forskjeller i aktivitet av gener som koder for enzymer som syntetiserer taurin og hypotaurin, men larvenes taurinmetabolisme var i seg selv lite påvirket. Mitokondriene er cellenes energifabrikker, og energiproduksjonen avhenger av en rekke proteiner i den såkalte elektrontransportkjeden. Syntesen av disse proteinene krever tilstedeværelse av taurin. Taurinmangel fører derfor til lavere nivå av disse proteinene, hemmer elektrontransport og fører til depolarisering av mitokondriemembranen. Dette kan så gi økt produksjon av reaktive oksygen metabolitter (ROS) og apoptose (celledød). Våre analyser indikerer at dette skjedde i fisken fôret på rotatorier, da flere prosesser knyttet til produksjon av og beskyttelse mot ROS var ulikt regulert i de to larvegruppene (se artikkel av Penglase og medarbeidere i dette nr.). Mange signalveier knyttet til betennelse og celledød var oppregulert i rotatorielarvene, på tross av det ikke var noen tegn til sykdomsutbrudd i karene, kun dårligere vekst. Disse funnene støttes også av tidligere mikroskopiske studier som viser litt ”rufsete” mitokondrier hos larver som har fått rotatorier. Distensive gut syndrome (DGS) er en alvorlig lidelse hos oppdrettede torskelarver som kjennetegnes av en væskefylt tarm og som resulterer i stor dødelighet. Vi har tidligere vist at larver som utviklet DGS, hadde betennelse og problemer knyttet til redox balansen, selv om den underliggende årsaken ikke ble identifisert (se Norsk Fiskeoppdrett 10; 54-55. 2010). Enkelte av genene som karakteriserer torskelarver med DGS er også oppregulerte i larver fôret med rotatorier i forhold til larver fôret med copepoder i CODE forsøket. 24 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Redox Oksidativt stress forårsaket av taurinmangel kan være en medvirkende årsak til redusert vekst hos torskelarver fôret med rotatorier Vi har tidligere vist at gener som er med å opprettholde en korrekt balanse mellom antioksidanter og oksidasjon i cellene (redoxbalansen; se faktaboks) er dynamisk regulert gjennom utviklingen hos torskelarver. Basert på dette ville vi teste om ernæringsmessige forskjeller mellom rotatorier (hjuldyr) og copepoder (hoppekreps) påvirker torskelarvenes redox-balanse og om dette kan forklare vekstforskjeller. Vi fant at torskelarver fôret med rotatorier hadde et mer redusert cellemiljø og at mange av genene i redoxsystemet var oppregulert. Dette kan bl.a. være en reaksjon på oksidativt stress forårsaket av taurinmangel, og en medvirkende årsak til redusert vekst. Av Samuel J. Penglase, Rolf B. Edvardsen, Tomasz Furmanek, Ivar Rønnestad, Ørjan Karlsen, Terje van der Meeren, Kristin Hamre spe@nifes.no Torskelarver i havet spiser primært copepoder, men disse fôrdyrene er vanskelig å dyrke i store mengder. Derfor fôres torskelarver i oppdrett med rotatorier og senere Artemia, noe som gir lavere vekst og mer deformiteter, selv etter store forbedringer i næringsinnhold gjennom bedre dyrkningsog anrikningsprosedyrer for byttedyrene. Vi vet at næringsstoffer kan påvirke menneskers helse, og at dette kan skje via molekylære mekanismer som for eksempel gjennom endring i genuttrykk. Dette skjer også i fisk, men mekanismene som kan forklare hvorfor larver fôret med copepoder har bedre kvalitet enn larver fôret med rotatorier, er ikke kjent. Ved NIFES har vi tidligere vist at gener som er med å opprettholde en korrekt balanse mellom antioksidanter og oksidasjon i cellene (redoxbalansen) er ulikt regulert i ulike perioder av utviklingen hos torskelarver. Vi ville også undersøke om næringssammensetningen i rotatorier forandrer redoxbalansen på en slik måte at det påvirker vekst og utvikling hos torskelarvene. FIGUR 1 Torskelarver fôret med rotatorier hadde et mer redusert cellemiljo enn larver fôret med copepoder. Foto: Scott Mills 120 gener involvert i redox Effekt av byttedyrtype på redoxbalansen i torskelarver under utvikling. A) Konsentrasjon av oksidert glutation (GSSG, μM) og B) redoxpotensial (mV). Torskelarvene ble fôret enten med rotatorier (rød linje) eller med copepoder (blå linje) fra startfôring. Utviklingen er gitt ved stadier (se Sæle m.fl. annet sted i bladet). Område med skygge representerer den perioden der det var størst forskjell i vekst (van der Meeren m.fl. annet sted i bladet). P-verdien angir overordnet forskjell mellom rotatorie- og copepodefôring, mens stjernene markerer stadier hvor forskjellene statistisk sett var signifikante. For å teste denne hypotesen brukte vi mRNA sekvenseringdata fra fôringsforsøket i CODE (van der Meeren m.fl. i dette bladet). Hos torskelarvene kunne vi identifisere mer enn 120 gener som er involvert i å opprettholde redoxbalansen, og vi sammenlignet uttrykket av disse genene hos larver fôret enten med rotatorier eller copepoder. Vi målte også konsentrasjonene av glutation. Glutation er en redoxbuffer, og forenklet kan man si at forholdet mellom totalt (tGSH) og oksidert (GSSG) glutation bestemmer redox-potensialet og 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 25 Redox FIGUR 2 dermed redoxbalansen i cellen. Vi antok at redoxbalansen i larver fôret med copepoder var optimalt regulert og brukte den som kontroll. Copepoder gir oksidert, rotatorier gir redusert cellemiljø Effekt av byttedyrtype på uttrykk av gener for glutationsyntese og -gjenvinning. Genene gclc, gclm og gss deltar i syntese av glutation mens gsr (glutation reduktase) reduserer oksidert glutation. Larvene er fôret med rotatorier (rød linje) eller copepoder (blå linje). Utviklingen er gitt ved stadier (se Sæle m.fl. annet sted i bladet). Område med skygge representerer den perioden der det var størst forskjell i vekst (van der Meeren m.fl. annet sted i bladet). P-verdien angir overordnet forskjell mellom rotatorie- og copepodefôring, mens stjernene markerer stadier hvor forskjellene statistisk sett var signifikante. Vi fant at larver fôret med copepoder hadde økt nivå av GSSG, og at dette førte til et mer oksidert cellemiljø (Figur 1). Sammenligningen viste at larver fôret med rotatorier hadde et redusert nivå av GSSG og også et mer redusert cellemiljø. Disse forskjellene oppstod i stadiene 2-4, den samme perioden hvor det var stor forskjell i vekst mellom gruppene (van der Meeren m.fl. i dette bladet). Omlag 1/3 av de testede genene (42 av 120) som er involvert i å opprettholde redoxbalansen var ulikt uttrykt hos larvene som fikk de to byttedyrtypene. Blant annet var gener involvert i syntese og gjenvinning av glutation oppregulert i torskelarver fôret med rotatorier (Figur 2). Dette samsvarer med utviklingen i redoxpotensialet og i konsentrasjonen av GSSG i torskelarvene (Figur 1). Faktaboks Redoxbalanse: Forholdet mellom antioksidanter og oksidanter i cellene. Redoxpotensialet er et uttrykk for redoxbalansen. Redoxpotensialet kan måles som forholdet mellom redusert og oksidert glutation Glutation (GSH) er en antioksidant som kroppen produserer for å regulere cellemiljøet via redoxpotensialet. Når GSH virker som antioksidant blir det selv oksidert, slik at to molekyler smelter sammen til ett GSSG. GSSG kan deretter gjenvinnes slik at man får tilbake GSH. Alle celler har et enzymapparat for syntese av GSH og regulering av konsentrasjonene av GSH og GSSG. Forholdet mellom dem brukes til å regulere redokspotensialet og er derfor viktig for cellemiljøet. Som regel utgjør konsentrasjonen GSSG ca 1% av GSH konsentrasjonen. GSH GSH 2H· GSSG Redoxpotensialet styrer stoffskiftet Redoxpotensialet er en viktig faktor for miljøet i cellen og bestemmer hvilke stoffskifteveier som skal være aktive. oksidert redusert 26 Redokspotensial målt ved GSH/GSSG Dominerende celleaktivitet >-150 mV Nekrose – uspesifikk celledød -160 mV Apoptose – styrt celledød -200 mV Celledifferensiering – stamceller blir til differensierte celler (for eksempel muskel, lever fettvev) -260 mV Aktiv celledeling og vekst 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 2H· Redox FIGUR 3 Ernæring spiller rolle for redoxbalansen Effekt av byttedyrtype på uttrykk av gener som regulerer redoxbalansen i torskelarver. Ca 120 gener ble identifisert som del av redoxbalansen. A) Andel av disse genene som var ulikt regulert i larver fôret med rotatorier eller copepoder på ulike stadier i utviklingen. B) Andel av de regulerte genene som var opp- eller nedregulert i larver fôret med rotatorier. Størst forskjeller i stadium 2-4 Dersom man ser på andel gener av de 120 som var forskjellig uttrykt i de ulike stadiene, finner man at redox-balansen var ulikt regulert i stadiene 2-4 da larvene vokste forskjellig, mens det var få forskjeller i stadium 1 og 5. På stadium 5 hadde begge larvegruppene blitt tilvendt tørrfôr og vokste likt. Fôring av torskelarver med rotatorier førte i de fleste tilfellene til oppregulering (≈ 75% av de regulerte genene) sammenlignet med torskelarver fôret med copepoder. Også en del gener som regulerer redoxbalansen på et overordnet nivå ved å slå på avlesning av andre redoxgener (blant annet keap 1 og nfe2l2), var oppregulerte i larver fôret med rotatorier. Spyler du? Samlet tyder dataene på at ernæring spiller en viktig rolle i reguleringen av redoxbalansen i torskelarver. Når larver fôres med rotatorier skjer det en oppregulering av mange gener i redoxsystemet, og dette skjer primært i den perioden der vekstforskjellen er størst. Vi vet at forskjellene mellom larvegruppene oppstod på grunn av forskjellig tilgang på ett eller flere næringsstoffer. I dette prosjektet ble rotatoriene dyrket og anriket med de best tilgjengelige metodene, men hadde likevel lavere nivå av en del næringsstoffer, særlig protein og taurin, enn copepodene (Hamre m.fl. i dette bladet). Taurin var 20 ganger lavere i torskelarver fôret med rotatorer enn i larver fôret med copepoder. Vi vet at taurin-mangel blant annet fører til at mitokondriene kollapser og begynner å produsere frie radikaler. En oppregulering av gener involvert i redoxbalansen kan derfor være en mekanisme som har som mål å beskytte torskelarvene mot oksidativt stress på grunn av lavt nivå av taurin i rotatoriedietten. NetCoating beskytter noten mot slitasje og UV-stråler. Groen får heller ikke så godt feste og noten kan dermed rengjøres med lavere vanntrykk. Design: Artgarden Not impregnert med NetCoating er dessuten lett å håndtere. • Vannbasert • Inneholder ikke biocid • Spesialutviklet for deg som spyler nøtene • Forlenger notens liv • Lett å håndtere. - rene nøter Se våre produkter på steen-hansen.no Jakten på de rene nøtene Vi er en internasjonalt ledende aktør innen behandling av oppdrettsnøter. Og vi jobber utrettelig med å utvikle enda bedre produkter, både for deg som spyler og deg som ikke gjør det. Målet er klart: Rene nøter! 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 27 Appetitt Hvordan kan appetitt og fôrinntak stimuleres hos torskelarver? Fisk som vokser raskt har god appetitt med et høyt fôropptak og får dermed rask og effektiv tilførsel av energi og næringsstoffer. Fiskens appetitt er en rask og god indikator på fiskens ve og vel. Høyt fôrinntak er ønskelig allerede fra startfôring, samtidig som lite er kjent om de indre faktorer som påvirker og styrer fiskens appetitt, spesielt på larve- og yngelstadiene. I denne artikkelen gir vi først en kort oversikt av hva vi vet om hvordan appetitt kontrolleres hos voksen fisk, og deretter vil vi diskutere et datasett fra to grupper av torskelarver som hadde svært ulik veksthastighet for å se om vi kan forstå hvilke nøkkelfaktorer som er sentrale for å forklare et økt fôrinntak. Av Ivar Rønnestad, Rolf B. Edvardsen, Augustine Arukwe, TMD Hoang-Le, A. Rita Angotzi, Lars Ebbesson, Kristin Hamre, Ørjan Karlsen, Terje van der Meeren, Ann-Elise O. Jordal Ivar.Ronnestad@bio.uib.no Fiskens appetitt eller matlyst, påvirkes av en rekke miljøfaktorer som temperatur, døgnsyklus, interaksjoner med andre dyr, helsestatus og livsstadium (fisk som gyter spiser vanligvis lite). Appetitten påvirkes også av fiskens energibalanse, næringsstatus og næringsinntak. Appetitten påvirker hvor ofte og hvor mye fisken spiser, og som oppdrettere ønsker man å tilrettelegge fôringsregimet slik at fôrutnyttelsen og veksten blir best mulig. Korttids- og langtidssignaler Appetitt blir kontrollert av egne nervesentre i hjernen og de viktigste sentrene ligger nederst, i et område som heter hypothalamus. Disse sentrene mottar signaler via nervebaner fra andre sentre i hjernen, for eksempel påvirkes appetitten sterkt av stress. Appetittsentrene mottar også en rekke signaler fra andre deler av kroppen. Forenklet skiller vi mellom korttidssignaler som oppstår i forbindelse med et måltid og kommer fra magen, tarmen, bukspyttkjertelen og stoffskiftet. Disse signalene er sterkt knyttet til sult og metthet. Andre, såkalte langtidssignaler, kommer fra lever og fettlagre i kroppen og videreformidler kroppens tilgjengelige energi og næringsreserver. De fleste av disse signalene går til hjernen via nerveimpulser eller hormonlignende substanser. Samlet sett utløser alle disse signalene en varierende grad av sult- eller metthetsfølelse, som igjen gir endringer i motivasjon til å spise, fôringsatferd og økt eller redusert fôrinntak (Faktaboks 1). Appetittsentrene skal derfor i utgangspunktet sikre at dyret får energien og næringsstoffene den trenger. 28 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Faktaboks 1: Hjernen kontrollerer appetitt En analogi for å forstå hvordan appetitten kontrolleres i hjernen er å sammenligne med en person som kjører bil med å holde et visst trykk på gass- og bremsepedal samtidig (uten at denne kjørestilen er særlig lur eller anbefalt). Farten kan økes ved enten å trykke mer på gassen eller å slippe opp på bremsen. I vår analogi tilsvarer dette at appetitten (farten) kan økes av signaler som stimulerer appetitten (mer gass) og/eller ved å hemme de som demper appetitten (slippe opp bremsen; se også faktaboks 2). Vi vet at en bilfører mottar mange signaler som avgjør hvilken fart han/hun velger å holde. Det kan være velmente råd om å senke farten fra passasjerer eller skilt som forteller at farten skal økes eller senkes. Sett utenfra kan vi kun se bilens hastighet, men vi kjenner ikke til samspillet mellom trykket på gass og brems hos sjåføren. Fiskens kontrollsenter for appetitt mottar også en rekke signaler som enten stimulerer eller hemmer matlysten og som kommer fra ulike deler av kroppen og fra høyere hjernesentre. Kontrollsenteret har sitt hovedsete i hypothalamus og består av nettverk av nerver som samlet styrer fôringsmotivasjon, -atferd og -inntak. Appetitthormoner Det er to grupper av hormonlignende signalstoffer som kontrollerer appetitten; oreksigene faktorer som øker matlysten og anoreksigene faktorer som demper denne (Faktaboks 2). Noen av disse signalstoffene er peptidhormoner som dannes og frisettes både i hjernen og i mage-tarmkanalen. Disse peptidhormonene har en dobbelt funksjon ved at de regulerer både fordøyelse og appetitt. De bidrar derfor til å optimalisere fordøyelsesprosessen blant annet ved å regulere frisetting av fordøyelsesenzymer for å sikre maksimal fordøyel- Appetitt Faktaboks 2: Noen (utvalgte) signalstoff som påvirker appetitten hos dyr Ikke alle er like godt beskrevet hos fisk. Effekten hos fiskelarver er lite kjent, men de er gruppert etter antatt rolle for å stimulere eller dempe appetitten- se Faktaboks 1: Stimulerer appetitt: • AgRP. Agouti regulert protein. Produseres i hjernen, stimulerer appetitten • Ghrelin. Produseres bl.a i magen og virker sterkt sultfremmende hos pattedyr. Hos fisk er funksjonen mer usikker • NPY. Neuropeptid Y. Et signalstoff som bl.a produseres i hjernen og som der virker sterkt appetittfremmende. Finnes også mye av i øye der det har andre funksjoner • Orexin. Et signalstoff som stimulerer appetitt, men som også påvirker våkenhet Demper appetitt: • Amylin produseres i bukspyttkjertelen og ser ut til å hemme appetitten • CCK. Cholecystokinin. Produseres i fremre del av tarmen og hjernen. Et nøkkelhormon i kontroll av fordøyelsen, bl.a for frisetting av galle. Gir metthet etter et måltid • CART. Cocain og amfetamin-regulert transcript. Navnet sier mye. Ble opprinnelig vist å bli oppregulert i hjernen hos gnagere i forbindelse med inntak av sentralstimulerende stoffer. Virker sultdempende • POMC. Pro-opiomelanocortin. Et stort protein som produseres i ulike deler av hjernen og som spaltes og gir opphav til flere viktige signalstoffer og er bl.a involvert i både appetitt og stress responser Kan ha begge roller: • MC4R. Melanocortinreseptor. En reseptor som kan binde både signalstoffer som hemmer og som stimulerer appetitten. • PYY. Peptid YY. Produseres bla. i tarm der PPY bidrar til metthet etter et måltid. PYY produsert i hjernen ser derimot ut til å øke matlysten se og absorpsjon av næringsstoffer. I tillegg medvirker de til å regulere inntaket av mat og dermed innholdet som til enhver tid befinner seg i fordøyelseskanalen. Kombinasjoner av stimulerende / hemmende signal Kontrollen av appetitten i hypotalamus er basert på å kombinere alle de innkommende signalene til en motivasjon til å spise eller til å slutte å spise. Dette skjer i et samspill mellom to hovedgrupper av nerver som henholdsvis øker eller hemmer appetitten. NPY og AgRP er to peptidhormoner som frisettes fra nervebaner som bidrar til å øke matlysten. I forsøk på rotter og hos mennesker er det vist at NPY er et av de signalene som stimulerer matlysten mest. Derimot vil signalstoffet CCK som frisettes både i tarm og hjerne, og leptin, som frisettes fra lever og fettvev, stimulere frisettelse av signalstoffene POMC og CART i hjernen. POMC og CART er med på å dempe matlysten. Det er viktig å se signalstoffene i forhold til hverandre siden det er ulike kombinasjoner av stimulerende/ hemmende signal som samlet vil opp-eller nedjustere appetitten (Faktaboks 1). Hjelper kundene til suksess! Europas ledende smittelaboratorium for oppdrettsfisk! RESEARCH FACILITY VESO APOTEK VESO Vikan Fiskehelse • Dokumentasjon av legemidler, helsefôr og avlsarbeid • En nøytral samarbeidspartner • Konkurransedyktige priser www.veso.no • Rask levering av lusemidler, legemidler og vaksiner til fisk • Bred fagkompetanse innen fiskehelse • Konkurransedyktige priser Veso Apotek tlf: 22 96 11 00 / Veso Vikan tlf: 74 21 77 70 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 29 Appetitt Kan vi finne gode biomarkører som viser at fisken har god appetitt og spiser godt? Økte nivå av appetittstimulerende signalstoff Forsøksmaterialet i CODE-prosjektet gav oss en god mulighet til å beskrive hvordan signalstoffene som påvirker appetitten er regulert i fiskelarver med ulike veksthastigheter. Vi studerte torskelarver som enten var matet med naturlig dyreplankton (hovedsakelig copepoder), eller anrikede rotatorier og senere anrikede Artemia. Torskelarvene i de to fôringsgruppene hadde nesten lik vekst frem til 22 dager etter klekking, da copepodegruppen raskt økte veksthastigheten, sammenlignet med rotatorie/ Artemia-gruppen (4,5% vs. 2,4% pr. dag; Se artikkel av van der Meeren m. fl. i dette nr). Vi undersøkte genutrykket av disse signalstoffene ved hjelp av RNAsekvenser, (transkriptomanalyser; Se artikkel av Rønnestad m. fl. i dette nr). Vi undersøkte to utviklingsstadier av larver (Stadium 2 og 3) som var innsamlet i perioden der vekstforskjellene mellom gruppene var størst. En sentral del av nervenettverket som kontrollerer appetitten i hjernen består av nerveceller som har en MC4R-reseptor på celleoverflaten. Denne reseptoren kan binde til seg to ulike signalstoffer som gir motsatt effekt: AgRP (appetittstimulerende) og alfaMSH (appetittreduserende, fra POMC genet). Vi fant imidlertid kun små forskjeller i uttrykket av disse genene mellom raskt- og sent-voksende torskelarver. NPY genet var oppregulert i rasktvoksende larver i stadium 3. Ghrelin, som er et signalmolekyl som bl.a. produseres i mage og som vi kjenner fra menneske som ”sulthormon” (og som gjør oss gradvis mer sultne før et måltid), var likt uttrykt i raskt- og sent voksende larver. Imidlertid fant vi at Orexin som også er et kjent appetittstimulerende signalstoff i hjernen var oppregulert i rasktvoksende larver i begge stadier. Dette tyder på at noe av torskelarvenes økte appetitt kan tilskrives økte nivåer av enkelte appetittstimulerende signalstoff, Faktaboks 3: Nervenettverkene som kontrollerer appetitten endres ettersom torskelarvene blir eldre Bildene viser tverrsnitt i hjerneregionen som er farget for å vise hvor signalstoffene blir produsert. A: Ved startfôring (stadium 0) blir Orexin, et appetittstimulerende hormon, produsert kun i et lite område nederst i hjernen – hypothalamus (Hyp). Orexin kan sees som et rødbrunt område. B: Ettersom torskelarvene vokser (stadium 2) er det fremdeles kun dette området som produserer Orexin. Dette kan tyde på at larvens nervesenter som stimulerer appetitten ligger i dette området. C: NPY som også er et appetittstimulerende signalstoff blir produsert i flere områder i hjernen ved startfôring (stadium 0). Figuren viser uttrykket i et område av hjernen kalt ventral telencefalon. D: NPY utrykkes i flere andre områder i hjernen ettersom larven blir eldre (stadium 6). Dette støtter andre data som indikerer at også flere andre områder i hjernen vil delta i kontroll av appetitt ettersom torsken vokser. 30 1- 2015 - BIOLOGI - CODE og at kontrollen kan endres ettersom larven vokser (Faktaboks 3). For signalstoffer vi antar virker appetittdempende var det rekke gener som var konsekvent nedregulert i de rasktvoksende torskelarvene. Dette gjaldt bl.a CART og Amylin. Våre funn tyder derfor på at noe av den økte matlysten hos torskelarvene som spiste copepoder og vokste raskere kan forklares av redusert nivå av appetitthemmende signalstoffer- dvs torskelarvene slipper opp på bremsen! (Faktaboks 1) Oppsummering Oppsummert har vi identifisert flere signalstoffer som påvirker appetitten og som kjennetegner rasktvoksende torskelarver. Disse ser i hovedsak ut til å være knyttet til mekanismer som hemmer signaler som demper appetitten. Flere av disse er gode kandidater til biomarkører som kan brukes til å vise at fisken har god appetitt og vokser godt. ForfatterStillinge-postAdresse Anders Mangor-Jensen Seniorforsker AMJ@imr.no Havforskningsinstituttet, Austevoll hav bruksstasjon, 5392 Storebø Ann-Elise O. Jordal Senioringeniør ann-elise.jordal@bio.uib.no Universitetet i Bergen, Institutt for Biologi, Pb 7803, 5020 Bergen Augustine Arukwe Professor augustine.arukwe@ntnu.no Department of Biology, Norwegian University of Science & Technology , Trondheim Bjørn-Steinar Sæther Seniorforsker bjorn-steinar.saether@nofima.no Nofima, Muninbakken 9-13, 9291 Tromsø Grete Bæverfjord Seniorforsker Grete.baverfjord@nofima.no Nofima, Sjølseng, 6600 Sunndalsøra Hanne Johnsen Forsker Hanne.johnsen@nofima.no Nofima, Muninbakken 9-13, 9291 Tromsø Helge Tveiten Seniorforsker Helge.tveiten@nofima.no Nofima, Muninbakken 9-13, 9291 Tromsø Hilde Toften Forskningssjef Hilde.toften@nofima.no Nofima, Muninbakken 9-13, 9291 Tromsø Ingrid Lein Seniorforsker Ingrid.lein@nofima.no Nofima, Sjølseng, 6600 Sunndalsøra Ivar Rønnestad Professor Ivar.Ronnestad@bio.uib.no Universitetet i Bergen, Institutt for Biologi, Pb 7803, 5020 Bergen Jon Vidar Helvik Professor Vidar.Helvik@bio.uib.no Universitetet i Bergen, Institutt for Biologi, Pb 7803, 5020 Bergen Juliane LukasStudentjulilukas@aol.deFreie Universität Berlin, Tyskland Kai K. Lie Forsker kli@nifes.no NIFES, PB 2029 Nordnes, 5817 Bergen Kaja Skjærven Forsker ksk@nifes.no NIFES, PB 2029 Nordnes, 5817 Bergen Kristin Hamre Professor kha@nifes.no NIFES, PB 2029 Nordnes, 5817 Bergen Lars O Ebbesson Forskningsleder Smoltbrain@me.com Uni Research, Thormøhlensgate 49B. 5006 Bergen Mari MorenForskningssjefmari.moren@nofima.no Matilde S. Chauton Forsker matilde.skogen.chauton@sintef.no SINTEF Sealab, Brattørkaia 17C, 7010 Trondheim Ragnhild Valen Stipendiat Ragnhild.Valen@bio.uib.no Universitetet i Bergen, Institutt for Biologi, Pb 7803, 5020 Bergen Rita Angotzi Forsker Rita.Angotzi@bio.uib.no Universitetet i Bergen, Institutt for Biologi, Pb 7803, 5020 Bergen Rolf B. Edvardsen Seniorforsker rolfbe@imr.no Havforskningsinstituttet, PB 1870 Nordnes, 5817 Bergen Samuel J Penglase Forsker spe@nifes.no NIFES, PB 2029 Nordnes, 5817 Bergen Sigurd O Handeland Seniorforsker Sigurd.Handeland@uni.no Uni Research, Uni Environment, Thormøhlensgate 49B. 5006 Bergen Sigurd O Stefansson Professor Sigurd.Stefanssson@bio.uib.no Universitetet i Bergen, Institutt for Biologi, Pb 7803, 5020 Bergen Synnøve Helland Forsker Synnove.Helland@nofima.no Nofima, Sjølseng, 6600 Sunndalsøra, Norway Terje van der Meeren Seniorforsker terjem@imr.no Havforskningsinstituttet og Hjortsenteret, Austevoll Forskningsstasjon, 5392 Storebø TMD Hoang Le Lecturer lehtmd@ntu.edu.vn Institute of Aquaculture, Nha Trang University, Vietnam Tom Ole Nilsen Forsker Tom.Nilsen@uni.no Uni Research, Uni Environment, Thormøhlensgate 49B. 5006 Bergen Tomasz Furmanek Senioringeniør Tomasz.furmanek@imr.no Havforskningsinstituttet, PB 1870 Nordnes, 5817 Bergen Trine HaugenForskerTrine.Haugen@imr.noHavforskningsinstituttet, Austevoll Forskningsstasjon, 5392 Storebø Velmurugu Puvanendran Seniorforsker Velmurugu.Puvanendran@nofima.no Nofima, Muninbakken 9-13, 9291 Tromsø Ørjan KarlsenSeniorforskerOrjanK@imr.noHavforskningsinstituttet og Hjortsenteret, Austevoll Forskningsstasjon, 5392 Storebø Øystein Sæle Forsker oyse@nifes.no NIFES, PB 2029 Nordnes, 5817 Bergen 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 31 Fettfordøyelse Fettfordøyelse i torskelarver Det er ikke ett fett hvilken type fett en torskelarve skal ha for å vokse godt og bli en sunn torsk. Ikke bare skal sammensetningen av fettsyrer være riktig, men også type fett (klasse) er veldig viktig. Med fettyper menes her fosfolipider og olje. Fosfolipider er den typen fett som bygger cellemembraner, mens olje er formen organismer bruker til å lagre fett. Som fiskelarver flest må torsken ha mest mulig av fettet i form av fosfolipider (PL) og ikke olje (TAG). Av Øystein Sæle oyse@nifes.no Fett fordøyes i hulrommet i tarmen ved at fordøyelsesenzymer spalter av fettsyrene. Det spaltede fettet tas opp i tarmcellene og settes sammen igjen før det transporteres videre ut i kroppen (Faktaboks). Å studere fordøyelsen i fiskelarver byr på store utfordringer fordi de er så små. Torskelarven er ikke lengre enn ~ 4,5 mm når den begynner å spise og disseksjon av organer som tarm og lever er mildt sagt en utfordring. Som en konsekvens måles fordøyelse, for eksempel aktivitet og mRNA uttrykk av fordøyelsesenzymer, i homogenat av hele larver. Disse metodene kan ha store begrensninger hvis målet er å belyse larvenes evne til å fordøye et næringsstoff. Enzymaktivitet i et helt dyr er vanskelig å tolke, da det ofte er flere enzymer i flere vev som hydrolyserer (bryter ned) det samme næringsstoffet. Vi har derfor utviklet en ny metode for å måle mengden fett som blir fordøyd, absorbert i tarmcellene og lagret for transport til kroppen. Mesteparten av fettet som brukes i fiskefôr er olje (triacylglyceroler, heretter kalt TAG) og fosfolipider (PL). Det er velkjent at fiskelarver har behov for et høyt nivå av PL i foret. Årsaken har vært omdiskutert, men de to mest sannsynlige forklaringene er: i) larver fordøyer PL bedre enn TAG. ii) fiskelarver har en sterkt redusert evne til å produsere PL av fordøyd TAG, altså en nysyntese av PL, og PL er nødvendig for å transportere TAG og andre fettyper fra tarmcellene og rundt i kroppen (se faktaboks), samt å bygge cellemembraner. Ulike nivåer av TAG og PL Vi har sett nærmere på hva som skjer med TAG og PL nivåene i 5 dager gamle torskelarver, når disse får emulsjonsdietter (fôr bestående av ørsmå fettdråper) sammensatt av forskjellige nivåer av TAG og PL. Vi har også målt genuttrykket av en rekke 32 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Fordøyelse og absorbasjon av fett Olje (TAG) og fosfolipider (PL) brytes ned av lipaser i tarmen (1). TAG til tre fettsyrer og ett glycerolmolekyl, mens PL bare får en fettsyre ”klippet” av, som resulterer i en fettsyre og ett lysoPL. Lange umettede fettsyrer og lysoPL tas opp i tarmcellen ved aktiv transport (2), mens kortere fettsyrer kan absorberes passivt gjennom cellemenbranen. Inne i cellen blir fettsyrene satt sammen til TAG (3) og PL (7) igjen i endoplasmatisk reticulum (E.R.). TAG kan enten settes inn i en fettdråpe (5) for lagring, eller en transportpartikkel (VLDL) (4) for distribusjon til kroppen. PL settes sammen (7) eller lages på ny (6) og er en viktig byggestein i overflaten til lipiddråper (5) og VLDL (4). Fettfordøyelse FIGUR 1 Økt fettfordøyelse gir økt effektivitet Vi viste også at når fordøyelse av TAG blokkeres, hindrer dette av fordøyelse av PL. For at fett kan fordøyes må det brytes opp i små fettdråper (emulgeres). Larvene ble riktignok fôret med fettdråper, men disse er fortsatt ikke små nok til at fordøyelsesenzymene (lipasene) kan komme til. De frie fettsyrene fra TAG-fordøyelsen hjelper gallesaltene å lage mindre fettdråper som er nødvendig for at enzymene som fordøyer PL skal kunne virke. Vi kan dermed si at etter hvert som fordøyelsen av fett øker vil dette øke effektiviteten til fettfordøyelsen. Artemia og copepoder gir ulike genuttrykk Etter at fettet er fordøyd transporteres det inn i tarmcellene og derfra til kroppen. Ett annet organ som er veldig viktig for fettmetabolismen er leveren. Som nevnt innledningsvis, er det ofte de samme proteinene som transporterer og omformer fett i tarm og lever. Tarm og lever i torskelarver fra og med stadium 4 i ernæringsforsøket i CODE (van der Meeren m.fl. annet sted i bladet), kunne dissekeres ut for å se på genuttrykk i disse organene separat. Gener som er assosiert med transport av fettsyrer inn i cellene, pakking og transport av fett ut til kroppen, gjenoppbygging av PL og nysyntese av PL var motsatt regulert i tarm og lever. Larvene som hadde spist copepoder hadde høyere uttrykk av disse genene i tarmen enn larvene fôret Artemia, mens det motsatte var tilfellet i leveren (Figur 1). Disse forskjellene fortsatte i noen grad etter at gruppene var overført til samme tørrfôr fra stadium 4. Forskjeller varte til senere stadier Genuttrykk i tarm og lever hos larver ved stadium 4 og 5 samt i juvenil fisk fôret rotatorier og Artemia i blått og naturlig zooplankton fôret i rødt. Fettsyretransport genet er LPCAT4, transport til kroppen: ApoB og MTTP, gjenoppbygging av PL: LPCAT4 og nysyntese av PL: AGPAT6. Stjerne viser signifikante forskjeller. enzymer og transportører som er viktig for fettmetabolismen i torskelarver. Når larvene ble fôret emulsjoner med 70 % TAG eller mer, akkumulerte larvene TAG i fettdråper i tarmcellene. Når mer av fettet var i form av PL ble fettet transportert ut av tarmcellene. Dette viste to ting: i) fiskelarver har ikke problemer med å fordøye fett i form av TAG og ta dette opp i tarmcellene. ii) problemet er at de ikke kan transportere fettet videre ut i kroppen uten PL i maten. Mot slutten av forsøket var larvene fôret rotatorer og Artemia fetere enn larvene som fikk naturlig zooplankton. Våre resultater viser at rotatoriefisken, som akkumulerte fett i kroppen på stadium 5, hadde høyere fettmetabolisme i leveren, og lavere fettmetabolisme i tarmen, enn copepodefisken, selv etter at larvene ble satt over på samme fôr. Nysyntese av PL i leveren var forskjellig også på juvenilstadiet. En del forskjeller i metabolisme, inkludert fettmetabolismen, ser ut til å ha holdt seg frem til førstegangs gyting (se Karlsen m.fl. annet sted i bladet). Dette viser at oppdrettsbetingelser i tidlige livsstadier kan påvirke fisken senere i livsløpet også når det gjelder omsetning og lagring av fett. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 33 Beinutvikling Skjelettutvikling og beinmetabolisme i tidlige livsstadier hos torsk Juvenil torsk som hadde spist naturlig zooplankton når de var larver hadde lavere forekomst av ryggvirvelfeil sammenlignet med fisk fôret anrikede rotatorier og Artemia. Fravær av virvelfeil i yngre fisk indikerer at deformitetene oppsto etter at ryggsøylen ble mineralisert. FIGUR 1 Sammenvoksing av ryggvirvler (pil) Kai Kristoffer Lie, Grete Bæverfjord, Mari Moren, Synnøve Helland og Øystein Sæle kli@nifes.no Beindeformiteter har lenge vært et problem i oppdrett av fisk, også i oppdrett av torsk. Selv om årsakene til deformiteter kan være flere og sammensatte, så er en del av problemene direkte knyttet til ernæring og fôrsammensetning. I oppdrettssammenheng er det tidligere observert at torsk som fikk naturlig zooplankton både vokste bedre og hadde mindre deformiteter sammenlignet med torsk som fikk rotatorier og Artemia. Videre ga fôring av torskelarver med dyrkede Acartia tonsa (copepode art) lavere forekomst av fisk med feil i rygg34 1- 2015 - BIOLOGI - CODE virvlene sammenlignet med larver fôret med rotatorier. Mekanismene som fører til deformiteter i oppdrettsfisk er ikke kjent, men det er kjent at næringssammensetningen i fôret kan påvirke mineraliseringen og dermed styrken til fiskeskjelettet. En sammenheng mellom grad av mineralisering, styrke på bein og deformiteter er blant annet vist hos laks. En tidligere undersøkelse viste at torskelarver av samme størrelse, fra en lokalitet hvor man fôret med zooplankton, hadde et mye mer mineralisert skjelett enn torskelarver fra an annen lokalitet der man brukte rotatorier. Siden larvene var fra ulike lokaliteter kan man ikke konkludere sikkert at det var fôret, og ikke andre oppdrettsbetingelser, som ga utslag på mineraliseringen. I ernæringsforsøket i CODE (van der Meeren m.fl. annet sted i bladet) hadde vi imidlertid sjansen til å gjøre denne sammenligningen på et riktig grunnlag. Skjelettutvikling i fisk fra stadium 4, 5 og 6 (juvenil fisk; for stadier se Sæle m.fl. annet sted i bladet) ble undersøkt ved hjelp av alizarin farging. Eldre fisk (70-120 mm) ble undersøkt ved hjelp av røntgenanalyser. Videre ble regulering av sentrale gener som er involvert i beinutvikling analysert for å se om fôret hadde noe betydning for beinmetabolismen. Beinutvikling Ingen forskjeller i skjelettmineralisering Totalt 468 fisk ble undersøkt, men de klassiske kjevedeformitetene som er blitt registrert i tidligere forsøk og hos fisk fra kommersielle anlegg fant vi ikke i dette forsøket. Årsaken kan være at rotatoriene brukt i CODE hadde en forbedret anrikning, bl. a. med mer mineraler, enn det som har vært tilfellet tidligere. Beinfargingsanalysene viste også at det ikke var noen forskjeller i mineralisering mellom larver som hadde fått rotatorier og copepoder. Det var heller ingen forskjeller i utrykket av gener som koder for beinmatriksproteiner (osteocalcin 1, osteocalcin 2 og matrix gla protein). Direkte sammenheng mellom osteocalcin og mineralisering har blitt vist i tidligere forsøk. Våre resultater viser derfor at det ikke var åpenbare forskjeller i mineralisering av bein mellom gruppene, men siden analysene ble gjort på hele larver, kan man ikke utelukke at det var forskjeller i genuttrykk knyttet til enkeltorganer. Fôring med rotatorier i larvefasen ga økt forekomst av virvelfeil først hos juvenil torsk Til tross for at det ikke var noen målbare forskjeller i mineralisering, viste røntgenanalysene av fisk på 5 g at 32% av fisken som hadde fått rotatorier og Artemia hadde feil i ryggvirvlene mot kun 4% av fisken fôret med copepoder (Figur 1). Feilene var dominert av sammenvoksing av ryggvirvler, hovedsakelig i fremre del av ryggsøylen. Lignende sammenvoksinger er tidligere blitt framprovosert hos laks av for lave fosfornivåer i fôret og høye temperaturer i deler av produksjonsperioden. Virvelfeilene vi observerte i den eldre fisken, ble ikke observert i samme grad i den yngre fisken (stadium 4, 5 og 6), der kun to individer fra gruppen som hadde fått rotatorier viste tegn til sammenvoksinger av ryggvirvler. I disse individene var 3. og 4. ryggvirvel enten sammenvokst eller gapet mellom dem var borte (tidlig tegn på sammenvoksing). Dette tyder på at feilene i virvlene først kom til uttrykk etter stadium 6, det vil si etter at fisken ble satt på samme fôr, noe som skjedde på stadium 4. Mekanismene som fører til disse sammenvoksingene er noe uklare, men tidligere arbeid har vist at noen typer forandringer kan forklares med omdannelse av «normalt» ryggsøylevev til brusk. TLF. 47661653 / 46979790 www.okmarine.no / post@okmarine.no RENSEFISKEN – en viktig medarbeider som trenger gode arbeidsforhold LEPPEFISKSKJUL / ROGNKJEKSSKJUL med flytekrage Ernæringsstatus i de tidlige livsstadiene påvirker beinhelsen senere i utviklingen hos juvenil torsk Selv om vi ikke så noen forskjeller i mineraliseringsgrad eller i uttrykket av gener som er med å danne beinmatriks i larver fra stadium 2 og 3, viste reguleringen av de sentrale genene som styrer aktiviteten til osteoblaster (celler som bygger bein) og osteoclaster (celler som bryter ned bein) en mulig ubalanse mellom disse prosessene. Dette kan tyde på at små forandringer tidlig i utviklingen kan resultere i makroskopiske og lett synlige abnormaliteter senere. Resultatene fra dette prosjektet viser at ernæringsstatus i de tidlige livsstadiene påvirker beinhelsen senere i utviklingen, men at de subtile virvelfeilene ikke kan forklares ut ifra mineraliseringsgrad. Til tross for at det ble oppdaget relativt få alvorlige skjelettfeil hos den juvenile fisken, viser forsøket at det er fremdeles mye å hente for å redusere innslag av deformiteter ved å videreutvikle og optimalisere larvefôr til oppdrettstorsk. Vi skreddersyr løsninger etter ønske. Vi har alt utstyr til fangst av leppefisk og bruk av rensefisk. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 35 Osmoregulering Utvikling av osmoreguleringssystemet hos torskelarver startfôret på rotatorier eller naturlig zooplankton Lik andre beinfisk som lever i havet er torsken omgitt av et miljø som har et langt høyere saltinnhold enn fiskens vevsvæsker. Dette medfører at fisken mister vann gjennom osmose til sjøvannet. Fisken erstatter dette vanntapet gjennom å drikke sjøvann og samtidig aktivt skille ut overskudd av salter. Osmoregulering er særlig utfordrende for små fiskeegg og larver pga den lille størrelsen og at ikke alle organsystemer som er involvert i salt- og vannbalansen er ferdig utviklet. I dette studiet har vi kartlagt endringer i genuttrykk og fordeling av saltregulerende celler gjennom tidlige utviklingsstadier hos torsk startfôret på to ulike dietter, hjuldyr (rotatorier) eller naturlig zooplankton (hovedsakelig copepoder). Vi har spesielt undersøkt hud og gjelleanlegg, i tillegg til tarm og ekskresjonssystemet. Tom O. Nilsen, Juliane Lukas, Ragnhild Valen, Jon V. Helvik, Lars O.E. Ebbesson, Ivar Rønnestad, Kristin Hamre, Sigurd O. Handeland, Sigurd O. Stefansson Tom.Nilsen@uni.no Voksen fisk opprettholder kroppens vannog saltbalanse ved hjelp av velutviklede osmoregulatoriske organ som gjelle, nyre og tarm. Osmotisk tap av vann kompenseres ved å drikke sjøvann med påfølgende opptak over tarmen. Dette medfører overskudd av salter (Na+, Cl-) i vevsvæskene som hovedsakelig skilles ut via spesialiserte celler i gjellene, såkalte kloridceller (Figur 1). Selv om fiskelarver tidlig utvikler embryonale kloridceller, og opprettholder vann- og salt balansen under embryonal- utviklingen så er ikke osmoregulatoriske organ alltid ferdig utviklet og funksjonelle ved klekking. I tillegg vil et ugunstig overflate/volum forhold stille larven ovenfor særlige utfordringer både før, under og etter klekking. Dette løser larven gjennom spesialiserte kloridceller spredt omkring på plommesekken og huden. for påvisning av transport av Na+, K+ og Cl(NKA genet), og brukte denne til å studere forekomst og fordeling av kloridceller på forskjellige utviklingsstadier hos torsk. Utviklingsstadiene er beskrevet av Sæle m.fl. annet sted i bladet. Genmarkør for påvisning av kloridceller Når en celle produserer genet vi har markør mot vil dette gi en sterk fiolett farge i det histologiske preparatet. Ved stadium 0, som tilsvarer 4 dager etter klekking, ser vi karakteristiske fiolette fargepunkt som representere kloridceller i hud og gjeller (Figur 2A). Spesielt rundt de tidlige Ved å studere endringer i uttrykket til nøkkelgener som bare fins i celler som er spesialiserte for osmoregulering, kan en kartlegge endringer i funksjonen til organer som gjeller, nyre, tarm og hud under larvens utvikling. Vi utviklet en markør Kloridceller finnes i både gjeller og hud hos torskelarver FIGUR 1 Skisse som viser oppbygging av gjeller og kloridceller. Enzymet Na+/K+-ATPase (NKA) er det sentrale transportproteinet i kloridceller. Dette enzymet setter opp en elektrokjemisk gradient som brukes av Na+/K+/2 Cl- - co-transporter (NKCC) for å transportere Na+, K+ og Cl- inn i cellen, hvorpå Cl- skilles ut gjennom en kloridkanal (CFTR). Na+ skilles ut i rommet mellom kloridceller og støtteceller. 36 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Osmoregulering FIGUR 2 Uttrykk av NKA genet i torskelarver på ulike utviklingsstadier. Larvene ble startfôret på zooplankton (Zoo) eller rotatorier (Rot) og prøver tatt ved stadie 0, 1, 2 og 3. De fiolette punktene representerer kloridceller i hud og gjeller etter at larvene ble fremkalt med fargesubstrat (NBT/BCIP) i 10-15 minutter. anleggene til gjellespalter kunne vi se svært mange kloridceller (Figur 2A). Dette støtter at gjellene har kapasitet til å skille ut salter tidlig etter klekking. Videre fant vi kloridceller fordelt i epitelet (det ytre hudlaget) som dekker fremre halvdel av kroppen til larven, spesielt rundt indre organer og plommesekken (Figur 2A). En uke seinere (Stadium 1, Figur 2B) økte kloridcellene til maksimal størrelse for deretter å minke i igjen frem til stadium 4. Deretter var kloridceller i huden fraværende. Under utviklingen av gjellene var det en økende tetthet av kloridceller i gjellespal- tene. Fire par gjellebuer ble først observert ved stadium 1 mens gjellefilamenter og lameller ennå ikke var ferdig utviklet. Gjellefilamenter ble først observert hos larver ved stadium 3 og lameller først observert ved stadium 4. Videre fant vi kloridceller på gjellefilamentene ved basis av lamellene, mens ingen kloridceller ble observert på lamellene (Figur 3). Intensiteten til fargingen i hudens kloridceller avtok med økende alder, noe som tyder på lavere aktivitet i kloridcellene. Dette er i overenstemmelse med en gradvis endring fra hud til gjelle som primær organ for utskilling av Na+ og Cl- etter stadium 4. På grunnlag av forskjellene i ernæring og vekst mellom de to larvegruppene kunne man kanskje forvente fysiologiske forskjeller i osmoreguleringssystemet. Tidspunktene for uttak var tilpasset den ulike veksten i de to gruppene; larvene ble innsamlet på samme stadium for å gjøre gruppene sammenlignbare. Det var ingen forskjeller mellom de to larvegruppene, hverken når det gjaldt fordelingen av kloridceller eller for utviklingen av osmoreguleringssystemet. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 37 Osmoregulering FIGUR 3 FIGUR 4 Konklusjon Utviklingen av osmoreguleringssystemet hos torskelarver synes å være likt det som er funnet hos andre marine fiskelarver. Larven klekkes med åpen munn som er forbundet til fordøyelsessystemet og drikkeraten øker betydelig gjennom de første dagene etter klekking. Vann tas opp over tarmen samtidig som overskudd av salt skilles ut ved hjelp av kloridceller i både hud og gjeller. Dette hindrer dehydrering av larven. Etter hvert som torskelarven blir eldre, utvikles gjellenes osmoregulatoriske kapasitet fullt ut og behovet for kloridcellene i huden reduseres. Huden er derfor et viktig osmoregulatorisk organ under larvestadiet, men denne funksjonen forsvinner etter metamorfose. Det var ingen forskjeller i utviklingen av osmoreguleringssystemet mellom torskelarver som spiste rotatorier og copepoder. Uttrykk til NKA i torskelarver ved stadie 1. Sorte piler viser de mørke punktene og representerer kloridceller i gjeller etter fremkalling med fargesubstrat (NBT/BCIP) i 100-110 minutter. Referanser • Hiroi, J., McCormich, S.D., Ohtani-Kaneko, R., Kaneko, T., (2005). Functional classification of mitochondrion-rich cells in euryhaline Mozambique tilapia (Oreochromis mossambicus) embryos, by means of triple immunofluorescence staining for Na+/K+-ATPase, Na+/K+/2Cl– Cotransporter and CFTR anion channel. J. Exp. Biol. Vol. 208: p. 2023-2036. • Mangor-Jensen, A. (1987). Water balance in developing eggs of the cod Gadus morhua L. Fish Physiol. Biochem. Vol. 3: pp 17-24. • Mangor-Jensen, A., Adoff, G.R. (1987)., Drinking activity of the newly hatched Uttrykk til NKA i gjeller hos torskelarver ved stadie 4. Sorte piler indikerer kloridceller i gjeller etter fremkalling med fargesubstrat NBT/BCIP). kloridceller er fordelt utelukkende på filamentene ved basis av lamellene, men ikke på selve sekundær lamellene (rød pil). larvae of cod Gadus morhua L. Fish Physiol. Biochem. Vol. 3: pp 99-103. • Sucre´ E., Charmantier-Daures, M., Grousset, E., Charmantier, G., CucchiMouillot, P., (2010). Embryonic occurrence of ionocytes in the sea bass Dicentrarchus labrax. Cell Tissue Res 339:543–550 • Tytler, P., Bell, M.V., (1989). A study of diffusional permeability of water, sodium and chloride in yolk-sac larvae of cod (Gadus morhua L.). J. Exp. Biol. 147, 125– 132. • Varsamos S, Nebel C, Charmantier G (2005). Ontogeny of osmoregulation in postembryonic fish: a review. Comp Biochem Physiol A 141:401–429 pH-justering? Vi hjelper deg med produkt og tekniske løsninger 48 14 25 57 www.kalk.no 38 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Synsutvikling Fra planktonfangst til fiskepredator; hvordan synet til kysttorsk endres gjennom utvikling Har du noen gang lurt på hvordan torsken oppfatter fargen på sluken du bruker, -eller hvordan den er i stand til å se omgivelsene rundt seg? Er synet likt som hos oss mennesker på land, eller er det tilpasset livet under havoverflaten? Ved å studere synet til torsken kan vi finne svar på nettopp disse spørsmålene, samt finne ut om synet er likt gjennom hele livet, eller om det endres gjennom utvikling fra torskelarve til voksen torsk. Faktaboks 1. Lysforhold i havet og øyets registrering av lys. I motsetning til lyset på land, blir mesteparten av lyset i havet absorbert av selve vannsøylen. Lys med kortere og lengre bølgelengder (UV og rødt) forsvinner først og er kun tilstede nær overflaten, mens lys i det blå og det grønne området dominerer mellom 50-100 m dyp, og dypere finnes det etterhvert kun blått lys før bioluminescens er eneste lyskilde. Dette betyr at evnen til å registrere farge fra UV-rød del av spekter er bare mulig nær overflaten, mens fargesyn i blått og grønt lys er mulig i en større del av vannsøylen. Dypere ned er lyset så svakt at tappene som brukes til fargesyn ikke lenger fungerer, og de sensitive stavene tar over. Det er retina (netthinnen) som er det lysabsorberende organet i øyet hvor lys fokuseres gjennom linsen og vandrer gjennom de ulike nervelagene før det absorberes av fotoreseptorceller. Det er to ulike hovedtyper fotoreseptorer: Tapper for fargesyn og staver for mørkesyn. I fotoreseptorenes ytre segment finnes det et synspigment (reseptorprotein) hvor energien fra lys-fotoner omdannes til elektriske nervesignal som sendes til synssentre i hjernen. Dette synspigmentet kalles opsin, og det finnes fire ulike typer i tapper (UV, SWS2/ blått, RH2/grønt og LWS/rødt) basert på hvilket lys (del av spekteret) de kan registrere, i tillegg til Rodopsin i staver. Som vi vet finnes torskeegg og larver i de øverste nivå av havet hvor et bredspektret lys finnes (UV-rødt), mens den juvenile/ voksne torsken også lever i større dyp, er det likevel tilgjengelige synspigment i øyet som begrenser hvilket lys som kan oppfattes. *Plassering av torskeegg, larver og voksen torsk i vannsøylen er ment for å illustrere hvilket lys de typisk eksponeres for, og ikke absolutt dybde de lever på. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 39 Synsutvikling Ragnhild Valen, Rolf B. Edvardsen og Jon Vidar Helvik Ragnhild.Valen@bio.uib.no I torskens utvikling skjer det en dramatisk overgang fra plommesekklarven til den aktivt jaktende fiskelarven som stiller krav til utvikling av organsystemer samt igangsetting av ulike fysiologiske prosesser før plommesekken tar slutt. Ettersom jakt på byttedyr krever et godt syn, er det essensielt at larven har øyne som er tilpasset det blå-grønne miljøet i «planktonsuppen» den lever. Det at larven gjennomgår en fase med massiv vekst i den første fasen av livet, innebærer at også øyet vokser dramatisk, samtidig som det stilles stadig nye krav til synet etter hvert som leveområder og lysforhold endres (Faktaboks 1). Vi har sett på hvordan disse endringene er reflektert i utvikling av øye til fisken, og i hvilken grad faktorer som livsstrategi, utviklingsstadier samt evolusjon er med på å påvirke det synet torsken har. I oppdrett av marine fiskelarver er dette viktig å ta hensyn til for å optimalisere oppdrettsmiljø. I dag finnes det begrenset med studier på marine fisk som beskriver hvilke lysabsorberende synspigmenter (se Faktaboks1; opsiner) som er tilstede i genmaterialet, og hvordan disse er regulert. I CODE prosjektet har vi benyttet oss av det relativt nylig sekvenserte torskegenomet til analyser av alle synspigmenter, som representerer hele repertoaret tilgjengelig for syn. Dette er den første studien som gir bevis på et genomisk nivå på at fargesyn i en beinfisk drives av kun to familier av opsiner (Valen et al. 2014). Vi har videre benyttet oss av både kvalitative og kvantitative molekylære metoder for å studere hvordan synet endres avhengig av livsstadiet. Torsken har mistet gener for UV- og rødt lys sensitivitet På tross av at det er vanlig for teleoster som lever i miljø med et bredt spekter av tilgjengelig lys å kunne registrere lys med ulik bølgelengde, fant vi til vår overraskelse ut at kysttorsk har mistet genene som registrerer UV- og rødt lys. Ved å søke etter visuelle opsiner i torskegenomet ved hjelp av både genkloning og bioinformatiske søk, fant vi at torsk kun hadde blå (SWS2) og grønne (RH2)-sensitive pigment, i tillegg til rodopsin (RH1) (mørkesyn) (Faktaboks 2, A). Vi fant videre ut at torsk hadde to ulike gener for blå-sensitive pigment og tre gener for grønn-sensitive pigment. Det ser derfor ut til at torsk kun har mulighet til fargesyn i den blå og grønne delen av 40 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Torskelarven er en visuell predator hvor derfor øyet spiller en grunnleggende rolle for overlevelse. Foto: Ragnhild Valen. lysspekteret, og at den har ikke kan se UV og rødt, som utgjør de mest ytterste delene av lysspekteret. Slik tap av hele grupper av visuelle pigment er også tilfelle i evolusjon av fargesyn hos pattedyr, men her ble problemet med tap av pigment løst ved at nye genkopier fikk endrede lysfølsomme egenskaper og dermed erstattet funksjonen til tapte pigment. Våre studier tyder i midlertidig på at dette er usannsynlig i torsk. Hvilke konsekvenser tap av gen for UV og rød-sensitivitet har for evolusjon og torskens økologiske tilpasning vet vi lite om. Torskelarvens syn; kun basert på fargesyn (blått-grønt) Ved å analysere genuttrykket (aktivering/ hemming) til samtlige synspigment oppdaget vi at de første fotoreseptorene var utviklet/funksjonelle allerede et par dager før klekking i spesifikke regioner av øyet. Dette tyder på at embryoet/plommesekklarven ble klargjort til et aktivt visuelt liv utenfor eggeskallet. Ved klekking var samtlige fem visuelle tappe-pigment aktivert (ingen staver tilstede) (stadium 0, CODE larver), og ble tilstede i flere fotoreseptorer ettersom plommesekklarven vokste (Faktaboks 2, B og C). Ved tidspunkt rundt startfôring (oppbrukt plommesekk) dominerte grønn-sensitive pigment. På dette livsstadiet, og i ukene fremover var kun fargesyn mulig, som tyder på at evnen til å registrere ulike deler av lysspekteret er prioritert i et lite øye. Endring av retina i overgang larve-juvenil; introduksjon av en ny visuell egenskap: Mørkesyn I ukene frem mot metamorfosen/overgang til juvenil fisk (stadium 4-5, CODE larver), forsvant de to grønn-sensitive pigment som dominerte i larven (RH2-2 og RH23), mens den grønn-sensitive RH2-1 ble helt dominerende (Faktaboks 2, D). Det interessante her var at denne endringen sammenfalt med første innslag av en ny type fotoreseptorer; staver med det sensitive rodopsin pigmentet. Torskens syn blir nå mer sensitivt og funksjonelt også ved svake lysforhold, -som dypere i havet. Den juvenile torsken har dermed en retina som hovedsakelig består av fotoreseptorer av èn blå type, èn grønn og rodopsin, et mønster som synes å opprettholdes i den voksne torsken. Dette kalles indirekte utvikling av en dupleks retina (først tapper, så staver), og er vist i marine fisk å sammenfalle med endring i morfologi og leveområde, inkludert lysforhold. Denne dynamikken i aktivering/hemming av ulike medlemmer av visuelle pigmentgrupper avhengig av livsstadiet tyder på at det er et larvespesifikt program for syn. Det kan tenkes at utrykk av alle tappe-pigment i torskelarven er en fordel for god fargeoppløselighet i «planktonsuppen» og det blå-grønne miljø, og etter hvert som torskelarven vokser og beveger seg dypere ned i vannsøylen endres sammensetningen og styrke på tilgjengelig lys, og stavene blir etterhvert viktig for å kunne se. Det kan i midlertidig synes som et paradoks at alle tilgjengelige tappe-opsiner er utrykt i et lite larve øye. Hvorfor det er slik, er fortsatt uvisst. Videre lesning • Valen R., Edvardsen R. B., Søviknes A. M., Drivenes Ø. and Helvik J. V. Molecular evidence that only two opsin subfamilies, the blue light- (SWS2) and green light-sensitive (RH2), drive color vision in Atlantic cod (Gadus morhua). PLOS ONE. 2014. • Hall, B.K. and Wake, M.H. 1999. The origin and evolution of larval forms. Academic Press San Diego, USA. • Balon, E.K. 1985. Early life histories of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives. Junk Publishers, Dordrecht, Netherlands. Synsutvikling Faktaboks 2. Torskens genomiske muligheter og bruk av synspigmenter. A) ved å søke etter synspigmenter i torskens genom kan vi få innsikt på hvilke typer opsiner torsk har og hvilke som er tapt, samt hvordan de som finnes er organisert i genomet. Våre studier gir sikre bevis på at torsk kun har blå- og grønnsensitive pigment for fargesyn, og har mistet evnen til å registrere UV og rødt lys, i tillegg til rodopsin for mørkesyn. Torsken har videre to typer blå og tre typer grønne pigment. B), C) og D); For å undersøke bruk (aktivering) av de ulike genene for synspigmentene, analyserte vi ulike livsstadier, inkludert overgangen fra plommesekkstadiet til aktivt jaktende torskelarver (stadiet 0, CODE larver). Overraskende fant vi ut at larven benyttet samtlige pigment for fargesyn (C), mens kun tre ble benyttet i den juvenile torsken (stadiet 4-5, CODE larver) (D). Vi fant også ut at to av de grønne opsinene ble skrudd av samtidig som torskelarven utviklet mørkesyn, og dette sammenfalt igjen med perioden hvor larven ble transformert til en juvenil (metamorfose). Tobias 28 Admiral Solid arbeidsbåt med svært gode sjøegenskaper! Båten har dyp kjøl og liten avdrift, men også mulighet for god fart. Båten kan leveres i mange versjoner, for alle oppgaver. Lengde: 850 cm Bredde: 320 cm Dypg.: 110 cm Diesel: Motor: Fart: 600 l 200-400hk 20-30 knop Tobias Produksjon AS 5943 Austrheim tlf 56169079 fax 56169303 www.tobias.no 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 41 Langtidseffekter Langtidseffekter av ulike startfôr Torsk som ble startfôret enten på naturlig dyreplankton (copepoder) eller med rotatorier etterfulgt av Artemia, ble overført til 3 m kar, begge grupper ble fôret med samme tørrfôr, og fulgt frem til kjønnsmodning ved to års alder. Selv om fisken økte i vekt fra 10 g til 1 kg, kunne vi spore effekten av ulikt fôr i larvestadiene hos den kjønnsmodne fisken to år senere. Ørjan Karlsen, Kaja H. Skjærven, Jorge M.O. FIGUR 1 Fernandes, Terje van der Meeren, Ivar Rønnestad og Kristin Hamre OrjanK@imr.no Som vist tidligere av van der Meeren m.fl. i dette nummeret, var det ulik vekst og utvikling hos torskelarvene fôret enten med copepoder eller rotatorier etterfulgt av Artemia. Begge gruppene ble overført til større kar, tilvendt standard kommersielt tørrfôr, og fulgt frem til kjønnsmodning våren 2014 da de var to år gamle. Størrelsen til de to fiskegruppene var ulik ved utsett, og denne størrelsesforskjellen ble beholdt hele tiden (Figur 1). Dette er også vist i tidligere forsøk, og siden fisken ikke ser ut til å ha en kompensasjonsvekst er ikke dette uventet. Det som derimot var uventet, var at fisken som var startfôret med copepoder hadde en lavere leverindeks (andel lever i prosent av totalvekten) gjennom hele perioden, selv om den ble holdt under like forhold og fikk identisk fôr fra den var tørrfôrtilvent (Figur 2). Fra sommeren 2013 og til rett før gytingen startet i 2014 ble gonadene (rogn og melke) tatt ut, veid og undersøkt for utvikling. Også i gonadestørrelsen fant vi en forskjell. Gonadeindeksen (andel i prosent som melke eller rogn utgjør av totalvekten) var høyere hos fisken startfôret med rotatorier/Artemia (Figur 3). Vekst til torsk fra september 2012 til februar 2014 for fisk startfôret på enten copepoder eller anrikede rotatorier etterfulgt av Artemia. Vertikale linjer indikerer standardavvik. Signifikante forskjeller mellom gruppene ved enkelt-uttak er markert med *. Nøstet toveis ANOVA viste en generell forskjell mellom gruppene (p<0.01). FIGUR 2 Forhold i larvefasen påvirker metabolisme og vekst hos den voksne fisken Vi har med andre ord vist at både vekst, lever- og gonadeindeks var påvirket av hvilket startfôr larvene fikk, og at denne forskjellen var beholdt nesten to år senere, selv om fisken i forsøket hadde vokst fra om lag 10 gram til over kiloet. Det er kjent at sammensetningen av fôret har stor betydning for både vekst, lever og gonadestørrelse, men etter det vi kjenner til er det første gang det er vist at forskjellene grunnet ulikt startfôr påvirker kondisjon og gonadestørrelse når fisken når kjønnsmodning. Årsaken til dette tror vi er at 42 1- 2015 - BIOLOGI - CODE Leverindeks hos torsk fra november 2012 til februar 2014 for fisk startfôret på enten copepoder eller anrikede rotatorier etterfulgt av Artemia. Vertikale linjer indikerer standardavvik. Nøstet toveis ANOVA viste en generell forskjell mellom gruppene (p<0.01). Langtidseffekter FIGUR 3 det ble skapt en forskjell i genuttrykk på larvestadiet som ble beholdt livet ut i første generasjon (F0). Da fisken ble kjønnsmoden tok vi prøver av egg og melke samt at vi undersøkte neste generasjonen (F1) på embryostadiet. Det var ingen forskjeller på embryo vekst eller utviklingsrate mellom gruppene. For å undersøkte om startfôret til F0 generasjonen påvirket potensialet for genuttrykk i F1, sekvenserte vi mRNA i ubefruktede egg og i embryo like før klekking (se forklaring av metode i Rønnestad m.fl., i dette nr.). En type epigenetisk effekt er at gener blir metylert, noe som gir en nedgang i uttrykk av det aktuelle genet. Foreløpige resultater viser forskjeller i uttrykk av syv gener i ubefruktede egg, mens det ikke ble påvist forskjell i genuttrykk hos embryoene. Vi målte også total metylering av DNA i hele genomet og fant ingen forskjeller. Dette vil være forventet når så få gener var ulikt uttrykt, fordi metoden ikke er følsom nok. Hvorvidt forskjellene i genuttrykk kan ha noen betydning for vekst og utvikling i F1 er foreløpig usikkert, men det er spennende at der er målbare forskjeller i ubefruktede egg. Vi vil jobbe videre for å forstå betydningen av disse funnene. Vi vil også kartlegge mekanismene bak de forskjellene som er funnet i F0. Her har vi tatt prøver som skal analyseres for genuttrykk og eventuelle forskjeller i metylering og metabolisme i den voksne fisken som ble fôret med rotatorier/Artemia eller copepoder på larvestadiet. Copepoder inngår i torskelarvenes naturlige diett. Foto: Terje van der Meeren Gonadeindeks til hanntorsk fra november 2012 til februar 2014 for fisk startfôret på enten copepoder eller anrikede rotatorier etterfulgt av Artemia. Vertikale linjer indikerer standardavvik. Nøstet toveis ANOVA viste en generell forskjell mellom gruppene (p<0.01). FIGUR 4 Forskjeller i genuttrykk i ubefruktede egg fra fisk som ble fôret med rotatorier/Artemia eller copepoder på larvestadiet. «Vulkanplottet» viser gener som er oppregulert (positiv fold change på x-aksen) og nedregulert (negativ fold change) i egg fra fisk fôret med rotatorier/Artemia sammenlignet med copepoder. Y- aksen viser signifikansnivå og gener med signifikant ulikt genuttrykk er merket med rødt. 1- 2015 - BIOLOGI - CODE 43 B- blad Postboks 4084 Sandviken, 5835 Bergen, Norway Kaldere sjø kaller på ekstra beskyttelse Målrettet bruk av funksjonelle fôr kan være et viktig bidrag primo – styrking før vinteren • Enrobustfiskmøtervinterensutfordringerbest • primoinneholderkomponentersomstyrkerfiskensgenerelle,indreforsvarog bidrar til helhetlig robusthet • primo har også komponenter som bygger slimlaget tykkere med endret sammensetning,detteerfiskensytreforsvar focus winter – styrking når temperaturene faller • Lavevintertemperaturerbyrpåflereutfordringer,enavdemervintersår • focus winter inneholder komponenter kjent for virkning mot sårdannelse • focus winter har også høye nivåer av vitaminer kjent for effekt på sårheling focus lice – styrking for håndtering • Styrking av slimlaget er spesielt viktig i perioder med behandlingsoperasjoner • Slimlageterogsåfiskensviktigstebarrieremotytreparasitter,somlus • focus lice bygger et tykkere slimlag med endret sammensetning Q Produktene leveres med som gir økt appetitt og økt opptak av aktive virkestoffer Generelt • Velg fôr tilpasset vinterproblemer som erfaringsmessig oppstår • Start fôringen tidlig, i god tid før problemene kommer
© Copyright 2024