1. No category

Forår 2015
Mikroplastik i biogødning
Mulige korttidseffekter hos E.
hortensis ved eksponering for
mikroplastik alene og i
kombination med fluoranthen
Nanna Høegh Wenzell og
Elisabeth Jensen
Specialerapport (30 ECTS) i
Almen Biologi,
Roskilde Universitet
Vejleder: Annemette Palmqvist, ENSPAC,
Roskilde Universitet
Ekstern vejleder: Erik Ervolder Olesen,
HedeDanmark
Abstract (dansk)
Mikroplastik i havmiljøet er fokus for mange videnskabelige studier, og har i den seneste tid også
været genstand for megen medieopmærksomhed. I skrivende stund findes der meget få studier
om mikroplastik i terrestrisk miljø. I dette studie har vi undersøgt om biogødning, der består af
forarbejdet spildevandsslam, kan være kilde til mikroplastik i det terrestriske miljø, og mulige
konsekvenser heraf. I biogødning fra Holbæk forsyning fandt vi hhv. 5061 og 7674
mikroplastikpartikler pr g tørvægt biogødning i to udtage prøver med en afvigelse på hhv. 7,5 % og
5,0 %. Optællingen blev foretaget manuelt under stereolup ved 4x forstørrelse. Af de fundne
partikler udgjorde primær mikroplastik ca. 12 % og sekundær mikroplastik i form af fibre ca. 88 % .
Partiklerne blev ikke målt, men det skønnes, at deres gennemsnitlige størrelse var ca. 100 µm i
diameter for primærpartikler og ca. 0,25-1 mm i længden for sekundærpartikler i form af fibre. Vi
har ikke undersøgt andre typer sekundær mikroplastik. Vi ønskede herefter at undersøge, hvorvidt
sammensætning og type af mikroplastik og en kombination med fluoranthen havde en akut effekt
på E. hortensis i form af undvigeadfærd, vækst, overlevelse, ROS-dannelse og
fluoranthenakkumulering. Med udgangspunkt i de fundne koncentrationer af mikroplastik i
biogødning eksponerede vi E. hortensis for 13 forskellige behandlinger med kombinationer af
mikroplastik og fluoranthen (sidstnævnte med nominelle koncentrationer på enten 0,38 ng/g el ler
3,83 ng/g) i OECD-jord over en periode på 14 dage. Resultaterne for vækst og overlevelse viste
ingen akut effekt, da der ikke var signifikant forskel mellem de 11 forskellige behandlinger og de 2
kontroller. Fluoranthenkoncentrationen i ormene viste sig at være for lave til at kunne måles med
GC/MS. Det var derfor ikke muligt at drage konklusioner baseret på denne del af undersøgelsen.
TBARS-analysen for ROS-dannelse kunne ikke gennemføres inden for projektets tidsramme på
grund af praktiske udfordringer. I løbet af forsøget udviste ormene tydelige adfærdsændringer,
særligt i løbet af den første uge af forsøget. Det vil være interessant at undersøge dette nærmere
ved fremtidige undersøgelser. Generelt vil det i fremtiden være interessant at foretage flere
undersøgelser af mikroplastik og en kombination med miljøfremmede stoffer, særligt i terrestrisk
miljø. Det vil også være relevant at foretage flere langvarige studier.
1
Abstract (english)
Microplastics in the marine environment are the object of many scientific studies and lately have
also attracted a lot of attention in the media. In the time of writing this report, few studies on
microplastics in the terrestrial environment are available. In this project we have examined
whether biofertilizer, consisting of processed sewage sludge, could be a source of microplastics in
the terrestrial environment and the possible consequences hereof. In biofertilizer obtained from
Holbæk Forsyning we found 5061 and 7674 particles of mikroplastics per g biofertilizer (DW) in
two chosen samples, respectively, with a deviation of 7.5 % and 5%, respectively. The count was
done manually using a stereo magnifyer at 4x magnification. Of the discovered microplastics,
primary microplastics where found to make up about 12 % while approximately 88 % where
secondary microplastics in the form of fibres. The particles were not measured, but it is estimated
that the average size was about 100 µm in diameter for the primary particles and 0.25-1 mm in
length for the fibres. We did not examine other types of secondary microplastics. After this
preceding study we wished to examine whether the combination and type of microplastics and
microplastics in combination with fluoranthene had an acute effect on E. hortensis with regards to
avoidance behavior, growth, survival, ROS-formation and bioaccumulation of fluoranthene. Based
on the concentrations of microplastics found in biofertilizer we exposed E. hortensis to 13
different treatments with combinations of microplastics and fluoranthene (the latter with nominel
concentration of either 0,38 ng/g or 3,83 ng/g) in OECD-soil over a period of 14 days. The results
for growth and survival showed no acute effect, as there was no significant difference between
the eleven different treatments and the two controls. The concentration of fluoranthene in the
worms turned out to be too low for analysis by GC/MS. Hence, it was not possible to draw any
conclusions based on this part of the study. The TBARS analysis for ROS-formation could not be
carried out within the time frame of the project due to practical challenges. During the experiment
the worms showed clear changes in behaviour, especially during the first week of the experiment.
I would be interesting to examine this further in future studies. Generally it will be interesting to
conduct more studies on microplastics and combinatorial effects with xenobiotic substances in the
future, especially in the terrestrial environment. It would also be relevant to further investigate
potential long term effects.
2
Forord
Denne rapport er et 30 ECTS point speciale fra Roskilde Universitet i faget Almen Biologi, som er
udarbejdet af Nanna Høegh Wenzell og Elisabeth Jensen i foråret 2015.
Det har været en fornøjelse at samarbejde med brancheforeningen for genanvendelse af
organiske ressourcer til jordbrugsformål (BGORJ) i forbindelse med dette speciale. Vi vil gerne
rette en tak til Sune Aagot Sckerl for det konstruktive samarbejde og bindeled mellem BGORJ og
Hededanmark. Der skal lyde en særlig tak til Erik Ervolder Olesen fra Hededanmark, Roskilde, for
god og kompetent vejledning. Vi har fået et stort indblik i Hededanmarks arbejde med biogødning
i praksis, som har været lærerigt og relevant for udarbejdelsen af denne rapport. Det var også Erik
Ervolder Olesen, der satte os i forbindelsen med Henrik Thygesen fra Holbæk forsyning. Her skal
også lyde en tak til Henrik Thygesen og Jacob Jensen fra Holbæk Forsyning for indblik i processerne
på rensningsanlægget på parallelvej 57, Holbæk. I den forbindelse sætter vi stor pris på, at vi fik
mulighed for at få en prøve med biogødning, som vi kunne bruge til analyse i dette speciale.
Vi vil gerne takke Torben Brandt Knudsen for relevant og stort arbejde i forbindelse med de
kemiske analyser af vores prøver. Der skal også lyde en tak til Mette Flodgaard og Klara Jensen for
hjælp med laboratoriearbejdet. Til sidst vil vi takke Annemette Palmqvist for god og kompetent
vejledning.
3
Indholdsfortegnelse
Abstract (dansk) ....................................................................................... 1
Abstract (english)...................................................................................... 2
Forord.................................................................................................. 3
1. Indledning........................................................................................... 7
1.1 Læsevejledning ................................................................................. 9
2. Biogødning .........................................................................................10
2.1
Rensningsanlæg .............................................................................10
2.1.1 Holbæk forsyning..........................................................................10
2.2 Biogødningens sammensætning ...............................................................12
2.2.1 Biogødnings skæbne.......................................................................12
3. Mikroplastik ........................................................................................14
3.1 Skæbne.........................................................................................14
3.2 Indtag og mulige effekter af mikroplastik hos forskellige organismer .......................15
3.3 Adsorbering af miljøfremmede stoffer........................................................16
3.3.1 Fluoranthen................................................................................17
4. Eisenia hortensis...................................................................................19
4.1 Biologisk rolle ..................................................................................19
4.2 Fysiologi ........................................................................................19
4.2.1 Reproduktion ..............................................................................20
4.2.2 Fordøjelse .................................................................................20
4.2.3 ROS-dannelse ..............................................................................21
4.3 Regnorme som modelorganisme til økotoksikologiske tests..................................21
5. Metode .............................................................................................23
5.1 Karakterisering og kvantificering af mikroplastik i biogødning ..............................23
5.1.1 Optimering af metode til optælling af MP i biogødning .................................23
5.1.1.1 Ekstrahering af mikroplastik fra biogødning .........................................23
5.1.1.2 Kvantificering af mikroplastik........................................................25
5.2 Toksicitetsbestemmelse .......................................................................27
5.2.1 Indledende bestemmelse af PAH-indhold i biogødning ..................................28
5.2.2 Forsøgsdesign..............................................................................28
5.2.2.1 OECD-jord.............................................................................30
5.2.2.2 pH og vandbindingsevne..............................................................30
4
5.2.2.3 Mikroplastik til vores prøver .........................................................31
5.2.2.3.1 Primær mikroplastik .............................................................31
5.2.2.3.2 Sekundær mikroplastik ..........................................................31
5.2.2.4 Fluoranthen ...........................................................................33
5.2.2.5 Spiking ................................................................................33
5.2.2.5.1 Overførsel af spiket jord til replikater ..........................................35
5.2.2.6 Økotoksikologisk test med E. hortensis..............................................36
5.2.2.6.1 Overlevelse og adfærd...........................................................38
5.2.2.6.2 Vækst.............................................................................38
5.2.2.6.3 ROS-dannelse ....................................................................39
5.2.2.7 Fluoranthenakkumulering ............................................................42
5.2.2.7.1 Metode til kvantificering af optag af fluoranthen med og uden mikroplastik .42
5.2.3 Statistisk analyse ..........................................................................44
5.2.3.1 Standardafvigelse.....................................................................45
5.2.3.2 Envejs-ANOVA.........................................................................45
6. Resultater..........................................................................................46
6.1 Karakterisering og kvantificering af mikroplastik og PAH i biogødning ......................46
6.2 Indledende bestemmelse af PAH-indhold i biogødning .......................................49
6.3 Toksicitetsbestemmelse .......................................................................51
6.3.1 Overlevelse og adfærd ....................................................................51
6.3.2 Vækst ......................................................................................53
6.3.2.1 Relativ ændring i masse..............................................................53
6.3.2.2 Relativ ændring i volumen ...........................................................54
6.3.3 ROS-dannelse ..............................................................................56
6.4 Optag af fluoranthen ..........................................................................56
7. Diskussion ..........................................................................................59
7.1 Ekstrahering og karakterisering af mikroplastik fra biogødning .............................59
7.2 Kvantifikation af mikroplastik i biogødning ...................................................60
7.3 Toksicitetsforsøg ...............................................................................63
7.3.1 Fluoranthen til toksicitetsforsøg..........................................................63
7.3.2 Mikroplastik til toksicitetsforsøg..........................................................64
7.3.3 Modelorganisme til toksicitetsforsøg .....................................................65
7.3.4 Forsøgsdesign..............................................................................66
7.3.5 Adfærdsændringer ........................................................................68
5
7.3.6 E. hortensis vækst under toksicitetsforsøget ............................................69
7.3.7 ROS-dannelse hos E. hortensis............................................................71
7.4 Fluoranthenoptag hos E. hortensis............................................................72
7.5 Biogødning i landbruget .......................................................................73
8. Konklusion .........................................................................................75
9. Perspektivering ....................................................................................80
10. Litteratur .........................................................................................81
6
1. Indledning
Danmark er et landbrugsland. Det opdyrkede areal var 2,66 mio. hektar i 2012, svarende til 62 % af
Danmarks samlede areal (Landbrug & Fødevarer, 2013). I gødningsåret 2012/13 blev der spredt
12.300 tons fosfor ud i form af handelsgødning (NaturErhvervstyrelsen, 2014). Fosfor er et
essentielt næringsstof, men det er også en begrænset ressource, der kun kan udvindes i de næste
50-400 år (Miljøstyrelsen, 2013a). Fosfor findes dog i en række restprodukter, eksempelvis
biogødning, som består af forarbejdet spildevandsslam. Ved at genanvende disse res tprodukter
kan forbruget af NPK-gødning reduceres (NaturErhvervstyrelsen, 2015). Ifølge Miljøstyrelsen
(2013b) skal 80 % af den samlede mængde fosfor fra spildevandsslam genanvendes i 2018. Det
kan opfyldes ved at genanvende spildevandsslam som biogødning til landbrugsjord, og ifølge
BGORJ (2015) bliver der på nuværende tidspunkt genanvendt ca. 77 % i landbruget.
I Danmark er der lovgivning for, hvilke miljøskadelige stoffer, der skal analyseres for i
biogødningen for at sikre, at de overholder gældende grænseværdier. Dette gælder for eksempel
for PAH’er. Overholdes grænseværdierne, vurderes det, at de miljøfremmede stoffer ikke udgør
nogen sundhedsmæssig risiko ved spredning af biogødningen på landbrugsjord (Miljøministeriet,
2006). Der har hidtil ikke været analyseret efter plastik i s pildevandsslam, da der ikke har været
fokus på dette felt i det terrestriske miljø.
Siden 1940’ernes produktion af plastik er efterspørgsel og produktion steget (Cole et al., 2011), og
i år 2013 blev der produceret 299 millioner ton plastik på verdensplan (Plastics Europe, 2015).
Allerede i 1970’erne blev der observeret plastik i havene (Andrady, 2011; Rocha-Santos & Duarte,
2015) og i de senere år er der kommet forøget fokus på forskning i mikroplastiks udbredelse samt
mulige effekter i miljøet og fødekæden (Rocha-Santos & Duarte, 2015; Rillig, 2012). På trods af
den manglende viden om mikroplastik i det terrestriske miljø, er der meget, der tyder på, at det
også findes der og for eksempel bliver spredt med biogødning (Rillig, 2012). Magnusson & Norén
(2014) har undersøgt mikroplastik i størrelsesordnen ≥300 µm i indkommende og renset
spildevand. Konklusionen på studiet var, at mere end 99 % af mikroplastikken blev ophobet i
slammet. I et studie af landbrugsjord gødet med spildevandsslam fandt Zubris & Richa rds (2005)
syntetiske fibre i jorden, 15 år efter spredning af biogødningen. Når mikroplastik udledes i miljøet,
enten det akvatiske eller terrestriske, kan det potentielt optages af en række forskellige
7
organismer (Rillig, 2012; Wood & Zimmer, 2014). Derudover kan mikroplastik også adsorbere
andre miljøfremmede stoffer, fx PAH (Rillig, 2012). Mikroplastik er altså ikke blot et potentielt
problem i sig selv, men det er også muligt, at plastpartiklerne kan fungere som vektorer for optag
af andre miljøfremmede stoffer (Syberg et al., 2015).
Med dette projekt ønsker vi derfor at undersøge følgende:
Har den type og sammensætning af mikroplastik, som potentielt findes i biogødning, en akut effekt
på Eisenia hortensis (tidligere Dendrobaena veneta) i form af undvigeadfærd, vækst, overlevelse,
ROS-dannelse og optag af fluoranthen fra OECD-jord?
Til brug i undersøgelsen har vi modtaget prøver af den biogødning, som produceres på Holbæk
forsyning og anvendes på dansk landbrugsjord i dag. Vores problemformulering forudsætter en
indledende undersøgelse, der har til formål at klarlægge hvorvidt mikroplastik er til stede i
biogødningen. For at svare på problemformuleringen, er det også nødvendigt at karakterisere og
kvantificere mikroplastikken. Da vores undersøgelse af mikroplastik i biogødning er foretaget på
den ene prøve vi har modtaget, er resultaterne altså kun et udtryk for de specifikke forhold i den
prøve, og ikke nødvendigvis et udtryk for det generelle indhold i biogødning. Vores
modelorganisme, tigerorm (Eisenia hortensis), er udvalgt da den, og lignende slægter, udgør en
essentiel økologisk rolle i forbindelse med omsætning af dødt organisk materiale og jordforbedring
af landbrugsjorde. Eventuelle skader på denne organisme kan derfor være yderst problemati sk for
landbruget. Vi har desuden udvalgt en specifik PAH, fluoranthen, som vi anvender som model til at
undersøge mikroplastiks mulige effekt på optag af PAH’er. Udvælgelsen er beskrevet og begrundet
i projektets metodeafsnit. Af hensyn til specialets relativt korte varighed har vi valgt ikke at
undersøge langstidseffekter, eksempelvis i forhold til reproduktion og vækst over længere tid. Vi
undersøger desuden ikke hvorvidt regnormene reelt har optaget mikroplastik ej heller om de har
udskilt dem via afføring, da det er uden for målet med denne rapport.
8
1.1 Læsevejledning
Rapporten er inddelt i ti overordnede afsnit, som hver især indeholder et antal underafsnit.
Afsnittene er nummererede jf. indholdsfortegnelsen. I rapporten har vi af hensyn til læsbarheden
valgt at henvise til de forskellige afsnit med deres respektive numre.
Kilder er angivet i parentes med navn og årstal for udgivelse. I litteraturlisten findes kilden ved at
se under efternavn, og årstallet er angivet efter forfattere i parentes. I de tilfælde, hvor der er
mere end én kilde med samme navn og årstal, skelnes kilderne med et lille bogstav efter årstallet.
Nogle steder i rapporten er en kilde angivet som (navn, PK årstal). I disse tilfælde er PK en
forkortelse af ”personlig korrespondance”, og angiver således, at oplysningerne stammer fra
direkte kommunikation med den angivne kilde. Dette gør sig eksempelvis gældende for
beskrivelsen af Holbæk rensningsanlæg, hvor vi har fået oplysninger om anlægget gennem
mailkorrespondance med anlæggets driftsleder og ved en rundvisning.
Til sidst skal det bemærkes, at der i rapporten henvises til bilag. Alle bilag er, for nemheds skyld,
samlet i én excelfil, således at det også er muligt at se, hvordan beregninger er foretaget, skulle
dette være nødvendigt. De bilagsnumre, der anvendes i teksten, angiver faner i excelfilen. I de
tilfælde, hvor bilagene er spektre eller andre billeder, er de indsat som billeder i excelfilen under
det fanenummer, som der henvises til i teksten.
9
2. Biogødning
I dette afsnit beskrives processerne fra spildevand til biogødning. Der tages udgangspunkt i et
rensningsanlæg i Holbæk. Dernæst følger en beskrivelse af, hvordan biogødning kan genanvendes
som gødning på landbrugsjord. Dette fører til næste afsnit om mikroplastik i biogødning.
2.1 Rensningsanlæg
Rensningsanlæg i Danmark er typisk opbygget sådan, at spildevandet bliver renset mekanisk,
kemisk og biologisk (Naturstyrelsen, 2014; Miljøstyrelsen, 2009). Spildevand defineres som vand
fra husholdninger, virksomheder, øvrige bebyggelser og befæstede arealer (Miljøministeriet,
2006).
2.1.1 Holbæk forsyning
I forbindelse med, at vi hentede en prøve af biogødning til vores analyse (se metodeafsnit) fik vi en
rundvisning på Holbæk forsyning, Parallelvej 47 i Holbæk af Jacob Jensen. Nedenfor følger en
beskrivelse af processerne på anlægget, som fører til den færdige biogødning som opfylder de
lovmæssige krav til jordbrugsanvendelse. Alle informationer er fra personlige korrespondancer (PK)
med Jacob Jensen, teknisk medarbejder, og Henrik Thygesen, der er driftschef på anlægget, med
mindre en anden kilde tydeligt er angivet.
Holbæk forsyning håndterer 7 millioner m3 spildevand fra 20.600 husstande og erhverv i Holbæk
kommune fordelt på 13 rensningsanlæg, hvoraf størstedelen har recipient i Holbæk fjord og
Isefjorden (Holfor, 2014).
Spildevand fra oplandet bliver ledt hen til rensningsanlægget, og der sker en såkaldt mekanisk
rensning, hvor en rist eller en slags kam sørger for en grovsortering. Dermed bliver større
materialer, som toiletpapir, tilbageholdt og senere kørt til forbrændingsanlæg. Afhængig af, hvor
store mellemrum der er i kammen eller risten, kan det ske, at vatpinde og lignende kommer
igennem.
Spildevandet ledes videre til sand- og fedtfanget, hvor sand og grus bundfældes, mens olie og fedt,
der er upolært, ligger som et lag ovenpå vandet. Sand og grus kan skrabes væk fra bunden, og olie
10
og fedt kan pumpes over i en rådnetank. Vandet ledes derefter over i en forklaringstank, hvor det
langsomt omrøres, så uopløste materialer bundfældes og samles i midten af tanken. Dette bioslam
overføres til en rådnetank. Samtidig er der overløb på tanken, så vandet ledes videre til en
luftningstank med bakterier, hvor der foregår biologisk rensning. Herved omdannes ammonium og
nitrat fra spildevandet til nitrogen. Det sker i to trin, hvor vandet først omrøres kraftigt for at sikre
aerobe forhold til nitrifikation. I nitrifikationsprocessen omdannes ammonium til nitrat. I andet
trin stoppes omrøringen, således at bakterierne kan udføre denitrifikation under anaerobe
forhold. Her omdannes nitrat til gasformigt kvælstof. Hvis kulstofindholdet i det indkomne
spildevand ikke er tilstrækkeligt højt til at opretholde bakteriekulturen, så tilsættes der eksternt
kulstof, som på Holbæk forsyning er ethanol.
Spildevandet og bakterierne ledes dernæst videre til en efterbehandlingstank, hvor der foretages
en kemisk rensning. Ved kemisk rensning på Holbæk rensningsanlæg benyttes jernsulfat for at
fælde fosfor fra spildevandet, idet man ikke er interesseret i at udlede det til fjorden af
miljømæssige hensyn. Bakterierne og andet materiale bundfældes som bioslam. Det kan enten
ledes tilbage til luftningstanken, hvor bakterierne kan genanvendes, eller overføres til
rådnetanken sammen med det fældede fosfor. Det rensede vand fortsætter ud i recipienten, som i
dette tilfælde er Holbæk fjord.
Slam fra de nævnte procestanke bliver ført gennem endnu et filter på vej til rådnetanken, som kan
opfange større partikler - fx vatpinde - der er sluppet igennem den mekaniske rensning. Her
tilsættes en flydende polymer, som fungerer som flokkuleringsmiddel, der gør det muligt at samle
slampartiklerne, så vandet kan slynges tilbage til procestankene ved forafvanding i en tromlesi.
Vandindholdet ønskes reduceret inden rådnetanken, da det blot fylder op og optager varme, uden
at danne methan. På vej til rådnetanken presses slammet gennem en varmeveksler, hvor det
opvarmes til 70 °C i 10 minutter. Det kaldes hygiejnisering, og udføres for at undgå uønsket
bakterievækst i slammet. I denne del af processen er tørstofindholdet steget fra 1 % til ca. 5-6 %,
men det er nødvendigt at indholdet er relativt flydende, for at komme igennem varmeveksleren.
Når slammet har passeret varmeveksleren passerer det et biogasanlæg på vej til rådnetanken. I
biogasanlægget nedbrydes en del af kulstoffet i slammet til methan. Methangassen udnyttes til el
og varme, og bruges således til at holde en konstant temperatur på ca. 52 °C i rådnetanken. Efter 3
uger overføres det forarbejdede spildevandsslam til en skruepresse, hvor der tilsættes en
11
pulverpolymer. Denne pulverpolymer er også et flokkuleringsmiddel, hvis formål er at opnå en
slutafvanding af produktet. Skruepressen er egentlig en tromlesi, der også har en pressefunktion
til sidst. Dette er sidste trin i processen, og det endelige biogødning ender med et tørstofindhold
på ca. 30 % (Thygesen, PK 2015).
2.2 Biogødningens sammensætning
Biogødning kommer som nævnt fra spildevandet, og indeholder således både organiske og
uorganiske forbindelser. Biogødningssammensætningen er forskelligt fra gang til gang, og
tørstofindholdet kan eksempelvis variere mellem 13 - 35 % (Olesen, PK 2015). Der er dermed en
stor andel af vand i biogødning. Med udgangspunkt i en tørvægt på 30 % på Holbæk Forsyning, er
der således ca. 70 % vand og 10-21 % kulstof (Olesen, 2010). Kulstof er med til at øge jordens evne
til at binde vand og sikre en bedre jordstruktur. Det er også med til at mindske udvaskning af
næringsstoffer og fører til en øget biologisk aktivitet i jorden. Biogødning indeholder
næringsstoffer, som er essentielle for plantevækst, herunder kvælstof og fosfor, hvoraf fosfor er
en begrænset ressource (Olesen, 2010). Indholdet varierer, men der er typisk omkring 1,6 %
kvælstof, 1 % kg fosfor og 0,14 % kg kalium per ton biogødning (BGORJ, 2015). Derudover findes
også andre mikronæringsstoffer i mindre mængder, for eksempel jern, bor, molybdæn, zink og
kobber. De nævnte tungmetaller er ikke toksiske i lave koncentrationer, men derimod nødvendige
næringsstoffer for planter (Olesen, 2010). Biogødning, der udbringes til landbrugsjorde analyseres
efter slambekendtgørelsen (Miljøministeriet, 2006), således at koncentrationerne for tungmetaller
(Cadmium, kviksølv, bly, nikkel, chrom, zink og kobber) og de miljøfremmede stoffer LAS, PAH, NPE
og DEHP holdes under deres respektive grænseværdier ved løbende kontrol.
2.2.1 Biogødnings skæbne
Når biogødningen forlader rensningsanlægget, kan det enten brændes, komposteres, udbringes
direkte til landbrugsjord eller opmagasineres til senere udbringning. I Danmark bliver der årlig t
produceret ca. 750.000 ton biogødning på kommunale rensningsanlæg. I følge BGORJ (2015) bliver
omkring 77 % af alt biogødning udbragt på landbrugsjorde som gødning til planter. Det er ikke
muligt at anvende biogødning til jordbrugsformål, hvis det overskrider grænseværdierne for
12
tungmetaller. Hvis et parti biogødning derimod overskrider de fastsatte grænseværdier indenfor
en eller flere af de nævnte miljøfremmede organiske stoffer der analyseres for, kan det
videreforarbejdes i et komposteringsanlæg under kontrollerede forhold, hvor temperaturen
holdes over 55 °C i 2 uger. Derefter skal denne biokompost igen analyseres for at sikre at de givne
miljøfremmede stoffer er blevet nedbrudt, således at koncentrationerne overholder
grænseværdierne. Den færdigbehandlede biokompost kan efterfølgende anvendes på
landbrugsjorde (Miljøministeriet, 2006).
Der er en række bekendtgørelser og love der skal opfyldes i forbindelse med håndtering af
biogødning:
·
Slambekendtgørelsen (Bek. nr. 1650 af 13/12-2006)
·
Godkendelsesbekendtgørelsen (Bek. nr. 1454 af 20/12-2012)
·
Miljøbeskyttelsesloven (Bek. nr. 879 af 26/6-2010)
·
Planloven (Bek. nr. 937 af 24/09-2009)
·
Tilsynsbekendtgørelsen (Bek. nr. 56 af 24/1-2000)
·
Gødningsbekendtgørelsen (Bek. nr. 624 af 15/7-1997) (Olesen PK 2015).
Producenten indrapporterer indholdsdeklaration til NaturErhvervsstyrelsen. Al udspredning af
biogødning bliver dokumenteret og indrapporteret til kommunerne, som sikrer, at alle regler er
opfyldt (Olesen, PK 2015). Typisk udbringes der ca. 12 ton biogødning pr. hektar jord, men de
eksakte mængder bliver nøje beregnet fra gang til gang ud fra næringsindholdet. Biogødning kan
udbringes til landbrugsjorde i foråret før såning af vårafgrøder, eller lige efter høst, inden der
bliver sået vinterafgrøder. Biogødning må ikke udbringes på jorde til direkte fortærbare afgrøder,
som for eksempel gulerødder og kartofler. Efter udbringning til landbrugsjorden skal biogødningen
indarbejdes i jorden (Olesen, PK 2015). Nedpløjningen skal senest være sket indenfor 6 timer efter
spredning af hensyn til naboer, da afgasning fra biogødning kan medføre lugtgener
(Miljøministeriet, 2006).
13
3. Mikroplastik
I dette afsnit beskrives mikroplastik både med hensyn til karakteristik og egenskaber. Herunder
mikroplastisk evne til at binde miljøfremmede stoffer, og der følger derefter en beskrivelse af
PAH’en fluoranthen. Denne viden benyttes til identifikation af mikroplastik i biøgødning, som
beskrives under metodeafsnittet, og til en senere diskussion af effekten af mikroplastik og en
kombination af mikroplastik og fluoranthen på regnormene E. hortensis.
Plastik bruges i stort omfang. I 2013 blev der produceret 299 millioner ton plastik, hvoraf 20 %
fremstilledes i Europa (Plastics Europe, 2015). Plastik er syntetiske produkter, der består af
forskellige organiske polymerer (Cole et al., 2011). Ifølge Plastics Europe (2015) er de mest
anvendte plastiktyper i Europa polypropylen og forskellige typer af polyethylen.
Mikroplastik kan inddeles i primær og sekundær mikroplastik (Wright et al., 2013). Primær
mikroplastik benyttes i kosmetik bl.a. i cremer og tandpasta, og er sfæriske, glatte små partikler på
<5 mm i diameter (Rocha-Santos & Duarte, 2015). Sekundær mikroplastik er
nedbrydningsprodukter fra større plastikstykker, men kan også være fibre fra eksempelvis tøjvask.
Da mikroplastik er et relativt nyt forskningsområde, og definitionen af mikroplastik i forhold til
størrelse varierer på tværs af undersøgelser, er der ikke en entydig definition på
størrelsesordenen. Forskere fokuserer således på forskellige størrelser af mikroplastik, som blandt
andet afhænger af, hvilken metode der anvendes til kvantificering (Rocha-Santos & Duarte, 2015;
Cole et al., 2011). Tidligere studier har vist, at det er sekundær mikroplastik, der dominerer i
miljøet (Leslie et al., 2013). Fordelingen af primær og sekundær mikroplastik kan dog variere
afhængig af hvilket miljø der er tale om (Eriksen et al., 2014).
3.1 Skæbne
Mikroplastik, typisk fibre, der i høj grad består af polyester og akryl, kan udledes fra vaskemaskiner
til spildevand (Sul & Costa, 2014). Mikroplastik kan ende i det terrestriske miljø gennem
forarbejdet spildevandsslam, eller aflejres som luftbårne partikler (Magnusson & Norén, 2014).
Mikroplastiks skæbne i miljøet afhænger blandt andet af, hvilken type plastik og eventuelt tilsatte
14
kemikalier, der er tale om. Derudover har meteorologiske faktorer som vind og temperatur og
geografiske forhold også betydning for transport og akkumulering (Rocha-Santos & Duarte, 2015).
Naturlige nedbrydningsprocesser kan fragmentere plastik i mindre stykker, men der er ikke noget,
der tyder på, at der sker en fuldstændig nedbrydning af plas tik. Det betragtes derfor som
persistent i miljøet i mikroskopiske størrelser (Besseling et al., 2012). Eksempler på forskellige
nedbrydningsprocesser, som plastik kan undergå i naturen, kunne være bionedbrydning,
fotonedbrydning eller thermooxidativ nedbrydning. Ved bionedbrydning fragmenteres større
stykker plastik af forskellige levende nedbrydere, oftest mikroorganismer. Ved fotonedbrydning
skyldes fragmenteringen UV-lys fra solen, og ved thermooxidativ nedbrydning er der tale om en
oxidation af plastikken ved moderate temperaturer (Andrady, 2011).
3.2 Indtag og mulige effekter af mikroplastik hos
forskellige organismer
Mikroplastikpartiklers lille størrelse gør dem lettere tilgængelige end makroplastik, da de let kan
indtages utilsigtet i forbindelse med fødeoptag. Derudover øges risikoen for indtag også ved øget
mængde af mikroplastik i miljøet. Noget plastik er indfarvet, og farve og form kan muligvis ligne
fødeemner for nogle organismer, således at de selektivt indtager mere plastik i forhold til andre
organismer. Dette kan specielt være tilfældet i den pelagiske zone i det akvatiske miljø, da der her
findes mange organismer, der bruger synet i deres jagt på føde og dermed går målrettet efter fx
indfarvede plastikfibre. I den pelagiske zone har densiteten også betydning for indtaget af
mikroplastik, da partikler med lav densitet netop vil findes her (Wright et al., 2013). I den bentiske
zone kan mikroplastik optages af detritivorer.
Det er endnu ikke klarlagt, hvilke konsekvenser indtag af mikroplastik i sig selv kan have på
organismer (Wright et al., 2013). Andrady (2011) påpeger, at der ikke er fundet enzymatiske
pathways, hvorigennem plastik kan nedbrydes i organismer, og at plastik derfor principielt må
antages at være biologisk utilgængeligt. Det er dog muligt, at der kan opstå såkaldte
partikeleffekter ved indtag af mikroplastik (Syberg et al., 2015). Hvorvidt størrelsen af partiklerne
spiller en rolle for de mulige negative effekter er uvist, men ifølge Wright et al. (2013) sandsynligt.
Mikroplastik kan muligvis have en negativ effekt på fødeoptag ved at blokere i fordøjelsessystemet
15
eller ligefrem skære i vævet, hvis der er skarpe elementer. Mikroplastik er desuden mistænkt for
at kunne blokere enzymproduktion, reducere vækst, forårsage kredsløbsforstyrrelser og påvirke
reproduktion (Wright et al., 2013). Plastikken kan også, efter det er indtaget, ende i andre organer
end fordøjelsessystemet og føre til fysiologiske skader, som potentielt kan have sublethale
konsekvenser (Sul & Costa, 2014). Den mekanisme, som ligger til grund for optag af mikroplastik
over tarmepitelet til blodkredsløbet og dermed andre organsystemer er endnu ikke kendt (Wright
et al., 2013). Det er desuden svært at generalisere om effekterne af optag af mikroplastik i sig selv,
da polymertype og –form kan have indvirkning på effekten i organismen (Wright et al., 2013).
Generelt mangler der forskning om mikroplastik i det terrestriske miljø (Sul & Costa, 2014; Rillig,
2012).
3.3 Adsorbering af miljøfremmede stoffer
Plastikpartikler, som polyethylen og polypropylen, kan adsorbere miljøfremmede stoffer som PAH,
PCB og andre POP’er. Organismer, der er i kontakt med plastik, vil altså også blive udsat for de
potentielt skadelige stoffer, der adsorberer til mikroplastik.
Studier tyder på, at mikroplastik har større affinitet overfor upolære, miljøfremmede organiske
forbindelser i forhold til naturligt forekommende sediment (Teuten et al., 2009; Syberg et al.,
2015). Mikroplastik har samtidig et større overfladeareal til volume-ratio end makroplastik og
dermed kan de mikroskopiske partikler binde flere upolære miljøfremmede stoffer, da
mikroplastik også er lavet af upolære polymerer. Således har tilstedeværelsen af mikroplastik
potentiale til at forøge koncentrationen af miljøfremmede stoffer i forhold til andre steder i
miljøet. Mikroplastik kan fungere som vektor for de miljøfremmede stoffer, og altså facilitere
transport både geografisk, for eksempel i havene, men også i forhold til optag i enkeltorganismer
(Sul & Costa, 2014). Optag af plastik og eventuelle adsorberede miljøfremmede stoffer kan ske ved
inhalering eller ved indtagelse, hvoraf det typisk sker ved indtagelse (Teuten et al., 2009; Sul &
Costa, 2014).
Studier har vist, at bentiske sandorme, der er udsat for PAH’er som phenantren og pyren, spiser og
graver mindre, og udviser øget oxidativt stress (Teuten et al., 2007; Brown et al., 2004; Browne et
al., 2013). Desuden er de mindre modstandsdygtige overfor patogener og har højere dødelighed.
16
Browne et al. (2013) har vist, at sandorme kan indtage mikroplastik med adsorberet phenantren,
hvorefter phenantren kan optages gennem tarmen eller direkte i vævet, frem for optages gennem
overfladeepitelceller. Hypotesen er, at de adsorberede miljøfremmede stoffer frigives fra
plastikken i tarmen, og derefter kan trænge over epitellaget og ind i organismen. Dette kan
muligvis være årsagen til øget bioakkumulering af de miljøfremmede stoffer i organismen (Teuten
et al., 2009; Sul & Costa, 2014).
I denne rapport har vi valgt at fokusere på en bestemt PAH som model, og alle forsøg er således
udført med fluoranthen. Udvælgelsen af fluoranthen beskrives nærmere i afsnit 5.2.1. Herunder
følger en kort karakteristik af fluoranthen og dets egenskaber.
3.3.1 Fluoranthen
Fluoranthen er som tidligere skrevet en PAH. Det er et miljøfremmed organisk stof, og har i andre
studier vist sig at have skadelige effekter på regnormen E. fetida (Ma et al., 2012; Nam et al., 2014;
Eom et al., 2007). Grænseværdien for fluoranthen er 3,0 g/g biogødning (tørvægt)
(Miljøministeriet, 2006).
Molekylestrukturen af fluoranthen ses i figur 1.
Figur 1: Strukturen af fluoranthen.
Som det ses på figuren, indeholder fluoranthenmolekylet ingen polære grupper og er derfor en
upolær forbindelse. Fluoranthen har derfor tendens til at bioakkumulere i fedtvæv hos
eksponerede organismer.
17
Et eksempel på konsekvenserne af eksponering for fluoranthen er påvist af Ma et al. (2012). De
undersøgte fluoranthens effekt på det antioxidative system hos Eisenia fetida ved at måle
påvirkning af forskellige antioxidative enzymers aktivitet. Studiet viste, at blandt andet enzymet
catalase blev stimuleret af tilstedeværelsen af fluoranthen. De påviste også i samme studie en
akut øget mængde malondialdehyd (MDA) ved eksponering af E. fetida for fluoranthen. MDA
dannes under tilstedeværelsen af frie reaktive oxygenarter (ROS), og kan altså indikere et øget
oxidativt stress i organismen (se desuden afsnit 4.2.3). Oxidativt stress kan over længere tid
medføre øget risiko for at udvikle cancer. Samtidig er der risiko for lipidperoxidation, når ROS er til
stede. Lipidperoxidation medfører betydelige celle- og følgende vævsskader hos den påvirkede
organisme, og er særligt problematisk, idet det har en selvforstærkende effekt, som kan modvirke
det umiddelbare respons fra organismens antioxidative system (Betteridge, 2000). Fluoranthen er
også mistænkt for at være skadeligt for reproduktionen, men da det ikke er relevant for vores
studie, vil vi ikke komme nærmere ind på det i denne rapport.
Da fluoranthen som beskrevet er problematisk i sig selv, og mikroplastik kan fungere som vektor
for eksempelvis fluoranthen, er det interessant at undersøge de mulige kombinatoriske effekter af
fluoranthen og mikroplastik nærmere. Der er, som tidligere nævnt, fastsat en grænseværdi for
PAH og dermed også for fluoranthen på 3,0 mg/kg biogødning (tørvægt). Det er derfor vigtigt a t
undersøge de mulige kombinatoriske effekter af hensyn til en mulig fremtidig revurderingen af
denne grænseværdi. Det har vi forsøgt at gøre ved hjælp af metoden beskrevet i afsnit 5.
18
4. Eisenia hortensis
I dette afsnit beskrives regnormen E. hortensis, herunder dens økologiske rolle i miljøet, dens
fysiologiske opbygning med særlig vægt på fordøjelsessystemet og dens anvendelse som
modelorganisme.
Regnormen E. hortensis tilhører ledorme (Annelida). Den tilhører familien Lumbricidae og alle de
ca. 20 arter af regnorme, der findes i Danmark, hører til denne familie (Andersen, 1983). Der har
været uenighed om navngivningen af denne regnorm, og således kan navne som Eisenia hortensis,
Eisenia veneta og Dendrobena veneta bruges synonymt (Annemette Palmqvist, PK 2015), og vi har
valgt at anvende navnet E. hortensis af hensyn til sammenligning med andre videnskabelige
studier.
4.1 Biologisk rolle
Regnorme har en essentiel rolle i det terrestriske økosystem. De er nedbrydere, der omsætter
detritus og dermed er medvirkende til at gøre de bundne næringsstoffer tilgængelige for
planterne. Når de graver sig gennem jorden, får de blandet det øverste lag med organisk
materiale, med den mere mineralholdige jord. Deres gamle gangsystemer udnyttes også af
planterødder, da der er sikret aerobe forhold, en høj porøsitet og gangene kan være
næringsholdige. Med regnormenes eksrementer og sammenblanding af jordlagene sikrer de et
højt humusindhold i jorden. Disse egenskaber gør regnorme til en vigtig organisme til at sikre god
jordkvalitet, og derudover er de også fødekilde for en række arter (Andersen, 1983).
4.2 Fysiologi
Regnorme er opbygget af segmenter og deres overhud består af epitelceller, der danner
kutikulasekret, som er en tynd hinde af collagenfibre. Mellem epitelcellerne er transportkanaler,
som er permeable overfor både vand, oxygen, glucose, aminosyrer og lipider. Der er også andre
kirtelceller, der danner slim. Slimen er et værn mod udtørring, da regnormen ikke kan forhindre
transpiration over de permeable transportkanaler under tørre forhold (Andersen, 1983; Edwards
19
& Lofty, 1977). Regnorme er således afhængige af at den jord, de bor i, har et vist vandindhold,
selvom nogle arter kan tåle at reducere deres kropsvægt med op til 63,5 % af i form af væsketab
(Curry, 1994). Dog kan det også være problematisk, hvis jorden bliver for våd, både mht.
respiration og lav pH værdi i jorden. Ifølge Curry (1994) har arter indenfor Eisenia sp. tilpasset sig,
til at leve i jord med højt vandindhold. De fleste regnorme kan tolerere temperaturer mellem 0-30
°C (Curry, 1994).
4.2.1 Reproduktion
Regnorme er tvekønnede og de har dermed både ovarier og testikler. Når de bliver kønsmodne, så
udvikler de en bælteagtig fortykkelse kaldet clitellum ca. 1/4 fra hovedenden. Clitellum består af
kirtler, der afsondrer slim under parring og ved kokondannelse. Det varierer, hvor mange
segmenter clittelum omfatter (Bresciani & Frandsen, 1994; Edwards & Lofty, 1977 ). Da vi ikke har
undersøgt reproduktionseffekter i dette forsøg, vil vi ikke komme nærmere ind på denne del af
ormenes fysiologi.
4.2.2 Fordøjelse
Når regnorme indtager føde føres det først gennem svælget, hvor en række kirtler producerer slim
og eventuelt enzymer. I svælget findes også kalkkirtler, som benyttes til at udskille overskydende
calcium. Calcium er essentielt for regnormen, idet det bruges til at regulere osmotisk tryk og
fysiologisk pH (Andersen, 1983). Efter svælget er spiserøret, som er inddelt i en kro og en krås, der
er en muskelmave. Kroen fungerer som en opbevaringsdepot, og kråsen laver en mekanisk
bearbejdning af føden, som også består af mange jordpartikler. Føden ledes til tarmen, der
strækker sig gennem hele kroppen, som et rør og ender i et gat. Den dorsale tarmvæg foldes, så
der opnås en stor absortptionsoverflade for de nedbrudte elementer- det kaldes thylopsolen, og
her bliver næringsstofferne fordelt til resten af kroppen via kapillærer. Udenpå tarmkanalen findes
specialiserede pigmenterede celler, kaldet chloragogen, som danner et gult væv, der fungerer
ligesom hvirveldyrenes lever. I dette væv foregår glycogensyntese og lipidsyntese og der
opbevares ekskretionsprodukter, herunder også forskellige tungmetaller fra jorden (Andersen,
1983; Bresciani & Frandsen, 1994; Brusca. & Brusca., 2003). Når chloragogencellerne ældes og dør,
20
frigøres de til kropshulen, hvor de nedbrydes af såkaldte “hvide blodlegemer”, der opkoncentrerer
de ophobede affaldsstoffer i brune legemer. De brune legemer transporteres til bagkropsspidsen,
hvor de ophobes. Regnormen kan derefter udskille de brune legemer ved at afsnøre den bagerste
del af bagkropsspidsen, hvor de brune legemer er højest koncentrerede (Andersen, 1983;
Bresciani & Frandsen, 1994; Brusca. & Brusca., 2003).
4.2.3 ROS-dannelse
Regnorme, ligesom andre organismer, kan danne intracellulære frie reaktive oxygenarter (ROS),
hvis de eksempelvis udsættes for stråling eller toksiske stoffer såsom PAH. ROS, ofte i form af
hydrogenperoxid (H2O2), kan have toksiske effekter på DNA i form af øget mutationsrate, eller
medføre andre cellulære skader. De kan dog også have en positiv effekt ved at beskytte mod
pathogener. For at undgå de toksiske effekter dannes antioxidanter. Hvis der er en ubalance i
forholdet mellem oxidanter og antioxidanter kaldes det oxidativt stress, hvilket kan måles ved
hjælp af forskellige biomarkører (Fuller-Espie et al., 2010). Et eksempel på en metode til at måle
tilstedeværelsen af ROS er TBARS-analyse, hvor man lader ROS fra vævet reagere med
thiobarbitursyre og danne et pink kompleks, der kan kvantificeres spektrofotometrisk. Det er den
metode, vi ønsker at anvende i dette forsøg. Metoden beskrives nærmere i afsnit 5.2.2.6.3.
4.3 Regnorme som modelorganisme til økotoksikologiske
tests
Der findes standardiserede økotoksikologiske tests som er udviklet af ”the Organisation for
Economic Cooperation and Development” (OECD), hvor regnorme (Eisenia sp.) blandt andet
benyttes som repræsentative testorganismer til at undersøge kemikalier i terrestrisk miljø (Walker
et al., 2006; Das Gupta et al., 2011; Nyholm et al., 2010). Eisenia sp. er gode testorganismer, da de
er lette at håndtere i kulturer, men resultater fra økotoksikologiske undersøgelser bør tage højde
for, at andre slægter af regnorme kan reagere anderledes på samme behandling. Det skyldes, at
Eisenia sp. foretrækker et varmt miljø, i dybe jordlag eller i kompostbunker og ikke er native arter i
Danmark. Til økotoksikologiske test anvendes en standardiseret jord (OECD), hvor det organiske
indhold er lavt og den anvendte lertype (kaolinler) er dårligere til at ionbytte i forhold til jord fra
21
felten. Dermed bliver miljøfremmede stoffer mere biotilgængelige i OECD jord i forhold til naturlig
jord. Tests foretaget i OECD-jord sikrer altså, at effekter på regnormene ikke påvirkes af
interaktionseffekter med jorden (Walker et al., 2006 ).
22
5. Metode
I dette afsnit beskrives de forskellige delelementer af vores forsøg. Først kommer en gennemgang
af vores karakterisering og kvantificering af mikroplastik i biogødning. Når vi kendte mængden af
mikroplastik i biogødningen, kunne vi bruge den viden til at udforme vores
toksicitetsundersøgelser. Ligeledes blev biogødningen undersøgt, for at bestemme hvilken type
PAH, der skulle indgå i toksicitetsundersøgelserne. Vi har således prioriteret at lave prøver, med
udgangspunkt i biogødningen, for at kunne relatere det til forhold på landbrugsjord. Dernæst
følger en beskrivelse af vores forsøg og efterfølgende metode til at måle vækst, overlevelse og
fluoranthen-optag i regnormene E. hortensis samt de anvendte statistiske metoder.
5.1 Karakterisering og kvantificering af mikroplastik i
biogødning
I denne del af metoden ønskede vi, at undersøge om der var mikroplastik til stede i en prøve af
biogødning fra Holbæk forsyning, og dernæst få kvantificeret og karakteriseret mikropIastikken.
Dette skulle bruges til at undersøge, hvilken effekt den faktiske mængde af mikroplastik i
biogødning kunne have på vores forsøgsorganisme, som kan sammenlignes med arter der findes i
landbrugsjorde.
5.1.1 Optimering af metode til optælling af MP i biogødning
5.1.1.1 Ekstrahering af mikroplastik fra biogødning
Der findes ikke en standard metode til at bestemme mikroplastik i sediment, jord eller biogødning.
Dette besværliggjorde både karakterisering og kvantificering af mikroplastik i biogødningen. Vi
ledte efter små partikler i størrelsesordenen ca. 10-100 µm, og det medførte en høj risiko for
selvkontaminering af prøverne, da de havde samme størrelse som luftbårne partikler, hvilket vi
selv erfarede. Fibre fra vores egen beklædning og fra andre kilder i lokalet kunne derfor let
23
forveksles med dem, vi ledte efter i prøverne. Vi forsøgte derfor selv at udvikle en metode til at
undersøge, om der var mikroplastik i prøverne fra biogødningen.
Vi undersøgte først, om det var muligt at opslemme biogødningen i demineraliseret vand, for
derefter at frasortere de enkelte partikler. Det viste sig, at vandet ikke var i stand til at opløse og
adskille alle klumper fra biogødningen. Ved eftersyn under stereolup ved 4x forstørrelse var det
tydeligt, at de tilbageværende klumper indeholdt betydelige mængder fibre – så mange, at det var
umuligt at vurdere antal og type. Samtidig var det nødvendigt at bruge meget vand for at opnå en
konsistens på opslemningen, som var tynd nok til, at hele væsken ikke bare var sort. Dette ville
gøre optælling og karakterisering af mikroplastik i en given mængde biogødning til en
langsommelig proces. Vi valgte derfor at se på andre alternativer.
Først valgte vi at undersøge, om opløseligheden af biogødning kunne være bedre i ethanol end i
vand, således at det blev nemmere at adskille potentielt mikroplastik fra den øvrige biogødning.
Biogødningen har, som tidligere beskrevet i afsnit 2.2, et højt indhold af vand og næringsstoffer på
ionform, hvilket bør gøre det til en relativt polær masse. Meget af det mikroplastik, der kunne
tænkes at ende i biogødningen, er overordnet set enten upolært eller semipolært, og det var
derfor vores tanke, at et semipolært opløsningsmiddel ville kunne bidrage til at adskille de store
klumper indeholdende plastikfibre, som ikke gik i opløsning med vand. Vi opslemmede derfor 1 g
biogødning i 10 mL ethanol, og whirlmixede det i 3 gange 30 sekunder. Efter denne behandling var
de fleste store klumper opløst, og de resterende forsvandt stort set ved tilsætning af 5 mL ekstra
ethanol og endnu en omrøring på whirlmixeren. Efter blanding kunne de 0,25-1 mm lange fibre
mere tydeligt skelnes fra hinanden, og vi fandt nu også for første gang primær mikroplastik i
prøverne. De fundne primærplastikpartikler havde en diameter på omkring 100 µm. Hverken fibre
eller primærplastik blev målt. Størrelsen blev i stedet vurderet ud fra sammenligning med vores
indkøbte partikler og hjemmelavede fibre. Vi forsøgte at udtage de enkelte partikler i prøven til
nærmere undersøgelse under et lysmikroskop. Det var vanskeligt, da vi var nødt til at fange dem
med enten pipette eller pincet. Det var dog næsten umuligt i prøverne der var opløst i
demineraliseret vand, da overfladespændingen for stor til at det var muligt at fange de enkelte
partikler. Også i den sammenhæng viste ethanol sig altså at være et mere fordelagtigt
opløsningsmiddel, da det har en langt mindre overfladespænding.
24
Vi forsøgte også muligheden for at separere mikroplastikpartiklerne fra biogødning på baggrund af
deres densitet, som Rocha-Santos & Durate (2015) beskriver. Ifølge deres beregninger har sand
sand/sediment en densitet på 2,65 g/cm , hvilket er højere end densiteten af plastik, der typisk er
3
0,8-1,14 g/cm . Vi afprøvede denne metode som et alternativ til ethanolmetoden, og fulgte
3
forskriften fra Leslie et al. (2013). Vi lavede en mættet saltvandsopløsning, som blev hældt på 25 g
biogødning (vådvægt) (det var dog ikke muligt at homogenisere det) og overfladevandet blev
derefter sugefiltreret på en Büchnertragt med et 0,7 µm Whatman glass filter. Metoden skulle i
princippet kunne bruges til ekstrahering af mikroplastik i størrelsesordenen 1-300 µm. Vi håbede
derfor, at vi kunne detektere mikroplastik fra filteret med stereoluppen eller mikroskoppet. Efter
filtrering var det dog tydeligt, at der ikke var blevet opsamlet noget mikroplastik ved denne
metode, på trods af resultaterne fra de tidligere undersøgelser (Leslie et al., 2013; Rocha -Santos &
Duarte 2015). Vi valgte derfor at fortsætte med vores oprindelige metode, med ethanol som
opløsningsmiddel.
5.1.1.2 Kvantificering af mikroplastik
Ekstraheringen foregik med den optimerede ethanol metode. Det foregik ved, at vi afvejede 2
forskellige prøver med biogødning, en på 250,2 mg (vådvægt) og en på 256,2 mg (vådvægt).
Prøverne blev rystet tre gange i 30 sekunder på en whirlmixer i et 50 mL Nunc-rør med 10 mL
ethanol, indtil alle store klumper var opløst. Derefter blev hver prøve af flere omgange hældt over
i en petriskål og derefter undersøgt under stereolup.
Under prøveoptællingerne fandt vi gentagne gange et relativt stort antal blå fibre, som vi regnede
med stammede fra biogødningen. Dette var interessant, idet de var meget nemme at skelne fra
resten af prøven, og fandtes i relativt stort antal – så stort, at det efter vores vurdering var
usandsynligt, at det kunne komme fra spildevandet. For at sikre, at de ikke stammede fra
flokkuleringsmidlerne på rensningsanlægget, hentede vi prøver fra både den faste og den flydende
polymer på Holbæk Rensningsanlæg, og kontrollerede dem for fibre. Da vi undersøgte den
flydende polymer fandt vi i første omgang igen flere blå fibre, men det viste sig dog ved nærmere
undersøgelse, at der var tale om kontaminering fra en ukendt kilde i laboratoriet. Vi besluttede
derfor at indskærpe vores procedure omkring klargøring af prøverne, ved at have låg på petriskåle
25
med prøver, have kontrolpetriskåle stående rundt om stereoluppen og rengøre grundigt rundt om
stereoluppen, så risikoen for kontaminering blev minimeret. Vi valgte nu på baggrund af vores
tidligere undersøgelser at tælle mikroplastik i biogødningsprøverne efter følgende procedure:
Prøven fra Nunc-røret blev i stinkskab hældt lidt af gangen over i en glaspetriskål, som forsynedes
med et låg. Vi brugte glas for at undgå kontaminering og adsorbering. Det var vigtigt at være
omhyggelig for ikke at spilde, når prøven blev hældt op. Til gengæld undgik vi ved hældning
fremfor pipettering, at plastik fra prøven eventuelt satte sig fast på pipetten. Bunden af
petriskålen blev dækket af opløsning, men uden at laget blev så tykt, at fibrene flød rundt. For at
undgå kontaminering af prøven med fibre fra luften, var det vigtigt at petriskålene var helt rene,
og at overførslen foregik under udsugning samt at prøven var dækket med låg frem til tællingen.
Derudover blev der afvasket med ethanol på stereoluppen og rundt om den på bordet. Samtidig
blev der lavet en kontrolprøve med ren ethanol, som gennemgik samme procedure som
gødningsprøverne. Kontrolprøven sikrede, at vi blev i stand til at tage højde for eventuel
kontaminering, der måtte forekomme på trods af alle foranstaltninger.
Prøven blev herefter talt ved hjælp af en stereolup med 4x forstørrelse, og potentielle
mikroplastpartikler blev fotograferet. Det var en visuel vurdering, hvorvidt der var mikroplastik
tilstede, og det var i flere tilfælde vanskeligt at skelne mellem plantefibre og sekundære
mikroplastikfibre. Vi forsøgte på trods af dette at inddele de fundne partikler i følgende kategorier:
Primær mikroplastik, sekundær mikroplastikfibre, farvede sekundære mikroplastikfibre og mulige
sekundære mikroplastikfibre. Den sidste kategori var til tilfælde, hvor en fiber lignede
mikroplastik, men vi alligevel var i tvivl om, hvorvidt det eventuelt kunne være en plantefiber. Vi
prøvede at udtage stikprøver af alle typer partikler til nærmere undersøgelse med mikroskop. I
mikroskopet kunne det afgøres om der var grønkorn tilstede i fibrene, og dermed afgøre om det
var plante- eller plastikfibre.Det var ikke muligt at udtage primær mikroplastik, da det var
nødvendigt at suge dem op med pipette hvorefter de forsvandt af syne.
Vi ønskede at udtage en tilstrækkelig stor mængde fibre af samme oprindelse, til nærmere
undersøgelse med metoden FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy). Dermed kunne vi med
sikkerhed fastslå, at det var plastik vi fandt og hvilken type, der var tale om. Vi forsøgte at udtage
26
de blå fibre, der var lette at kende, men da de viste sig at være kontaminering, droppede vi denne
del. Det var også for vanskelig at udføre inden for specialets tidsramme .
For at kunne sammenligne vores resultater med andre studier, var det nødvendigt at kende
tørvægten af biogødningen. Den blev bestemt ved at udtage en kendt mængde biogødning og
tørre i en tørreovn ved 105 °C i 24 timer. Prøven blev derefter vejet igen, og forholdet mellem
tørvægt og vådvægt blev bestemt til at være 0,3.
Vores metode til kvantificering af mikroplastik har ikke til formål at fastslå, hvor meget
mikroplastik der generelt er i biogødning. Den er derimod en skønsmæssig vurdering af den
potentielle mængde af mikroplastik i en biogødningsprøve. Det ville have taget for lang tid at lave
en grundigere analyse af mikroplastik i biogødning, og det var ikke nødvendigt at kende det
præcise antal af mikroplastikpartikler for at designe vores forsøg. Det er i den sammenhæng værd
at bemærke, at de koncentrationer af mikroplastik, som er anvendt til toksicitetsforsøget
omtrentligt svarer til de koncentrationer som vi fandt i biogødning. Dermed er de anvendte
koncentrationer ikke direkte sammenlignelige med de koncentrationer af mikroplastik, som man
potentielt ville finde på landbrugsjorde, idet biogødningen bliver indarbejdet i landbrugsjord. Vi
har beregnet, at blandingsforholdet mellem biogødning og jord efter nedpløjning i 15-20 cm typisk
ligger mellem 0,375-0,8 g biogødning pr. kg. jord afhængig af jordtype og pløjedybde, hvis det
antages at jord har en gennemsnitlig densitet på ca. 1-1,6 kg pr. dm3. Dette svarer til at
biogødningen fortyndes mellem 125 og 267 gange, når den indarbejdes i jorden. Beregningerne
kan ses i bilag 1.
5.2 Toksicitetsbestemmelse
I vores toksicitetsforsøg ønskede vi at undersøge de akutte effekter af mikroplastik ved at udsætte
E. hortensis for henholdsvis primær og sekundær mikroplastik, de to i kombination, samt
mikroplastik i kombination med en udvalgt PAH, fluoranthen. Dette valgte vi, da det i andre
sammenhænge er vist, at mikroplastik kan fungere som vektor for andre miljøfremmede stoffer,
herunder PAH’er (Browne et al. 2013). Dette er tidligere beskrevet i teoriafsnit 3.3. Det er derfor
interessant at undersøge, hvorvidt mikroplastik kan have den samme effekt i det terrestriske miljø.
27
For at designe vores forsøgsopstilling valgte vi igen at tage udgangspunkt i biogødningen fra
Holbæk Forsyning.
5.2.1 Indledende bestemmelse af PAH-indhold i biogødning
I vores undersøgelse har vi taget udgangspunkt i en enkelt PAH, for at begrænse mængden af
prøver, og den fungerede således som model til at teste hvorvidt mikroplastik kunne fungere som
vektor for miljøfremmede stoffer. Udvælgelsen foregik ved at undersøge indholdet af 16
forskellige standard PAH’er i biogødningen ved hjælp af GC-MS. Ekstraheringen blev udført med
kittet roQ QuEChERS Extraction Kit (EN Method) fra Phenomenex, nr. KSO-8909 efter protokollen
ENSPAC-MK03, som kan ses i sin fulde længde i bilag 2. Vi antog, at PAH kunne ekstraheres fra
biogødning på samme måde som fra sediment.
Den PAH, som havde den højeste koncentration i prøven, var fluoranthen (se afsnit 6.2).
Koncentrationen af fluoranthen i biogødningen var ifølge prøverne ca. 0,3 mg/kg biogødning. Vi
valgte derfor at arbejde videre med fluoranthen i vores forsøgsopstilling. Ved overførsel glemte vi
dog at tage højde for, at der skulle laves tre replikater af hver behandling, og at koncentrationen
skulle være pr g OECD-jord og ikke en absolut mængde. Derfor tilførte vi altså for lidt fluoranthen
til de forskellige jordprøver, der skulle spikes i forhold til den oprindelige hensigt. De faktiske,
nominelle koncentrationer af fluoranthen i de spikede prøver ses i figur 2.
5.2.2 Forsøgsdesign
Toksicitetsbestemmelsen blev gennemført ud fra følgende design (figur 2):
28
Kontrol
Kontrol
Primær
Sekundær
Primær og sekundær
(kun OECD-jord)
(OECD-jord +
mikroplastik
mikroplastik
mikroplastik
acetone)
K
K+
P
S
PS
Primær
Primær mikroplastik
Sekundær
Sekundær
Primær og sekundær
mikroplastik +
+ 3,82 ng
mikroplastik +
0,382 ng
fluoranthen pr g jord
0,382 ng
ng fluoranthen pr g
ng fluoranthen pr g
fluoranthen pr g
fluoranthen pr g
jord
jord
jord
jord
PS0,3
PF0,3
mikroplastik + 3,82 mikroplastik + 0,382
PF3
S0,3
S3
Primær og sekundær
0,382 ng
3,82 ng
mikroplastik + 3,82
fluoranthen pr g
fluoranthen pr g
ng fluoranthen pr g
jord
jord
F0,3
F3
jord
PS3
Figur 2: Oversigt over de 13 forskellige spikede jordprøver i vores forsøg. Alle prøver blev tilført 130 g OECDjord og 90 g demineraliseret vand.
I alt var der 13 forskellige behandlinger i forsøget. Ved behandling med fluoranthen blev der brugt
acetone som opløsningsmiddel. Vi lod det fordampe væk inden det videre forløb, men for at være
sikker på at det ikke havde en effekt, blev der lavet en ekstra kontrol, som også blev behandlet
med acetone der blev bortfordampet. Fluoranthenkoncentrationerne havde vi ønsket skulle være
den samme som grænseværdien for PAH i biogødning på 3,0 mg/kg tørvægt (se afsnit 3.3.1) og 10
gange højere, for at øge muligheden for at se en effekt. Mængden af fluoranthen i vores prøver er
meget lav, hvilket som tidligere nævnt skyldes en regnefejl, hvor der dels ikke er taget højde for
mængden af jord og antallet af replikater og dels er en faktor ti for lidt i forhold til vores
oprindelige plan. Konsekvensen af regnefejlen og den deraf følgende lave koncentration
diskuteres senere. For at have et statistisk grundlag for vores senere analyse af forsøgets udfald
udførtes forsøget med tre replikater, altså 39 prøver i alt.
29
5.2.2.1 OECD-jord
De forskellige prøver blev alle udført i OECD-standardjord (OECD, 2004). Sphagnum (Djursland
spagnum, pH 3,8-4,6) blev på forhånd tørret i 3 dage ved 105 C° i en ovn, da den ikke var tør efter
24 timer. Derefter blev den sorteret og findelt i hånden. Den tørrede sphagnum blev derefter
blandet ved håndkraft med kaolinler og kvartssand (indkøbt hos Harald Nyborg, Roskilde) i en stor
plastikbeholder. Vi måtte lave OECD-jorden af to omgange, da vi ikke havde nok jord i første
omgang. Vi fulgte guidelinen (OECD, 2004), som foreskriver et forhold på 10 % sphagnum, 20 %
kaolinler og 70 % kvartssand.
5.2.2.2 pH og vandbindingsevne
Vi målte pH med pH-meter efter tilsætning af 0,5 % Ca.CO , hvor værdien var 5,2. Ved tilsætning af
3
1 % Ca.CO målte vi pH til 5,4 hvorefter vi valgte at tilsætte sammenlagt 2 % Ca.CO . Vi havde dog
3
3
haft problemer med pH-meteret og det viste sig således, at den endelige pH-værdi i OECD-jorden
var 6,8 efter tilsætning af 2 % Ca.CO . Guidelinen (OECD, 2004) anbefalede pH-interval på 5,5-6,
3
men vi har også fundet kilder der anbefaler pH 6,3 (Walker et al., 2006). Ifølge Jikong et al. (2005)
er den anbefalede pH-værdi for E. fetida mellem 6-8,6. For at kunne udregne den nødvendige
mængde vand til hvert prøveglas blev jordens vandbindingsevne (WHC) målt til sidst. Dette gjorde
vi ved at udtage tre OECD-jord prøver på hhv. 7,3, 6,4 og 7,3 g i hver deres 5 mL pipettespids, som
var blevet klippet til i den spidse ende, så der var lige stort hul i begge ender. Inden opsamling af
OECD-jord blev plastikrøret vejet. Derefter blev WHC målt efter OECD (2004), hvor jorden i røret
først blev gennemfugtet med demineraliseret vand. Derefter blev røret forsynet med et stykke
filterpapir og sat på en våd sandbund, så overskydende vand kunne løbe af. Her henstod prøven i
2 timer og blev derefter vejet, og vægten noteret. Herefter blev OECD-jorden overført fra røret til
en glaspetriskål, og blev tørret til fuldstændig tørhed i varmeovn over natten. Efter tørring blev
jorden igen vejet. Efter vejning var det nu muligt at beregning WHC efter formlen:
(
)
(1)
30
Hvor S = massen af plastikrøret med det fugtede OECD-jord samt filterpapiret, T er massen af
filterpapir og plastikrør alene, og D er tørvægten af OECD-jorden (OECD, 2004). OECD-jordens
vandbindingsevne blev efter denne procedure målt til gennemsnitligt 48,7 % for de tre prøver, og
det bruges senere til at beregne, hvor meget vand der skal tilføres til prøveglassene, for at et
vandindhold på 60 % (se afsnit 5.2.2.6).
5.2.2.3 Mikroplastik til vores prøver
I de prøver, hvor toksiciteten af en enkelt type mikroplastik – primær eller sekundær – blev testet
alene, blev der tilføjet 5000 partikler pr. g jord (tørvægt). Denne mængde blev valgt på baggrund
af resultaterne fra undersøgelsen af mikroplastik i biogødningen (se afsnit 6.1).
5.2.2.3.1 Primær mikroplastik
Antallet af partikler blev for primær mikroplastik vurderet ud fra vægt, idet relationen mellem
partikelantal og vægt tidligere er undersøgt i laboratoriet for netop den anvendte type
mikroplastik (Trac, 2015). Han kom frem til, at 1 g primær mikroplastik af typen polyethylen fra
Cospheric med varierende diameter fra 10-106 µm i gennemsnit svarede til 4,0∙106 partikler. Da
han anvendte samme størrelse og type plastik som os, antager vi, at disse resultater kan overføres
til vores forsøg. Dette giver en vis usikkerhed omkring antallet af partikler i de enkelte prøver, som
vil blive diskuteret senere.
5.2.2.3.2 Sekundær mikroplastik
Den sekundære mikroplastik blev fremstillet i laboratoriet ved at klippe fibre af naturfarvet fleece.
Fleece er fremstillet af polyethylentereftalat (PET), som er en polyestertype. Vi undersøgte den
afklippede fleece under stereoluppen og vurderede, at den lignede de fibre, vi havde fundet i
biogødningen (se figur 3). Den eneste forskel var, at længderne varierede lidt mere på det
afklippede fleece, hvor der både var kortere og længere fibre end vi typisk så i biogødningen (hvor
vi antager at en del af fibrene stammer fra tøjvask). Dog var de gennemsnitligt i den samme
størrelsesorden, og formen var meget lig den fra biogødningen.
31
Figur 3: Fibre fremstillet af fleece. Billedet er taget med 4x forstørrelse gennem stereolup.
Vi forsøgte først at klippe en mængde fleece, som blev afvejet og forsøgt kvantificeret via
stereoluppen. Det var dog ikke muligt at optælle fibre på denne måde, da de ikke vejer ret meget,
og usikkerheden blev for stor, ved at afveje så lidt, at det var muligt at tælle dem. De afklippede
fibre blev derfor opløst i 200 mL kolbe med ethanol og rystet, så de alle lå frit og ikke klumpede
sammen. Vi valgte igen at bruge ethanol som opløsningsmiddel, da polyethylenterephtalat er et
semipolært molekyle ligesom ethanol. Dette ses af PET’s strukturformel, som er vist i figur 4
herunder.
Figur 4: Strukturen af en monomer i PET. Grundet de mange oxygenatomer er den interne
elektronforskydning i molekylet høj, men da forskydningerne er fordelt over hele molekylet og modvirkes af
polymerens form, er molekylet upolært.
Efter omrystningen blev 30 µL af fiberopløsningen straks overført til en lille, ren glaspetriskål, og
antallet af fibre i de 30 µL blev talt. Hvis kolberne ikke blev rystet grundigt før brug, lå fibrene på
bunden af kolben i en klump. Optællingen blev gentaget tre gange for at sikre en rimelig
konsistens i tallene. Derefter blev antallet af plastikfibre i de 200 mL opløsning beregnet. Det viste
sig, at vi ikke kunne tilsætte specielt mange fibre, uden at de klumpede sig sammen, og dermed
32
ikke var mulige at tælle. Til gengæld var antallet af fibre i hver optælling meget ensartet, når man
rystede dem og vi lavede derfor to ”opløsninger” med fleecefibre og ethanol. Dette blev gjort i to
forskellige kolber, hvor den ene havde en koncentration på 400.000 partikler pr 200 mL, og den
anden 600.000 partikler pr. 200 mL. Alle 200 mL i begge prøver blev nu inddampet til fuldstændig
tørhed i stinkskab og prøverne blev derefter vejet. Det gennemsnitlige resultat for disse to prøver
blev 4,0∙106 partikler/g. Denne værdi blev derefter brugt til at udregne, hvor mange gram
fleecefibre, der skulle i hvert prøveglas for at opnå den ønskede koncentration af partikler.
5.2.2.4 Fluoranthen
Udover mikroplastik, skulle vi også bruge fluoranthen til vores forsøg, og der blev således først
fremstillet en stamopløsning af fluoranthen i acetone. Denne opløsning blev lavet ved at afveje
0,0343 g fluoranthen i en glasvejebåd, som blev overført til en 100 mL målekolbe. Målekolben blev
derefter fyldt op med acetone. Dette gav en koncentration af fluoranthen i stamopløsningen på
343 µg/mL. Af denne opløsning blev 869 µL overført til en ny 100 mL målekolbe og fortyndet med
acetone. Den nye koncentration i denne flaske var således 2,98 µg/mL, hvilket var lidt mindre end
de 3,0 µg/mL vi ønskede. Da dette skyldtes en fejlberegning, som vi først opdagede senere, brugte
vi den fremstillede opløsning med en koncentration på 2,98 µg/mL til alle vores forsøg. Efter
fremstillingen af opløsningen blev der straks sat sølvpapir rundt om kolben, så der ikke skete
fotonedbrydning af fluoranthenen.
5.2.2.5 Spiking
Efter fremstilling af alle nødvendige opløsninger spikede vi vand og de øvrige blandinger. Dette
blev gjort for at efterligne de forhold hvor spildevand og slam transporteres rundt på
rensningsanlægget, der hvor biogødningen kommer fra (se afsnit 2.1.1). Derefter blev
blandingerne spiket i OECD-jord.
Proceduren foregik ved først at navngive 13 glaskolber (250 mL) med slib og glaslåg, jævnfør tabel
1, og alle kolber, der skulle indeholde acetone og fluoranthen, blev pakket ind i stanniol. Kolberne
blev placeret i stinkskab og der blev overført 1 mL af fluoranthenopløsningen (2,98 µg/mL) til alle
glas, der skulle have tilført 3 µg fluoranthen. Disse glas henstod derefter uden låg i stinkskabet i en
33
time, så al acetonen kunne fordampe. Acetone kontrollen (K+) var også pakket ind i stanniol og fik
overført 1 mL acetone, og den stod ligeledes uden låg i en time, til al acetone var fordampet. Der
overførtes 100 µL af fluoranthenoplsøningen (2,98 µg/mL) til alle glas, der skulle have en endelig
mængde på 0,3 µg (svarende til den mængde, der blev fundet i 1 g biogødning). Disse kolber
henstod derefter i stinkskab uden låg i 30 minutter, så acetonen også her kunne fordampe. Der
blev dernæst tilført mikroplastik i en mængde, der svarede til ca. 5100 partikler pr. gram jord
(tørvægt) til de glas, der kun skulle have primær eller sekundær mikroplastik. I tabel 1 herunder
ses desuden masseprocenten for den angivne mikroplastiktype i de enkelte prøver. Mængden er
højere end vores optælling af de to individuelle typer mikroplastik fra vores biogødning (se afsnit
6.1), men vi valgte at bruge den samlede mængde som udgangspunkt, og brugte samme
koncentration i vores prøver med primær og sekundær mikroplastik, for at kunne sammenligne
eventuelle effekter. Indholdet i alle 13 glas kan ses i tabel 1 herunder.
Acetone
K
K+
P
S
PS
PF0,3
PF3
SF0,3
SF3
PSF0,3
PSF3
F0,3
F3
-
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
Ja
-
-
0.838 g
-
-
-
0.101 g
0.101 g
-
-
-
-
0.3
3
µg
µg
(afdampet)
Primær
mikroplastik
Sekundær
(0,13%)
-
-
-
mikroplastik
Fluoranthen
0.101 g 0.838 g 0.838 g
(0,02%) (0,13%) (0,13%)
0.920 g
0.81 g
-
-
(0,14%) (0,12%)
-
-
-
-
-
(0,02%) (0,02%)
0.920 g 0.920 g 0.810 g
0.810 g
(0,14%) (0,14%) (0,12%) (0,12%)
0.3 µg
3 µg
0.3 µg
3 µg
0.3 µg
3 µg
Tabel 1: Oversigt over indholdet i de 13 spikede jordprøver. Tabellen viser massen af mikroplastik og
fluoranthen, som er tilført prøven, i gram og masseprocenten af mikroplastik i jorden (i parantes).K+ er
medtaget for at sikre, at acetonen fra den spikede jord i sig selv ikke interfererer med resultaterne, selvom
den dampes af.
Til alle 13 kolber blev der nu overført 90 mL demineraliseret vand. Prøverne blev derefter forsynet
med glasprop med slib, forseglet med parafilm og sat på rystebord i et klimarum indstillet til 10°C i
et døgn. Efter et døgn på rystebordet blev der overført 130 g OECD-jord (tørvægt) til hver prøve,
34
og alle prøverne blev igen forseglet med parafilm og placeret på rystebordet, denne gang i tre
døgn (over en weekend).
5.2.2.5.1 Overførsel af spiket jord til replikater
Det var meningen at vi ville overføre 40 g (tørvægt) jord fra den spikede prøve til hver replikat, og
da det ikke er muligt at overføre alt, havde vi tilsat 130 g jord i stedet for 120 g, som vi reelt skulle
bruge. Vi kendte massen (130 g tørvægt) og vandindholdet (90 g), og skulle således have overført
68 g til hver replikat. Efter spikning på rystebord stod det dog klart, at forseglingen havde været
utæt, og der var derfor løbet væske ud fra glassene. Da vi ikke havde afvejet de 13 glaskolber før
brug til spiking, var det derfor nødvendigt på ny at beregne, hvor meget af de spikede prøver, der
skulle overføres til hver af de tre replikater af de enkelte prøver. Dette blev gjort ud fra følgende
formel (2):
(
)
(
(
)
)
(
)
(2)
Denne fremgangsmåde kunne anvendes, idet det umiddelbart kun var væske, der var forsvundet
fra kolben. Massen af jord og mikroplastik i tørvægt (m(Jord+MP) 1), den totale masse af prøven
inklusiv væske (m(total)1) og den ønskede masse af jord og mikroplastik i de enkelte replikater (40
g, tørvægt – m(Jord+MP)2) var altså kendt. Ved at isolere m(total) 2 i ligningen var det derfor muligt
at beregne massen af spiket prøve, der skulle overføres til de enkelte replikater, selvom der under
spikningen var gået vand tabt.
Til beregning og overførsel af spiket prøve fra de 13 glaskolber til de 39 1 L bægerglas brugte vi
følgende metode: Indholdet i hver glaskolbe blev omrørt grundigt og derefter hurtigt fordelt
direkte til de tre replikate prøveglas, der på forhånd var blevet vejet. Ved at omrøre dem kunne vi
sikre at forholdet mellem jord og væske var så ens som muligt i de tre replikater. Vi ønskede at
kende den samlede vådvægt for at kunne anvende ovenstående formel (2), men ville undgå
unødigt spild ved først at overføre hver af de 13 prøver til nye bægerglas, og veje indholdet, for
35
derefter at overføre dem til de respektive replikatglas, da det ikke er muligt at overføre alt.
Dermed blev hvert replikatglas vejet, og den overførte masse (vådvægt) til hvert glas blev noteret.
Ved at lægge masserne sammen for alle tre replikater, kunne den samlede vådvægt bestemmes
for hver af de 13 prøver. Vi overførte altså al prøve til de tre replikatglas, så vi kunne bestemme
den samlede vådvægt og beregne den samlede tørvægt. Vi havde som sagt tilsat 130 g (tørvægt)
OECD-jord til hver prøve, og ønskede kun at overføre 40 g (tørvægt) OECD til hver af de tre
replikater. Derfor var det nødvendigt at fjerne det overskydende jord fra hvert replikat jævnfør
beregningerne, således at massen endte på 40 g spiket jord (tørvægt) i hvert replikat.
Der blev nu overført 200 g ren, tør OECD-jord til hvert prøveglas, og de blev alle blandet grundigt.
Dermed indeholdte hvert prøveglas sammenlagt 240 g OECD-jord (tørvægt). Derefter blev der
tilført demineraliseret vand, så vandindholdet svarede til 60 % af OECD-jordens WHC. Prøverne
blev igen grundigt omrørt for at sikre, at al jorden var fugtet. Under selve forsøget varierede
væskemængden ikke mere end højest 5 % fra 60 % WHC for de enkelte prøver. Dette blev sikret
ved vejning af prøverne hver 3. dag og justering med demineraliseret vand til alle prøver. Det
foregik ved at veje glassene, og tilføje vand så den nåede op på startvægten. Derudover blev der
taget stikprøver til vejning oftere de første dage, for at undersøge, om der var behov for at veje
alle prøver og justere med vand, hvilket ikke var tilfældet.
5.2.2.6 Økotoksikologisk test med E. hortensis
Der blev nu udvalgt fire orme til hvert replikat. Ormene blev fordelt, så størrelsesfordelingen på
tværs af både prøver og replikater var nogenlunde ensartet. Der blev desuden kun anvendt orme
uden clitellum til forsøgene, da det var vores antagelse, at orme, som endnu ikke var kønsmodne,
ville vokse mere over den relativt korte periode end kønsmodne orme. Ormene havde i to døgn op
til forsøget gået i ren OECD-jord fugtet til 60 % af WHC uden adgang til føde. Inden overførslen
blev ormene vasket i demineraliseret vand, duppet tørre i en papirserviet og vejet. Der blev også
taget billede af ormene til senere rumfangsberegninger. Ormene blev derefter overført til deres
respektive prøveglas. Glassene blev forseglet med parafilm. De prøver, som indeholdt fluoranthen,
blev desuden dækket med stanniol. Kontrolprøverne K+ blev også dækket af stanniol, som tidligere
nævnt, så de kunne bruges til sammenligning. Efterfølgende er vi blevet opmærksomme på, at vi
36
burde have været konsekvente og også dække de prøver, der ikke indeholdt fluoranthen, med
stanniol. Dette diskuteres senere.
Prøverne blev nu sat i klimarum ved 20oC i et døgn. Efter det første døgn blev der tilført 2,0 g
tørret hesteafføring til hver prøve, svarende til 0,5 g per orm jævnfør OECD-guidelinen (OECD,
2004). Mængden af væske i prøven blev herefter kontrolleret ved vejning. Efter 7 dage blev
prøverne transporteret hen til laboratoriet (figur 5) og alle fire orme i hver prøve blev vasket i
demineraliseret vand, duppet tørre i en papirserviet, vejet og fik taget billede. Herefter blev to
orme fra hver prøve udtaget, overført til 15 mL Nunc-rør, som var mærket med prøvens nummer,
og ormene blev derefter frosset ned i en -80 C-fryser til senere analyse. De to andre orme blev
o
puttet tilbage i prøveglasset, og dagen efter fodret med 1,0 g tørret hesteafføring per prøveglas.
Væskemængden blev igen kontrolleret ved vejning og justeret til 60 % WHC. Forsøget blev stoppet
efter 14 dage, hvor de resterende orme blev vasket med demineraliseret vand, duppet tørre i en
papirserviet, vejet og der blev taget et billede. Ormene blev herefter overført til 15 mL Nunc-rør
mærket med prøvens nummer og frosset ned til senere analyse.
Figur 5: Forsøgsglassene med regnorme transporteres hen til laboratoriet fra klimarummet, for at afveje og
fotografere regnormene.
37
5.2.2.6.1 Overlevelse og adfærd
Under forsøget blev ormenes overlevelse og adfærd vurderet. I forhold til adfærd blev ormene
observeret de første 15 minutter efter overførslen til prøveglassene både på dag 1 og på dag 7
efter måling, og deres nedgravningsadfærd noteret. Hvis alle orme i en prøve ikke havde gravet s ig
ned inden for 15 minutter, blev det betragtet som undvigeadfærd. Under selve forsøget blev
eventuelle ændringer i ormenes forventede graveadfærd noteret.
Overlevelse blev vurderet både efter syv dage og ved forsøgets afslutning. Alle orme blev, som
beskrevet ovenfor, taget op, vasket, vejet og fotograferet, og i den forbindelse vurderet til at være
levende eller døde.
5.2.2.6.2 Vækst
Ormenes relative vækst i de forskellige prøvejorde blev målt efter syv dage og ved forsøgets
afslutning efter 14 dage. Væksten blev målt som et gennemsnit af de fire orme i hver enkelt prøve
fra dag 1-7, og som et gennemsnit af de to resterende orme i hver prøve fra dag 7-14. Både
ormenes masse (målt som vådvægt) og deres volumen blev vurderet.
Ormenes masse målt som vådvægt blev målt efter samme fremgangsmåde for alle prøver.
Ormene blev udtaget af prøveglassene og vasket i demineraliseret vand. De blev derefter lagt på
en papirserviet og duppet for at fjerne noget af fugten. Umiddelbart derefter blev ormene flyttet
til en petriskål, som på forhånd var blevet sat på en vægt, der blev nulstillet. Ormenes samlede
masse blev derefter noteret. Efter syv dage blev alle fire orme i prøverne igen vasket og vejet, og
de to orme, som skulle tilbage i jorden, blev vejet separat og fik taget et billede, inden de blev sat
tilbage i prøvejorden. Ved forsøgets afslutning efter 14 dage blev de resterende orme vejet efter
samme fremgangsmåde.
Ormenes vækst målt som ændring af rumfang blev målt ved hjælp af computerprogrammet Cell D
version 3.4 fra Olympus Soft Imaging Solutions GmbH. Efter vask og vejning blev alle orme
fotograferet, hvorefter billederne blev overført til computeren, billedets proportioner blev
kalibreret, og længden af ormene og arealet af ormenes tværsnit blev målt. Derefter blev ormenes
rumfang beregnet efter følgende ligning (3):
38
(3)
Her er BV = ”body volume”, altså rumfanget af ormen, A = det målte areal af ormen og L =
længden af ormen. Metoden er fremsat af Self & Jumars (1978) og antager, at ormen kan
betragtes som en cylinder. De komplette datasæt fra vækstmålingerne på hhv. masse- og
rumfangsændringer kan findes i bilag 3 og 4. En sammenfatning kan ses i afsnittet ”Resultater”.
5.2.2.6.3 ROS-dannelse
Vi ønskede fra starten at undersøge, hvorvidt de forskellige behandlinger i forsøget kunne føre til
øget dannelse af reaktive oxygenarter (ROS) hos E. hortensis. Til denne undersøgelse brugte vi
kittet OXI-TEK Thiobarbituric Acid Reactive Species (TBARS) Assay Kit fra ZeptoMetrix Corporation.
Dette kit skulle ifølge producenten også kunne anvendes til vævsprøver. Efter protokollen, der
fulgte med kittet, lavede vi først en standardkurve ud fra kendte koncentrationer af
malondialdehydreagent (MDA-reagent), som reagerer med thiobarbitursyre (TBA) i forholdet 1:2.
For at kunne lave standardkurven fremstillede vi først en MDA-reagent ved at blande en halv
flaske af kittets diluent 1 (eddikesyre) med den medfølgende TBA. Resten af diluent 1 blev brugt til
at skylle TBA-glasset med, så vi var sikre på, at al TBA var blevet overført. Derefter tilsatte vi kittets
diluent 2 (NaOH), og lod det omrøre i 10 min. Dernæst fortyndede vi den koncentrerede MDA fra
kittet ved at overføre 1,8 mL MDA-diluent og 200 µL MDA. Dette gav os en stamopløsning af MDA
med en koncentration på 100 nmol/mL. Denne stamopløsning blev nu brugt til at lave følgende
koncentrationer til standardkurven efter skemaet (figur 6), der er vist herunder:
39
Prøve
MDA-koncentration
Volumen af MDA-stamopløsning
Volumen af MDA-diluent
(nmol/mL)
(µL)
(µL)
0
0
0
1000
1
12,5
125
875
2
25
250
750
3
50
500
500
4
100
1000
0
Figur 6: Skema over de anvendte mængder ved fremstilling af MDA-opløsninger til standardkurven til
TBARS-kittet fra ZeptoMetrix Corporation.
100 µL af hver af disse opløsninger blev nu overført til et nyt reagensglas og tilført 100 µL SDS
(natriumdodecylsulfat) fra kittet. Prøverne blev derefter kort whirlmixet for at blande dem.
Derefter blev der tilført 2,5 mL af den tidligere fremstillede TBA-reagent, og prøverne blev
inkuberet i 60 min. i varmeblok ved 95 C. Efter 60 minutter var alle prøver undtagen 0-prøven
o
skiftet til forskellige nuancer af lyserød. Prøverne blev taget ud af varmeblokken og centrifugeret i
15 min ved 1610 g. Herefter blev supernatanten overført til kuvette, og prøverne målt ved 532 nm
på et spektrofotometer af typen Genesys6 (Thermo Scientific). Den resulterende sta ndardkurve
ses på figur 7 herunder.
40
Standardkurve TBARS
0.12
y = 0.0011x - 8E-05
R² = 0.9997
Absorbans (532 nm)
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0
-0.02
20
40
60
80
100
120
MDA-koncentration (nmol/mL)
Figur 7: Standardkurve for ROS-målinger med TBARS-kit fra ZeptoMetrix.
Efter fremstilling af standardkurven brugte vi nu kittet til at undersøge ROS-dannelsen hos nogle
andre forsøgsorme, der også havde gået i OECD-jord, men som ikke indgik i vores egentlige forsøg.
Disse regnorme var henholdsvis blevet frosset i flydende nitrogen og i en fryser ved -80 °C. Det
blev gjort for at undersøge, hvorvidt der var forskel på ROS-dannelsen hos regnorme, der blev
lynnedfrosset med flydende nitrogen og regnorme, der var blevet frosset langsommere i en -80 °C
fryser.
Der blev udvalgt 5 tilfældige orme til hver af de to test (langsom frysning og lynnedfrysning). Alle
orme blev vejet (vådvægt) efter at de var vasket i demineraliseret vand og duppet tørre på
køkkenrulle. Derefter blev de 5 regnorme, der skulle langsomt nedfryses overført til reagensglas
med låg og lagt i en -80°C fryser. De resterende 5 orme blev med en tang nedsænket i en beholder
med flydende nitrogen (-196°C) i ca. 30 sekunder, til de blev vurderet at være gennemfrosne.
Derefter blev hver orm knust med en morter og overført til et reagensglas og vejet igen for at
kende den reelt overførte masse. Det var vanskeligt at knuse hele ormen, da nogle dele var meget
hårde og når ormen begyndte at tø, blev det meget svært at knuse. Alle reagensglas fik tilført et
passende volumen PBS D8537 fra Sigma-Aldrich, så den endelige prøve indeholdt 50 mg orm pr.
mL opløsning. For at undgå de større stykker som ikke kunne knuses, anvendte vi en homogenizer
for at få prøven så homogen som muligt.
41
Efter homogenisering overførte vi 100 µL af prøven til et nyt reagensglas, tilføjede 100 µL SDS og
whirlmixede kort for at blande det. Derefter blev der tilført 2,5 mL TBA-reagent, og prøven blev
inkuberet i 60 min ved 95 C i en varmeblok med en marmorkugle som låg. Efter inkubering blev
o
prøverne kølet til stuetemperatur på isbad og centrifugeret i 15 min ved 3000 rpm. Efter
inkubering og centrifugering stod det klart, at prøverne ikke var egnede til sammenligning med
standardkurverne, idet de var brune og meget uklare. Vi fandt efterfølgende en anden protokol,
hvori det var forklaret, at hæmoglobin i vævet kan interferere med resultatet. Vi målte derfor ikke
prøverne i spektrofotometer ved 532 nm, da prøverne alligevel ikke var sammenlignelige med
standardkurven. Mulige løsninger på denne problemstilling diskuteres senere.
5.2.2.7 Fluoranthenakkumulering
Udover de akut toksiske effekter af mikroplastik alene og i kombination med fluoranthen, blev
også ormenes optagelse af fluoranthen med og uden mikroplastik til stede målt. Det var vores
hypotese, at mikroplastikken enten kunne medvirke til at øge optaget af fluoranthen ved at
fungere som vektor – eller til at sænke optaget, hvis fluoranthen bindes kraftigt nok til
mikroplastikken til at passere ormens tarm uden at blive frigivet.
5.2.2.7.1 Metode til kvantificering af optag af fluoranthen med og uden
mikroplastik
Mængden af fluoranthen i ormene blev målt ved hjælp af GC-MS. Behandlingerne K+ og PS blev
ikke undersøgt, da vi i første omgang kun ønskede at undersøge, hvorvidt det overhovedet var
muligt at måle fluoranthen. Til denne indledende undersøgelse havde vi kun 11 C18-rør hjemme,
og vi valgte derfor ikke at teste de to prøver, da vi vurderede, at de sandsynligvis ikke ville vise
optag af fluoranthen. Inden selve kørslen på GC-MS gennemgik ormene en ekstraktionsprocedure.
Dette foregik ved først at veje den enkelte orm, og derefter klippe den i stykker på 2-3 mm ned i et
reagensglas med skruelåg. Prøven blev dernæst tilført 10 mL acetonitril og blev sonikeret i
ultralydsbad i 20 minutter. Herefter blev prøven whirlmixet i 30 sekunder. Dette blev gentaget to
gange mere, til prøven i alt havde været sonikeret i 60 minutter. Prøven blev nu overført til et nyt
centrifugerør og tilført 20 µL af den interne standard, som var deuterium-mærket phenantren. De
20 µL havde en koncentration på 1 µg/mL phenantren. Prøven blev derefter rystet grundigt i
42
hånden i 30 sekunder. Fra dette trin blev et kit til oprensning af blandt andet vævsprøver af typen
roQ QuEChERS Extraction Kit (EN Method) fra Phenomenex, nr. KSO-8909 anvendt, som også
tidligere blev anvendt til ekstrahering af PAH i biogødning (se metodebeskrivelse i afsnit 5.2.1).
Kittets indhold af salte (Magnesiumsulfat, NaCl og natriumcitrat) blev overført til hvert reagensglas
og rystet i 1 minut, hvorefter alle prøverne blev centrifugeret i 5 minutter ved 2862 g. Herefter
blev 6 mL af supernatanten overført til et C18-rør fra et andet kit af typen roQ QuEChERS dSPE Kit
fra Phenomenex, nr. KSO-8926 for at fjerne lipiderne fra prøven. Dette var nødvendigt, da lipider
dels kunne tilbageholde fluoranthen, og dels kunne forstyrre resultatet i GC’en. Røret blev rystet
grundigt i 30 sekunder og derefter centrifugeret i 5 minutter ved 2862 g. Herefter blev
supernatanten overført til et nyt reagensglas med skruelåg, og der blev tilført 200 µL isooctan.
Herefter blev prøven inddampet til et samlet volumen på 200 µL for at sikre så høj en
koncentration af fluoranthen i prøven som muligt. Isooctan blev tilsat for at sikre, at der var et
bestemt volumen (ca. 200 µl) tilbage efter inddampning som fluoranthen var opløst i, idet den
grundet sit højere kogepunkt forblev i reagensglasset ved inddampningen, mens acetonitrilen
fordampede. I tabel 2 ses de fysisk-kemiske egenskaber for de to opløsningsmidler.
Massefylde (g/mL) Kogepunkt ( C)
o
Acetonitril
0,786
82,0
Isooctan
0,690
99,0
Tabel 2: Oversigt over relevante fysisk-kemiske egenskaber for de to opløsningsmidler, som blev brugt til
ekstraheringen.
Efter inddampningen blev de resterende 200 µL prøve overført til et brunt GC-vial, for at undgå
fotonedbrydning, med indsats, og prøverne blev kørt på GC-MS. Gaskromatografen (GC) var fra
Agilent og havde nr. 6890, og massespektrometeret (MS) var ligeledes fra Agilent og havde nr.
5975. Programmet, som GC-MS’en kørte efter, kan ses i bilag 5. De opnåede responssignaler for
prøverne blev derefter sammenlignet med en standardkurve, som tidligere var blevet lavet af
instituttets tilknyttede kemiker Torben Brandt Knudsen. Standardkurven ses herunder i figur 8.
43
Figur 8: Her ses den standardkurve, som ligger til grund for koncentrationsberegningerne med GC -MS.
Som det fremgår af figur 8, er koncentrationen på x-aksen og signalstørrelsen på y-aksen. Ved
hjælp af ligningen for tendenslinjen til standardkurven, som ses på figuren, kan vi altså beregne
koncentrationen af fluoranthen i vores prøver. Resultaterne præsenteres i afsnit 6.4.
5.2.3 Statistisk analyse
Til at analysere vores data har vi anvendt forskellige statistiske metoder. Disse metoder beskrives
herunder.
44
5.2.3.1 Standardafvigelse
Standardafvigelsen for de enkelte behandlinger blev beregnet efter formlen:
√
(4)
Her er VIndenfor = variansen for observationerne indenfor den enkelte behandling. Variansen blev
beregnet efter følgende formel:
∑(
̅)
(5)
Hvor x = den enkelte observation, = gennemsnittet af alle observationer i behandlingen og df =
antallet af frihedsgrader i behandlingen. Antallet af frihedsgrader beregnes som følger:
(6)
Hvor n = antallet af prøver i behandlingen. I vores tilfælde var der tre prøver i hver behandling, og
df var altså 2 for de enkelte behandlinger.
5.2.3.2 Envejs-ANOVA
Med envejs-anova kunne vi undersøge om der var statistisk signifikant forskel på regnormenes
vækst mellem de forskellige behandlinger. Til dette formål anvendte vi programmet Systat, hvori
vi foretog en envejs-ANOVA over henholdsvist masse- og rumfangsændringer for de to perioder
(0-7 dage og 7-14 dage). ANOVA bruges til at sammenligne gennemsnittet for forskellige
behandlinger og dermed fastslå, hvorvidt en eller flere behandlinger i et datasæt har forskelligt
gennemsnit end de øvrige behandlinger. For at kunne anvende ANOVA var det først nødvendigt at
omregne vores resultater fra procent til ratio, og derefter arcsin-transformere dem. Desuden
måtte vi sikre os, at vores data var normalfordelte og at variansen var homogen, idet dette er to af
forudsætningerne for at kunne lave ANOVA. Dette gjorde vi ved at foretage en KolmogorovSmirnoff-test for normalfordeling og en Levene-test for varianshomogenitet.
45
6. Resultater
6.1 Karakterisering og kvantificering af mikroplastik og
PAH i biogødning
I dette afsnit beskrives karakteriseringen af mikroplastik og resultaterne af kvantificeringen af
mikroplastik i en prøve med biogødning. Dernæst følger resultaterne af PAH koncentrationerne i
prøven med biogødning.
Til karakteriseringen af plastikfibre vurderede vi som beskrevet tidligere form og farve på fibrene.
Plastikfibre var karakteriserede ved at være cylindriske, ensfarvede og uden tydelige strukturer.
Hårfibre kunne godt ligne plastikfibre idet de også havde en cylindrisk form og va r ensfarvede. Ved
nærmere undersøgelse under lysmikroskop, var det dog tydeligt, at der var cellestrukturer i
hårfibrene. Derudover var hårfibre ofte helt sorte under stereoluppen. Plantefibre var ofte fladere
end de cylindriske plastikfibre. Enderne blev også vurderet, da plantefibre ofte var flossede, i
modsætning til plastikfibre, der enten var helt runde eller havde spids, afbrækket struktur. Den
tydeligste forskel var, hvorvidt der kunne spores organeller som grønkorn eller ej. For at
karakterisere primær mikroplastik, sammenlignede vi med indkøbte primær mikroplastik partikler
i størrelsen 10-106 µm som beskrevet i afsnit 5.1.
B
A
C
Figur 9: Til venstre (A) ses en primærplastikpartikel fra biogødningen. I midten (B) ses en plastikfiber fra
biogødningen. Til højre(C) ses en plantefiber, der er udtaget fra biogødningen til nærmere
mikroskopundersøgelse.
46
På figur 9 ses eksempler på primær plastik, mikroplastik fiber og plantefiber fundet i
biogødningen. Det ses at mikroplastik kan være svært at detektere på grund af den gennemsigtige
farve og ringe størrelse. Derudover kunne det være vanskeligt at skelne plantefibre og
mikroplastikfibre, specielt når plastikfibre var beskidte eller blevet deforme af behandlingen på
rensningsanlægget. Nedenfor ses to billeder (figur 10) som illustrerer, hvor vanskeligt det kunne
være at detektere mikroplastik i biogødningen. Til højre på figur 10 ses en fiber nr 1, der vurderes
som en plastikfiber, på grund af den runde form og enderne anes som runde. Fiber nr 2 er lidt
mere vanskelig at vurdere og ville blive kategoriseret som muligvis plastikfiber, da formen ser
cylindrisk ud, men den er grønlig i farven og enderne ser en smule flossede ud som på plantefibre.
Det afgørende i dette tilfælde vil være, at der ikke ser ud til at være strukturer, i form af grønkorn,
tilstede og derfor ender den i kategorien “muligvis plastikfiber”. Det lyserøde der ses på nogle
billeder (eksempelvis på figur 10) er genskær fra stregerne bagpå petriskålen. Stregerne gjorde det
lettere at sikre, at hele prøven på petriskålen blev optalt.
Figur 10. Til venstre (A) ses en primær mikroplastikpartikel, der er vanskelig at detektere i biogødningen, da
den er helt gennemsigtig. Til højre (B) ses tre fibre, hvoraf to er markeret med tallene 1 og 2. De illustrerer,
at det kan være vanskeligt at vurdere, om en fiber er plastik eller plante. Nr. 1 er vurderet til at være plastik
og nr. 2 er vurderet til at være en mulig plastikfiber.
Der var også farvede fibre i biogødningen, som det fremgår på figur 11, og disse var naturligvis
lette at adskille. Det viste sig dog ved metodeoptimering som beskrevet i afsnit 5.1.1, at de blå
fibre typisk var kontaminering fra luften.
47
Figur 11: Optælling af mikroplastik i biogødning, hvor de farvede plastikfiber let skiller sig ud. Her ses to
forskellige eksempler, hvor der er observeret farvede fibre.
I den sidste del af hver prøve, var der flere uopløste klumper med biogødning, hvor det var
vanskeligt at vurdere, hvor meget mikroplastik, der var til stede (figur 12). Det er dog vigtigt at
bemærke, at problemet med disse klumper var langt mindre ved brug af ethanol som
opløsningsmiddel end ved brug af demineraliseret vand.
Figur 12: Ved kvantificering af den sidste del af P1 og P2 kunne det ikke undgås at der var klumper med
biogødning til stede. Figuren viser sådan en klump af biogødning hvor fibre stikker ud.
48
Ved optælling af mikroplastik i de to prøver fandt vi hhv 576 partikler i prøve 1 (P1)og 389 partikler
i prøve 2 (P2). Til sammenligning var der ca. 29 partikler i kontrolprøverne, som alle var fibre. I P1
fandt vi 81 primær mikroplastik partikler og i P2 fandt vi 43 primær mikroplastik partikler. Således
var andelen af primær mikroplastik hhv 14 % og 11 % af det samlede antal mikroplastikpartikler og
det resterende antal var dermed mikroplastikfibre. I forbindelse med optællingen havde vi også
kategoriseret partikler efter mikroplastikfibre, farvede fibre og mulige mikroplasti kfibre. Vi har
desværre mistet disse data for P2. I P1 blev der observeret 328 mikroplastikfibre, 31 farvede fibre
og 136 mulige mikroplastikfibre. Vi har noteret at der var færre partikler observeret i kategorien
mulige plastikfibre i P2 i forhold til P1. En oversigt over optællingerne kan ses i tabel 3.
Tabel 3: Oversigt over optællinger af mikroplastik i biogødning fra Holbæk forsyning.
Primær
MP
Farvede MP
Mulige MP
MP i
Primær MP
MP
fibre
fibre
fibre
alt
i%
P1
81
328
31
136
576
14
P2
43
-
-
<136
389
11
Kontrol
Partikler pr g
Afvigelse i
tørvægt
%
29
5061
7,5
≈29
7674
5,0
Resultaterne viste, at der var mikroplastik til stede i biogødning. Ved omregning til tørvægt fandt
vi sammenlagt 7674 mikroplastikpartikler pr. g. biogødning i P1 og 5183 mikroplastikpartikler pr. g.
biogødning i P2. Disse tal blev dannede grundlag for designet af toksicitetsforsøgene (Se afsnit
5.2.2.6 for metode og afsnit 6.3 for resultater).
6.2 Indledende bestemmelse af PAH-indhold i biogødning
Resultatet af PAH målinger i biogødningen kan ses på tabel 4. På grund af flygtigheden af visse
PAH’er var det ikke muligt at måle alle 16 PAH ved denne metode. Det er derfor kun resultater for
de 11 PAH’er, der kunne detekteres, som er vist i tabel 4.
49
Tabel 4: Resultaterne af de forskellige PAH koncentrationer i biogødning, der er målt med GC-MS. Alle
prøver er angivet med enheden µg/g biogødning (tørvægt). Beregninger ses i bilag 6.
Replikat 1 Replikat 2 Replikat 3 Gennemsnit
Fluoren
0.000
0.160
0.109
0.090
Phenanthren
0.154
0.168
0.148
0.157
Antracen
0.105
0.101
0.099
0.102
Fluoranthen
0.267
0.292
0.264
0.274
Pyren
0.213
0.230
0.213
0.219
Benz(a)antrancen
0.167
0.184
0.169
0.173
Chrysen
0.126
0.136
0.125
0.129
Benz(b)fluoranthen
0.156
0.157
0.151
0.155
Benzo(a)pyren
0.149
0.162
0.150
0.154
Indeno-1,2,3-cd-pyren
0.256
0.268
0.273
0.266
Benzo(g,h,i)perylen
0.153
0.158
0.156
0.156
Fluoranthen er altså den PAH, som findes i højest koncentration i de udvalgte prøver af
biogødning. I tabel 4 ses koncentrationen i mg/kg biogødning (tørvægt), som kan sammenlignes
med grænseværdien på 3,0 mg/kg for PAH i biogødning.
50
6.3 Toksicitetsbestemmelse
I dette afsnit præsenteres resultaterne fra de undersøgelser, der blev udført i forbindelse med
toksicitetsbestemmelsen af mikroplastik i biogødning alene og i kombination med fluoranthen.
6.3.1 Overlevelse og adfærd
Ved forsøgets start blev ormenes nedgravningsadfærd observeret, idet orme, som havde gravet
sig ned inden for 15 minutter, blev anset som at have normal nedgravningsadfærd. Det var kun én
orm i ét replikat af K+, der ikke var nedgravet indenfor 15 minutter, og derfor udviste unormal
nedgravningsadfærd. Alle orme ormene i K+ nedgravet var nedgravet, da vi observerede dem igen
efter 24 timer. Denne metode til observationa f adfærdsændringer var i princippet kvantificerbar,
men da der kun var en enkelt afvigende orm i ét replikat i én af behandlingerne, er det ikke muligt
at drage nogen statistisk funderede konklusioner.
A
Figur 13. Observerede adfærdsændringer hos ormene i de 13 forskellige prøveglas fra 0-7 dage (A) og 7-14
dage (B).
I løbet af de 14 dage forsøget varede, observerede vi adfærdsændringer i de fleste prøveglas, dog
ikke kontrolprøverne (se figur 13).
Efter 2 dage observerede vi, at flere orme var stukket af, og lå døde på bordet, og det observerede
vi igen efter 6 dage. Således var det efter 0-7 dage registreret at 9 orme der var stukket af. Der var
51
B
også flere orme, der var kravlet op af jorden, og lå ovenpå ”låget” af parafilm, under stanniolen,
specielt fra prøverne PF3, hvor der blev registreret adfærdsændringer i samtlige replikater. Disse
orme blev ført tilbage til jorden og der kom ny parafilm over glassene. I løbet af den første uge (07 dage) noterede vi således spor på parafilmen eller orme på parafilmen i 7 replikatprøveglas
fordelt på 5 forskellige behandlinger (se figur 13A). I den følgende uge (7-14) observerede vi kun
én adfærdsændring i form af en enkelt orm der var stukket af fra behandlingen i et replikat fra
F0,3, som det fremgår af figur 13B.
Hvis man blot ser på behandlingstype og ikke tager højde for koncentrationer og sammensætning
af mikroplastik og fluoranthen i prøverne, kan det ses , at seks ud af de ni observationer af
adfærdsændringer mellem 0-7 dage finder sted i prøverne med både mikroplastik og fluoranthen
tilstede. De grupperede observationer for dag 0-7 er vist på figur 14. Dernæst er der 2
observationer af adfærdsændringer i prøver kun med mikroplastik og en observation af
adfærdsændring i prøver kun med fluoranthen. Der er ingen observationer af disse
adfærdsændringer i kontrolprøverne. Det er vigtigt at understrege, at adfærdsændringerne er
kvalitative observationer, og at det derfor ikke er muligt at undersøge dem statistisk.
Grupperede adfærdsobservationer, dag 0-7
7
Antal replikater med
observerede
adfærdsændringer dag 0
6
5
4
Antal replikater med
observerede
adfærdsændringer dag
1-7
Antal replikater med
manglende orme
3
2
1
0
K
MP
F
MP+F
Figur 14: Gruppering af observerede adfærdsændringer fra dag 0-7, hvor behandlingerne er samlet i
kategorierne kontrolprøver (K), mikroplastikprøver (både primær og sekundær) (MP), fluoranthenprøver (F)
og mikroplastik+fluoranthen prøver (MP+F). Resultaterne fra dag 7-14 er ikke vist.
52
6.3.2 Vækst
Regnormenes vækst blev målt i form af masseændring og volumenændring fra dag 0-7 og dag 714. De rådata, som ligger til grund for figurerne, ses i bilag 3 og 4.
6.3.2.1 Relativ ændring i masse
På figur 15 ses den relative massetilvækst for de 13 behandlinger i procent for 0-7 dage og 7-14
dage.
A
Relativ massetilvækst (%)
Masseændring 0-7 dage
70
50
30
10
-10
-30
-50
K
K+
P
S
PS
PF0,3
PF3
SF0,3
SF3
PSF0,3
PSF3
F0,3
F3
B
Relativ massetilvækst (%)
Masseændring 7-14 dage
70
50
30
10
-10
-30
-50
K
K+
P
S
PS
PF0,3
PF3
SF0,3
SF3
PSF0,3
PSF3
F0,3
F3
Figur 15: Her ses den relative gennemsnitlige masseændring for de enkelte behandlinger fra dag 0-7 (A) og
dag 7-14 (B). Standardafvigelsen for alle behandlinger er angivet.
53
På figur 15 ses det tydeligt, at der er store usikkerheder forbundet med resultaterne for de
individuelle behandlinger, idet standardafvigelsen på mange af behandlingerne er stor. Samtidig er
der prøver, hvor man inden for standardafvigelsen ikke kan afgøre, om tendensen går mod
stigning eller fald i masse. Det er altså som udgangspunkt ikke muligt at drage nogen endelige
konklusioner om de individuelle behandlingers masseændringer på baggrund af vores
observationer.
For at teste, om nogen af de 11 behandlinger afveg signifikant fra de to kontroller i forhold til
massetilvækst, anvendte vi ANOVA som beskrevet i afsnit 5.2.3.2. Ved denne analyse fandt vi, at
hverken masseændringerne for 0-7 dage (p = 0,131) eller for 7-14 dage (p = 0,573) afveg
signifikant fra hinanden. Vores data var i begge tilfælde normalfordelte ifølge Levene-testen (p =
0,279 for 0-7 dage og p = 0,310 for 7-14 dage), men opfyldte til gengæld ikke betingelsen om
varianshomogenitet ifølge Kolmogorov-Smirnoff-testen (p = 0,02 for 0-7 dage og p = 0,037 for 7-14
dage). Vi valgte derfor at lave en non-parametrisk Kruskal-Wallis-test for at forsøge at underbygge
vores resultater som foreslået af Fowler et al. (1998). Resultatet af denne analyse viste også, at
der ikke var signifikant forskel på masseændringerne, hverken for 0-7 dage (p = 0,135) eller 7-14
dage (p = 0,420). Der altså ikke nogen statistisk signifikant forskel på den gennemsnitlige
vægtændring mellem de 13 behandlinger ved hverken ANOVA eller Kruskal-Wallis-test. Dette
gælder både for 0-7 dage og for 7-14 dage.
6.3.2.2 Relativ ændring i volumen
Den relative ændring i volumen for prøven fra 0-7 dage og fra 7-14 dage blev som beskrevet i
afsnit 5.2.2.6.8 målt ved hjælp af et computerprogram, CellD, hvor det var muligt at måle areal og
længde ud fra billeder. Resultaterne ses på figur 16 herunder.
54
A
Relativ volumenændring (%)
Volumenændring 0-7 dage
50
0
-50
-100
K
K+
P
S
PS
PF0,3
SF0,3
SF3
PSF0,3
PSF3
F0,3
F3
PF3
B
Relativ volumenændring (%)
Volumenændring 7-14 dage
50
0
-50
-100
K
K+
P
S
PS
PF0,3
SF0,3
SF3
PSF0,3
PSF3
F0,3
F3
PF3
Figur 16: Figuren her viser den relative massetilvækst for de enkelte behandlinger fra dag 0-7 (A) og dag 714 (B). Standardafvigelsen for alle behandlinger er angivet.
På figur 16 er det tydeligt, at de enkelte målinger i hver behandling varierer betydeligt inden for
hvert replikat. Der er dermed ikke noget entydigt grundlag for at udtale sig om ormenes
væksttendens i de enkelte behandlinger.
Vi har, på trods af den umiddelbart store varians i de enkelte behandlinger med massevækst, også
for disse målinger valgt at analysere resultaterne med ANOVA for at sammenligne den
gennemsnitlige volumenændring. Resultatet af ANOVA-analysen viste også her, at der ikke er
statistisk signifikant forskel på ændringerne i kropsvolumen behandlingerne imellem, hverken for
0-7 dage (p = 0,052) eller for 7-14 dage (p = 0,388). Kolmogorov-Smirnoff-testen for
55
normalfordeling viste, at dataene i begge tilfælde var normalfordelte (p = 0,145 for 0-7 dage og p =
0,063 for 7-14 dage), men igen var der problemer med varianshomogenitet ifølge resultaterne fra
Levene-testen (p = 0,005 for 0-7 dage og p = 0,000 for 7-14 dage). Vi valgte derfor igen at foretage
en Kruskal-Wallis-test, som viste sig at understøtte ANOVA-analysen (p = 0,085 for 0-7 dage og p =
0,487 for 7-14 dage).
Baseret på resultaterne er der altså ikke nogen statistisk signifikant forskel på prøverne, og
behandlingerne har derfor ikke ført til ændringer i vækst målt som relativ massevækst og
volumenændring hos vores orme.
6.3.3 ROS-dannelse
Udover målinger på overlevelse, adfærd og vækst ønskede vi også at undersøge, hvorvidt de
forskellige behandlinger førte til en øget mængde af reaktive oxygenarter i regnormenes væv.
Dette forsøgte vi at måle som beskrevet i afsnit 5.2.2.6.3.
Desværre viste det sig under målingerne, at kittet ikke var egnet til at lave målinger på ubehandlet
væv, idet hæmoglobin som tidligere nævnt kan forstyrre resultatet. I stedet for klare, pink
opløsninger, som vi havde set under udarbejdelsen af standardkurven, endte vi derfor med en
uklar, brun væske, som det ikke var muligt at lave spektrofotometriske målinger på.
6.4 Optag af fluoranthen
I den sidste del af undersøgelsen ønskede vi at teste, hvorvidt mikroplastik i jorden kunne have en
indflydelse på optaget af fluoranthen hos ormene. Dette blev undersøgt ved hjælp af GC/MS.
Metoden er beskrevet i afsnit 5.2.2.7.1. Rådata fra GC/MS-målingerne kan ses i bilag 7. Vi
undersøgte som beskrevet i afsnit 5.2.2.7.1 én orm fra 11 af behandlingerne for at se, om vi kunne
påvise fluoranthen i nogen af prøverne. Et eksempel på et resultat ses i figur 17.
56
Figur 17: Her ses spektret for prøve SF3, som er optaget på GC. Retentionstiden for fluoranthen er 15.75
med vores metode. Retentionstiden for den interne standard, deuteriummærket phenantren, er 13.42.
Som det ses på figuren, giver phenantren en tydelig top omkring den forventede retentionstid,
mens der ingenting er ved den forventede retentionstid for fluoranthen. Der er altså ikke noget
fluoranthen til stede i prøven. De øvrige toppe er baggrundsstøj. Det gælder ikke kun prøven SF3,
som er vist på figur 17, men også for samtlige andre prøver. Dette resultat kan have flere årsager,
57
hvilket vi vil diskutere senere. Dog er det værd at nævne, at vi i vores prøver med højeste
koncentration maksimalt havde en fluoranthenkoncentration på 3,84 ng/g jord, svarende til 230,4
ng fluoranthen per orm, hvis alle orme optog lige meget og al fluoranthen blev optaget. Dette
svarer til en maksimal koncentration i vores GC-prøver på 691,2 µg/L efter inddampning til et
samlet volumen på 200 µL. Beregningerne kan ses i bilag 8.
58
7. Diskussion
Denne rapport har bl.a. fokuseret på at optimere en metode til at karakterisere og kvantificere
mikroplastik i biogødning. Det har, som tidligere nævnt, været en udfordring, da der på
nuværende tidspunkt ikke findes en standardiseret metode til den type undersøgelser i terrestrisk
miljø.
7.1 Ekstrahering og karakterisering af mikroplastik fra
biogødning
Vi valgte, efter forskellige pilotforsøg, at anvende den metode, som er beskrevet i afsnit 5.1.1.1 og
5.1.1.2. Metoden har både fordele og ulemper. Den klare fordel er, at metoden er meget low-tech,
og kan udføres med billige materialer og uden brug af særligt udstyr. Samtidig kan alle med lidt
øvelse blive i stand til at genfinde fibre og partikler i prøverne. Dette leder videre til metodens
ulemper - vurderingen er nemlig ofte subjektiv og afhænger af observantens rutine i identifikation
og ikke mindst, om der bliver talt korrekt. Hvis der samtidig udtages prøver til eksempelvis FTIR analyse, som vi oprindelig planlagde at gøre, er det problematisk, hvis partiklerne flytter sig på
grund af ændringer i overfladespændingen, når pincet eller andet redskab føres ned i prøven, og
partiklerne derfor potentielt tælles to gange. FTIR-analyse er tidligere anvendt af Magnusson &
Noren (2014) til at identificere mikroplastik i slam fra rensningsanlæg, hvor de kunne analysere
andre typer af sekundær mikroplastik end fibre, hvorfor metoden ikke tyder på at være anvendelig
på dette punkt endnu.
Anvendelsen af vores metode betyder således, at det er nødvendigt at tælle samme prøve flere
gange, hvis man ønsker en præcis kvantificering og karakterisering af indholdet af mikroplastik i
prøven. Dette kunne til en vis grad undgås, hvis det i stedet var muligt at benytte en mere pålidelig
metode til karakteriseringen. Habib et al. (1998) foreslog som de første at anvende PLM (Polarized
Light Microscopy) til at identificere syntetiske og naturlige fibre med, og dermed kunne adskille
dem fra hinanden. De beskriver selv metoden som værende nem og hurtig (Habib et al., 1998).
Ved denne metode belyses en prøve på et objektglas med polariseret lys, og refraktionsindekset
måles og sammenlignes med referencer. Baseret på de opnåede refraktioner vurderes det, hvil ken
59
typer fiber der er tale om. Et alternativ til PLM kunne være Raman-spektroskopi hvor udvalgte
mikroplastikpartikles spektre kan sammenlignes med spektre fra et referencebibliotek i et
computerprogram. Den metode er bl.a. anvendt af Van Cauwenbergh et al. (2013), hvor de
analyserede mulige plastikpartikler fra dybhavssediment. Det er således en relativ nem og præcis
metode til at afgøre, præcis hvilken type fiber eller partikel, der er tale om - og om det
overhovedet er plastik. Fordelene ved disse to metoder er altså dels, at man får en konkret
vurdering af, om en fiber eller partikel er naturlig eller plastik, og at det er muligt at vurdere,
hvilken type plastik, der eventuelt er tale om. Udover dette er Raman-metoden ikke destruktiv for
prøven, og den analyserede fiber kan altså bevares, og derudover kan størrelsen også bestemmes
samtidig. Det er dog stadig nødvendigt manuelt at udvælge de individuelle fibre og partikler, man
vil have testet, og ved PLM-metoden er det nødvendigt at undersøge meget små prøver ad
gangen, hvis man følger den forskrift, som er foreslået af Habib et al. (1998), idet prøven uanset
forudgående behandling skal overføres til objektglas inden det er muligt at måle refraktion.
Desuden kræver begge metoder adgang til enten specialudstyr eller referencebibliotek, hvilket
ikke har været en mulighed i vores tilfælde.
I fremtiden vil det være optimalt at forsøge at finde en metode, hvor de enkelte partikler og fibre
automatisk bliver sorteret og analyseret, hvorved fejlkilderne både indenfor kvantificering og
karakteristik af mikroplastik ville formindskes. Indtil dette bliver en mulighed, vil det være en
fordel for identifikationsarbejdet at fjerne en del af det organiske materiale fra prøverne, inden
selve karakteriseringen. Dette er blandt andet gjort af Mintenig et al. (2014), som har anvendt
forskellige typer af enzymer samt oxidation med hydrogenperoxid til at nedbryde det organiske
materiale inden FTIR-analyse. Derved kan man undgå at blive i tvivl om hvorvidt en fiber er en
plante- eller plastikfiber, som var tilfældet ved vores metode, hvor visse fibre blev kategoriseret
som mulige plastikfibre.
7.2 Kvantifikation af mikroplastik i biogødning
Vores egen optælling af mikroplastik i biogødning er ikke tilstrækkelig præcis til at kunne
konkludere entydigt på indholdet af mikroplastik i vores biogødningsprøve fra Holbæk forsyning.
Det skyldes, at vi kun har talt mikroplastik fra to replikate prøver, og dermed ikke kunne lave en
statistisk analyse af vores data. Derudover har vi kun talt hvert replikat én gang, og der er således
60
ikke taget højde for de subjektive forskelle i forbindelse med optællingerne. Samtidig kan metoden
ikke bruges til at bestemme at alle optalte mikroplastikpartikler rent faktisk er plastik, da
indholdet ikke analyseret. Dog blev der udtaget stikprøver af fibre til nærmere undersøgelse med
lysmikroskop, hvor det i flere tilfælde, med overvejende sandsynlighed, kunne antag es at være
plastik. Det skyldtes, at det ved nærmere undersøgelse under lysmikroskopet var relativt let at se,
om der var grønkorn eller andre cellestrukturer til stede, og hvis det ikke var tilfældet, måtte det
antages at være plastik. Samtidig blev der også sammenlignet med tøjfibre, herunder fleece. Vores
optælling af mikroplastik er således ikke et præcist resultat af mængden af mikroplastik i vores
biogødningsprøve. Det opfyldte dog vores formål, som var at få en idé om, hvilken koncentration
af mikroplastik, der skulle benyttes til vores forsøg.
For at undersøge, om den optalte mængde af mikroplastik i biogødning tilnærmelsesvis er
repræsentativ, har vi undersøgt den litteratur, der foreligger om emnet. Ved de to optællinger
fandt vi ca. 5100 og ca. 7600 mikroplastikpartikler pr gram biogødning i tørvægt, svarende til ca.
5.100.000 og 7.600.000 partikler pr kg tørvægt. Heraf var henholdsvis 14 % og 11 % primærplastik
(se i øvrigt afsnit 6.1). Da vi fandt mikroplastik, i form af fibre, i vores kontrolprøver har vi
korrigeret for det, og således var usikkerheden i første optælling 7,5% og i anden optælling 5,0 %.
Størrelsen på de fundne partikler var omtrent 100 µm, som kunne ses ved de stikprøver vi udtog,
og ved sammenligning med indkøbte primær mikroplastikpartikler i den størrelsesorden. Det var
dog ikke målet med denne rapport at bestemme størrelsen på mikroplastik. Magnusson & Norén
(2014) fandt i deres studie, at spildevandsslam fra Långeviksverket indeholdte omkring 17.000
mikroplastikpartikler pr kg slam (tørvægt). Deres fokusstørrelse var partikler på over 300 µm. I
deres studie blev der ikke registreret primær mikroplastik, men det gennemsnitlige antal fibre var
ca. 1200 partikler pr kg slam, svarende til ca. 7,1 % procent af den samlede mængde mikroplastik
pr kg slam. Dette er betydeligt lavere end vores observerede mængde, hvilket sandsynligvis kan
forklares med den størrelse, de kiggede på, da deres ekstraheringsmetode ikke kunne registrere
fibre under 300 µm. Magnusson & Noren (2014) fandt også andre typer sekundære
mikroplastikpartikler og registrerede gennemsnitligt omkring 3400 plastikfragmenter og 1300
plastikflager pr kg biogødning, svarende til henholdsvis 20 % og 7,6 % af den samlede mængde
mikroplastik, mens de sidste 65,3 % mikroplastikpartikler er ikke karakteriseret i en af de tre
grupper (fibre, fragmenter og flager). Det viser, ikke overraskende, at typen og mængden af
61
sekundær mikroplastik, som findes i slam eller biogødning, er afhængigt af, hvilken størrelse man
kigger efter. Således er det muligt at vi havde fundet flere og større typer sekundær mikroplastik,
hvis vi havde screenet en meget større mængde end de anvendte to gange 250 mg biogødning.
I et andet, meget omfattende, studie af mikroplastik i spildevandsslam fra tolv forskellige tyske
rensningsanlæg, undersøgte Mintenig et al. (2014) mængden og typen af mikroplastik i slammet.
De kiggede både på mikroplastik over og under 500 µm, i størrelser helt ned til 10 µm. I
undersøgelsen fandt de, at der var flest mikroplastikpartikler til stede i spildevandsslammet i
størrelsesordenen 50-100 µm. Undersøgelsen afslørede både tilstedeværelsen af primær og
sekundær mikroplastik, uden dog nærmere at komme ind på den relative forekomst af de to typer
mikroplastik i slammet. Sammenlagt fandt de mellem 1.041.000 og 24.129.000
mikroplastikpartikler per ton slam (tørvægt) på de seks rensningsanlæg, svarende til mellem 1041
og 24.129 partikler pr kg (tørvægt). Deres resultater viser altså tydeligt, at der kan være stor
variation i mængden af mikroplastik i spildevandsslam mellem de forskellige rensningsanlæg. Det
er desuden muligt, at indholdet kan variere på det enkelte rensningsanlæg over tid. Det er
desuden værd at bemærke at de har undersøgt mikroplastik af typen PP, PS og PA, og således ville
de med stor sandynlighed have fundet endnu flere partikler, hvis de havde medtaget andre typer
af mikroplastik, specielt med udgangspunkt i fibre fra tøjvask.
Da det kun er lykkedes at finde ét andet studie, der har beskæftiget sig med mikroplastik i
spildevandsslam i den størrelsesordenen, som vi har har fundet, er det vanskeligt at vurdere,
hvorvidt vores resultater er repræsentative for spildevandsslam og biogødning generelt i forhold
til mikroplastik i denne størrelse. Det er ikke muligt at konkludere noget ud fra vores resultater
alene, da vi kun har talt mikroplastik i to prøver af biogødningen, der begge kommer fra samme
rensningsanlæg. Vi kan dog konstatere, at mikroplastik er til stede i biogødningen i vores forsøg,
og at det stemmer overens med de få andre studier der som nævnt findes på området.
62
7.3 Toksicitetsforsøg
7.3.1 Fluoranthen til toksicitetsforsøg
Til vores toksicitetsforsøg valgte vi fluoranthen som repræsentativ PAH på baggrund af, at det var
dén PAH med højest koncentration i en prøve med biogødning fra Holbæk forsyning. Således er
den ikke valgt på baggrund af PAH koncentrationer generelt i biogødning, da vi kun har taget
udgangspunkt i én prøve, og kun har haft mulighed for at teste én PAH i kombination med
mikroplastik inden for projektets tidsramme. Indholdet af PAH i biogødning kan variere over tid,
hvilket også er grunden til, at koncentrationen til stadighed skal overvåges ved løbende kontrol
jævnfør slambekendtgørelsen (Miljøministeriet, 2006). Det er altså ikke givet, at det altid er
fluoranthen, der har den højeste koncentration i biogødningen. Der er nogle usikkerheder ved kun
at anvende én PAH til toksicitetsbestemmelser, da det er muligt, at der er andre effekter ved
kombination af flere typer PAH, eller at andre PAH’er interagerer anderledes med mikroplastik. Vi
er dog under vores litteratursøgning stødt på adskillige andre økotoksikologiske studier, hvor
fluoranthen er anvendt – eksempelvis Ma et al. (2012), Ma et al. (1995) og Nam et al. (2015). Ma
et al. (1995) undersøgte hvorvidt regnorme af Lumbricus rubellus kunne bioakkumulere
fluoranthen fra jord med en nominel koncentration på 100 µg/g jord. Deres studie viste, at
ormene bioakkumulerede fluoranthen og at det blev øget hvis de blev sultet, men de kom ikke
nærmere ind på effekterne heraf. Ma et al. (2012) viste med deres studie af Eisenia fetida, at
ormene akkumulerede fluoranthen via tarmene, og således optog de det primært fra indtagelse
med jordpartikler. De viste desuden at koncentrationen af fluoranthen i jorden faldt relativt meget
(27 %) i løbet af de første 25 dage, hvorefter bioakkumuleringen hos E. fetida foregik
langsommere. De fandt desuden en korrelation mellem antioxidanter og akkumuleret fluoranthen,
således at enzymaktiviteten af antioxidanter overordnet blev lavere i takt med øget intercellulært
fluoranthenkoncentration. Da Ma et al. (2012) har målt mængden af antioxidanter i ormene, har
de i princippet målt ormenes respons på den øgede ROS-dannelse. Det er derfor nærliggende at
forestille sig, at ROS-dannelsen kunne være målt tidligere end de 25 dage, for eksempel ved
TBARS-analyse. Dette diskuteres nærmere i afsnit 7.3.7.
63
Nam et al. (2015) har i deres studie ikke kunnet påvise akutlethale toksiske effekter af fluoranthen
på regnormen E. fetida, før en koncentration på 1000 g/L acetone, der blev anvendt som
opløsningsmiddel ligesom i vores forsøg. Det er altså nærliggende at tænke, at fluoranthen heller
ikke umiddelbart har akut lethale toksiske effekter på E. hortensis, hvilket ændrer præmissen for
vores forsøg. Det er dog ikke direkte sammenligneligt, da Nam et al. (2015) har anvendt voksne
individer af regnorme. Vi har anvendt juvenile individer af E. hortensis, og det er ikke lykkedes for
os at finde studier, der har vist, hvilke effekter fluoranthen har på juvenile individer.Til gengæld
har Nam et al. (2015) vist, at E. fetida ved eksponering for fluoranthen, phenantren og fluoren
selektivt udtrykte et bestemt protein, og de foreslår derfor, at dette protein muligvis kan bruges
som biomarkør for tilstedeværelsen af de tre stoffer. Dette kunne muligvis være brugbart, hvis
man i fremtiden ønsker at teste effekten af fluoranthen og mikroplastik i kombination.
7.3.2 Mikroplastik til toksicitetsforsøg
I vores toksicitetsforsøg anvendte vi ca. 5100 mikroplastpartikler pr. g. jord (tørvægt). Denne
mængde blev udvalgt på baggrund af vores kvantificering af mikroplastik i biogødning fra Holbæk
Forsyning (se afsnit 6.1 for resultater). Som det fremgår af afsnit 5.2.2.5, valgte vi at overføre
mikroplastik til prøverne ud fra vægt.
I forhold til optælling af sekundær mikroplastik, måtte vi derfor optimere en metode, ved at
adskille fibrene i en ethanolopløsning og udtage stikprøver der blev optalt. Vi har således ikke talt
alle partikler i de to afvejede prøver. Det havde været en fordel, hvis vi havde optalt mindst tre
replikater, for at få en mere sikker relation mellem antal og vægt. Trac (2015) havde netop tre
replikater, hvor han fandt relationen mellem antal partikler af primær mikroplastik og vægt ved
coulter counter, hvor relationen tilnærmelsesvis var lineær. Da der er tale om en bestemt type af
primære plastikpartikler, og at den sekundære mikroplastik er lavet i vores eget laboratorium, er
det ikke relevant at søge i den foreliggende litteratur efter data. Det er i stedet nødvendigt at tælle
begge typer plastik mange flere gange, så vi i fremtiden får et mere præcist antal partikler pr gram.
Desuden er det nødvendigt at optimere fremstillingsmetoden for de sekundære mikroplastfibre,
så de i højere grad bliver ensartede i størrelse. Det er desuden også meget tidskrævende at klippe
en tilstrækkelig mængde af fibre, sådan som vi har gjort i vores metode. Derfor er det relevant at
overveje at opsamle fibre fra tøjvask, da det må forventes at en stor del af de fibre der findes i
64
biogødning stammer herfra, og da de samtidig må forventes at være mere ensartet i størrelsen,
som vi så i biogødningen.
7.3.3 Modelorganisme til toksicitetsforsøg
Til vores toksicitetsforsøg har vi anvendt regnormen E. hortensis, da vi ønskede at relatere vores
resultater til forhold på landbrugsjorde, hvor biogødning udspredes. Da det ikke er muligt at teste
effekter på samtlige organismer og funktioner i det terrestriske miljø, er det nødvendigt at
udvælge en repræsentativ modelorganisme. Jensen (2011) beskriver således, at det vil være
relevant at vælge en terrestrisk invertebrat eller mikroorganisme, som eksempelvis regnorme eller
springhaler, og det er studier med disse modelorganismer der blandt andet ligger til grund for
fastsættelsen af danske grænseværdier af PAHer i jorden. Vi valgte at bruge regnorm, da de er en
såkaldt økologisk nøgleart og spiller en stor rolle i forhold til eksempelvis jordforbedring (Walker et
al., 2006). Mange studier anvender Eisenia sp. som modelorganisme, og specielt E. fetida, da den
er let at håndtere i kulturer (Walker et al., 2006; Das Gupta et al., 2011; Nyholm et al., 2010).
Dermed kan vores forsøg i en vis udstrækning sammenlignes med andre økotoks ikologiske studier,
hvor disse typer regnorme benyttes. For at være direkte sammenlignelige kunne vi have valgt at
teste forsøgene med E. fetida i stedet for E. hortensis, men det ville have været mere vanskeligt
for os at skaffe dem, og da de tilhører samme slægt, må vi formode at de har mange fællestræk.
Til gengæld findes Eisenia-arter ikke som hjemhørende arter i Danmark, og derfor er den ikke
direkte sammenlignelig med de fleste arter af regnorme på landbrugsjorde. Mange danske arter
hører dog til samme familie som Eisenia - Lumbricidae - og der er derfor også mange fællestræk
(Andersen, 1983). Eisenia-arter kræver typisk en højere temperatur, end der findes på
landbrugsjorde året rundt (Walker et al, 2006). Det er dog vores antagelse, at det ikke har nogen
betydning for effekterne af mikroplastik og at vores resultater stadig kan overføres til andre
slægter af regnorme. Dog kan valget af regnormeart have betydning for, hvordan man fodrer sine
modelorganismer, da visse arter af regnorme ikke søger føde på jordoverfladen, men i stedet kun
fouragerer i det øverste jordlag (Andersen, 1983). E. hortensis søger også føde på jordoverfladen,
og vi valgte derfor at fodre dem der, og dermed i så høj grad som muligt undgå at forstyrre
prøvejorden unødigt og dermed stresse ormene. For at maksimere regnormenes eksponering for
mikroplastik og fluoranthen, kunne man vælge at forsøge at spike den føde, som prøverne tilføres,
65
i stedet for jorden. Hvis maden er spiket, er det muligt, at regnormene i højere grad vil optage
stofferne, idet de aktivt vælger at spise føden, men ikke jorden. Dette ville dog betyde, at ikke al
fluoranthen og mikroplastik ville være i jorden fra starten, idet føden ifølge OECD-vejledningen
skal tilføres hver 7. dag. Samtidig ville ormene kun blive eksponeret, når de s øger op mod
overfladen for at spise, og dermed være uden for eksponering, når de ligger nedgravet i OECDjorden. Dette kunne tænkes at påvirke resultatet. Det er ikke lykkedes at finde eksempler på
undersøgelser, der minder om vores, hvor man har valgt at spike fødeemner i stedet for jord.
Jensen (2011) nævner dog i sin rapport til Miljøstyrelsen eksempler på PAH-toksicitetsforsøg med
bænkebidere, hvor individerne er blevet eksponeret for PAH gennem føden. Disse forsøg tydede
på en lille effekt på væksten, men havde ingen effekt på overlevelse eller reproduktion. Jensen
(2011) påpeger, at effekterne af PAH på terrestriske isopoder generelt viser en faktor 1000 lavere,
når der eksponeres via føden i forhold til eksponering via jorden med andre modelorganismer, og
derfor anbefaler han at eksponere via jorden, da han ikke mener, at eksempelvis bænkebidere
skulle være 1000 gange mindre følsomme i forhold til regnorme. Der er dog ifølge Jensen (2011)
ikke nogen entydig forklaring på denne forskel. Hvis man ønkser at undersøge worst casescenarier, er det derfor ifølge Jensens beskrivelse relevant at eksponere modelorganismen for PAH
gennem jorden i stedet for gennem føden.
7.3.4 Forsøgsdesign
Vores generelle forsøgsdesign kunne med fordel forbedres i forbindelse med et eventuelt
fremtidigt eksperiment. Først og fremmest oplevede vi, at ormene stak af fra prøveglassene, som
var dækket med stanniol og parafilm. Det vil altså være optimalt at finde en anden type beholder
til fremtidige forsøg, eventuelt med fast låg, hvori der er lagt en membran, så luftcirkulering sikres.
Det kan nok ikke helt undgås, at nogle regnorme eventuelt vil forsøge at kravle op ad jorden, og
dermed undgå at blive udsat for behandlingerne i jorden. Men så længe regnormene forblev i
deres prøveglas, vurderede vi, at de stadig benyttes til senere analyse. Det er dog muligt, at de ved
at undgå at grave sig ned i jorden ikke har været eksponeret for mikroplastik og fluoranthen i
samme grad, som de orme, der blev i jorden, hvilket potentielt kan have påvirket resultatet.
Derimod havde de undslupne orme i vores forsøg den konsekvens, at hele replikater måtte udgå af
resultatbehandlingen, da vi ikke kunne skelne de individuelle orme i replikatet og derfor ikke
66
vidste, hvilken orm, vi havde mistet ud af de fire orme i et replikat. Dette betød, at det ikke var
muligt at korrigere for den tabte orm. Da vi kun havde tre replikater for hver behandling, er der
altså nogle behandlinger, hvor der i praksis kun er medtaget to replikater i databehandlingen.
Dette er ikke nok til at kunne behandle dataene statistisk, og få et signifikant resultat. Derfor ville
det have været bedre at anvende flere replikater i hver behandling og dermed sikre det statistiske
grundlag, selvom et eller flere replikater måtte udgå. En anden mulighed kunne også være at
anvende færre orme i hvert replikat, måske endda kun en orm i hvert. Dette blev gjort af en anden
projektgruppe på RUC, der lavede forsøg parallelt med os (Nielsen et al., 2015). Fordelen ved dette
er, at der på trods af flere replikater, stadig er et begrænset antal orme, hvorfor arbejdsbyrden i
form af dataindsamling af billeder og vægtmålinger ikke øges. Dermed vil det have mindre
betydning for den statistiske analyse, hvis en orm stikker af, da der er flere replikater. Det kan også
give mulighed for at undersøge, hvorvidt størrelsen på regnorme har betydning for, hvilke
regnorme der stikker af. Vi har ikke fundet studier om regnormenes sociale mønstre, men vi
observerede, at de ofte lå sammen, og det kunne muligvis have en betydning hvis man kun har én
orm i hvert replikat. Det er dog uvist, hvilken konkret effekt dette kunne tænkes at have.
Ulempen ved kun at have én orm i hvert replikat er, at der kommer større usikkerhed i forbindelse
med håndteringen af behandlingerne, da det i stedet bliver en såkaldt “destructive sampling”.
Dette burde dog ikke være et problem, hvis man er omhyggelig med prøverne og i øvrigt har
mange replikater (Annemette Palmqvist, PK 2015).
Sidst, men ikke mindst, valgte vi under forsøgene kun at dække prøveglassene, som indeholdte
fluoranthen og acetone, med stanniol. Dette er en fejlkilde i sig selv, da vi ikke har håndteret alle
prøver ens, og derfor i praksis har indført en ekstra variabel. Dette betyder reelt set, at det
egentlig ikke er korrekt at sammenligne alle prøver på tværs. I stedet burde vi sammenligne dem,
som har været dækket af stanniol for sig og dem uden stanniol for sig. Hvis man ønskede at
undersøge, om der kunne være en effekt, når flouranthenbehandlingerne med og uden
mikroplastik samtidig blev udsat for lys, kunne man have valgt at lave et dobbelt testsæt, hvor det
ene sæt af eksempelvis fem replikater af de 13 behandlinger blev udsat for lys og det andet sæt af
fem replikater af 13 behandlinger blev dækket med stanniol. Ved at analysere disse data med en
tovejs-ANOVA, som kan sammenligne data baseret på to forskellige variabler (her behandling og
lys/mørke) (Fowler et al., 1998), ville det være muligt at undersøge, om lysets påvirkning af
67
behandlingerne kunne have en effekt. Dette ville dog i det beskrevne tilfælde give i alt 130
prøveglas, hvilket er langt mere, end vi med rimelighed har kunnet beskæftige os med indenfor
dette projekts tidsramme.
Ved spiking af OECD-jorden i de enkelte behandlinger var der flere steder, hvor vores valgte
procedure kunne ændres og potentielt forbedres. Vi brugte nominelle koncentrationer af
fluoranthen og mikroplastik i vores spikede behandlinger, og målte således ikke de reelle
koncentrationer i de endelige prøveglas med spiket jord og øvrig jord. Dette medfører en vis
usikkerhed, da vi ikke kan være sikre på, at mikroplastik og fluoranthen er ligeligt fordelt i de tre
replikater, eller hvor meget, der er gået tabt under overførslen.
7.3.5 Adfærdsændringer
Under selve toksicitetsforsøget observerede vi en række forskellige adfærdsændringer. Vi havde
på forhånd forsøgt at gøre os nogle tanker om, hvilke mulige adfærdsændringer, vi kunne
forvente. På baggrund af disse overvejelser valgte vi at foretage en kvantitativ undersøgelse af
regnormenes nedgravningsadfærd, ved forsøgets start. Det kunne potentielt vise om der var
behandlinger i vores forsøg, som de forsøgte at undgå ved ikke at grave sig ned, da regnormes
naturlige adfærd er at grave sig ned så hurtigt som muligt (ISO, 2011).
Vi observerede, som det fremgår af afsnit 6.3.1, kun en enkelt adfærdsændring i form af
manglende nedgravning inden for 15 minutter. I dette tilfælde var der tale om en enkelt orm i ét
replikat fra behandlingen K+. Vi havde dog noteret under forsøget, at jorden i lige præcis K+
virkede meget fugtig i forhold til jorden i de andre prøver. Det er derfor muligt, at vi har lavet en
fejl ved tilføjelse af vand, og at ormen derfor har forsøgt at undgå jorden, hvis den har været for
våd.
Under selve forsøget noterede vi andre ikke-kvantificerbare observationer. Vi observerede at flere
af ormene, under forsøget, kravlede op af jorden og lagde sig enten mellem parafilm og stanniol,
eller kravlede helt ud mellem prøveglas og stanniol. Vi noterede også spor og afføring på
parafilmen, både på over og undersiden. Andre orme havde held med at undslippe helt, og endte
på rullebordet, som prøverne stod på, hvor vi fandt dem døde og udtørrede. Det er værd at
bemærke, at adfærdsændringerne primært foregik indenfor den første uge af vores forsøg. Disse
68
adfærdsændringer, hvor orme undgår behandlingen og stikker af, er også set hos Besseling et al.
(2012), som undersøgte mikroplastiks effekt på sandormen Arenicola marina. De fandt, at
sandorme, der stak af fra prøverne, havde mere plastik i tarmene end de sandorm, som blev
tilbage. Til gengæld var det muligt at genfinde mikroplastik i afføringen fra de tilbageværende
sandorm. Det tyder altså på, at der sker en form for tilpasning blandt ormene, hvor de orme, som
er i stand til at udskille mikroplastik, bliver tilbage, mens de, der ikke kan, søger væk og i nogle
tilfælde dør. Det havde været interessant at undersøge tarmen hos de orme, der var stukket af fra
vores forsøg, for at se, om vi kunne se de samme tendenser, men på grund af ormenes tilstand var
dette ikke en mulighed.
De observerede resultater om adfærdsændringer, hvor regnormene forsøger at undgå jorden i
løbet af forsøget, kunne tyde på, at der ikke er optimale forhold i jorden, på trods af at vi ikke så
undvigeadfærden ved forsøgets start. Forskellen mellem dag 0-7 og dag 7-14 kunne muligvis
skyldes, at der er mere plads per orm i slutningen af forsøget. Dette kunne muligvis påvirke deres
adfærd. Ser man på resultaterne præsenteret i afsnit 6.3.1, er det dog tydeligt, at undvigeadfærd
ikke observeres i kontrolprøverne, heller ikke selvom der er fire orme til stede. Derudover lader
det ikke umiddelbart til, at adfærdsændringerne sker ved bestemte behandlinger i vores forsøg.
Dog ændrer det sig, hvis man ser på figur 14 (afsnit 6.3.1), hvor resultaterne er grupperede i
overordnede behandlinger - kontroller, mikroplastik, fluoranthen og mikroplastik+fluoranthen.
Her ses det, at de fleste adfærdsændringer i perioden 0-7 dage er sket i prøver, hvor der både har
været mikroplastik og fluoranthen til stede. Det er ikke muligt at komme med konklusioner på
baggrund af vores resultater, men i fremtiden kunne det være interessant at undersøge, hvorvidt
kombinationen af PAH og mikroplastik kan føre til adfærdsændringer hos E. hortensis.
7.3.6 E. hortensis vækst under toksicitetsforsøget
Udover de observerede adfærdsændringer ønskede vi at måle potentielle effekter af
behandlingerne i forhold til ormenes vækst. Vi havde derfor udvalgt orme til forsøget, i
nogenlunde samme størrelse, som endnu ikke var kønsmodne, idet vi antog, at de ville vokse
hurtigere end kønsmodne orme. Det havde selvfølgelig været optimalt at anvende orme med
samme alder til forsøgene, men dette var ikke muligt på grund af projektets tidsramme. Ifølge
Viljoen et al. (1991) er kokoner fra E. hortensis mellem 15 og 80 dage om at klække og har en lav
69
udklækningsrate. Da vi skulle bruge 160 orme til forsøget, ville det tage for lang tid at sikre, at der
var orme nok i samme alder til forsøget.
Resultaterne af regnormenes vækst viste, at der ikke var en signifikant forskel på væksten mellem
de 13 behandlinger, hverken i forbindelse med masseændringen eller rumfangsændringen. Det
kunne dog være interessant at efterprøve disse resultater, særlig ved højere koncentrationer af
fluoranthen og mikroplastik og med et større antal replikater. I forbindelse med opnåelsen af disse
data, var der flere steder hvor proceduren var problematisk. I forhold til måling af masse var det
nødvendigt at måle ormenes vægt i vådvægt, da de jo var levende. Inden vejning blev al jord
vasket af ormene i demineraliseret vand, og de blev duppet tørre på en papirserviet. På trods af at
denne procedure skulle bevirke at alle orme blev behandlet ens, kan det overvejes om der
alligevel ville være forskel på hvor våde de var ved vejning. Dermed kan det have påvirket
resultatet, da ormenes respektive vandoptag (eller -tab) ville give udslag i målingerne, der også
gav udsving afhængig af hvor længe ormene lå i petriskålen inden vægten blev noteret. Vi forsøgte
naturligvis at veje dem med det samme, og gøre det så ensartet som muligt, men der vil stadig
være en vis usikkerhed forbundet med denne metode. Samtidig var det problematisk, at vi har
anvendt orme af forskellig størrelse, da de jo har forskelligt overfladeareal og dermed kan optage
større eller mindre mængder vand, selvom proceduren er ens. Umiddelbart er det vores
vurdering, at anvendelsen af orme i forskellig størrelse og manglende konsistens ved udførelsen af
proceduren er de to steder, hvor det i denne sammenhæng er muligt at optimere forsøgets
fremgangsmåde. Det er sværere at ændre proceduren omkring fotografering af ormene i
forbindelse med rumfangsmålingerne. Vi oplevede under forsøget, at det var meget svært at få
ormene til at ligge stille. Samtidig gav billeder, hvor en orm strakte sig op mod kameraet,
usikkerhed på måling af rumfang, idet programmet ikke kunne tage forbehold for dette. Det var
også meget vigtigt at tage billedet direkte ovenfra og uden hældning på kameraet, da dette ellers
gav udfordringer i forhold til at kalibrere computerprogrammet til billedets proportioner. Det
havde været en god idé at anvende et fastlåst kamera i stedet for et håndholdt, da dette ville
eliminere problemer med kalibrering og give samme vinkel på billederne fra gang til gang.
70
7.3.7 ROS-dannelse hos E. hortensis
Fra starten var det vores mening at undersøge ROS-dannelse hos de eksponerede regnorme, både
efter 7 dage og efter 14 dage. ROS-dannelsen skulle efter planen måles som TBARS. Dette er en
hyppigt anvendt metode i mange sammenhænge; eksempelvis brugte Stepíc et al. (2012) TBARSmålinger til at bestemme oxidativt stress hos Almindelig Karpe (Caprinus carpio) under
eksponering for CdCl 2 og Vega-Lopez et al. (2013) påviste oxidativt stress hos phytoplankton, som
blev udsat for blandt andet fluoranthen ved målinger af TBARS og andre molekylære indikatorer.
Som beskrevet i afsnit 6.3.3 erfarede vi dog under forsøget, at vores kit til at analysere TBARS ikke
kunne bruges direkte på ormene. Ved at undersøge vejledninger fra andre lignende kit, fandt vi, at
man ved at behandle prøverne med heparin kan minimere interferensen fra hæmoglobin
(CellBioLabs, 2012). Desværre var vi på daværende tidspunkt for langt henne i forløbet til at kunne
nå at efterprøve det, og vi valgte derfor at prioritere analysen af fluoranthenoptaget. Det er dog
muligt at bruge TBARS selv på prøver, der indeholder en høj koncentration af hæmoglobin; det har
Yamaji et al. for eksempel gjort i et studie fra 2004, hvor oxidativt stress induceret af jern frigivet
fra transferrin brugt til behandling af nyresygdomme blev målt ud fra hepariniserede blodprøver
analyseret for TBARS. Det er derfor stadig en nærliggende mulighed at unders øge ROS-dannelsen
hos regnorm eksponeret for mikroplastik og fluoranthen i forhold til TBARS ved et eventuelt
fremtidigt forsøg, hvis man sørger for at behandle prøverne med heparin. Man bør dog være
opmærksom på, at der er visse ulemper ved metoden. Først og fremmest er testen ikke specifik,
idet flere forskellelige stoffer kan reagere med TBA og danne det farvede kompleks (Zeptometrix
Corporation, 2006). Det anbefales derfor også fra producenten af vores anvendte kit, at man
foretager en mere specifik analyse som HPLC, hvis man finder forhøjet TBARS-niveau ved analyse
med kittet (Zeptometrix Corporation, 2006).
Havde vi haft tid til at fuldføre forsøget inden for tidrammen, ville vi have forventet at se
ændringer i ROS-dannelsen hos regnormene, som det var tilfældet hos Ma et al. (2012). De
påviste, at regnormen E. fetida viste tegn på øget oxidativt stress i form af øget koncentration af
MDA, når de blev udsat for fluoranthen. Resultaterne var dog kun statistisk signifikante i forsøgets
første ti dage. Herefter var der ingen statistisk signifikant forskel, hvilket indikerer, at ormenes
antioxidantsystem var i stand til at modvirke den øgede mængde ROS over tid. Således kunne vi
71
muligvis forvente at se øget oxidativt stress i vores prøver fra 0-7 dage, mens denne effekt
muligvis ville være mindre ved prøverne fra 7-14 dage.
7.4 Fluoranthenoptag hos E. hortensis
Ved analysen af ormenes optag af fluoranthen med GC-MS var det ikke muligt at påvise
fluoranthen i vævet (se afsnit 6.4). Detektionsgrænsen på den GC, vi anvendte til analysen, lå på
10 µg/L (Knudsen, PK 2015). Da hele ormen blev ekstraheret i et samlet volumen acetonitril på 10
mL, ville det altså være nødvendigt at kunne ekstrahere mindst 3,33 ng fluoranthen fra ormen for
at kunne se det på GC-MS’en. I vores prøver med højeste koncentration havde vi maksimalt en
fluoranthenkoncentration på 3,84 ng/g jord, svarende til 230,4 ng fluoranthen per orm, hvis alle
orme optog lige meget og al fluoranthen blev optaget (se beregninger i bilag 8). Det er dog muligt,
at ormene ikke har optaget over de 3,33 ng, som var påkrævet for at nå over detektionsgrænsen. I
prøverne med lav fluoranthenkoncentration var der maksimalt 23,04 ng fluoranthen per orm, og
det var derfor meget usandsynligt at detektere eventuelt optaget fluoranthen fra disse
prøver. Det er derfor ikke muligt på baggrund af vores resultater at udtale sig om, hvorvidt
regnorme i højere grad optager fluoranthen, når der er mikroplastik til stede, idet vi ikke har
kunnet måle det ud fra vores forsøgsdesign og GC’ens detektionsgrænse.
Ma et al. (1995) undersøgte i deres studie bioakkumulering af fluoranthen hos regnorm af typen
Lumbricus rubellus. De udsatte ormene for en nominel fluoranthenkoncentration på 100 µg/g jord,
og målte effekten af forskellige fremgangsmåder på bioakkumuleringen af fluoranthen. I den del af
studiet, der mest minder om vores forsøg, blev ormene eksponeret for fluoranthen med fri adgang
til føde, og der blev udtaget prøver til analyse efter 14, 28, 42 og 56 dage. Analysen blev udført på
HPLC efter ekstrahering af prøverne med hexan. Efter 14 dage havde ormene i dette studie en
gennemsnitlig koncentration af fluoranthen i kroppen på ca. 17 µg/g vådvægt. Sammenligner vi
disse tal med vores forsøg, er det tydeligt at se, at selvom Ma et al. (1995) har anvendt en anden
fremgangsmåde, så er vores koncentrationer ikke i nærheden af de koncentrationer, som giver
udslag hos dem. Samtidig har Ma et al. (1995) i samme studie påvist, at graden af bioakkumulering
kan hænge sammen med fødetilgængeligheden, idet deres orme udviste langt større
bioakkumulering under forhold med manglende føde. De nævner, at det kan skyldes, at de graver
72
mere i deres søgen efter føde, og derfor indtager flere jordpartikler med fluoranthen. Til gengæld
har de i deres studie ikke valgt at bruge en standardjord, hvilket gør det sværere at sammenligne
deres resultater med andre studier. Ifølge deres resultater er det dog vigtigt at overveje, hvordan
man fodrer ormene i løbet af forsøget, som tidligere nævnt, idet det kan have stor betydning for
resultatet.
Udover optaget af fluoranthen er også vores vækstforsøg påvirket af den lave
fluoranthenkoncentration. Sverdrup et al. (2002) har undersøgt toksiciteten af fluoranthen på E.
hortensis (benævnt E. veneta i deres studie). Herunder bestemte de også NOEC for væksten af E.
hortensis, som de fik til at være 98 mg/kg jord (tørvægt). Da dette er betydeligt højere end vores
koncentration af fluoranthen i jorden, er det altså meget usandsynligt, at vi ville opnå en effekt på
ormenes vækst alene som følge af eksponering for fluoranthen. Det betyder også, at det kan være
meget sværere at spore kombinatoriske effekter mellem fluoranthen og mikroplastik, da den
mulige ekstra effekt ved kombinationsnsbehandlingen kan risikere at være meg et lille.
En anden ting, som er værd at overveje i forbindelse med et fremtidigt forsøg er den mad, ormene
havde i maven, da de blev udtaget til analyse. I vores tilfælde var det som sagt ikke muligt at
påvise fluoranthen i det hele taget, men ved en eventuel fremtidig analyse bør man overveje at
sulte ormene, inden de ekstraheres. På den måde vil man kunne tage højde for, at der potentielt
er fluoranthen i tarmen hos ormen, som er bundet til afføring og ikke bliver optaget i vævet. Det
er nødvendigt at kunne skelne de to ting, hvis man ønsker at undersøge, hvorvidt tilstedeværelsen
af mikroplastik øger eller nedsætter optaget af fluoranthen over tarmen - eller om det har en
effekt i det hele taget.
7.5 Biogødning i landbruget
I vores forsøg tog vi udgangspunkt i koncentration af fluoranthen og mikroplastik fra biogødning,
for at få mulighed for at relatere resultaterne til forhold på landbrugsjorde. Der er dog flere
problematikker forbundet med dette. For det første så anvendte vi koncentrationer af
mikroplastik som var baseret på en optælling ud fra en enkelt biogødningsprøve. Således er den
optalte koncentration af mikroplastik som tidligere nævnt ikke et udtryk for de generelle
koncentrationer af mikroplastik i biogødning. Dernæst er der i vores forsøg ikke taget højde for, at
biogødning, der spredes på landbrugsjord, fordeles og derefter blandes i forholdet 0,375-0,8 g
73
biogødning pr. kg. jord, jævnfør afsnit 5.1.1.2. Dermed bliver den potentielle koncentration af
mikroplastik i biogødning som nævnt i afsnit 5.1.1.2 mellem 1250 og 2667 gange lavere på
landbrugsjord end i vores prøver, hvis det antages, at mikroplastik udelukkende kommer fra
biogødning, og at mængden af mikroplastik i biogødningen generelt ligger på samme niveau som
det, vi har optalt. Det er dog relevant at benytte højere koncentrationer i toksicitetsforsøg, end
der er reelt findes in situ, da der således undersøges for “worst case” effekter. Dette fører til
overvejelser om de anvendte fluoranthenkoncentrationer i vores forsøg. Det var meningen, at de
skulle afspejle den koncentration, der findes i biogødning og ti gange over denne koncentration,
svarende til grænseværdien. Det var dog ikke sådan, prøverne endte med at blive. Derimod var
koncentrationen af fluoranthen, som nævnt, for lave til at det var muligt at måle optaget hos
regnormene. For at kunne sammenligne vores behandlinger direkte med biogødningen havde det
altså været nødvendigt at anvende højere koncentrationer. Det ville samtidig have givet en bedre
mulighed for at undersøge fluoranthenakkumuleringen, og dermed teste, om optaget ville være
anderledes, hvis der også var mikroplastik tilstede i jorden.
Contreras-Ramos et al. (2008) har i deres undersøgelse af optag af forskellige PAH’er vist, at E.
fetida ikke i særlig høj grad optager kontaminanterne fra jorden. Contreras -Ramos et al. (2008)
undersøgte E. fetidas akkumlering af phenantren, antrazen og benz[a]pyren i koncentrationer på
hhv. 100, 500 og 50 mg/kg. Orme blev udtaget til analyse efter 7, 14, 28, 56 og 70 dage. Deres
resultater viste, at ormene for phenantrens vedkommende efter syv dage havde optaget 17.7±8,3
µg/kg væv fra jord, der ikke var steriliseret inden forsøgets start, og 2,6±2,0 µg/kg væv fra jord, der
var steriliseret inden forsøget. For antrazen fandt de et optag på hhv. 4,3±2,9 µg/kg væv og
10,3±6,6 µg/kg væv i usteriliseret og steriliseret jord, og for benz[a]pyren fandt de 57±4 µg/kg væv
og 30±8 µg/kg væv i hhv. usteriliseret og steriliseret jord. Det er altså tydeligt ud fra deres
resultater, at ormene optager langt mindre PAH, end der er tilgængeligt i jorden.
74
8. Konklusion
I denne rapport har formålet været at undersøge, hvorvidt den type og sammensætning af
mikroplastik, som findes i biogødning, kunne have en akut effekt på E. hortensis i form af
undvigeadfærd, ændret vækst, overlevelse, ROS-dannelse og optag af fluoranthen fra OECD-jord.
Først og fremmest undersøgte vi, hvorvidt der var mikroplastik tilstede i den prøve af biogødning,
som blev stillet til rådighed fra Holbæk Forsyning. Vores optælling viste mellem ca. 5000-7600
mikroplastikpartikler pr gram biogødning (tørvægt, afvigelse hhv. 7,5 og 5,0 %), hvoraf hhv. 11 %
og 14 % var primær mikroplastik og resten fibre. Partikelstørrelsen var i omegnen af 100 µm for
primær mikroplastik og 0,25-1 mm for fibrene, men er ikke direkte målt i dette studie. Da vi kun
har foretaget to optællinger af 250 mg af biogødningsprøven, er der ikke lavet nogen statistiske
analyser på disse data. Men vi kan konkludere at der var mikroplastik til stede i prøven med
biogødning, selvom resultaterne ikke er et udtryk for det generelle antal af mikroplastikpartikler i
biogødning fra Holbæk Forsyning eller for biogødning generelt.
Vores toksicitetsforsøg viste ikke nogen tegn på ændringer i overlevelse og vækst ved de 11
behandlinger med mikroplastik og fluoranthen i forskellige kombinationer i forhold til de to
kontroller og hinanden. Der var ingen signifikant forskel i væksten mellem behandlingerne ved
ANOVA og Kruskal-Wallis-Test, og der var ingen orme der døde i behandlingen. Det er værd at
bemærke, at vi i forsøget har anvendt meget lave koncentrationer af fluoranthen, og at det derfor
er nødvendigt at foretage yderligere undersøgelser for at fastlægge, om der kan være
kombinatoriske effekter ved højere koncentrationer.
Vi ønskede oprindelig at undersøge dannelsen af reaktive oxygenarter (ROS) hos ormene ved de
forskellige behandlinger ved hjælp af en TBARS-analyse. Dette lod sig dog ikke gøre, idet
hæmoglobin fra vævet forstyrrede vores resultater. Vi blev senere klar over, at vævet kunne
behandles med heparin, og derefter indgå i analysen uden forstyrrelser, men af tidsmæssige
årsager var det ikke muligt at udføre i dette projekt.
Undersøgelsen af potentielle ændringer i fluoranthenoptag som følge af de forskellige
kombinatoriske behandlinger gav ikke nogen brugbare resultater. Dette skyldtes, at vi havde lavet
en fejl i beregning af fluoranthenkoncentrationen i prøverne, og at forsøget derfor blev kørt med
75
meget lavere koncentrationer af fluoranthen (0,38 ng/g og 3,8 ng/g) end vi oprindeligt havde til
hensigt (3 µg/g og 30 µg/g). Dette betyder, at vi ikke kan konkludere, om det manglende udslag på
GC-målingen skyldes, at fluoranthen slet ikke optages, eller om det skyldes den lave
tilgængelighed, og at den optagne mængde derfor ligger under GC’ens detektionsgrænse. Det er
altså nødvendigt at lave yderligere undersøgelser for at kunne udtale sig om tilstedeværelsen af
mikroplastiks effekt på optag af miljøfremmede stoffer.
Under selve forsøget observerede vi en række forskellige adfærdsændringer hos ormene; nogle
orme stak helt af fra prøverne, andre gravede sig fri af jorden og lagde sig mellem parafilm og
stanniol, og i nogle tilfælde blev der observeret ormeafføring oven på parafilmen, hvor ormen i
disse tilfældehavde gravet sig ned i jorden igen. Der er en tendens til at adfærdsændringer
forekommer ved behandling af en kombination af mikroplastik og fluoranthen, da der overordnet
set var 6 ud af 9 observationer i prøver med denne kombination. Overordnet tyder resultaterne
på, at ormene er i stand til at tilpasse sig de nye forhold inden for en relativt kort tidsperiode, da
adfærdsændringer hovedsageligt observeres indenfor 0-7 dage. Det er ikke muligt at sige, om
observationerne er tilfældige, men andre studier har vist lignende resultat med mikroplastik i
sediment. Det kunne derfor være interessant at undersøge ændringer i adfærd som følge af
tilstedeværelse af mikroplastik nærmere i et fremtidigt forsøg.
Sammenfattende kan det altså konkluderes, at forsøgene har vist, at der ikke var nogen akut
effekt i form af ændret vækst, overlevelse eller umiddelbar undvigeadfærd hos E. hortensis ved de
forskellige behandlinger. Således var der ingen forskel på, om ormene blev udsat for primær
mikroplastik eller sekundær mikroplastikfibre. Ligeledes blev der ikke påvist nogen effekt ved en
kombination af disse typer af mikroplastik. Det var ikke muligt at få data om ROS-dannelse
indenfor projektets tidsramme. Ormenes optag af fluoranthen viste sig at være for lavt til at måle
med GC/MS, og derfor kan der ikke konkluderes noget om mikroplastiks effekt på optaget af
fluoranthen.
76
9. Perspektivering
Udarbejdelsen af denne rapport har givet indsigt i de udfordringer, der ligger i at detektere og
kvantificere mikroplastik i biogødning. Det mangler generelt en standardiseret metode til
oprensning og karakterisering af mikroplastik, både i terrestrisk og marint miljø.
Denne rapport har haft til formål at undersøge mulige akutte effekter ved mikroplastik i terrestrisk
miljø, men da dette forskningsfelt er relativt nyt, vil det være oplagt at lave flere grundige
analyser. Dette gælder både korttidseffekter, men især vil det også være relevant at undersøge
langtidseffekter. Ved at øge forsøgsperioden kunne der, udover vækst og dødelighed, også
undersøges for reproduktionsevne.
Det vil være oplagt stadig at bruge regnorme som modelorganisme, da de som beskrevet i
rapporten er en vigtig art i forhold til jordkvalitet. Nye forsøgsdesign bør efter vores vurdering
bestå af langt flere individer. Hvis der eksempelvis er 20-30 individer i hver behandling og flere
replikater, vil det give mulighed for en større statistisk sikkerhed. Forsøgene bør også designes, så
de bliver så flugtsikre som muligt, for at undgå at regnormene stikker af. Derudover kunne det
være optimalt at bruge nyklækkede regnorme, der med sikkerhed havde samme alder.
Det kunne være interessant at undersøge, hvorvidt regnormene optager mikroplastik, hvor meget
de optager, om der er forskel på optag af primær og sekundær mikroplastik og hvilke effekter det
kan have på molekylærbiologisk niveau. Herunder ville ROS-dannelse netop være en parameter,
som ville være oplagt at få undersøgt. Man kunne også forsøge med højere koncentrationer af
både mikroplastik alene og i kombination med miljøfremmede stoffer, og gerne i højere
koncentrationer end dem, som er anvendt med fluoranthen i dette forsøg. Det kunne desuden
være interessant at undersøge adfærdsændringer hos regnorme i løbet af den første uge, og se
om der forekommer en undvigeadfærd, da vores forsøg peger på, at det muligvis sker, specielt ved
en kombinationsbehandling af mikroplastik og et miljøfremmed stof. Alt i alt er der stadig meget
at lære om dette emne, og vi håber, at vores forsøg på at udarbejde en metode kan danne
præcedens for kommende projektgrupper, der kunne have lyst til at arbejde med emnet.
77
10. Litteratur
Andersen C. (1983). Regnormene & os. Forlaget ASK.
Andrady A. L. (2011): Microplastics in the marine environment. Marine pollution Bulletin 62, s.
1696-1605.
Annemette Palmqvist (2015). Personlig korrespondance. Lektor i Miljøbiologi og Environmental
Risk, ENSPAC, Roskilde Universitet.
Besseling E., Wegner A., Foekema E. M., Heuvel-Greve M. J. og Koelmans A. A. (2012): Effects of
microplastic on Fitness and PCB Bioaccumulation by the Lugworm Arrenicola marina (L.). American
Chemical Society (ACS) publica.tions, Environmental Science & Technologoy vol 47, s. 593-600.
Betteridge (2000): What Is Oxidative Stress? Metabolism, 49 (2), supplement 1, s. 3-8.
BGORJ (2015): Biogødning og biokompost. Tilgængeligt online 16. juni 2015 kl 14.40:
http://bgorj.dk/Nyheder/2015/Hvad_er_Biogoedning.aspx
Bresciani J. & Frandsen F. (1994): Invertebrat zoologi. Jordbrugsforlaget, 5. udgave, København, s.
323-366.
Brown P. J., Long S. M., Spurgeon D. J., Svendes C. og Hankard P. K. (2004): Toxicological and
biochemical responses of the earthworm Lumbricus rubellus to pyrene, a non-ca.rcinogenic
polycyclic aromatic hydroca.rbon. Chemosphere 57, s. 1675-1681.
Browne M. A., Niven S. J., Galloway T. S., Rowland S. J. og Thompson R. C. (2013): Microplastic
Moves Pollutants and Additives to Worms, Reducing Functions Linked to Health and Biodiversity.
Current biology 23, s. 2388-2392.
Brusca. R. C & Brusca. G. J. (2003): Invertebrates. Sinauer Associates, Inc, 2. Udgave, kapitel 13 s.
387-554. Sunderland
78
CellBioLabs (2012): Product Manual: OxiSelect™ TBARS Assay Kit (MDA Quantitation). Tilgængelig
online d. 25. Juni 2015 på http://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-330-tbars-assaykit.pdf
Cole M., Lindeque P, Halsband C. og Galloway T. S. (2011). Microplastics as contaminants in the
marine environment: A review. Marine pollution bulletin 62, s. 2588-2597.
Contreras-Ramos S. M., Álvarez-Bernal D. og Dendooven L. (2009): Charateristics of Earthworms
(Eisenia fetida) in PAHs Contaminated Soil Amended With Sewage Sludge or Vermicompost.
Applied Soil Ecology, 41, s. 269-276.
Curry J. P. (1994): Grassland invertebrates; Ecology, influence on soil fertility and effects on plant
growth- Chapmann & Hall, London. Kapitel 2, s. 45-55.
Das Gupta, Chakravorty og Kaviraj (2011): Susceptibility of epigeic earthworm Eisenia fetida to
agricultural application of six insecticides. Chemosphere, 84, s. 724-726.
Edwards C. A. & Lofty J. R. (1977): Biology of earthworms, 2 nd edition, Chapman and Hall, London.
Eom I. C., Rast C., Veber A. M. og Vasseur P. (2007): Ecotoxicity of a polycyclic aromatic
hydrocarbon(PAH)-contaminated soil. Ecotoxicology and environmental safety 67, s. 190-205.
Eriksen M., Lebreton L. C. M., Carson H. S., Thiel M., Moore C. J., Borerro J. C., Galgani F., Ryan P.
G. og Reisser J. (2014): Plastic Pollution in the World´s Oceans: More than 5 trillion plastic pieces
weighing over 250,000 tons afloat at sea. PLoS ONE, 9 (12): e111913.doi:10.1371/journal.pone0111913.
Fuller-Espiree S.L., Nasca.relli T., Blake E.L. og Bearoff F.M. (2010): The effect of oxidative stress on
phagocytosis and apoptosis in the earthworm Eisenia hortensis. ISJ 7, s. 89-106.
Fowler J., Cohen L. og Jarvis P. (1998): Practical Statistics for Field Biology. Wiley, 2nd ed.
Holfor (2014): Holbæk forsyning. Affald, vand, spildevand, varme. Ydelser, regler og
klagevejledning. Tilgængelig online 10. juni 2015: http://www.holfor.dk/
79
Habib D., Locke D.C., Cannone L.J. (1998): Synthetic fibres as indicators of municipal sewage
sludge, sludge products, and sewage treatment plant effluents. Water, Air, and Soil Pollution, 103
(1-4), s. 1-8.
ISO (2012): Soil quality -- Avoidance test for determining the quality of soils and effects of
chemicals on behaviour -- Part 1: Test with earthworms (Eisenia fetida and Eisenia andrei). ISO
17512-1:2008, tilgængelig online d. 25. juni 2015 på
http://www.iso.org/iso/home/store/catalogue_tc/catalogue_detail.htm?csnumber=38402
Jensen, J.(2011): Økotoksikologiske jordkvalitetskriterier for PAH. Miljøstyrelsen, Miljøprojekt nr.
1394.
Jensen, J. (2015). Personlig kommunikation. Ansat ved Holbæk forsyning.
Knudsen, T. B. (2015). Personlig kommunikation. Tilknyttet videnskabelig konsulent ved ENSPAC
på Roskilde Universitet.
Landbrug & Fødevarer (2013): Landbrugsproduktion; Fakta om erhvervet 2013.
Leslie H. A., Velzen M. J. M og Vethaak A. D. (2013): Microplastic survey of the Dutch environment.
Novel data set of microplastics in North Sea sediments, treated wastewater effluents a nd marine
biota. IVM Institute for Environmental Studies
Nielsen P. K. F, Læssøe C. D., Boesen E., Hansen M. J. og Ottosen E. K. (2015): Effekten af
mikroplastik i interaktion med kobber på væksten og nedgravningsadfærden af regnormen E.
veneta. Naturvidenskabeligt Bachelorstudium, Roskilde Universitet. Tilgængelig online:
http://oatd.org/oatd/search?q=id%3A%22oai%3Arudar.ruc.dk%3A1800%2F23421%22
Ma W-C., Immerzeel J. og Bodt J. (1995): Earthworm and food interactions on bioaccumulation
and disappearance in soil of polycyclic aromatic hydrocarbons: studies on phenanthrene and
fluoranthene. Ecotoxicology and Environmental Safety, 32 (3), s. 226-232
80
Ma L. L., Ma C., Shi Z. M., Li W. M., Xu L., Hu F. og Li H. X. (2012): Effects of fluoranthene on the
growth, bioavailability and anti-oxidant system of Eisenia fetida during the ageing process.
European journal of soil biology 50, s. 21-27.
Magnusson K. & Norén F. (2014): Sreening of microplastic particles in and down-stream a
wastewater treatment plant. Sampling of mikroplastic litter particles in a waste water treatment
plant and in the water recipient outside the mouth of the waste water effluent tube. IVL Swedish
environmental research institute, rapport C, 55.
Miljøministeriet (2006). Bekendtgørelse om anvendelse af affald til jordbrugsformål
(Slambekendtgørelsen). https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=13056
Miljøstyrelsen (2009): Spildevandsslam fra kommunale og private renseanlæg i 2005. Orientering
fra Miljøstyrelsen, nr. 3, Miljøministeriet.
Miljøstyrelsen (2013a). Notat til Miljøudvalget 2013-14. MTU Alm. del Bilag 112. Miljøministeriet,
Jord & Affald. http://www.ft.dk/samling/20131/almdel/miu/bilag/112/1313820/index.htm
Miljøstyrelsen (2013b). Ressourcestrategien Danmark uden affald 2013. Miljøministeriet.
http://mst.dk/media/mst/Attachments/Ressourcestrategi_DK_web.pdf
Mintenig S., Löder M og Gerdts G. (2014): Mikroplastik in ausgewählten Kläranlagen des
Oldenburgisch- Ostfriesischen waterverbandes ( OOWV) in Niedersachsen.
Nam, T.-H., Jeon, H.-J., Mo, H.-H., Cho, K., Ok, Y.-S. og Lee, S.-E. (2015): Determination of
biomarkers for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) toxicity to earthworm (Eisenia fetida).
Environmental Geochemistry & Health, udgivet online forud for publicering, april 2015.
NaturErhvervsstyrelsen (2014): Danmarks salg af handelsgødning 2012/2013. Ministeriet for
Fødevarer, Landbrug og Fiskeri, København.
http://naturerhverv.dk/fileadmin/user_upload/NaturErhverv/Filer/Landbrug/Handelsgoedning/Da
nmarks_salg_af_handelsgoedning_2012_2013.pdf
81
NaturErhvervsstyrelsen (2015): Optimeret brug af fosfor fra restprodukter kan reducere dansk
import af gødningsfosfor med to tredjedele. http://naturerhverv.dk/tvaergaaende/gudp/gudpprojekter/2013/optimeret-brug-af-fosfor-fra-restprodukter-kan-reducere-dansk-import-afgoedningsfosfor-med-to-tredjedele/
Naturstyrelsen (2014): Opdatering af nøgletal for miljøfarlige forurenende stoffer i spildevand fra
renseanlæg – på baggrund af data fra det nationale overvågningsprogram for punktkilder 19982012. Naturstyrelsen, Miljøministeriet København.
Nyholm J.R., Asamoah R.K., van der Wal L., Danielsson C. og Anderson P.L. (2010): Accumulation of
Polybrominated Diphenyl Ethers, Hexabromobenzene, and 1,2-Dibromo-4-(1,2-dibromoethyl)cyclohexane in Earthworm (Eisenia fetida). Effects of Soil Type and Ageing. Environmental Science
& Technology, 44, s. 9189-9194.
OECD (2004): OECD Guideline for the testing of chemicals. Earthworm reproduction test (Eisenia
fetida/Eisenia andrei). OECD/OCDE nr. 222.
Olesen E. E. (2010): Slam er gavnlig på landbrugsjord. Teknik & Miljø, nr 11, årgang 100, s. 54-55.
Olesen E. E. (2015): Personlig kommunikation. Miljøfaglig konsulent for Hededanmark:
http://www.hededanmark.dk/
Plastics Europe (2015): Plastics – The facts 2014/2015. An analysis of European plastics production,
demand and waste data. Beligien.
Rillig M. (2012). Microplastic in Terrestrial Ecosystems and the soil. American Chemical Society, 46,
s. 6453-6454.
Rocha-Santos T. & Duarte A. C. (2015). A critical overview of the analytical approaches to
occurrence, the fate and the behavior of microplastics in the environment. Trends i n Analytical
Chemistry 65, s. 47-53.
Self R.F.L., Jumars P.A. (1978): New ressource axes for deposit feeders? Journal of Marine
Research. 36, 627-641
82
Stepid, S., Hackenberger, B., Hackenberger, D., Velki, M., & Lončarid, Ž. (2012): Impact of Oxidative
Stress Indicated by Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) and Protein Carbonyl Levels
(PC) on Ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) Induction in Common Carp ( Cyprinus carpio).
Water, Air & Soil Pollution, Vol. 223 Issue 8, p. 47-85
Sul J. A. I. & Costa M. F. (2014): Review; The present and the future of microplastic in the marine
environment. Environment pollution, vol 185, s. 352-364.
Sverdrup L.E., Krogh P.H., Nielsen T. og Stenersen J. (2002): Relative sensitivity of three terrestrial
invertebrate tests to polycyclic aromatic hydrocarbons. Environmental Toxicology and Chemistry,
21 (9), s.1927-33
Syberg K., Khan F.R., Selck H., Palmqvist A., Banta G. T., Daley J., Sano L. & Duhaime M.B. (2015):
Microplastics: Addressing Ecological Risk Through Lessons Learned. Environmental Toxicology and
Chemistry, Published online, DOI: 10.1002/etc.2914
Teuten E. L., Saquing J. M., Knappe D. R. U., Barlaz M. A., Jonsson S., Björn A., Rowland S. J.,
Thopson R. C. Galloway T. S., Yamashita R., Ochi D., Watanuki Y., Moorre C.m Viet P. H., Tana T. S.,
Prudente M., Boonyatumanond R., Zakaria M. P., Akkhavong K., Ogata Y., Hirai H., Iwasa S.,
Mizukawa K., Hagiani Y., Imamura A., Saha M. og Takada H. (2009): Transport and release of
chemicals from plastics to the environment and to wildlife. Philosophical Transport of the Royal
Society B., vol. 364, s. 2027-2045.
Thygesen H. (2005): Personlig kommunikation. Driftsleder for Holbæk forsyning: www.holfor.dk.
Trac N.L. (2015): Personlig korrespondance. Roskilde Universitet.
Van Cauwenbergh L., Vanreusen A., Mees J. og Janssen C., R. (2013): Microplastic pollution in
deep-sea sediments. Envrionmental pollution 182, s. 495-499.
Vega-López, A., Ayala-López, G., Posadas-Espadas, B. P., Olivares-Rubio, H. F., Dzul-Caamal, R.
(2013): Relations of oxidative stress in freshwater phytoplankton with heavy metals and polycyclic
aromatic hydrocarbons. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative
Physiology, 165(4):498-507.
83
Viljoen S. A., Reinecke A. J. og Hartman L. (1991): Life-cycle of the European compost worm
Dendrobaena vaneta (Oligochaeta). South African Journal of Zoology, 26 (1) s. 43-48.
Walker C. H., Hopkin S. P., Sibly R. M. og Peakall D. B. (2006): Principles of Ecotoxicology. Taylor &
Francis Group, 3. udgave, New York. Kapitel 6, s. 87-108.
Wood C. T. & Zimmer M. (2014): Can terrestrial isopods (Isopoda: Oniscidea) make use of
biodegradable plastics? Applied Soil Ecology 77, s. 72-79.
Wright S. L., Thompson R. C. og Galloway T. S. (2013): The physical impacts of microplastics on
marine organisms: A review. Environmental pollution 178.
Yamaji, Y., Nakazato, Y., Oshima, N., Hayashi, M. & Saruta, T. (2004): Oxidative stress induced by
iron released from transferrin in low pH peritoneal dialysis solution. Nephrology Dialysis
Transplantation, 19: 2592–2597
Zeptometrix Corporation (2006): OXITek TBARS Assay Kit Product Insert, tilgængelig d. 25. Juni
2015 på http://www.zeptometrix.com/docs/PI0801192.pdf?1366201528
Zubris K. A. V. og Richards B. K. (2005): Synthetic fibers as an indicator of land application of
sludge. Environmental Pollution 138, s. 201-211.
84