1. No category

Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo
TM
HLA Wipe Test BF-40-01
Sidan 1 av 8
Bruksanvisning till Biofortuna SSPGoTM HLA Wipe Test BF-40-01
Revision 3
Juli 2014
C
V
C
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo
TM
HLA Wipe Test BF-40-01
Sidan 2 av 8
1. Användningsområde
Biofortuna SSPGo HLA Wipe Test är avsett att användas för att monitorera laboratorieutrymmen och -utrustning för
kontaminering med PCR-amplikon som kan genereras av Biofortuna SSPGo-produkterna.
2. Introduktion
PCR är en känslig teknik som är mottaglig för kontaminering med DNA-amplikon från en tidigare PCR. Kontaminering
kan leda till falskt positiv amplifiering i efterföljande PCR-reaktioner, vilket kan leda till felaktig genotypning. PCRamplikon kan kontaminera reagens och prover samt även laboratorieutrustning såsom pipetter. Reagens och utrustning ska undersökas regelbundet efter tecken på kontaminering.
3. Beskrivning av analysen
Varje SSPGo HLA Wipe Test består av en strip med åtta PCR-brunnar som innehåller frystorkad PCR-buffert,
polymeras och primrar som är specifika för HLA-DRA-genen och som kommer att generera en amplikon på 187 bp
från humant genomiskt DNA. Eftersom en DRA-amplikon används som intern kontroll i alla Biofortuna-förpackningar
kommer all kontaminering från användning av Biofortuna SSPGo-förpackningar leda till amplifiering av DRA-genen
och detekteras av avtorkningstestets primrar.
Varje strip med åtta brunnar testar förekomst av kontaminering i upp till tre avtorkningsområden. Varje strip
innehåller integrerade positiva och negativa kontrollreaktioner, samt inhibitionskontrollreaktioner för vart och ett av
avtorkningsområdena. Ett område testas för kontaminering genom att man först stryker över området med en provtagningspinne som sedan blötläggs i vatten. Vattnet används som templat i avtorkningstestet och som 50:50blandning med genomiskt DNA som ett PCR-inhibitionstest.
Tester för kontaminering bör utföras regelbundet. Typiska områden som bör testas är DNA-prepareringsområdet,
PCR-uppsättningsområdet och post-amplifieringsområdet. Typiska föremål som bör testas är arbetsbänkar, pipetter,
centrifuger, handtag till kylskåp och frys, dörrhandtag och rackar. Typiska lösningar som bör testas är DNAprepareringsbuffertar och DNA-spädningsvätskor. Reagens som används i flera analyser, såsom PCR-buffertar och
Taq-polymeras, är särskilt känsliga för kontaminering, men dessa påverkar inte Biofortuna-förpackningarna eftersom
Biofortuna-produkterna är kompletta och endast kräver tillsatt DNA.
4. Förpackningens innehåll

12 strips med 8 PCR-brunnar där varje brunn innehåller 10 µL fördispenserade frystorkade primrar,
polymeras, dNTP* och buffert. Varje folieförpackad strip är avsedd att testa tre områden för kontaminering.
Formatet med en strip och åtta reaktioner visas nedan.
Reaktion
1
2
3
4
5
6
7
8





Färgämne Användning
Rött
Positiv kontroll: DNA
Negativ kontroll: vatten som används för att genomfukta
Lila
provtagningspinnen
Blått
Område 1, inhibitionstest: 50 % DNA, 50 % avtorkningsvatten
Lila
Område 1, avtorkningstest
Blått
Område 2, inhibitionstest: 50 % DNA, 50 % avtorkningsvatten
Lila
Område 2, avtorkningstest
Blått
Område 3, inhibitionstest: 50 % DNA, 50 % avtorkningsvatten
Lila
Område 3, avtorkningstest
36 sterila provtagningspinnar
12x8 PCR-lock
1x bruksanvisning
1x analyscertifikat
Säkerhetsdatablad (MSDS) kan laddas ned från Biofortunas webbplats www.biofortuna.com. Kontakta er
lokala distributör om det inte går att ladda ned från webbplatsen.
C
V
C
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo
TM
HLA Wipe Test BF-40-01
Sidan 3 av 8
*CleanAmp™ dNTP är licensierat av Trilink Biotechnologies Inc för användning i Biofortuna SSPGo-produkter.
5. Reagens och utrustning som inte medföljer






Lämpliga kalibrerade pipetter och sterila spetsar, t.ex. P10-pipett med filterspetsar på 10 µL.
DNA-isoleringskit/-utrustning.
UV-spektrofotometer.
Polypropylenrör.
Sterilt vatten för molekylär användning.
En termocykel med följande specifikationer ska användas:
 Termocykel med värmelock för 96 brunnar med en temperatur på 104°C för oljefri drift
 Ramptakt på 1,0oC/s.
 Temperaturområde på 4,0°C till 99,9°C
 Temperaturprecision på ±0,25°C för området 35°C till 99,9°C
 Temperaturkalibrering som kan spåras till en referensstandard
 Programmera termocykeln med hjälp av PCR-cyklingsparameterna i avsnitt 8 nedan.
Anmärkning: För specifik termocykelinformation, se tillverkarens användarmanual. Termocykeln ska kalibreras i
enlighet med reglerna för ackreditering från ASHI (American Society of Histocompatibility and Immunogenetics)
eller EFI (European Federation of Immunogenetics).


Gelelektroforesreagens (agaros, 0,5x TBE, 1 000 bp DNA-molekylviktmarkör, 10 mg/mL etidiumbromid).
Gelelektroforesutrustning (geltankar, strömförsörjning, geldokumentationssystem med UV-transilluminator).
Anmärkning: ändringar i de specificerade tillstånden, som termocykelns ramptakt, kan påverka tolkningen av
testresultatet.
6. Säkerhetsföreskrifter







Analyser får endast utföras av lämpligt utbildad personal.
Alla reagens ska hanteras i enlighet med god laboratoriesed.
Håll områdena för pre- och post-PCR åtskilda. Material som genomgått post-PCR får inte återföras till området
för pre-PCR.
Biologisk risk: Hantera alla blodprodukter som potentiellt smittfarliga.
Biologisk risk: Etidiumbromid är ett potentiellt karcinogent ämne. Vid användning av detta ämne ska alltid
skyddshandskar, laboratorierock och skyddsglasögon användas.
Biologisk risk: Var försiktig vid användning av UV-källor – använd alltid skyddshandskar, laboratorierock och
skyddsglasögon. Titta aldrig direkt på UV-ljuset.
Säkerhetsdatablad (MSDS) finns tillgängliga från www.biofortuna.com.
7. Förvaring och stabilitet
Förpackningarna till Biofortuna SSPGo ska förvaras i 2-28°C. När PCR-brunnarna har tagits fram ur foliepåsarna ska
reagensen rehydreras med DNA inom 3 timmar. Se sista förbrukningsdag på förpackningen. Använd inte
produkterna efter den sista förbrukningsdag som finns tryckt på förpackningen.
Använd inte förpackningarna om foliepåsen har revor eller hål eller om det inte finns någon torkmedelspåse där.
Använd endast förseglingsarken eller locken som medföljer för att se till att PCR-brunnarna förseglas ordentligt efter
att DNA tillsatts, annars kan avdunstning förekomma under PCR-amplifieringen. Var särskilt noga med kanter och
hörn.
Anmärkning (1): Vid behov kan de icke-hydratiserade PCR-plattorna och -stripsen hållas utanför påsen upp till 3
timmar innan man tillsätter DNA vid en temperatur på upp till 21oC och luftfuktighet som inte överstiger 60%.
C
V
C
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo
TM
Sidan 4 av 8
HLA Wipe Test BF-40-01
Anmärkning (2): När de har hydratiserats med DNA kan PCR-strips och -plattor från nyöppnade påsar lagras upp till
24 timmar vid 2 - 8°C innan PCR-steget, förutsatt att brunnarna är väl förseglade för att undvika avdunstning.
8. Anvisningar för användning
Observera:
En vanlig källa till kontaminering är PCR-pipetterna och det är tillrådligt att man torkar av spetsen och om möjligt
inuti cylindern med en provtagningspinne. Dessutom bör alla kontamineringstester utföras med en pipett som har
testats och funnits vara negativ. Om kontaminering detekteras ska laboratoriets riktlinjer för dekontaminering följas
och områdena testas igen.
1. Arbeta i ett DNA-fritt utrymme och märk ett sterilt DNase-fritt polypropylenrör som rymmer 2 mL för vart och ett
av avtorkningsområdena som ska testas. Märk ett extra rör med ”Negativ kontroll”.
2. Använd en pipett som är garanterat fri från kontaminering och tillsätt 500 µL sterilt destillerat vatten för molekylär användning i varje 2 mL-rör.
3. Placera en av de medföljande sterila plastprovtagningspinnarna i varje avtorkningsteströr så att den genomfuktas.
4. Stryk med den genomfuktade pinnen över området som ska testas.
5. Bryt eller klipp av plaststickan på pinnen och placera den i det ursprungliga 2 mL-röret med vatten.
6. Blanda kort med vortexblandare.
7. Avlägsna och kassera provtagningspinnen med hjälp av en steril pincett.
8. Centrifugera i 1 minut vid 10 000 till 13 000 rpm i en mikrocentrifug för att avlägsna partiklar.
9. Öppna foliepåsen med testet. Alla tester ska rehydreras med totalt 10 µL vätska i enlighet med diagram 1.
10.Negativ kontroll: Tillsätt 10 µL sterilt vatten för molekylär användning till den negativa kontrollreaktionen 2 (lila).
11.Tillsätt 5 µL sterilt vatten till reaktionerna 1, 4, 6 och 8.
12.Positiv kontroll: Tillsätt 5 µL humant genomiskt DNA på 10 ng/µL till reaktion 1 (röd reaktion) och reaktionerna 3,
5 och 7 (blå).
13.Reaktioner för avtorkningstestet: Tillsätt 5 µL centrifugerad vätska (avtorkningsvatten) från avtorkningsområde 1
till reaktionerna 3 och 4, från avtorkningsområde 2 till reaktionerna 5 och 6 samt från avtorkningsområde 3 till
reaktionerna 7 och 8.
14.Alla reaktioner har nu en rehydrerad volym på 10 µL, vilket visas i diagram 1. Förslut reaktionerna med de medföljande locken och fortsätt med de vanliga SSPGo PCR-parametrarna som visas nedan.
Diagram 1.
Reaktion 1
RÖD
5 µL sterilt
vatten
5 µL DNA
Reaktion 2
LILA
10 µL sterilt
vatten
Reaktion 3
BLÅ
Område 1
5 µL avtorkningsvatten
5 µL DNA
Reaktion 4
LILA
Område 1
5 µL avtorkningsvatten
5 µL sterilt
vatten
Kontroller
Kontroller
Reaktion 5
BLÅ
Område 2
5 µL avtorkningsvatten
5 µL DNA
Reaktion 6
LILA
Område 2
5 µL avtorkningsvatten
5 µL sterilt
vatten
Reaktion 7
BLÅ
Område 3
5 µL avtorkningsvatten
5 µL DNA
Reaktion 8
LILA
Område 3
5 µL avtorkningsvatten
5 µL sterilt
vatten
Avtorkningstester – 3 områden
ANMÄRKNING OM RESUSPENDERING: Se till att PCR-blandningar resuspenderas med proverna inom 3 timmar efter
att plattan har tagits ut ur foliepåsen.
ANMÄRKNING OM PCR-PLATTANS/-STRIPSENS HÖJD: Plattorna och stripsen bör vara lika höga om de placeras i
samma PCR-maskin. Olika höjd kan orsaka dålig kontakt med PCR-maskinens värmelock. Detta kan leda till dålig eller
utebliven PCR-amplifiering.
C
V
C
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo
TM
HLA Wipe Test BF-40-01
Sidan 5 av 8
PCR-parametrar
Följande PCR-parametrar ska användas. Se till att ramphastigheten är minst 1 °C per sekund och aktivera värmelocket. Läs tillverkarens användarmanual till termocykeln för att få en fullständig handhavandebeskrivning. Termocyklar ska kalibreras i enlighet med reglerna för ackreditering från American Society of Histocompatibility and
Immunogenetic (ASHI) eller European Federation of Immunogenetics (EFI).
Denaturering
94 °C
5 minuter
Denaturering
Bindning
Förlängning
96 °C
66 °C
72 °C
15 sekunder
50 sekunder
30 sekunder
10 cykler
Denaturering
Bindning
Förlängning
96 °C
64 °C
72 °C
15 sekunder
50 sekunder
30 sekunder
20 cykler
HÅLLTEMPERATUR
15 °C
Gelelektrofores
Dessa anvisningar gäller horisontell agarosgelelektrofores: Bered en 2-procentig agarosgel i 0,5x TBE-buffert. När
gelen har svalnat till cirka 60 °C ska etidiumbromid tillsättas så att den slutliga koncentrationen blir 0,5 µg/mL. Härda
gelen och sätt i mikrotiterkammar (t.ex. 12 x 8 brunnar med 9 mm mellanrum). När gelen har stelnat ska kammarna
tas ur och gelen täckas med 0,5x TBE-buffert. Överför minst 5 µL och högst 10 µL från varje reaktion på plattan eller
stripen till motsvarande brunn i gelen och notera varje reaktions position. En stege på 100 bp kan vara till hjälp vid
storleksbestämningen. Kör gelen i 20 minuter vid 10 V/cm.
Se tillverkarens bruksanvisning till elektroforessystemet för särskild information som gäller utrustningen. Gelerna ska
avbildas med ett UV-geldokumentationssystem med UV-transilluminator.
C
V
C
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo
TM
HLA Wipe Test BF-40-01
Sidan 6 av 8
9. Tolkning
Testresultaten för testade områden är endast giltiga om den positiva kontrollen är positiv och den negativa
kontrollen är negativ.
Testerna av avtorkningsområdena är endast giltiga om motsvarande inhibitionskontrolltest är positivt.
En amplikon på 187 bp ska observeras om PCR-kontaminering eller DNA-kontaminering förekommer. Alla fläckar
eller band i andra storlekar kan också indikera PCR-kontaminering, men primerdimer och andra primerförlängningsartefakter på mindre än 100 bp ska ignoreras.
Rx
1
2
3,
5, 7
Färgämne
Användning
Rött
Positiv
kontroll
Lila
Negativ
kontroll
Blått
Inhibitionstest
Resultat
187 bp +ve
Ingen amplifiering
187 bp +ve
Ingen amplifiering
187 bp +ve
Ingen amplifiering
187 bp +ve
4,
6, 8
Lila
Slutsats
Testet giltigt. DNA lämpligt. PCR
effektivt
Testet ogiltigt
Testet ogiltigt. Vattnet och/eller
pipetten är kontaminerade
Testet giltigt. Vattnet är inte
kontaminerat
Avtorkningstestet giltigt. Inga
inhibitorer närvarande
Avtorkningstestet ogiltigt.
Potentiella inhibitorer närvarande
Kontaminering förekommer
Avtorkningstest
Ingen amplifiering
Åtgärd
Upprepa hela analysen med en
annan DNA-kontroll
Testa med annat vatten och en
annan pipett
Rengör området med sterilt
vatten, upprepa
Isolera och rengör den pipett som
användes. Rengör det kontaminerade området med en lösning avsedd att avlägsna DNA. Upprepa
testet.
Avtorkningstestet negativt. Ingen
kontaminering
10. Kvalitetssäkring och kvalitetskontroll
Test av analysen: PCR-amplikon från en Biofortuna-förpackning fick torka på en hård yta. Avtorkningstestet utfördes
på ospädd amplikon och därefter i spädningar från 1x101 till 1x1015. Amplikonen detekterades i spädningar upp till
och inklusive 1x1015.
Genomiskt DNA fick torka på en hård yta. Avtorkningstestet utfördes på gDNA på 100 ng/µL och sedan i spädningar
från 1x101 till 1x1015. DNA detekterades i spädningar på upp till 1x103.
11. Referenser
1) Bunce M et al Tissue Antigens. 1995 Nov;46(5):355-67.
2) Saiki RK et al. Nature. 1986 Nov 13-19;324(6093):163-6.
C
V
C
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo
TM
Sidan 7 av 8
HLA Wipe Test BF-40-01
12. Biofortuna HLA Wipe Test (v2): Provregistreringsblad
Provregistreringsblad Detta provregistreringsblad bör kopieras före användning eftersom förpackningen räcker till
36 områden (3 avtorkningsområden per strip med 8 brunnar, 12 strips per förpackning).
Testdatum:
Testet utfördes av:
Godkändes av:
Övrig information:
Förpackningens lotnummer:
Reaktion
Färgämne
1
Rött
Positiv kontroll: DNA
2
Lila
Negativ kontroll: vatten
3
Blått
Område 1, inhibitionstest
4
Lila
Område 1, avtorkningstest
5
Blått
Område 2, inhibitionstest
6
Lila
Område 2, avtorkningstest
7
Blått
Område 3, inhibitionstest
8
Lila
Område 3, avtorkningstest
C
Användning (se anvisningar)
V
Testresultat
Åtgärd
Provinformation
C
Dot159v1 Instructions for Use for Biofortuna SSPGo
TM
HLA Wipe Test BF-40-01
Sidan 8 av 8
13. Symbolförklaring
X
P
i
M
V
H
28:
4: s
g
Antal tester
EG-represantant
Läs bruksanvisningen
Tillverkningsplats
In vitro-diagnostik
Sista förbrukningsdag
Förvaringstemperatur
Lotnummer
Distribuerad av
Global Trade Item Number
14. Tillverkarens kontaktinformation
Biofortuna Ltd
1 Hawkshead Road
Croft Business Park
Bromborough, CH62 3RJ, UK
Tel: +44 (0) 151 334 0182
E-post: info@biofortuna.com
Webb: www.biofortuna.com
15. Översättningar
Français:
Deutsch:
Español:
Italiano:
České:
Danske:
Έλληνες:
Magyar:
Norsk:
Polska:
Português:
Россию:
Slovenskému:
Türk:
Svenska:
Traductions disponibles
Übersetzungen verfügbar
Traducciones disponibles
Traduzioni disponibili
Překlady k dispozici
Tilgængelige oversættelser
διαθέσιμες μεταφράσεις
Fordítások
Oversettelser tilgjengelig
Dostępne tłumaczenia
Traduções disponíveis
Переводы доступны
Preklady k dispozícii
Çeviriler mevcut
Översättningar tillgängliga
www.biofortuna.com
Revisionshistorik
C
V
C