1. No category

Umeå Universitet
Biomedicinska analytikerprogrammet
Detektion av aktin och cyklin D1
med hjälp av western blot
XXXX XXXXX
YYYY
YYYYY
Årskull: BMA-09
Laborationsrapport i Klinisk laboratoriemetodik 2, termin 4
Laborationsdatum: 2011-03-03
Handledare: XXXXX XXXXXX
Inlämnad: 11/3, 8/5 2011
Godkänd:
Abstrakt
Western blot är en vanlig molekylärbiologisk metod som används inom proteinkemin för att detektera
och identifiera specifika proteiner med hjälp av antikroppar. Först lyseras cellerna, därefter separeras
proteinerna från lipider, cellkärnor och andra cellstrukturer genom centrifugering. Proteinerna som
extraherats i lysatet kan sedan separeras med SDS-PAGE. Nästa steg även kallad blotting, är att
överföra proteiner till ett nitrocellulosa eller polyvinylidenfluoridmembran med hjälp av en elektrisk
spänning. Efter blottingen blockeras membranet för att förhindra ospecifik bindning av antikroppar,
därefter appliceras en primärantikropp och sen sekundärantikropparna, vilket gör att antigenet kan
detekteras genom ett färgomslag från sekundärantikroppen.Syftet med denna laboration var att
detektera aktin och cyklin D1 i två cellinjer och att optimera olika antikroppsspädningar. Infärgning
av totalproteinet visade en jämn applicering av proverna. Aktin detekterades med ett band som var ca
45 kDa, bandet detekterades vid samtliga antikroppskoncentrationer. Cyklin D1 detekterade s vid ca
45 kDa, mot förväntat 36 kD. Detta tyder på att det detekterade proteinet inte är cyklin D1. Ingen
bakgrund detekterades i något av försöken. Slutsatsen av laborationen var att spädningen 1/2000
fungerar för att detektera aktin, men försöket med att detektera cyklin D1 måste optimeras mer.
Nyckelord: Aktin, cyklin D1, western blot, primär antikropp, sekundär antikropp.
Introduktion
Western blot är en vanlig molekylärbiologisk metod som används för att påvisa proteiner, vid t.ex.
diagnostik av cancer samt vid forskning. Proteininnehållet extraheras från de celler eller vävnader som
ska diagnostiseras. För att göra det möjligt att separera cellerna från andra beståndsdelar måste de
behandlas innan analys, homogenisering eller ultrasonikering används för att bryta ned
vävnadsprover. Celler genomgår samma behandling eller så lyseras de med hjälp av en detergent.
Centrifugering används för att rena fram proteinet och avlägsna övriga cellrester.
SDS-PAGE är en metod som separerar proteiner med avseende på storlek samt molekylmassa vilket
mäts i kilo Dalton (kDa). SDS binder till proteinerna och därmed denaturerar dem samt gör dem
negativt laddade. Proteinerna får sedan vandra i ett elektriskt fält genom en polyakrylamidgel, där de
separerars. (1) Nästa steg, blotting, är att överföra proteiner till ett nitrocellulosa eller polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) med hjälp av en elektrisk spänning. När proteinerna har överförts blockas
membranet för att förhindra ospecifik bindning av antikroppar till membranets yta. Vanliga
blocklösningar tillverkas av bovint serumalbumin (BSA) eller fettfri torrmjölk. Efter blockningen
appliceras en specifik primär antikropp på membranet, vilket leder till att det binder till proteinet med
specificitet. Därefter appliceras de sekundära antikropparna som binder till den konstanta delen på de
primära antikropparna. De sekundära antikropparna är länkade till ett enzym vilket gör att deras
katalytiska effekt omvandlar ett substrat till en detekterbar produkt. Produkten kan ses direkt via
färgomslag på membranet med blotta ögat eller indirekt genom att sända ut chemiluminiscent ljus
som kan fångas på ljuskänslig film, ses med CCD kamera eller med någon typ av phosphorimanger
(2,3).
Proteiner som kan detekteras vid diagnostik av humana celler är aktin samt cyklin D1. Aktin är ett
protein som har en viktig roll i vår uppbyggnad av cytoskelettet (4). Det finns i relativt stor mängd i
alla våra celler och har en storlek på 42kDa. För att detektera proteinet används antikroppar och
lämplig antikroppsspädning är ungefär 1/500- 1/5000. Cyklin D1 är ett protein som förekommer i de
flesta tumörer eftersom det är en onkgen vilket reglerar celldelningen av tumörcellerna. Proteinet har
en storlek på 36kDa och har en rekommenderad antikroppsspädning på 1/500 (5).
Syftet med denna laboration var att detektera aktin och cyklin D1 i två olika cellinjer och att optimera
antikroppsspädningar som används i western blot.
Material och metoder
Celler och proteinextraktion
Vid laborationen användes HeLa celler som härstammar från tumör i livmodern som odlades med 89
% DMEM, 10 % FBS och 1 % PEST. Cellerna trypsinerades med trypsin/EDTA lösning (0,4/99,6 %)
och inkuberades i 5 min. Cellsuspensionen centrifugerades i 200 G under fem minuter. Supernatanten avlägsnades och cellerna resuspenderades i odlingsmedium över natten. Vid laborationen
användes även FaDu celler vilka kommer från skivepitelcancer i oropharynx (ATCC). Proteinerna
extraherades med trisbaserad buffert och proteinkoncentrationen analyserades med Coomasie
Brilliant Blue, G-250 (Bio-Rad).
Western Blot
Proteinextrakt från cellerna blandades i rör (25 % protein och 25 % H2O och 50 % 2*LB ME), proverna
vortexades och kördes på värmeblock i 98o C i 2-3 min. På en 12% SDS-PAGE tillsattes 30 µg protein ).
Molekylviktstandard (10 µL 2* LBME och 0,6 µL standard) tillsattes till en brunn. Elektroforesen
kördes på 200 V i 40 min. PVDF-filter blötlades i metanol och därefter i transferbuffert (0,3 % tris, 1,4
% glycine, 20 % methanol, löses i H2O). Gelen överfördes till PVDF-filter genom transfer i 1 h 100 V.
Filtret placerades i Ponceau-red (0,5 % Ponceau-red, 1 % HAc) och avfärgades i Milli-Q vatten.
Immundetektion
Filtret blötlades i metanol och tvättades i Milli Q vatten 2x5 min. Filtren blötlades i mjölkblocklösning
(5% mjölkpulver, 0,2 % Tween, löst i tvättlösning (1X PBS, 0,1 % Tween, löses i H2O )) under 40 min
med skak.
Antikropparna späddes i mjölkblocklösning, 1/500, 1/1000 och 1/2000 och inkuberades med filtren i
40 min i fuktkammare. Filtren tvättades med tvättlösning (1X PBS, 0,1 % Tween, löses i H2O) 2x25
min och inkuberades med färdigspädd sekundär antikropp (invitrogen) i fuktkammare i 30 min.
Tvättning enligt ovan och därefter tvättades filtren 3x2 min i Milli Q vatten.
Filtren inkuberades med NBT/BCIP arbetslösning (Roche) som späddes 1/50 i detektionslösning
(0,1M Tris-HCl, pH 9,5, 0,1M NaCl) tills band framträdde och tvättades i Milli Q vatten i 3x2 min.
Resultat
Infärgning av totalprotein
Proteinextrakt från HeLa och FaDu celler analyserades med western blot. Efter blotten till PVDF-filtret
färgades proteinerna med Ponceau röd (figur 1). Samtliga lanes färgades och inga artefakter syntes,
dock var lane 6 och 8 som innehöll extrakt från HeLa celler svagare än övriga lanes. Molekylviktsstandarden var lätt att utläsa då banden syntes tydligt. Viss intensitetsskillnad på filtret syntes.
Detektion av aktin
Aktin detekterades i totalproteinextrakt från HeLa och FaDu celler, det detekterade proteinet var ca
44-45 kDa vilket stämmer med den förväntade storleken på 42kDa (figur 2). Detektionen skedde med
tre olika spädningar av primärantikroppen, 1/500, 1/1000 samt 1/2000. Tydliga proteinband, utan
bakgrund, sågs vid alla tre antikroppsspädningarna för både HeLa- och FaDucellerna.
Detektion av cyclin D1
Vid försöket att detektera cyklin D1 i HeLa celler påvisades starka proteinband vid de tre
antikroppsspädningarna 1/500, 1/1000 samt 1/2000. Samtliga band var ca 44-45 kDa.
Diskussion
Ponceaufärgningen visade att elektroforesen lyckats och protein kunde detekteras i alla brunnar. Aktin
har en normalt en vikt på 42 kDa, men vid jämförelse med molekylviktstandarden har den en vikt på
ca 44-45 kDa. Att band kan påvisas innebär att antikropparna bundit till aktinet, att proteinet inte
vandrat så långt som det förväntades göra (42 kDa) kan bero på att molekylviktstandarden inte var
riktigt tillförlitlig eller att separationsgelen inte var 12 %.
Tre olika spädningar av primärantikroppen användes och proteinet detekterades med ungefär samma
intensitet i samtliga fall. Ur ekonomiskt perspektiv är det bäst att använda antikroppsspädningen
1/2000 i fortsättningen då inga större färgskillnader kunde påvisas. Metoden kan optimeras ännu mer
för att se hur mycket antikropparna kan spädas utan att banden försvinner.
Vid deteketion av cyklin D1 erhölls ett band med en molekylvikt 44-45 kDa, men den förväntade
storleken var 36 kDa. Att cyklin D1 inte kan detekteras med ett band av rätt storlek kan bero på att
proteinet inte uttrycks i HeLa celler, eller att proteinet ändrats till följd av tumören och de epitoper
antikropparna normalt skulle bundit inte längre finns eller är förändrade så att affiniteten är lägre. De
band som kunde påvisas liknar de band som detekterades för aktin både i färgintensitet och vikt, av
det kan man dra slutsatsen att det är aktin och inte cyklin D1 vi kan se. Att aktinet påvisades kan bero
på att vi använde samma petrisskål för båda antikropparna och antikropparna mot aktin kan ha
överförts med ytspänning till filtret för cyklin D1-detektion. Att proteinet inte kunde detekteras kan
även bero på gammalt eller felaktigt antikroppskit mot cyklin D1.
Slutsatsen var att primärantikroppsspädningen kan optimeras mer för aktin för att göra den mer
ekonomisk. För detektion av cyklin D1 krävs lägre antikroppsspädningar och test av nytt antikroppskit
för att se att om cyklin D1 verkligen uttrycks i cellen.
Referenser
1.
SDS-page. Department of biology, Davidson College, Davidson, NC
www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html 2011-09-01.
2. Western Blot. Department of biology, Davidson College, Davidson, NC.
www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/Westernblot.html 2011-09-01.
3. Western Blot. Molecular station. www.molecularstation.com/protein/western-blot/ 2011-0901.
4. Aktin. Nationalencyklopedin. http://www.ne.se/lang/aktin 2011-09-01.
5. Cyklin. Karolinska institutet.
mesh.kib.ki.se/swemesh/show.swemeshtree.cfm?Mesh_No=D12.776.624.664.700.100 201109-01.
Figur 1: Ponceaufärgning som visar molekylviktstandard och extraherat protein i HeLa- och
FaDuceller.
Figur 2: Detektion av aktin vid olika antikroppspädningar.
Figur 3: Detektion av cyklin D1 vid olika antikroppsspädningar.
Riskbedömning
Temed
Farliga egenskaper: mycket brandfarligt samt frätande och farligt vid förtäring
Vid inandning sköljes näsa, mun och svalg med vatten och personen vila samt inandas frisk luft. Vid
symtom som kvarstår ska läkare uppsökas.
Vid hudkontakt ska förorenade kläder avlägsnas och huden tvättas med tvål och vatten samt om
möjlighet finns ska den även torkas av med polyetynelglykol.
Vid ögonkontakt ska ögonen sköljas med vatten under minst 15 min och ögonen ska hållas vidöppna.
Vid förtäring får kräkning INTE framkallas utan personen skall dricka mycket vatten och läkare skall
kontaktas omedelbart!
Brand: släcks med skum, koldioxid eller vatten.
Skyddsåtgärder: allt arbete utförs i dragskåp, med skyddshandskar, ögonskydd samt tillgång till
ögonspolning. (1)
Akrylamid
Giftig kemikalie som är mycket giftig vid hudkontakt, inandning och förtäring. De symtom som kan
uppkomma vid kontakt är nervskador, yrsel, svettningar, trötthet samt irritation vilka kan uppkomma
som fördröjd giftverkan.
Vid upphettning polymeriseras akrylamid och brandfarliga och giftiga gaser bildas.
Skyddsåtgärd: Använd dragskåp eller väl ventilerade godkända utrymmen.
Hantering: använd ögonskydd och handskar.
Första hjälpen: Frisk luft och värme, skölj näsa, mun och svalg med vatten. Kontakta läkare!
Tag av förorenade kläder och tvätta hud med tvål och vatten.
Vid ögonkontakt ska ögonen sköljas med vatten i 10-15 minuter och om symtom kvarstår ska läkare
kontaktas.
Vid förstäring ska personen genast dricka ett par glas vatten eller mjölk och grädde och uppsöka
läkare.
Hanteras som riskavfall. (2)
Merkaptoetanol
Hälsofarlig, farlig vid hudkontakt, irriterar ögonen och andningsorganen. Skadligt för vattenlevande
organismer.
Förebyggande åtgärder: all hantering skall ske i dragskåp eller andra godkända utrymmen,
skyddsutrustning används i form av skyddshandskar och ögonskydd samt övrig skyddsutrustning vid
behov.
Första hjälpen: frisk luft och värme, skölj näsa, mun och svalg med vatten. Kontakta läkare vid
kvarstående symtom. Konstgjord andning ges vid behov.
Tag av förorenade kläder och tvätta hud med tvål och vatten.
Vid ögonkontakt ska ögonen sköljas med vatten i 10-15 minuter och om symtom kvarstår ska läkare
kontaktas.
Vid förtäring skall större mängder vatten intas och läkare kontaktas om större mängder av kemikalien
förtärts.
Vid brand bildas farliga gaser som är tyngre än luft., använd andningsapparat samt skyddsutrustning.
Brand släcks med skum, koldioxid och pulver.
Hanteras som riskavfall. (3)
Refererenser
1.
Fishersci. Säkerhetsblad TEMED. www.fishersci.se/safenet/pdf/04610061.pdf 2011-09-01.
2. Fishersci. Säkerhetsblad akrylamid. www.fishersci.se/safenet/pdf/04636421.pdf. 2011-09-01.
3. Fishersci. Säkerhetsblad akrylamid. www.fishersci.se/safenet/pdf/04610055.pdf 2011-09-01.