1. No category

Kloning, ekspression og karakterisering
af rødt fluorescerende protein fra
Entacmaea quadricolor
Cloning, expression and characterization of red fluorescent protein from Entacmaea quadricolor
05-01-2015
UCN Laborantskolen/Aalborg Universitet
Trine Bjerregaard Nielsen
0
Laborantskolen
Sofiendalsvej 60
9200 Aalborg SV
Tlf. 72 69 80 00
tb@ucn.dk
Titel:
Kloning, ekspression og karakterisering af rødt fluorescerende protein fra Entacmaea quadricolor
Cloning, expression and characterization of red fluorescent protein from Entacmaea quadricolor
Projektperiode:
Synopsis:
5. semester, efteråret 2014
Forfatter:
Trine Bjerregaard Nielsen
Skolevejleder:
Jenni Kathrine Sloth
Projektvejleder:
Evamaria Petersen
Oplagstal: 5
Sidetal:
30
Bilagsantal: 8
Afsluttet d. 05-01-2015
Et stykke donor DNA i form af
TagRFP-T ønskes indsat i en pET11a vektor ved kloning. Efterfølgende ønskes proteinet ekspressioneret og karakteriseret ved SDSPAGE.
TagRFP-T er med succes indsat i
vektoren og efterfølgende ekspressioneret. Molekylvægten på proteinet bliver ved SDS-PAGE bestemt
til at være ca. 28 kDa, og proteinet
identificeres derfor som værende
TagRFP-T.
Forord
Denne rapport er udarbejdet af en afgangsstuderende på 5. semester på laborantstudiet ved professionshøjskolen University College Nordjylland (UCN). Projektet er udført på praktikstedet, som er
Institut for Fysik ved Aalborg Universitet.
Læsevejledning
Der vil igennem rapporten fremtræde kildehenvisninger, og disse vil være samlet i en bibliografi
bagerst i rapporten. Der er i rapporten anvendt kildehenvisning efter Harvard-metoden, så i teksten
refereres en kilde med (Efternavn, År). Denne henvisning fører til bibliografien, hvor bøger er angivet med forfatter, titel, udgave og forlag, mens Internetsider er angivet med forfatter, titel og dato.
Billedtekster er placeret under billedet og henvises til som eksempelvis ”ses på figur 1”.
______________________________________
Trine Bjerregaard Nielsen
Indholdsfortegnelse
1. Introduktion ................................................................................................................................................... 1
Indledning ...................................................................................................................................................... 1
Problemformulering ...................................................................................................................................... 1
2. Teori .............................................................................................................................................................. 3
Kloning .......................................................................................................................................................... 3
Kemisk transformation .................................................................................................................................. 4
Oprensning af plasmid DNA ......................................................................................................................... 4
Restriktionsenzymer ...................................................................................................................................... 4
PCR ............................................................................................................................................................... 5
Gelelektroforese ............................................................................................................................................ 6
Ekspression af TagRFP ................................................................................................................................. 7
3. Metoder.......................................................................................................................................................... 9
Arbejdsmiljø .................................................................................................................................................. 9
Kvalitetssikring.............................................................................................................................................. 9
Kemisk transformation ................................................................................................................................ 10
Oprensning af plasmid DNA ....................................................................................................................... 10
Skæring af vektor ........................................................................................................................................ 10
PCR ............................................................................................................................................................. 10
Agarosegeler ................................................................................................................................................ 11
Ligering ........................................................................................................................................................ 12
Kemisk transformation ................................................................................................................................ 12
Oprensning og skæring af plasmid DNA .................................................................................................... 12
Ekspression .................................................................................................................................................. 12
Karakterisering ............................................................................................................................................ 12
4. Resultater ..................................................................................................................................................... 13
5. Diskussion ................................................................................................................................................... 23
6. Konklusion .................................................................................................................................................. 27
Bibliografi.................................................................................................................................................... 29
Bilag 1 – Sekvensen for TagRFP-T ................................................................................................................... 1
Bilag 2 – Mærkning ........................................................................................................................................... 3
Bilag 3 – Journalskrivning............................................................................................................................... 13
Bilag 4 – Producenter og batchnumre ............................................................................................................. 15
Bilag 5 – Flowsheet ......................................................................................................................................... 19
Bilag 6 - Forskrifter ......................................................................................................................................... 21
Bilag 7 – Vækstkurver ..................................................................................................................................... 27
Bilag 8 – Beregning af molekylvægt ............................................................................................................... 29
1. Introduktion
Indledning
Ved kloning forstås overførelse af arvemateriale fra en organisme til en anden, eksempelvis fra et
menneske til en mikroorganisme, og opformere det. Dette gør det muligt at producere et protein i en
mikroorganisme, som ellers ikke vil producere dette (Stilling, 2012).
Proteinet TagRFP er et rødt fluorescerende protein, som oprindeligt dannes af søanemonen Entacmaea quadricolor. Den primære anvendelse er protein- og celle labeling. Det er en monomer med
excitationsmaximum ved 555 nm og emissionsmaximum ved 584 nm og er det lyseste monomere
røde fluorescerende protein til dato. Molekylvægten for TagRFP er 27 kDa (Evrogen, 2014).
Problemformulering
Dette projekt handler om kloning og rekombinant ekspression af TagRFP i Escherichia coli (E.
coli). cDNA fra TagRFP indsættes i en pET-11a vektor, som resulterer i et ekspressionsplasmid, der
kan anvendes til at producere TagRFP. Produktionen sker under kontrol af en T7/lac promoter. For
at opnå dette plasmid anvendes molekylærbiologiske metoder som PCR til at øge antallet af cDNA
og simultant modificere enderne af disse. Enderne af det modificerede cDNA skæres vha. restriktionsenzymer og indsættes herefter i ekspressionsvektoren. Det dannede TagRFP ekspressionsplasmid anvendes efterfølgende til transformation af E. coli. Kloningsprocessen verificeres ved ekspression af funktionelt protein i E. coli. Hvis proteinet er overekspressioneret, skulle det være muligt at
bestemme molekylvægten ved SDS-PAGE.
~1~
~2~
2. Teori
Kloning og efterfølgende ekspression er en lang proces, hvor der anvendes mange metoder. I dette
afsnit gennemgås mekanismen i selve kloningen, hvorefter teorien bag nogle af metoderne beskrives.
Kloning
Ved kloning ønskes et DNA-fragment indsat i en værtscelle. Dette kan ikke gøres direkte, så der
anvendes en vektor til formålet. En vektor kan enten være et plasmid eller en virus. I dette tilfælde
anvendes et plasmid. Plasmider er små stykker cirkulært DNA fra organismer, og de er i stand til at
replikere sig selv uafhængigt af værtscellens kromosom (Brown, 1997). Den anvendte vektor er her
plasmidet pFCEX1D|TP1 (EX1D), som er en modificeret udgave af pET-11a, som er afbildet på
figur 1. Modificeringen ligger i, at der mellem skæringssitesene for BamHI og NdeI er indsat en
sekvens på 750 bp, der gør det lettere at identificere, om det er lykkedes at skære denne del fra til
kloningsprocessen (Amstrup, et al., 2008).
Figur 1 pET-11 vektorer (Agilent Technologies, 2014)
Det ses at plasmidet indeholder en T7/lac promoter, et ribosombindingssite, en T7 terminator, et
lac-I regulator-gen, et ori, skæringssite for BamHI og NdeI og et gen, der koder for ampicillinresistens. Disse karakteristika er vigtige for den senere kloning og ekspression.
I denne vektor skal der indsættes et stykke DNA. Til at fremskaffe det ønskede fragment, kan der
anvendes flere metoder. Her anvendes PCR til at opnå det cDNA, som koder for TagRFP. Genet
kommer fra donoren pc-DNA3-TagRFP-T (RFP) og består af 732 bp (Snapgene, 2014). Et uddrag
af sekvensen ses i bilag 1, hvor sekvensen markeret med rødt er den del, der koder for TagRFP-T.
TagRFP-T er den fotostabile variant af TagRFP, og det er denne, der arbejdes med her (Shaner, et
al., 2008).
~3~
Kemisk transformation
Til at opformere plasmider anvendes kemisk transformation. Ved transformation optages fremmed
DNA af en celle. I dette tilfælde er det plasmid, der ønskes optaget. For at cellen er i stand til at
optage plasmidet, kræver det, at cellevæggen er gennemtrængelig. Celler med en gennemtrængelig
cellevæg omtales som kompetente celler. Måden, hvorpå plasmidet trænger ind i cellen, er ved at
give cellerne et kort varmechok, hvor de går fra -20 °C til 42 °C. Desværre er det kun ganske få
celler, der optager plasmid. De fleste plasmider har den egenskab, at de koder for antibiotikaresistens. Dette giver mulighed for at skelne mellem celler, der har optaget plasmid, og celler, der ikke
har. I praksis gøres det ved at dyrke cellerne på plader, som indeholder antibiotika. Her er det kun
celler med plasmid, der kan overleve. Inden cellerne plades ud, dyrkes de dog kort i medie uden
antibiotika, da de først skal syntetisere det enzym, der gør dem resistente (Brown, 1997).
Oprensning af plasmid DNA
Oprensning af plasmid DNA kan ske enten ved kogemetoden eller alkalimetoden. I dette projekt
anvendes bl.a. et kit som bygger på alkalimetoden og efterfølgende søjleoprensning. Først høstes
celler fra en kultur, hvorefter cellerne lyseres. Ved cellelysen går det kromosomale DNA fra at være
cirkulært til at blive lineært, hvorimod plasmid DNA vil være supercoiled og/eller relaxed. Samtidig
med cellelysen øges pH, som resulterer i at det kromosomale DNA denaturerer, mens plasmid DNA
forbliver supercoiled. Efterfølgende sænkes pH, hvorved det denaturerede DNA vil aggregere til en
uopløselig sammenfiltret masse, som kan nedcentrifugeres (Brown, 1997). Tilbage er der plasmid
DNA i supernatanten, som bindes til en resin søjle vha. lavt saltindhold og pH. DNA’et vaskes med
en buffer indeholdende en medium koncentration af salt for at fjerne RNA, proteiner og urenheder
med lav molekylvægt. Herefter elueres det ved brug af en høj saltkoncentration, og derefter præcipiteres det med isopropanol, vaskes i ethanol og resuspenderes i vand eller en svagt basisk buffer
(QIAGEN, 2012).
Udover dette kit anvendes også kogemetoden til at oprense plasmid DNA. Forskellen er, at DNA
her denatureres ved en kort opvarmning i stedet for øgning af pH. Proteiner, cellevægsrester og
kromosomalt DNA denatureres, mens plasmid DNA bevarer strukturen. Resten bygger på samme
princip som alkalimetoden. Metoden er hurtig og nem, men renheden er ikke så høj (Thougaard, et
al., 2011).
Restriktionsenzymer
For at fjerne den del af sekvensen fra vektoren anvendes restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer,
også kaldet restriktionsendonukleaser, er enzymer, der skærer DNA ved bestemte basesekvenser.
Denne sekvens kaldes skæringssekvensen eller skæringssitet. Sekvensen består af 4-8 baser og er
ofte palindromisk, hvilket vil sige, at sekvensen er den samme, hvad enten der læses på den ene
eller den anden streng fra 5’ mod 3’. Enzymerne navngives efter den bakterie, de stammer fra. Første bogstav er førstebogstavet i slægtsnavnet, de næste to er de første to bogstaver i artsnavnet. Disse efterfølges af to tal eller bogstaver.
~4~
Enzymerne kan skære et molekyle på to måder; lige ned gennem basesekvensen eller forskudt.
Skæres der lige ned gennem sekvensen dannes blunt ends, hvor begge strenge vil have lige mange
baser på hver side af skæringen. Hvis der derimod skæres forskudt, vil der ikke være lige mange, og
der vil være enten 5’ eller 3’ overhang. Denne type skæring giver sticky ends.
Molekyler med samme sticky ends er i stand til at finde sammen igen og danne hydrogenbindinger.
Efterfølgende kan enzymet DNA-ligase binde molekylerne sammen ved at danne kovalente esterbindinger. Denne proces kaldes ligering. Molekyler med blunt ends kan også ligeres, men da der
ikke er nogle ender til at danne hydrogenbindinger, er det ikke sandsynligt, at ligeringen sker
(Thougaard, et al., 2011).
PCR
cDNA fra donoren amplificeres ved PCR. PCR er en forkortelse for polymerase chain reaction, og
metoden anvendes til at amplificere et DNA-fragment fra en længere DNA-streng. Til reaktionen
skal der først og fremmest bruges en lille mængde DNA. Dernæst er der brug for to primere. Primere er oligonukleotider, som definerer det fragment, der skal amplificeres. Disse er designet til at
binde til en specifik del af DNA-strengen og vil derfor variere afhængigt af, hvilken sekvens, der
ønskes. Inden primerne kan bindes til DNA-strengen, skal strengen denatureres, så den bliver enkeltstrenget i stedet for dobbeltstrenget. Dette sker ved at opvarme til 94 °C. Efter denaturering
sænkes temperaturen, hvorefter en såkaldt annealing (binding) af primere kan finde sted. Temperaturen bestemmes ud fra længden og nukleotidsammensætningen af primerne (Dale & von Schantz,
2002). Hver primer vil binde til hver sin streng og efter at have øget temperaturen til ca. 72 °C, vil
der dannes en komplementær DNA-streng vha. Tag polymerase og dNTP’er (triphosphater af de
fire deoxynukleotider) (Stilling, 2012). Ved at øge temperaturen til 94 °C stoppes reaktionen, og en
ny cyklus begynder. I stedet for den ene dobbeltstreng, der oprindeligt var, er der nu to. Hver består
de af en streng fra den oprindelige og en nydannet. Den ene ende er defineret af primer, mens den
anden er uspecifik og afhænger af tiden ved de 72 °C. Forløbet er skildret på figur 2.
~5~
Figur 2 PCR cyklus. Til venstre ses første cyklus, til højre ses anden og det ønskede produkt af efterfølgende cykler (Dale
& von Schantz, 2002)
I de næste cykler gentages processen, men fra tredje cyklus dannes strenge med specifikke ender,
som er bestemt af primersekvenserne. Der vil hver gang stadig produceres to strenge, som kun er
specifikke i den ene ende, mens antallet af specifikke strenge vil stige eksponentielt for hver cyklus
(Dale & von Schantz, 2002). Normalt køres 20-35 cykler, hvorefter dNTP’er vil være brugt op, og
polymerasen har mistet aktivitet (Stilling, 2012).
I dette tilfælde har primerne også en anden egenskab. Da det amplificerede fragment efterfølgende
skal skæres med samme restriktionsenzymer som vektoren, skal enderne af fragmentet bestå af de
krævede skæringssites. Derfor binder primerne ikke kun til en DNA-streng, men modificerer samtidig enderne af fragmentet ved at koble nogle få nukleotider på, så der kommer et genkendelsessite,
som passer til restriktionsenzymet (Dale & von Schantz, 2002).
Gelelektroforese
Til at bestemme størrelsen af DNA-fragmenter anvendes gelelektroforese. Det udnyttes, at DNA er
negativt ladet og derfor i et elektrisk felt vil vandre mod den positivt ladede pol. I dette tilfælde anvendes agarosegeler (Kielberg, et al., 2003). Ved støbning af en agarosegel dannes et tredimensionelt netværk, da der dannes hydrogenbindinger mellem de lineære agarose-polymerer (Thougaard,
et al., 2011). Netværket har en bestemt porestørrelse, som afhænger af agarosekoncentrationen. Når
der efterfølgende sættes DNA på gelen, vil molekylerne vandre med forskellig hastighed, som afhænger af molekyllængden og den rumlige struktur. De små og kompakte molekyler vandrer hurtigst, mens de store har sværere ved at trænge igennem porerne. Der sker herved en adskillelse på
baggrund af størrelsen (Kielberg, et al., 2003).
~6~
Efterfølgende visualiseres fragmenterne under UV-lys. For at dette kan lade sig gøre, skal gelen
indeholde et fluorescerende farvestof, her ethidiumbromid. Ethidiumbromid binder sig til DNAmolekylerne og lyser orange under UV-lys. For at kunne bestemme størrelsen af fragmenter påsættes også en standard på gelen, som indeholder DNA-fragmenter af kendt størrelse (Thougaard, et
al., 2011).
Til at bestemme størrelsen af det fremstillede protein, anvendes SDS-PAGE. Her er det ikke agarosegeler, men polyakrylamidgeler, der anvendes. Princippet er det samme, men i stedet for agarose
bruges akrylamid. Her polymeriseres akrylamidmonomerer og kæderne krydsbindes med N,N’methylen-bisakrylamid (BIS). Dette giver et netværk lignende agarosens. Reaktionen sker ved tilsætning af TEMED og ammoniumpersulfat, som danner frie radikaler (Kielberg, et al., 2003).
Ekspression af TagRFP
Efter kloningen verificeres processen ved at ekspressionere protein. Som beskrevet tidligere har
vektoren nogle bestemte egenskaber, som er vigtige for ekspressionen af et protein. Den første del
er promoteren. Her er det en T7/lac promoter, og denne styrer flere gener. Denne samling af gener
kaldes et operon, og i dette tilfælde er det et lac-operon. Generne i dette koder for de enzymer, der
kræves til at nedbryde lactose. Operonet består både af en promoter og en operator. Promoteren er
startstedet for transkriptionen, hvorimod operatoren er en del af et reguleringssystem.
Til lac-operonet hører også et regulator-gen, lac-I. Dette gen koder for et såkaldt repressorprotein,
som bindes til operatoren og herved forhindrer transkriptionen. For at undgå binding af repressorprotein tilsættes en inducer. Induceren skal her være laktose, da repressorproteinet binder stærkere
til laktose end til operatoren. Herved forløber transkriptionen (Thougaard, et al., 2011). I stedet for
laktose anvendes her IPTG, som er en laktoseanalog (Causey, 2003).
En anden vigtig del er ribosombindingssitet. Dette er det sted, hvor ribosomet binder til mRNA, og
er en nukleotidsekvens, som genkendes af ribosomet. Den sidste del er terminatoren. Terminatoren
er en nukleotidsekvens, der stopper transkriptionen for enden af genet (Brown, 1997).
~7~
~8~
3. Metoder
Arbejdsmiljø
I forbindelse med laboratoriearbejdet til dette projekt, er der nogle forholdsregler, der skal tages. Da
der arbejdes med genmodificerede organismer (GMO), arbejdes der i klasse 1 laboratorier og der
bæres klasse 1 mærket kittel. Denne mærkning er ikke længere lovpligtig, men på min arbejdsplads,
er de stadig mærkede. Alle kemikalier og reagenser, der har været i kontakt med GMOmaterialerne, skal autoklaveres inden det sendes videre til affaldssortering. Efter autoklavering kan
de hældes i vasken, da det ikke indeholder farlige kemikalier. Diverse utensilier og glasvarer autoklaveres også inden det efterfølgende kan håndteres som dagrenovation eller rengøres. Buffere, som
har været anvendt til gelelektroforese hældes i vasken.
Til agarosegelerne anvendes ethidiumbromid. Dette har tidligere været mærket som et kræftfremkaldende stof, men er det ikke længere. Dog håndteres det på denne arbejdsplads stadig som kræftfremkaldende affald. Derfor opsamles det for sig i spande, som mærkes med kræftfremkaldende
affald.
Nogle af de kemikalier og reagenser, der er arbejdet med, kræver at der bliver taget nogle forholdsregler. Mærkningen af disse findes i bilag 2.
Kvalitetssikring
Kvalitetssikring er en vigtig del af det daglige arbejde. Her på universitetet, hvor der arbejdes med
forskning, er der en anden type kvalitetssikring end der oftest ses i f.eks. en virksomhed, der laver
analyser. Der er f.eks. ingen registrering af prøver i et system. Den form for kvalitetssikring, der er,
minder meget om den, der anvendes under laborantuddannelsen. På prøver påføres indhold, dato,
initialer, og hvad der ellers måtte være nødvendigt, for at identificere denne korrekt. Derudover
føres der journalbog. Her indskrives dato, navn på eksperiment, batchnumre på kemikalier, afvejninger, procedurer og iagttagelser. Denne er meget vigtig for både at dokumentere arbejdet og identificere eksempelvis afvigelser. I bilag 3 ses retningslinjerne for journalskrivningen, som de universitetsstuderende skal rette sig efter. Dette er utroligt vigtigt inden for forskning, især hvis der skal
søges om patenter (Nielsen, 2014). Derfor er der i bilag 4 en liste med producenter og lot/batchnumre på kemikalier og apparaturer, som er anvendt til dette projekt. Journalbogen, som er ført for
dette projekt forefindes ved Aalborg Universitet, Institut for Fysik.
I det efterfølgende beskrives metoderne. Et flowsheet for hele processen findes i bilag 5 og forskrifterne i bilag 6.
~9~
Kemisk transformation
Første trin er at indsætte plasmid i en E. coli-streng. Plasmidet, der ønskes indsat, er EX1D, og den
anvendte E. coli-streng er NEB 5-alpha. NEB 5-alpha/RFP er blevet udleveret fra en studiegruppe,
som havde lavet transformationen, da det er dyrt at lave disse transformationer.
Oprensning af plasmid DNA
Til oprensning af plasmid DNA anvendes kittet QIAGEN® Plasmid Midi Kit (100). Protokollen er
startet fra punkt 3. Forud for dette er der dyrket en kultur af NEB 5-alpha/EX1D og en af NEB 5alpha/RFP i 100 mL LB/Amp-medium, som er podet med kolonier fra transformationerne. Protokollen blev ikke fulgt slavisk, og ændringerne ses i skemaet nedenfor.
Punkt 7
Punkt 8
Punkt 13
Punkt 14
Punkt 15
40 min. Centrifugering + 15 min. Ved 22.000 g + 25 min. Ved 24.000 g
Dette punkt springes over
Centrifugering i 45 min. + 10 min.
6 mL ethanol
RFP opløses i 200 µL DNA-vand og EX1D i 100 µL
Skæring af vektor
EX1D skæres med to forskellige restriktionsenzymer, NdeI og BamHI. Skæringssitesene er som
følger:
NdeI:
5'...C A↓T A T G...3'
3'...G T A T↑A C...5'
BamHI :
5'...G↓G A T C C...3'
3'...C C T A G↑G...5'
Dette gøres i to trin, hvor der først skæres med det ene enzym. Herefter testes det ved gelelektroforese, om skæringen lykkedes, hvorefter der skæres med det andet enzym. Som skæringsbuffer anvendes 2x Tango.
Efter skæring med begge enzymer loades al vektor DNA på en præparativ agarosegel, hvorefter det
ønskede bånd skæres ud og oprenses ved brug af ”Centrifugal filter units for concentration and purification of biological solutions”. Dernæst præcipiteres DNA og vektoren er nu klar til ligering.
PCR
cDNA fra RFP amplificeres ved PCR. Primerne, som anvendes, er RFPforward og RFPreverse.
Sekvenserne for disse er som følger:
RFPforward:
5’-CTC ATA TGG TGT CTA AGG GC-3’
RFPreverse:
5’-ATG GAT CCT CAT TAC TTG TAC AG-3’
~ 10 ~
Programmet til dette er forindstillet på PCR-cycleren under navnet RFPTECOLI og ser ud som følger:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
95 °C i 4 min.
95 °C i 30 sek.
55 °C i 30 sek.
72 °C i 1 min.
Gå til punkt 2, gentag 34 gange
72 °C i 7 min.
Hold 4 °C
Efterfølgende oprenses produktet ved brug af kittet ”Nucleospin® Extract II” efter protokollen ”Protocol for direct purification of PCR products”. Herefter skæres, oprenses og præcipiteres DNA efter
samme metode som EX1D, og RFP er klar til ligering.
Agarosegeler
For at se om oprensninger, skæringer osv. lykkes, analyseres de forskellige produkter ved gelelektroforese med agarosegeler. Gelerne består af 1 % agarose i 1x TAE-buffer, og som runningbuffer
bruges 1x TAE-buffer. Den anvendte farve er ethidiumbromid. Som loadingbuffer anvendes 6x
DNA Loading Dye, og standarden er GenerulerTM 1 kb DNA ladder (figur 3).
Figur 3 Standard: Generuler 1 kb DNA
ladder (Thermo Scientific, 2012)
~ 11 ~
Ligering
Til ligeringen anvendes det fremstillede EX1D (vektor) og RFP (insert). Disse blandes sammen
med T4 DNA ligase buffer og T4 DNA ligase.
Kemisk transformation
Det ligerede produkt transformeres ind i E. coli (NEB 5-alpha) efter samme procedure som tidligere
beskrevet. Efterfølgende isoleres enkelte kolonier på nye plader.
Oprensning og skæring af plasmid DNA
De isolerede kolonier oprenses hver for sig; denne gang efter kogemetoden i stedet for kit. Herefter
testes det på en gel, om det er lykkedes at oprense DNA. Efterfølgende skæres det med SmaI, som
kun skærer i den del, som er skåret ud af den oprindelige vektor, for at se om plasmidet indeholder
insert. Skæringssitet for denne er:
5'...C C C↓G G G...3'
3'...G G G↑C C C...5'
Ekspression
Proteinet TagRFP-T ekspressioneres ved at transformere det nye plasmid ind i E. coli BL21(DE3).
Herefter dyrkes en forkultur i LB-medium med 100 mg/L ampicillin. En hovedkultur af samme
mediesammensætning inokuleres med 4,4 % forkultur og dyrkes til OD ca. 0,5, hvorefter der induceres med 0,3 mM IPTG, og der dyrkes over nat. Efterfølgende høstes cellerne, og proteiner ekstraheres ved osmotisk chok.
Karakterisering
Produktet karakteriseres ved SDS-PAGE efter Laemmli systemet. Gelen er akrylamid og består af
en 12 % separationsgel og 4 % stackinggel. Som runningbuffer anvendes 1x TGS. Der anvendes en
Laemmli sample buffer og standarden er LMW (figur 4). Efterfølgende farves med Coomassie Brilliant Blue, og der affarves med en destain.
Figur 4 LMW - Molekylvægt på
kendte proteiner i standarden
(GE Healthcare, 2006)
~ 12 ~
4. Resultater
I dette afsnit præsenteres resultaterne. Resultaterne består af billeder, og billederne af gelerne er
desværre ikke lige tydelige, da kameraet på UV-lampen ikke virkede hver gang. Nogle billeder er
derfor taget med mobiltelefon, der ikke giver så god kvalitet.
Som det første trin i hele processen laves en kemisk transformation af hhv. vektor (EX1D) og donor-DNA (RFP). Resultatet for transformationerne ses på figur 5.
Figur 5 Transformeret E. coli med hhv. EX1D (tv) og RFP (th)
På billedet ses, at der er vækst på begge plader, så plasmiderne er blevet transformeret ind i cellerne. Herefter dyrkes og oprenses plasmid DNA, og på gelen på figur 6 ses resultatet.
Figur 6 Gelelektroforese. Brønd 1 og 7 (fra
venstre) er standard, brønd 3 er EX1D og
brønd 5 er RFP
Standarden ses ikke på billedet, så størrelsen på DNA’et kan ikke bestemmes. Både EX1D og RFP
giver tre bånd. Båndet ved brønden er uopløst DNA, det næste er plasmid på relaxed form, og det
sidste er supercoiled plasmid. Oprensningen er altså vellykket, og der fortsættes med næste trin,
som er skæring af EX1D og PCR af RFP. Resultatet ses på figur 7.
~ 13 ~
Figur 7 Skæring af EX1D og PCR af RFP. Brønd 1,
7 og 8 er standard, 2+3 er skåret EX1D og 4-6 er
RFP efter PCR
Her er standarden ikke så tydelig, men nogle af båndene ses, så der kan laves en størrelsesbestemmelse. Det ses, at båndet fra EX1D er et fragment med en størrelse på lidt over 6.000 bp. Der er
ikke nogen synlige bånd fra PCR-produkterne. EX1D skæres med det andet enzym, og resultatet af
dette ses på figur 8 sammen med PCR-produkterne.
Figur 8 2x skåret EX1D og RFP efter PCR. Brønd
1 og 7 er standard, brønd 2+3 er skåret EX1D og
brønd 4-6 er PCR-produkt
~ 14 ~
På billedet ses to bånd fra skåret EX1D, et ved ca. 6.000 bp og et ved ca. 750 bp. Hermed kan det
siges, at det er skåret succesfuldt med begge enzymer, og herefter laves en præparativ gel, hvor det
store fragment oprenses fra. PCR-produkterne giver tre bånd, et over 10.000 bp, et ved ca. 5.000 bp
og et ved ca. 750 bp. Båndet ved 750 bp er det eneste interessante, så der laves en clean-up af PCRprodukterne. På figur 9 er resultatet skildret sammen med det oprensede fragment fra EX1D.
Figur 9 Oprenset, skåret EX1D og cleaned-up PCRprodukt. Brønd 1 og 7 er standard, brønd 3 er oprenset, skåret EX1D og brønd 5 er cleaned-up PCRprodukt
Der ses et kraftigt bånd ved ca. 6.000 bp fra det oprensede, skårede EX1D, så denne er nu klar til
ligering. PCR-produktet viser stadig tre bånd ved hhv. 10.000 bp, 5.000 bp og 750 bp. Produktet
skæres nu på samme måde som EX1D, og der laves også en præparativ gel, hvor fragmentet på 750
bp oprenses fra. Dette giver resultatet på figur 10.
~ 15 ~
Figur 10 Brønd 2 og 6 er standard og brønd 4
er oprenset, skåret PCR-produkt
Der ses her kun et bånd fra det oprensede, skårede PCR-produkt, og det er ved ca. 750 bp. Denne er
nu klar til ligering og efterfølgende til at transformeres ind i E. coli. Transformationen dyrkes på
plader, og resultatet ses på figur 11.
Figur 11 Ligering transformeret i E. coli. De to øverste plader er
en kontrolligering (ingen RFP), og de to nederste er ligeringen.
Tallene på pladen nederst til venstre har ingen betydning.
Som det fremgår af figuren, er der vækst på samtlige plader. Dette indikerer, at ikke alle kolonier
indeholder insert i form af RFP. Der udvælges nogle kolonier fra ligeringen, som isoleres på nye
plader og nummereres. Isoleringen ses på figur 12.
~ 16 ~
Figur 12 Isolering af kolonier fra ligering transformeret i E. coli
Det ses, at alle isoleringer er vokset op, dog er koloni 6 og 7 groet lidt sammen, så disse arbejdes
der ikke videre med. Fra de resterende oprenses plasmid DNA, hvor det efterfølgende testes på en
gel, om der er plasmid DNA til stede. Resultatet herfra ses på figur 13.
Figur 13 Oprensning af plasmid DNA fra isolering
~ 17 ~
På gelen ses, at det i alle tilfælde er lykkedes at oprense DNA. De oprensninger, hvor der kun ses et
bånd nede ved brønden, er ikke blevet opløst, og derfor arbejdes kun videre med 1, 2, 4, 10, 11, 14
og 16. Disse oprensninger laves der efterfølgende PCR på, for at se om det indeholder insert. Dette
er skildret på figur 14.
Figur 14 PCR af oprenset plasmid DNA fra ligering
Som det fremgår af billedet, er der kun bånd fra standarden på gelen, hvilket indikerer, at der ikke
er blevet indsat insert. For at bekræfte dette laves endnu en test, hvor plasmidet skæres med et enzym, som kun skærer i den del af vektoren, som blev skåret fra i starten af forløbet. Resultatet ses
på figur 15.
Figur 15 Skæring af oprenset plasmid DNA fra ligering. S’erne indikerer, at plasmidet er blevet skåret med
enzym.
~ 18 ~
Det fremgår, at samtlige oprensninger er blevet skåret, så plasmiderne indeholder ikke insert. Derfor
isoleres flere kolonier fra ligeringen, som efterfølgende oprenses og skæres. Dette resultat ses på
figur 16.
Figur 16 Skæring af oprenset plasmid DNA fra ligering. S’erne indikerer, at plasmidet er blevet skåret
med enzym.
Ud fra billedet ses det, at langt de fleste oprensninger er blevet skåret. Nr. 19 og nr. 25 ser ikke ud
til at være blevet skåret, så disse kan indeholde insert. Derfor transformeres disse ind i en anden E.
coli-streng, så TagRFP-T efterfølgende kan ekspressioneres. Transformationerne ses på figur 17.
~ 19 ~
Figur 17 Transformation af E. coli. Øverst ses oprensning nr. 19 og nederst nr. 25.
Det ses, at transformationerne er vellykkede. Derfor dyrkes de videre, så TagRFP-T ekspressioneres. Vækstkurverne ses i bilag 7. Efter ekspression, cellehøst og osmotisk chok, karakteriseres produkterne ved SDS-PAGE. Resultatet af dette ses på figur 18.
Figur 18 SDS-PAGE af ekspressionerne. EX1D er det oprindelige plasmid
~ 20 ~
Billedet viser, at der fra plasmid fra koloni nr. 19 er blevet produceret et protein med en molekylvægt på ca. 28 kDa (beregning ses i bilag 8). Det oprindelige plasmid, EX1D, producerer et med en
vægt på 25 kDa. Plasmid fra nr. 25 giver et bånd ved samme vandringslængde som EX1D.
~ 21 ~
~ 22 ~
5. Diskussion
Ud fra resultaterne kan der nu laves en opsamling. Som det første laves en kemisk tranformation af E. coli,
hvor vektor og donor skal indsættes i hver sin streng. Dette trin er succesfuldt, og der fortsættes derfor med
næste trin. Her skal transformationerne dyrkes for at opformere plasmid, hvorefter plasmid DNA, som skal
bruges til kloningen, oprenses fra cellerne. Denne proces kan være svær, da der i de sidste trin er et pellet,
som skal bevares. Pellet er tydeligt at se for RFP, men det ses ikke ved EX1D. Derudover er det svært at
opløse pellet, hvis det er blevet for tørt. Det testes nu på en gel, om oprensningen er vellykket. På gelen ses
tre bånd fra begge oprensninger, et for uopløst DNA, et for relaxed plasmid DNA og et for supercoiled plasmid DNA. Standarden er desværre ikke synlig på gelen, og der kan derfor ikke siges noget om størrelsen på
plasmiderne. De tre bånd indikerer dog, at der er blevet oprenset plasmid DNA. Herefter skæres vektoren
med restriktionsenzym, mens et stykke af donoren amplificeres ved PCR. Igen testes på gel.
Gelen viser nu kun et bånd ved lidt over 6.000 bp for vektoren, som er lineær plasmid DNA. Dette er bevis
for, at vektoren er blevet skåret. Skæringen er foretaget i to rør, hvor der er skåret med ét enzym i det ene, og
et andet enzym i det andet. På den måde testes det, om der er enzym nok til at skære al DNA. Da der kun er
ét bånd, er der enzym nok, og samme mængde enzym kan derfor tilsættes det andet rør. Der ses ikke noget
PCR-produkt, hvilket skyldes, at gelen har fået lov til at køre for længe. Derfor ses de små fragmenter ikke.
Der laves to PCR mere, så der er mere materiale at arbejde med. Standarden er igen ikke særlig tydelig, hvilket gør det vanskeligt at vurdere størrelserne. Det tyder på at UV-lampen ikke fungerer helt optimalt.
På den næste gel testes om det er lykkedes at skære vektoren med det andet enzym, og om der er et PCRprodukt. Der ses nu to bånd ved vektoren, ét ved ca. 6.000 bp og ét ved ca. 750 bp. Dette viser, at der også er
blevet skåret med det andet enzym, så der nu er to fragmenter. Fragmentet på 750 bp ønskes fjernet, så derfor
oprenses båndet på de ca. 6.000 bp fra en præparativ gel. Der ses på denne gel også tydelige PCR-produkter
ved ca. 750 bp. Udover disse ses dog også fragmenter med størrelser på hhv. ca. 5.000 bp og over 10.000 bp.
Dette er ikke ønskeligt, så PCR-fraktionerne pooles, og der laves en clean-up.
Det næste resultat viser en gel af det oprensede fragment fra vektoren og cleaned-up PCR-produkt. Standarden er nu blevet noget tydeligere, fordi UV-lampen er blevet optimeret. Der har været en fejl i reflektionen i
lampen, som er blevet udbedret. Der ses nu kun ét bånd fra vektoren ved ca. 6.000 bp, og dette viser, at dette
fragment er blevet oprenset, og vektoren er hermed klar til at blive ligeret med donor DNA. PCR-produktet
ser ud som på den sidste gel, hvilket skyldes, at clean up kun fjerner primerrester, som er meget små fragmenter. De store fragmenter, der ses her, er i stedet biprodukter fra reaktionen, og disse kan ikke fjernes på
den måde. PCR-produktet skæres og fragmentet på 750 bp oprenses på samme måde som fragmentet fra
vektoren. Skæringen foretages inden oprensning, da det alligevel ikke vil kunne ses på en gel, om skæringen
er vellykket, fordi det er meget små stykker, der skæres fra. Det testes efterfølgende på en gel, om oprensningen er succesfuld. Gelen viser kun et bånd ved 750 bp, hvorfor det kan siges, at oprensningen er lykkedes.
Det ønskede PCR-produkt er nu oprenset og vektor og PCR-produkt kan ligeres.
~ 23 ~
Ligeringen transformeres direkte ind i en E. coli-streng og plades ud. Det er ikke muligt at teste på gel, om
ligeringen er lykkedes, da det indsatte donor DNA har samme størrelse som det fragment, der er fjernet fra
vektoren. Der laves to ligeringer, en med PCR produkt og en kontrol uden PCR-produkt. Kontrollen laves for
at se, om vektoren selvligerer. Det er ikke muligt at skære 100 % af vektoren med begge enzymer, og er der
kun blevet skåret med et enzym, vil vektoren kunne selvligere og indeholder ikke insert. Det fremgår af udpladningerne fra kontrollen, at vektoren har selvligeret. Nogle af kolonierne fra ligeringen vil altså ikke indeholde insert. Derfor skal enkelte kolonier isoleres og opformeres, så de kan analyseres for insert.
I første omgang isoleres 16 kolonier, hvoraf to er groet sammen og derfor ikke analyseres nærmere. Fra de
resterende 14 oprenses plasmid DNA, og oprensningerne testes herefter på en gel. Der er tilsyneladende blevet oprenset plasmid DNA fra alle, men ikke alle er efterfølgende blevet opløst. Kun de syv, som er opløst,
analyseres nærmere ved at køre PCR. Det testes på en gel, om der er fremkommet et PCR-produkt, og det er
der desværre ikke. Dette indikerer, at der ikke blevet indsat insert.
For at analysere oprensningerne på en anden måde skæres i stedet for med et nyt restriktionsenzym, som kun
skærer i den del af vektoren, som blev skåret fra i starten og kun er til stede, hvis vektoren har selvligeret.
Skæringen testes på gel, men resultatet viser, at samtlige oprensninger er blevet skåret. Den ene af gelerne
som anvendes til denne test giver dog et lidt underligt resultat. Normalvis vil der ved skæring med enzym
fremkomme et bånd, som ligger mellem supercoiled og relaxed plasmid. Det er ikke tilfældet her. Her har
det løbet længere. Båndet fra det skårede plasmid ligger omkring 6.000 bp, som forventet, men supercoiled
og relaxed er ikke vandret så langt, som det ellers vil gøre. Dette kan ikke forklares, men der ses stadig den
forskel, at båndene placerer sig forskelligt, afhængigt af, om plasmidet er skåret. Det kan hermed siges, at
plasmidet er skåret og derfor ikke indeholder insert. Derfor isoleres yderligere 12 kolonier fra ligeringen.
Fra de 12 kolonier oprenses plasmid DNA, og samtlige skæres med enzym. Herefter testes på gel, om skæringen har fundet sted. Gelerne viser, at nr. 19 og nr. 25 muligvis ikke er skåret, da båndene vandrer lige
langt ved skåret og uskåret plasmid. Nr. 19 giver kun et bånd ved lidt under 6.000 bp, både skåret og uskåret.
Nr. 25 er før skæringen uopløst og har et bånd helt nede ved brønden. Efter skæringen fremkommer to bånd,
et for supercoiled og et for relaxed plasmid. Det er muligt at DNA bare er blevet opløst pga. varmen og skæringen ikke har været fuldendt. Sammenlignes med nogle af de andre uskårede, ser det ud til at nr. 25 er
vandret lidt længere, og det indikerer derfor, at der muligvis er insert. Begge oprensninger transformeres ind
i E. coli for efterfølgende at blive dyrket.
Tranformationerne er vellykkede og dyrkningen, og hermed ekspressionen, startes. Det er ikke muligt ud fra
selve dyrkningen at se, om det ønskede protein ekspressioneres. Der laves løbende OD-målinger for at se,
om væksten forløber, som den skal, men andet kan ikke siges herudfra. Efter ekspressionen høstes cellerne
og proteiner ekstraheres ved osmotisk chok. Derefter analyseres proteinerne ved SDS-PAGE.
Alle fraktioner fra celleekstraktionen testes på gelen. Parallelt med dette testes også hvordan det oprindelige
plasmid, EX1D, ser ud. Spændingsfeltet har ikke været helt lige over gelen, hvorfor den ene standard og
EX1D er trukket skævt og derfor ikke kan bruges til at beregne ud fra. Af gelen fremgår at der for nr. 19
ingen proteiner er i mediefraktionen. Der findes ganske lidt af et enkelt protein i TES-fraktionen, og i mili Q
fraktionen findes resten. Et meget kraftigt bånd fremkommer ved ca. 28 kDa. Da TagRFP-T har en molekylvægt på 27 kDa, er det sandsynligvis dette protein, der her er fremstillet. Det tyder altså på, at plasmid fra
koloni nr. 19 indeholder insert i form af TagRFP-T. Dette gælder ikke for nr. 25. Her er der heller ingen proteiner i mediefraktionen, men nogle få i TES-fraktionen og en del i mili Q fraktionen. Sammenlignes med det
oprindelige EX1D, er der proteiner af ca. samme størrelse, som findes både ved EX1D og nr. 25. Ydermere
~ 24 ~
er det en TES-fraktion af EX1D, der er påsat på gelen, og den ligner TES-fraktionen for nr. 25. Det kraftigste
bånd er et protein med en molekylvægt på ca. 25 kDa. EX1D producerer oprindeligt cutinase, som har en
molekylvægt på 22 kDa (Delorme, et al., 2014), hvilket er noget afvigende fra de 25 kDa, men det er sandsynligvis dette protein, der er fremstillet. Det er svært at vurdere den nøjagtige størrelse fra en gel, da der er
mange parametre, f.eks. om alle afstande er målt ens, eller om gelen er trukket skævt. Der er hermed ingen
indikationer for, at plasmid fra koloni nr. 25 indeholder insert. For at få bekræftet at nr. 19 indeholder insert,
skal der laves en DNA sekventering. Dette er ikke noget, der laves her på universitetet, og pga. tidspres er
det endnu ikke blevet sendt til sekventering.
Det forsøges at finde excitations- og emissionsmaximum ved fluorescensspektroskopi, men da disse to bølgelængder ligger tæt op ad hinanden, er det ikke muligt at få et spekter. Dette skyldes at lampen overskygger
ved den interessante bølgelængde. Det kan også skyldes, at TagRFP er lysfølsomt, men da der arbejdes med
den fotostabile variant, burde det ikke være et problem. Derfor forsøges det også ved en type fluorescensmikroskopi at belyse mili Q fraktionen med lys af excitationsbølgelængden. Dette resulterer også i fluorescens,
men når der belyses med lys af en anden bølgelængde, giver det også fluorescens. Dette kan skyldes, at det
har været forureninger frem for protein, der er blevet belyst. Der kan derfor ikke siges noget om proteinet ud
fra disse observationer.
~ 25 ~
~ 26 ~
6. Konklusion
Det kan konkluderes, det er lykkedes at klone et stykke donor DNA i form af TagRFP-T ind i en pET-11a
vektor. Derefter er plasmidet indsat i E. coli. Efterfølgende ekspression resulterer i et protein med en molekylvægt på ca. 28 kDa. Denne molekylvægt stemmer overens med molekylvægten for TagRFP-T på 27 kDa,
og det kan dermed konkluderes, at det ekspressionerede protein er TagRFP-T.
~ 27 ~
~ 28 ~
Bibliografi
Agilent Technologies, 2014. pET Expression Systems - Details & Specifications. [Online]
Available at: http://www.genomics.agilent.com/article.jsp?pageId=472&_requestid=1095307
[Senest hentet eller vist den 30 December 2014].
Amstrup, L. J. et al., 2008. Homology studies and recombinant production of antifungal defensins
in Escherichia coli, Aalborg: s.n.
Brown, T. A., 1997. Gene cloning an introduction. 3rd red. London: Chapman & Hall.
Causey, J., 2003. The pET Expression System. [Online]
Available at:
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Causey/pET.html
[Senest hentet eller vist den 3 Januar 2015].
Dale, J. W. & von Schantz, M., 2002. From Genes to Genomes. 1. red. West Sussex: John Wiley
& Sons Ltd.
Delorme, V. et al., 2014. Supported inhibitor forfishing lipases in complex biological media and
mass spectrometry identification. Biochimie, 16 Juli, pp. 1-11.
Evrogen, 2014. Red fluorescent protein TagRFP. [Online]
Available at: http://www.evrogen.com/products/TagRFP/TagRFP_Detailed_description.shtml
[Senest hentet eller vist den 30 December 2014].
GE Healthcare, 2006. Amersham Low Molecular Weight Calibration Kit for SDS Electrophoresis.
Buckinghamshire: GE Healthcare.
Kielberg, V., Nørby, S. & Rasmussen, L., 2003. DNA og RNA - en håndbog. s.l.:Gads Forlag.
Nielsen, T. B., 2014. Praktikforløb ved Aalborg Universitet, Aalborg: s.n.
QIAGEN, 2012. QIAGEN Plasmid Purification Handbook. s.l.:QIAGEN.
Shaner, N. C. et al., 2008. Improving the photostability of bright monomeric orange and red
fluorescent proteins. Nature, 4 Maj, pp. 545-551.
Snapgene, 2014. TagRFP-T. [Online]
Available at:
http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/fluorescent_protein_genes_and_plasmids/TagRF
P-T/
[Senest hentet eller vist den 30 December 2014].
Stilling, B., 2012. Biokemi og bioteknologi. 2. red. Valby: Nyt Teknisk Forlag.
~ 29 ~
Thermo Scientific, 2012. PRODUCT INFORMATION Thermo Scientific GeneRuler 1 kb DNA
Ladder. [Online]
Available at: http://www.thermoscientificbio.com/uploadedFiles/Resources/prodinfo-SM0311GeneRuler-1-kb-DNA-Ladder.pdf
[Senest hentet eller vist den 28 November 2014].
Thougaard, H., Varlund, V. & Madsen, R. M., 2011. Mikrobiologi. 3. red. Valby: Nyt Teknisk
Forlag.
~ 30 ~
Bilag 1 – Sekvensen for TagRFP-T
~1~
~2~
Bilag 2 – Mærkning
Ethidiumbromid (10 mg/mL)
Advarsel
H341: Mistænkt for at forårsage genetiske defekter.
P261: Undgå indånding af damp, aerosoler eller pulver.
P304+340: VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vejrtrækningen lettes.
P308+313: VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp.
Affaldsgruppe B
Ampicillin (100 mg/mL)
Fare
H334: Kan forårsage allergi- eller astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved indånding.
H317: Kan forårsage allergisk hudreaktion.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
Affaldsgruppe B
50x TAE buffer
Mærkning på baggrund af selvvurdering:
Advarsel
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation.
H315: Forårsager hudirritation.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
P302+352: VED KONTAKT MED HUDEN: Vask med rigeligt vand.
Affaldsgruppe H
~3~
Lysozym
Mærkning på baggrund af selvvurdering:
Fare
H334: Kan forårsage allergi- eller astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved indånding.
H317: Kan forårsage allergisk hudreaktion.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
P302+352: VED KONTAKT MED HUDEN: Vask med rigeligt vand.
P304+340: VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vejrtrækningen lettes.
"Forsigtig - stoffet er endnu ikke fuldstændigt undersøgt".
Affaldsgruppe H
Ethanol
Fare
H225: Meget brandfarlig væske og damp.
P210: Holdes væk fra antændelseskilder. Rygning forbudt.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
P303+361+353: VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages
straks af. Skyl/brus huden med vand.
Affaldsgruppe C
Isopropanol
Fare
H225: Meget brandfarlig væske og damp.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation.
H336: Kan forårsage sløvhed eller svimmelhed.
EUH019: Kan danne eksplosive peroxider.
P210: Holdes væk fra antændelseskilder. Rygning forbudt.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
P304+340: VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vejrtrækningen lettes.
P305+351+338: VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning.
Affaldsgruppe C
~4~
Buffer P2, lysis buffer
Buffer P3, neutralization buffer
Buffer QBT, Equilibration buffer
Buffer QC, Wash buffer
~5~
Buffer QF, elution buffer
SDS-PAGE
Henvisnings
nummer
Klassificering
1 1,5 M Tris-HCl
Advarsel
H-sætninger
P-sætninger
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation.
H315: Forårsager
hudirritation.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
P302+352: VED KONTAKT MED HUDEN: Vask
med rigeligt vand.
P305+351+338: VED
KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med
vand i flere minutter. Fjern
eventuelle kontaktlinser,
hvis dette kan gøres let.
Fortsæt skylning.
P332+P313: Ved hudirritation: Søg lægehjælp
P337+P313: Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp
P280: Bær beskyttelsesH
handsker/øjenbeskyttelse.
P261: Undgå indånding af
damp.
P302+352: VED KONTAKT MED HUDEN: Vask
med rigeligt vand.
P305+351+338: VED
KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med
vand i flere minutter. Fjern
eventuelle kontaktlinser,
Eye irrit. 2
Skin irrit. 2
2 10 % SDS
Mærkning på baggrund af selvvurdering:
Fare
Resp. Sens. 1,
1A, 1B
Eye irrit. 2
Skin irrit. 2
Skin sens. 1,
1A, 1B
H334: Kan forårsage
allergi- eller astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved
indånding.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation.
H315: Forårsager
~6~
Affalds
faldsgruppe
H
hudirritation.
H317: Kan forårsage
allergisk hudreaktion.
hvis dette kan gøres let.
Fortsæt skylning.
"Forsigtig - stoffet er endnu
ikke fuldstændigt undersøgt".
3 30 % Acrylamide/bis
Fare
Acute tox. 3
Carc. 1B
Repr. 2
Muta. 1B
STOT RE 1
Eye Irrit. 2
Skin Irrit. 2
Skin Sens. 1
4 0,5 M Tris-HCl Ingen
5 Glycerol
Ingen
6 0,5 % Bromophenol blå
7 βMercaptoethanol
H301: Giftig ved indtagelse.
H350: Kan fremkalde
kræft.
H361: Mistænkes for
at skade forplantningsevnen.
H340: Kan forårsage
genetiske defekter.
H372: Forårsager organskader ved længerevarende eller gentagen eksponering.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation.
H315: Forårsager
hudirritation.
H317: Kan forårsage
allergisk hudreaktion.
Ingen
Ingen
H310: Livsfarlig ved
hudkontakt.
H301: Giftig ved indtagelse.
H314: Forårsager
svære forbrændinger
af huden og øjenskader.
~7~
P202: Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst
og forstået.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
Z
Ingen
Ingen
P273: Undgå udledning til
miljøet.
Vasken
H
H
"Forsigtig - stoffet er endnu
ikke fuldstændigt undersøgt".
P280: Bær
B
handsker/øjenbeskyttelse/ansigts
beskyttelse.
P302+352: VED KONTAKT MED HUDEN: Vask
med rigeligt vand.
P305+351+338: VED
Fare
Acute tox. 1/2
(dermal)
Acute tox. 3
(oral)
Skin Corr. 1B
Aquatic
Chronic 3
8 Trizma base
Advarsel
Eye irrit. 2
Skin irrit. 2
STOT SE 3
9 Glycin
10 SDS
Ingen
Fare
H411: Giftig for vandlevende organismer,
med langvarige virkninger.
EUH071: Ætsende for
luftvejene.
KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med
vand i flere minutter. Fjern
eventuelle kontaktlinser,
hvis dette kan gøres let.
Fortsæt skylning.
P273: Undgå udledning til
miljøet.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation
H315: Forårsager
hudirritation
H335: Kan forårsage
irritation af luftvejene
P280: Bær beskyttelsesH
handsker/øjenbeskyttelse.
P302+352: VED KONTAKT MED HUDEN: Vask
med rigeligt vand.
P304+340: VED INDÅNDING: Flyt personen til et
sted med frisk luft og sørg
for, at vejrtrækningen lettes.
P305+351+338: VED
KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med
vand i flere minutter. Fjern
eventuelle kontaktlinser,
hvis dette kan gøres let.
Fortsæt skylning.
Ingen
H
P210: Holdes væk fra anH
tændelseskilder. Rygning
forbudt.
P261: Undgå indånding af
støv.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
P305+351+338: VED
KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med
vand i flere minutter. Fjern
eventuelle kontaktlinser,
hvis dette kan gøres let.
Ingen
Mærkning på baggrund af selvvurdering:
H228: Brandfarligt
fast stof.
H311: Giftig ved hudkontakt.
H302: Farlig ved indtagelse.
H334: Kan forårsage
allergi- eller astmasymptomer eller ån-
~8~
Flam. Sol. 1/2
Acute tox. 3
Acute tox. 4
Resp. Sens. 1,
1A, 1B
Skin sens. 1,
1A, 1B
Eye irrit. 2
STOT SE 3
Skin Irrit 2
Reagens
Klassificering
A
Separationsgel
Fare
Acute tox. 4
Carc. 1B
Repr. 2
Muta. 1B
STOT RE 1
Eye Irrit. 2
Skin Irrit. 2
Skin Sens. 1
B
Stacking-gel
dedrætsbesvær ved
indånding.
H317: Kan forårsage
allergisk hudreaktion.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation.
H335: Kan forårsage
irritation af luftvejene.
H315: Forårsager
hudirritation.
Fortsæt skylning.
"Forsigtig - stoffet er endnu
ikke fuldstændigt undersøgt".
H-sætninger
P-sætninger
H302: Farlig ved indtagelse.
H350: Kan fremkalde
kræft.
H361: Mistænkes for
at skade forplantningsevnen.
H340: Kan forårsage
genetiske defekter.
H372: Forårsager organskader ved længerevarende eller gentagen eksponering.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation.
H315: Forårsager
hudirritation.
H317: Kan forårsage
allergisk hudreaktion.
P202: Anvend ikke
produktet, før alle
advarsler er læst og
forstået.
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse.
P261: Undgå indånding af damp.
P302+352: VED
KONTAKT MED
HUDEN: Vask med
rigeligt vand.
P305+351+338:
VED KONTAKT
MED ØJNENE:
Skyl forsigtigt med
vand i flere minutter.
Fjern eventuelle
kontaktlinser, hvis
dette kan gøres let.
Fortsæt skylning.
P202: Anvend ikke
produktet, før alle
advarsler er læst og
forstået.
P280: Bær beskyttel-
H350: Kan fremkalde
kræft.
H361: Mistænkes for
at skade forplantningsevnen.
~9~
Affalds- Opbevaring
faldsgruppe
Z
Ingen særlige
Z
Ingen særlige
Fare
Carc. 1B
Repr. 2
Muta. 1B
STOT RE 2
Eye Irrit. 2
Skin Sens. 1
C
Sample
buffer
Fare
Reps. Sens. 1,
1A, 1B
Acute tox. 1/2
Skin Corr. 1A-C
Eye Irrit. 2
Skin sens. 1, 1A,
1B
Aquatic Chronic
3
D
10x
Running
H340: Kan forårsage
genetiske defekter.
H373: Kan forårsage
organskader ved længerevarende eller gentagen eksponering.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation.
H317: Kan forårsage
allergisk hudreaktion.
seshandsker/øjenbeskyttelse
P261: Undgå indånding af damp.
P302+352: VED
KONTAKT MED
HUDEN: Vask med
rigeligt vand.
H334: Kan forårsage
allergi- eller astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved
indånding.
H310: Livsfarlig ved
hudkontakt.
H314: Forårsager
svære forbrændinger
af huden og øjenskader.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation
H317: Kan forårsage
allergisk hudreaktion.
H412: Skadelig for
vandlevende organismer, med langvarige
virkninger
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse
P302+P350+P310:
VED KONTAKT
MED HUDEN:
Vask forsigtigt med
rigeligt sæbe og
vand. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller
en læge
P304+P342+P311:
VED INDÅNDING:
Ved luftvejssymptomer: Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller
en læge
P305+P351+P338:
VED KONTAKT
MED ØJNENE:
Skyl forsigtigt med
vand i flere minutter.
Fjern eventuelle
kontaktlinser, hvis
dette kan gøres let
P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttelse
P305+P351+P338:
H334: Kan forårsage
allergi- eller astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved
~ 10 ~
B
H
buffer
Fare
indånding.
H319: Forårsager alvorlig øjenirritation
H317: Kan forårsage
allergisk hudreaktion.
Reps. Sens. 1,
1A, 1B
Eye Irrit. 2
Skin sens. 1, 1A,
1B
E
1x
Running
buffer
Ingen
Ingen
~ 11 ~
VED KONTAKT
MED ØJNENE:
Skyl forsigtigt med
vand i flere minutter.
Fjern eventuelle
kontaktlinser, hvis
dette kan gøres let
P302+P352: VED
KONTAKT MED
HUDEN: Vask med
rigeligt sæbe og
vand.
Ingen
Vasken
~ 12 ~
Bilag 3 – Journalskrivning
~ 13 ~
~ 14 ~
Bilag 4 – Producenter og batchnumre
Celler og plasmider
Celle/plasmid
E. coli BL21 (DE3)
E. coli NEB 5-alpha
EX1D
RFP
Producent
New England Biolabs
New England Biolabs
AAU
AAU
Lot/batch
0511107
1111206
Producent
Applichem
Merck
AAU
Sigma
AAU
Lot/batch
2M007007
VM619326 346
16-09-13, DAR
BCBC2317
16-09-13 DAR
Producent
Sigma
Sigma
AAU
Fermentas
Fermentas
Lot/batch
100M9432V
SLBF7132V
Medier (flydende og faste)
Kemikalie/opløsning
Tryptone
Yeast extract
Ampicillin (100 mg/mL)
Agar
IPTG (100 mM)
Agarosegeler
Kemikalie/opløsning
Agarose
Ethidiumbromid (10 mg/mL)
TAE-buffer
GenerulerTM 1 kb DNA Ladder
6x DNA Loading Dye
Elektroforese:
03610
00065513
00071285
Biorad Powerpac 300, serienr. 283BR 03611 og 283BR
QIAGEN Plasmid Midi Kit
Kemikalie/opløsning
P1, Resuspension buffer
P2, Lysis buffer
P3, Neutralization buffer
QBT, Equilibration buffer
QC, Wash buffer
QF, Elution buffer
QIAGEN-tip 100 (kolonne)
Isopropanol
DNA-vand
Producent
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
QIAGEN
Sigma Aldrich
Sigma Aldrich
~ 15 ~
Lot/batch
136261867
139272674
136266196
136261729
139273016
139271253
139273489
SZBD280CV
RNBC3293
Centrifuge: Sorvall Lynx 4000, serie nr. 41579486
Rotorer:
A27 – 8x50 og Fiberlite F12 – 6x500 LEX
Restriktionsenzymer + PCR reagenser + ligering
Kemikalie/opløsning
Skæringsbuffer, 10x Tango
NdeI (10 U/µL)
BamHI (20.000 U/mL)
SmaI (10 U/µL)
dNTPs (200 µM each)
MgCl2 (2 mM)
10x Dream Taq Buffer
Primer 1, RFPforward (100
pmol)
Primer 2, RFPreverse (100
pmol)
Dream Taq polymerase (5
U/µL)
10x T4 DNA Ligase buffer
T4 DNA Ligase (400.000
U/mL)
Producent
Fermentas
Thermo Scientific
Fermentas
Fermentas
AAU
Fermentas
Thermo Scientific
TAG Copenhagen A/S
Lot/batch
00033251
00125955
00071399
00027513
00029381
00106086
131120J1 H05
TAG Copenhagen A/S
131120J1 B08
Thermo Scientific
00177587
New England Biolabs
New England Biolabs
0020906
0991012
PCR cycler: Eppendorf Mastercycler gradient, serienr. 5331 02596
PCR Clean Up med Nucleospin ® Extract II, Macherey-Nagel
Kemikalie/opløsning
NT Binding buffer
NT 3 Wash buffer
NE Elution buffer
Producent
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Macherey-Nagel
Lot/batch
PAF0019214
PAF0018975
PAF0018617
Producent
Millipore
AAU
Sigma
Lot/batch
Præcipitation
Kemikalie/opløsning
Centrifugal Filter Units
NaAc
Elution solution
024K6600
~ 16 ~
Centrifuge: Eppendorf 5417R, serienr. 0017315
Rotor:
FA45-30-11
SDS-PAGE
Kemikalie/opløsning
0,5 M Tris-HCl pH 6,8
1,5 M Tris-HCl pH 8,8
10 % SDS
10 % APS
TEMED
30 % Acrylamid/Bis
1x TGS running buffer
LMW marker
Sample buffer
Producent
AAU
AAU
AAU
AAU
Sigma
AAU
AAU
Amersham
AAU
Lot/batch
01-10-2014 Gruppe 4: JKJ
01-10-2014 Gruppe 2: LNS
17-12-14 TBN
036K0694
14-02-14 KBJ
02-10-2014 KDH
Mini-PROTEAN® 3 Cell, Biorad
Diverse apparaturer
Centrifuge:
Eppendorf 5804R, serienr. 0031263
Rotor:
F-34-6-38
Thermomixer:
Eppendorf Thermomixer comfort, serienr. 5355 05175
Spektrofotometer:
Pharmacia Biotech Ultrospec 3000, serienr. 70056
Block heater:
Stuart Scientific Test tube heater, serienr. 3139
~ 17 ~
~ 18 ~
Bilag 5 – Flowsheet
RFP
EX1D
Transformation
Transformation
Oprensning af plasmid DNA
Oprensning af plasmid DNA
Skæring med NdeI og BamHI
PCR
Præcipitering fra præparativ gel
Skæring med NdeI og BamHI
Præcipitering fra præparativ gel
Ligering
Transformation
Isolering af kolonier
Oprensning af plasmid DNA
Transformation
Ekspression
Karakterisering
~ 19 ~
~ 20 ~
Bilag 6 - Forskrifter
Kemisk transformation:
-
4 µL plasmid DNA
tilsæt 20 µl optøede kompetente E. coli celler
20 min på is
60 sek ved 42 °C i termomixer --> heatshock!
tilsæt 500 µl opvarmet (37 °C) LB medium
ryst i 1 time ved 37 °C, 230 rpm
udplad 100 µl på en LB/Amp plade, resten på en anden
inkubér over nat ved 37°C
LB medium:10 g/l Tryptone
5 g/l Yeast Extract
5 g/l NaCl
pH 7.5
(100 mg/l Ampicillin)
(15 g/l Agar)
Oprensning af plasmid DNA ved kit:
Oprensningen er udført efter protokollen ”Plasmid og Cosmid DNA Purification Using QIAGEN
Plasmid Midi and Maxi Kits” fra håndbogen ”QIAGEN® Plasmid Purification Handbook”
(QIAGEN, 2012), som kan findes på Internettet og følger med kittet.
Agarosegelelektroforese:
Der anvendes agarosegeler, som består af 1 % agarose i 1x TAE buffer. Til hver gel bruges ca. 30
mL, som tilsættes 0,5 µL 10 mg/mL ethidiumbromid. 1x TAE buffer bruges også som running buffer. Gelen kører ved 95 V i 60-90 min.
1x TAE buffer:
0,04 M Tris-acetat
1 mM EDTA
~ 21 ~
Skæring af EX1D med enzymer:
Rør 1:
-
Rør 2:
47 µL EX1D
- 47 µL EX1D
12 µL skæringsbuffer (10x Tango) - 12 µL skæringsbuffer (10x Tango)
3 µL NdeI
- 3 µL BamHI
Inkubér ved 37 °C i 2-3 timer. Test herefter på gel, om skæring er lykkedes og tilsæt derefter 3 µL
af det andet enzym og inkubér ved 37 °C i 2-3 timer. Test igen på gel.
PCR:
-
4 µL dNTPs (20 nmol/µL opløsning af hver)
8 µL MgCl2 (25 mM)
10 µL 10x PCR buffer
10-20 ng template (her: 1 µL)
1 µL Primer 1 (100 pmol/µL)
1 µL Primer 2 (100 pmol/µL)
0,5 µL Taq polymerase (5 U/µL)
74,5 µL DNA vand
Skæring af PCR-produkt med enzym:
-
46 µL PCR-produkt
12 µL skæringsbuffer (10x Tango)
3 µL BamHI
Inkubér ved 37 °C i 2-3 timer. Tilsæt derefter 3 µL NdeI og inkubér ved 37 °C i 2-3 timer.
DNA-præcipitation fra præparativ gel:
Fra en agarosegel skæres det ønskede bånd ud, skæres i små stykker, pakkes i parafilm og lægges i
fryseren i 1½-2 timer. DNA ekstraheres herefter ved brug af centrifugal filter units.
Præcipitation:
-
Tilsæt et volumen 3 M NaAc svarende til 1/10 af volumen af DNA
Tilsæt et volumen 96 % ethanol svarende til det dobbelte volumen af DNA
30 min. i fryser
30 min. centrifugering ved 20.000 g (5 °C)
Frahæld supernatant
Vask med 200 µL 80 % ethanol, centrifuger i 5 min. ved 20.000 g (5 °C)
Frahæld supernatant, lad pellet tørre og opløs i 20 µL Elution solution (10 mM Tris-HCl, pH
8,5)
~ 22 ~
Ligering:
Ligering:
Kontrolligering:
-
- 7 µL EX1D (200 ng)
- Intet PCR-produkt
- 2 µL 10x ligasebuffer
- 1 µL 10 mM ATP
- 9 µL DNA-vand
- 1 µL ligase
7 µL EX1D (200 ng)
8 µL PCR-produkt (80 ng)
2 µL 10x ligasebuffer
1 µL 10 mM ATP
1 µL DNA-vand
1 µL ligase
Inkubér ved 8-10 °C i 3½ time, derefter stuetemperatur i 45 min.
Oprensning af plasmid DNA ved kogemetoden:
-
Opløs celler fra en plade i 400 µL TELT buffer ved at vortexe
Tilsæt nogle få krystaller lysozym og vortex
Varmebehandl prøverne ved 95 °C i 90 sek.
Sæt straks prøverne på is og lad dem køle i 10 min.
Centrifuger i 20 min. ved 14.000 rpm (5 °C)
Fjern pellet med en tandstikker
Tilsæt 240 µL isopropanol og sæt på is i 10 min.
Centrifuger i 30 min. ved 14.000 rpm (5 °C)
Fjern supernatanten uden at løsne pellet
Vask pellet med 300 µL 70 % ethanol
Fjern forsigtigt væsken og tør pellet
Opløs pellet i 40 µL DNA-vand
TELT buffer:
50 mM Tris
62,5 mM EDTA
2,5 M LiCl
0,4 % Triton X-100
pH 7,5
Skæring med SmaI
-
5 µL oprenset DNA
2 µL skæringsbuffer (10x Tango)
13 µL DNA-vand
1 µL SmaI
Inkubér ved 30 °C i ca. 1. time
~ 23 ~
Ekspression:
Efter kemisk transformation dyrkes en forkultur af en koloni i LB/Amp-medium ved 25 °C, 230
rpm over nat. Denne kultur anvendes til at dyrke en hovedkultur:
-
Hovedkultur dyrkes af 2,2 mL forkultur i 50 mL LB/Amp-medium ved 25 °C, 230 rpm
til OD ca. 0,5 (600 nm)
Inducer med 0,3 mM IPTG og fortsæt vækst ved 25 °C, 230 rpm over nat
Da der arbejdes med et lysfølsomt protein, foregår væksten i mørke.
Cellehøst:
-
Høst celler ved 6000 rpm i 6 min.
Opsaml supernatant, opslem celler i 3,3 mL TES-buffer og centrifuger i 20 min. ved
9000 rpm
Opsaml supernatant, opslem i 3,3 mL Mili Q vand og centrifuger i 35 min. ved 9000
rpm
Opsaml supernatant
TES buffer: 50mM Tris
10mM EDTA
20% sucrose
pH 7.5 (autoklaved)
Karakterisering ved SDS-PAGE:
% Acrylamid
Ionbyttet H2O
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
10 % SDS
30 % Acrylamid/Bis
10 % APS
TEMED
Stackinggel
4,0
3,05 mL
1,25 mL
50 µL
0,65 mL
30 µL
10 µL
Separationsgel
12
1,68 mL
1,25 mL
50 µL
2,0 mL
30 µL
10 µL
~ 24 ~
Prøveforberedelse:
Prøverne fortyndes 2 gange med sample buffer. Herefter varmebehandles de ved 95 °C i 3 min og
opbevares derefter på is indtil loading. Der loades 10 µL af TES- og Mili Q fraktioner og 20 µL af
mediefraktioner. Der loades 3 µL markør. Gelen kører ved 130 V i 60-100 min.
1x TGS running buffer: 0,3 % Trizma base
1,4 % Glycin
0,1 % SDS
~ 25 ~
~ 26 ~
Bilag 7 – Vækstkurver
19
25
Tid
(min)
OD
LogOD OD
0,213
-0,67162
0,195
59
0,441 -0,35556
0,349
141
0,666 -0,17653
0,519
182
1,725 0,236789
1,18
312
2,18 0,338456
1,51
388
Efter 3. måling induceres med IPTG
LogOD
-0,70997
-0,45717
-0,28483
0,071882
0,178977
Vækstkurver
0,4
0,2
LogOD
0
0
100
200
300
400
500
19
-0,2
25
-0,4
-0,6
-0,8
Tid (min)
~ 27 ~
~ 28 ~
Bilag 8 – Beregning af molekylvægt
kDa
97
66
45
30
20,1
14,4
logkDa Vandring (cm)
1,986772
1,0
1,819544
1,6
1,653213
2,5
1,477121
3,9
1,303196
5,4
1,158362
6,7
Standard
2,2
2
LogkDa
1,8
1,6
1,4
1,2
y = -0,1177x + 1,9421
R² = 0,9993
1
0
1
2
3
4
5
6
Vandringslængde (cm)
19 H2O
25 H2O
EX1D
Vandring (cm)
4,2
4,6
4,6
logkDa kDa
1,447978
28
1,447978
25
1,400915
25
Eksempel:
=
19:
+
→
= −0,1177 + 1,9421
= −0,1177 ∙ 4,2 + 1,9421 = 1,448
= 1,448 →
= 10
~ 29 ~
,
= 28
7
8