1. No category

Kompendium i Bioteknologi (TBT4170)
Det følgende er en oppsummering av emnet TBT4170 Bioteknologi på NTNU basert på pensumboka Biotechnology for
Beginners av Reinhard Renneberg, og forelesninger. Det ble i utgangspunktet skrevet som en slags ordliste (men det
tok litt av), derfor starter mange avsnitt med en kort definisjon/beskrivelse av det som står i overskriften.
På slutten av dokumentet ligger det en tonsill (mange dokumenter har appendiks, men man skal ikke glemme at
kroppen har da sannelig andre organer som kan skjæres vekk også) med blant annet lenker til videoer og artikler,
kildekoden til dette dokumentet, og et register.
Sist oppdatert 29. mai 2015.
Jonathan Reichelt Gjertsen
jonath.re@gmail.com
Innhold
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cellebiologi
Enzymer
Genteknologi
Industriell bioteknologi
Medisinsk bioteknologi
Miljøbioteknologi
Grønn bioteknologi
Kloning og embryoer
Medisinsk bioteknologi II
Analytisk bioteknologi
1
1
4
6
8
12
14
17
20
21
23
Cellebiologi
samt dannelse av forløperne til makromolekyler som karbohydrater, aminosyrer og fettsyrer.
Dette kapittelet er en innføring i hvordan celler er
bygget opp, samt litt om hvordan celler tar opp og bruker Genetiske funksjoner Celler lagrer og prosesserer
genetisk informasjon, som videreføres til etterkommere
energi (metabolisme).
gjennom reproduksjon. Denne informasjonen er lagret
som DNA. De genetiske funksjonene til en celle fasiliterer
1.1 Celler
reproduksjon. Genetiske funksjoner i cellen inkluderer transkripsjon (produksjon av RNA fra DNA) og translasjon
Celle Den fundamentale enheten for liv.
(produksjon
av proteiner fra RNA).
Alle celler
• er avgrenset fra omgivelsene med en cellemembran,
• er åpne systemer med metabolisme (de tar opp
næringsstoffer fra miljøet, transformerer dem, og
slipper ut avfallsstoffer i miljøet),
• er i stand til å vokse ved å omforme kjemikaler fra
miljøet til nye celler, og
• inneholder gener, og er del av en evolusjonsprosess:
endringer i genene videreføres til etterkommere.
Noen celler
• kan bevege seg på egenhånd ved hjelp av spesialiserte
strukturer (dette kalles motilitet),
• kan forandre form og egenskaper i løpet av forskjellige
faser i en livssyklus (dette kalles differensiering),
• kan kommunisere og interagere med andre celler ved
hjelp av kjemikalier som tas opp og slippes løs i
miljøet, eller
• kan overføre arvematerialer til og fra andre celler
(dette kalles horisontal genetisk utveksling).
Prokaryot celle En kategori relativt enkle celler som
omfatter bakterier og arkebakterier. Navnet kommer fra
det greske karyon (kjerne), og forteller at dette er cellene
som fantes før (pro) det fantes organismer med cellekjerne.
Det hender at “bakterie” og “prokaryot” brukes om hverandre litt upresist, men det går stort sett fint.
Alle prokaryoter har
• en cytoplasmamembran (se eget avsnitt),
• en nukleoid : sirkulært DNA som inneholder den
genetiske koden til organismen, som ikke ligger i en
cellekjerne, og
• ribosomer, som utfører translasjon (lager proteiner
fra RNA).
De fleste prokaryoter har
• plasmid er: små, ekstra fragmenter av DNA utenfor
nukleoiden,
• en cellevegg som beskytter cellen mekanisk og kjemisk
fra omgivelsene og er et ekstra beskyttende lag,
og/eller
• flagella og pili (strukturer på utsiden av cellen som
gjør cellen i stand til å bevege seg på egenhånd og
kommunisere med andre celler).
Katalytiske funksjoner Celler utfører kjemiske reaksjoner som akselereres via enzymer. Dette beskrives i
Kapittel 2. De katalytiske funksjonene til en celle fasiliterer
cellevekst, og inkluderer lagring av energi i form av ATP,
1
Eukaryot celle Cellene som planter, dyr og sopper
selv om konsentrasjonsgradienten i miljøet skulle tilsi
består av. De er større og mer komplekse enn prokaryote
det motsatte,
celler. De har forskjellige kompartementer som utfører
• er et anker for viktige proteiner (som beskrevet over),
spesifikke metabolske oppgaver og er adskilt fra hverandre
og
med membraner.
• spiller en viss rolle i energilagring: det produseres
eller brukes energi når ioner passerer cellemembraAlle eukaryoter har
nen, avhengig av om ionet henholdsvis følger konsen• en cellekjerne, som inneholder cellens DNA, organistrasjonsgradienten eller går motsatt vei av den.
ert i form av kromosomer,
• mitokondrier som genererer energi,
• en cytoplasmamembran (se under),
Regler for bevegelse gjennom cellemembranen
• ribosomer,
• endoplasmatisk retikulum, et transportnettverk for
• Enkelte små uladde molekyler (som vann) kan passere
molekyler som skal til bestemte steder, og
gjennom passiv diffusjon.
• et golgiapparat som prosesserer og pakker makro• Store molekyler og små ladde molekyler kan ikke
molekyler som syntetiseres av cellen, f.eks proteiner
passere gjennom membranen på passivt vis, men
og lipider.
må delvis degraderes før opptak. For eksempel må
Noen eukaryoter har
proteiner degraderes til aminosyrene de består av.
• kloroplaster, også kjent som grønnkorn, som utfører
• Mange typer molekyler kan passere gjennom aktive
fotosyntese, og
transportsystemer - disse prosessene er forskjellige
• cellevegg.
fra stoff til stoff, og kan kreve energi ved bruk av
ATP.
Cellemorfologi Morfologi er læren om form, og celler
kan ha forskjellige former. De vanligste celleformene for
prokaryoter er coccus (kulerunde eller eggformede), stav
1.2 Metabolisme
(sylindriske) og spirillum (spiralformede). Faktorer som
Metabolisme De livgivende kjemiske reaksjonene som
kan påvirke cellemorfologi er
• Optimalisering av næringsopptak. Dette favoriserer foregår i celler. Den deles opp i katabolisme og anabolisme.
små celler med stort areal per volum, siden næringsopptak skjer ved celleoverflaten.
• Svømmeevne i tyktflytende medier eller nær over- Katabolisme Den delen av metabolismen som bryter
ned organiske stoffer til enklere stoffer og henter energi gjenflater. Dette favoriserer spiralformede celler.
nom en rekke kjemiske reaksjoner som kalles celleånding.
• Glideevne. Dette favoriserer tynne bakterier.
Alle avsnittene mellom dette og “Anabolisme” omhandler
Cytoplasmamembran Halvgjennomtrengelig mem- aspekter ved katabolisme.
bran som omringer cellen, og skiller innholdet i cellen
(cytoplasmaet) fra miljøet. Den er 6-8nm tykk. Den
består av et dobbeltlag av fosfolipider der de hydrofobe
karbonkjedene er vendt mot hverandre og de hydrofile
fosfat/glyserol-endene er vendt utover mot miljøet og
innover mot cytoplasmaet. Det finnes andre variasjoner
over samme tema, der andre kjemiske grupper er bundet
til glyserol-“ryggraden”.
Metabolsk diversitet Forskjellige mikroorganismer har
gjennom 4 milliarder år med evolusjon utviklet metoder for
å oppta energi fra miljøet på nesten alle tenkelige måter.
Figur 1 viser en oversikt over metabolsk diversitet: organismer som bruker lys som energikilde kalles fototroper - dette
kan skje ved oksygenisk fotosyntese (produserer oksygen)
eller anoksygenisk fotosyntese (produserer ikke oksygen).
Andre organismer kalles kjemotrofer og opptar energi ved å
oksidere kjemisk drivstoff. Organismer som bruker uorganiske stoffer (H2 H2 SFe2+ NH4+ , etc) som energikilde kalles
kjemolitotrofer - kun prokaryoter er kjemolitotrofer. Organismer som bruker organiske stoffer (glukose, acetat,
etc.) som energikilde kalles kjemoorganotroper - aerobe
organismer bruker oksygen for å ta opp energi og anaerobe
organismer opptar energi i fravær av oksygen). Uansett
hvordan energien er tatt opp fra miljøet, lagres den som
ATP.
Proteiner i cytoplasmamembranen Det finnes proteiner som “setter seg fast” inne i cellemembranen. Disse
kalles membranproteiner. De kan enten stikke ut på en
side (perifere membranproteiner) eller på begge (dvs. at de
går tvers igjennom - integrale membranproteiner). Dette
stabiliseres av hydrogenbindinger. I tillegg kan Mg2+ og
Ca2+ -ioner stabilisere membranen ved å lage ionebindinger.
Membranforsterkere Noen membranforsterkende stoffer er steroler (stive plane lipider som finnes i eukaryoter)
og hopanoider (ligner på steroler og finnes i bakterier).
Autotrofer og heterotrofer Alle organismer trenger
karbon. Autotrofer får karbonet sitt fra CO2 , og kalles
ofte primærprodusenter. Heterotrofer trenger ett eller flere
organiske molekyler som kilde for karbon, og får tak i dette
enten ved å spise autotrofer eller produkter som produseres
av autotrofer, eller ved å spise andre heterotrofer.
Funksjonene til cytoplasmamembranen Cytoplasmamembranen
• er en halvtgjennomtrengelig membran som er spesifikk nok til at næringsstoffer kommer inn og avfallsstoffer går ut (ved hjelp av transportproteiner),
2
• nukleinsyrer (består av nukleotider, brukes til å lagre,
transportere og uttrykke genetisk informasjon),
• proteiner (består av aminosyrer, brukes til enzymer,
som strukturelle komponenter og til transport av
molekyler), og
• lipider (består av glyserol, fettsyrer og i noen tilfeller fosfat, fungerer som membraner (enten cytoplasmamembranen eller intracellulære kompartmenter)).
Ekstremofile organismer Organismer som overlever i
ekstreme habitater der de har funnet sin egen nisje, for
eksempel kokende varme kilder, breer, og vann med ekstremt høy saltkonsentrasjon eller pH. Teknikkene som
ekstremofile organismer bruker for å takle slike miljøer,
kan være interessante å studere, bruke og forsøke å gjenskape.
Aerob glukosemetabolisme Aerob glukosemetabolisme
er cellens mest effektive metode for å produsere ATP. Det
kalles også respirasjon, og involverer den vanlige reaksjonen
for celleånding:
38 ADP til ATP
C6 H12 O6 + 6 O2 −−−−−−−−−−→ 6 CO2 + 6 H2 O
Anaerob glukosemetabolisme Kalles fermentering,
og involverer reaksjoner som
1-4 ADP til ATP
C6 H12 O6 −−−−−−−−−−−→ 2 C2 H5 O2 + 2 CO2
Det produseres mye mindre cellemasse gjennom fermentering enn ved respirasjon (kun 5%). Reaksjonen krever mer glukose per ATP som blir produsert, og produserer sideprodukter som etanol. Eksempler på anaerob
Figur 1: Klassifisering av organismer, basert på energikilde. glukosemetabolisme er gjæring, og er når menneskekroppen
danner melkesyre.
Energibærere Energivalutaen i celler er Adenosin trifosfat (ATP). ATP er det som produseres når cellen bryter ned næringsstoffer, og det som brukes når cellen skal
gjøre noe som krever energi. Reaksjonen der ATP mister
en fosfatgruppe for å bli adenosin difosfat (ADP) slipper løs 32 kJ/mol. De samme gjelder ADP −−→ AMP.
AMP −−→ Adenosin slipper løs 14 kJ/mol når fosfatadenosin-bindingen kuttes. Ett vannmolekyl inngår i hver
slik spaltning.
Gjæring Når konsentrasjonen av O2 blir lav, endres
genuttrykket i gjær slik at det er andre enzymer som
aktiveres. I stedet for enzymene som utfører aerob
metabolisme, aktiveres enzymene som utfører anaerob
metabolisme. Dette er prinsippet bak gjøring.
Elektronbærere Energibærere som overfører elektroner: Metabolsk spor Et metabolsk spor er en tegning av
nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) og flavin adenin veien fra næringsstoff til produkt, med piler mellom mellomprodukter. Skissering av metabolske spor med glukose
dinukleotid (FAD).
som utgangspunkt sies å være veldig eksamensrelevant.
Langtidslagring av energi Gjøres ved å lagre stoffer
som uløselige polymerer som kan oksideres for å generere
ATP. Noen eksempler er glykogen, polyhydroksyalkanoater Glukosemetabolisme Figur 2 er en omformulering av
og svovel i prokaryoter; og stivelse og fettsyrer i eukaryoter. figuren på slides, og kan med fordel pugges siden detaljer
herfra har vært eksamensoppgaver. Det er naturligvis en
del forenklinger her, blant annet forklares det ikke hvor
Anabolisme Den delen av metabolismen som lager celman får vann fra. Man blir ikke så fryktelig klok på hvorfor
lens byggestoffer fra enklere stoffer gjennom energikrevende
glukosemetabolisme er relevant for resten av stoffet ved å
reaksjoner.
se på denne figuren. Det blir man derimot ved å se på den
utvidede figuren i Box 1.4 i Renneberg; når du er ferdig
Cellens byggestoffer er
med å lese hele pensum kan du stirre lenge og vel på den
• karbohydrater (består av monosakkarider som figuren, og innse at nesten alle bioproduktene som har blitt
glukose og fungerer som energilager samt en kompo- diskutert til syvende og sist stammer fra nedbrytning av
nent i cellevegger),
glukose.
3
når H fra en aminogruppe og OH fra en karboksylsyregruppe går ut som et vannmolekyl, og legger igjen en
binding som ser slik ut:
På grunn av resonans i peptidbindingen (i resonansstrukturen som ikke er vist i figuren, blir C−O-bindingen til
en C−O– -binding, mens C−N-bindingen blir til en C−N+ binding) kan ikke molekylet rotere rundt en peptidbinding,
og alle atomene som inngår i en peptidbinding (C, O, N,
H) ligger i samme plan.
Figur 2: Oversikt over glukosemetabolismen
2
Peptider Korte kjeder av aminosyrer kalles peptider og
navngis ved å begynne på den terminale aminogruppen,
traversere peptidet til man støter på den terminale karboksylsyregruppen, og ramse opp alle aminosyrene på veien.
Fullstendig navngivning av proteiner er dermed upraktisk,
men det som er så fint er at det finnes altså en russisk fyr
som har uttalt hele det fullstendige systematiske navnet til
verdens lengste protein (titin). Det tok så lang tid at man
kunne se forskjellen i skjeggvekst på starten og slutten av
opptaket.
Enzymer
Dette kapittelet forklarer hva proteiner er laget av og
hvordan de er bygd opp. Så går vi nærmere på enzymer og
hvordan de fungerer. Mot slutten også noen eksempler på
enzymer, enzymkatalyserte reaksjoner og bioteknologiske
løsninger som tar i bruk enzymer.
2.1
Proteiner
Primærstrukturen til proteiner er sekvensen av
aminosyrer, samt eventuelle disulfidbindinger mellom cysteingrupper. Primærstrukturen gir opphav til sekundær- og
tertiærstruktur (men du blir ikke akkurat så mye klokere
på høyere ordens struktur ved å se på aminosyresekvensen).
Aminosyrer Karbon bundet til et hydrogenatom, en
karboksylsyregruppe og en aminogruppe, samt en såkalt
R-gruppe som kan være mye rart (upolar alifatisk som i
glysin, aromatisk som i fenylalanin, polar uladd som i serin,
positivt ladd som i lysin, negativt ladd som i aspartat).
9 av de 20 aminosyrene som brukes i proteinsyntese er
essensielle aminosyrer som må opptas gjennom mat.
Sekundærstrukturen til proteiner er lokale strukturer i proteinet. Det er bare to slike strukturer vi snakker
noe særlig om: α-helikser og β-flak.
D- og L-stereoisomeri En type stereoisomeri for
aminosyrer, som fungerer som følger: hvis man lar hydrogenatomet gå inn i arket, har man L-formen hvis gruppene som går mot klokka er COOH −−→ R −−→ NH2 , og
D-formen hvis man får denne rekkefølgen ved å gå med
klokka.
α-heliks Proteinet kan kveile seg i en spiral, som kan
være venstre- eller høyrehendt. Denne strukturen stabiliseres av hydrogenbindinger langs spiralens akse. I en slik
spiral kan man for eksempel ha at en side er hydrofob,
mens den andre er hydrofil.
β-flak Flak som dannes når rette “tråder” av proteinet
bretter seg frem og tilbake, med hydrogenbindinger mellom trådene. Hvis trådene går i samme retning, er flaket
parallelt, og hvis de går i alternerende retninger er flaket
Av en eller annen grunn finnes kun L-enantiomerene antiparallelt. β-flak er foldet i “trekkspill-mønster”, og
til aminosyrene i proteiner. D-aminosyrer finnes an- R-gruppene på aminosyrene vil stå ut av flaket.
dre steder i naturen, der de fungerer som mellomtrinn
i aminosyremetabolisme, i polypeptider i celleveggene til Tertiærstrukturen til proteiner er den tredimennoen bakterier, og som nevrotransmittere (signalstoffer). sjonale strukturen som reflekterer proteinets funksjon. Slik
Det har også blitt syntetisert proteiner av D-enantiomerer struktur er stabilisert av hydrofobe interaksjoner med vann
i laboratoriet - disse vil være speilbilder av proteinene som (hydrofobiske grupper vender seg mot midten av proteinet
dannes fra L-enantiomerene.
og hydrofile grupper vender seg utover) samt hydrogenbindinger og ioniske interaksjoner som optimaliseres i de
Peptidbinding Aminosyrer bindes sammen via peptid- mest termodynamisk stabile strukturene. Disse interakbindinger i lange polymerer som vi kaller proteiner. En sjonene gjør at proteiner har en tendens til å “krølle seg
peptidbinding dannes gjennom en kondensasjonsreaksjon sammen” til den karakteristiske klumpete formen.
4
Kvartærstrukturen til proteiner I noen tilfeller er
det flere proteiner, eller flere molekyler av det samme
proteinet, som går sammen for å danne en større struktur. Denne strukturen kalles da kvartærstrukturen til
proteinet. Et eksempel på et protein med kvartærstruktur
er hemoglobin, der 4 polypeptidkjeder går sammen for å
danne én funksjonell enhet.
gjør at enzymet lokalt ligner på en organisk (upolar) løsning. Dermed blir de få polare gruppene i nærheten svært
reaktive i forhold til det de ville vært i vandig løsning.
Kofaktorer Kjemiske stoffer som ikke er proteiner, og
som et enzym krever for å utføre oppgaven sin. Typisk
inorganiske molekyler som Fe3+ , Mg2+ , Mn2+ og Zn2+ .
Koenzymer Organiske forbindelser som binder seg til
eller i nærheten av det aktive setet. De modifiserer strukEnzym Biologisk katalysator som får reaksjonene i cellen
turen til substratet eller beveger elektroner, protoner eller
til å gå raskere ved å senke aktiveringsenergien til reakkjemiske grupper mellom substratet og enzymet. I motsetsjonene.
ning til enzymene selv brukes koenzymer opp i enzymkatalyserte reaksjoner. Mange av disse kommer fra vitaminer,
Struktur til enzymer De fleste enzymer er proteiner. for eksempel NAD+ fra vitamin B.
Det finnes også enzymer som består helt eller delvis av
RNA, disse kalles ribozymer. Proteiner er bygget opp av Klassifisering av enzymer Det finnes seks typer enaminosyrer som er kovalent bundet til hverandre i lange zymer, som navngis etter hva de gjør:
kjeder. Et område på en enzym der det foregår en reaksjon
• oksidoreduktaser reduserer ett stoff og oksiderer et
kalles et aktivt sete.
annet,
• transferaser overfører kjemiske grupper fra et stoff
Substrat Enzymer er gjerne veldig spesifikke, i så stor
til et annet (gjerne ved hjelp av koenzymer),
grad at proteinet har en fysisk form der molekylet som skal
• hydrolaser kløyver stoffer med addisjon av vann,
prosesseres (dette molekylet kalles substratet) passer inn.
• lyaser kløyver stoffer uten addisjon av vann (og danner gjerne dobbeltbindinger eller ringstrukturer),
• isomeraser omdanner et molekyl til en annen isomer,
Nøkkel-i-lås Dette var den første hypotesen om samog
spillet mellom enzymet og substratet: at substratet passer
•
ligaser bruker ATP for å binde sammen to stoffer.
perfekt inn i enzymet fordi enzymet er en romlig negativ
av substratet. En slik hypotese forklarer hvordan enzymer
kan være så spesifikke.
Eksempler på enzymer og enzymkatalyserte reaksjoner
• Ekstracellulære hydrolaser produseres av mikrober
Hånd-i-hanske Det har vist seg at substratet fungerer
og slippes ut i miljøet for å degraderer biopolymerer
mer som en hånd i en handske, fordi substratet og enzymet
til mindre enheter som kan tas opp av mikroben.
kan påvirke hverandre underveis i reaksjonen. Enzymet og
De brukes også av edderkopper til såkalt ekstrainsubstratet er altså litt mer fysisk fleksible enn nøkkel-i-låstestinal fordøyelse. Ekstracellulære hydrolaser er av
analogien skulle tilsi.
naturlige grunner de enzymene som er enklest og
billigst å ekstrahere fra en cellekultur - det er ikke
Lysozym er det første proteinet som ble analysert ned til
noen cellemembran mellom deg og enzymet. De fire
den minste atomære detalj. Lysozym hydrolyserer bindinneste eksemplene er ekstracellulære hydrolaser.
gen mellom sukkerring 4 og 5 i et molekyl som består av 6
• Malt inneholder amylaser, som bryter opp stivelse til
sukkerringer.
kortere oligosakkarider, samt glucoamylase, som bryter opp oligosakkarider til glukose. Disse enzymene
Glukoseoksidase Dette proteinet omformer β − Dkan brukes i baking for å bryte ned stivelse til sukker
glukose, men ingen andre sukkerarter eller karbohydrater,
og dermed akselerere heving, samt for å degradere
til glukonolaton. Dette er fordi det kun er β − D-glukose
klebrig gluten og gjøre deigen luftigere. I tekstilindussom er lite nok og passer akkurat inn i den romlige struktrien tilsetter man gjerne stivelse for å få fibrene til
turen til glukoseoksidase. Glukoseoksidase er med andre
å holde seg sammen under veving. Amylaser brukes
ord svært substratspesifikt enzym.
til å fjerne stivelse når vevingen er ferdig.
• Pektinaser bryter ned de store pektinmolekylene i
Mulige årsaker til reduksjon i aktiveringsenergi
frukt for å gjøre juicen mindre tyktflytende. Hvis
Enzymer kan redusere aktiveringsenergien til en reaksjon.
man ikke fjerner pektin, får juicen en gel-aktig konEnzymet binder seg ikke til substratet i sin opprinnelige
sistens som er uønsket og vanskelig å håndtere. Pekkonfigurasjon, men til en mellomtilstand som kan være
tinaser hentes fra Aspergillus- og Rhizopus-sopp.
deformert i forhold til det originale stoffet.
• Papaya, fiken og ananas inneholder proteaser som
Inne i enzymet er svært reaktive funksjonelle grupper
bryter ned bindevev i kjøtt, og dermed gjør det
konsentrert på et veldig lite område, og satt sammen på
mørere. De samme enzymene brukes også for å mykne
en måte som gjør at de er i direkte kontakt med bindinlær.
gene i substratet som skal modifiseres. Området rundt
• Hydrolaser med lav substratspesifisitet: brukes som
det aktive setet består stort sett av upolare grupper, som
vaskemidler som bryter ned fett og proteiner, som
2.2
Enzymer
5
binder seg til fibrene i tøy. Fett og proteiner er “limet”
som gjør at skitt setter seg fast i klær. Enzymer er
nyttige fordi de gjør at man kan gjøre oppvasken
på relativt lav temperatur. Før i tida måtte slike
enzymer hentes ut fra bukspyttkjertler til dyr, men
etter at enzymet subtilisin ble oppdaget i Bacillus
licheniformis på 60-tallet, inneholder vaskemiddel
som regel hydrolytiske enzymer fra mikroorganismer.
Andre enzymer som brukes i vaskemiddel er cellulaser, som bryter ned mikrofibre i bomull og gjør
stoffet mer mykt, og amylaser og lipaser som fjerner
matrester i vaskemaskiner.
• Fosfor i planter lagres gjerne i form av fytat, en seksringet forbindelse. Mennesker og dyr klarer ikke å
ta opp fosfor i denne formen, men det finnes mikrobiell fytase som hydrolytisk kløyver fytat slik at man
ender opp med fosfat, som vi kan ta opp. Fytaser er
et spesielt nyttig tilskudd i grisefôr, fordi man slipper
å tilsette så mye miljøskadelig fosfat (kapittel 6) i
fôret.
• Glukoseisomerase: brukes til å omdanne glukose til
fruktose, som er søtere enn glukose (og sukrose).
eukaryote celler er DNA lagret i cellekjernen, samt i mitokondrier og kloroplaster, som har eget DNA (da disse
organellene opprinnelig var bakterier med eget arvemateriale). Grunnenheten som DNA består av er en nukleotid : en base (adenin(A), guanin(G), cytosin(C) eller
tymin(T)/uracil(U) (sistnevnte er henholdsvis for DNA
og RNA)) bundet til et molekyl av sukkeret deoksyribose
(eller ribose, i RNA), som så er bundet til en fosfatgruppe.
Sammensetning Nukleotidene er bundet til hverandre
gjennom fosfodiesterbindinger for å danne en polynukleotidkjede. Vi sier at kjeden har en retning, 5’→3’, fordi
5’-hydroksygruppen på ett nukleotid er bundet til 3’hydroksygruppen på et annet nukleotid via en fosfatgruppe.
Per konvensjon begynner vi på ende-fosfatgruppen som er
bundet til en 5’-hydroksygruppe.
Dobbeltstrengen i DNA i DNA er hver nukleotid i
en polynukleotidkjede bundet til en tilsvarende nukleotid
i en annen polynukleotidkjede etter regelen A ←−→ T,
G ←−→ C. Denne baseparringen skjer på grunn av hydrogenbindinger mellom basene: adenin og tymin danner to
hydrogenbindinger seg imellom, guanin og cytosin danner
tre hydrogenbindinger seg imellom. Dette holder DNA,
som altså egentlig er to molekyler (polynukleotidkjeder),
sammen som om det var ett molekyl. Derfor kommer
det noe ukorrekte begrepet “DNA-molekyl” til å bli brukt
videre i teksten.
De to strengene i DNA er antiparallelle - 3’-enden på
en streng korresponderer til 5’-enden på en annen streng.
Immobiliserte enzymer Enzymer som på en eller annen måte sitter fast i et medium. Metoder for å immobilisere enzymer inkluderer adsorbsjon til fibre, kovalente
bindinger til fibre, krysslinking mellom enzymer, immobilisering i gel eller hule fibre og mikrokapsler.
Det som er fint med immobiliserte enzymer, er at de
kan utføre reaksjoner under kontrollerte betingelser uten å
legge igjen enzymrester i produktet (nyttig for å forhindre
immunreaksjoner i pasienter). Samtidig blir mindre av Replikasjon av DNA At DNA tar form som en dobbeltenzymet kastet bort; enzymet er resirkulerbart.
streng, gir opphav til en mekanisme for å kopiere et DNAmolekyl. De to strengene separeres, og en ny streng settes
Enzymkilder Hvis vi vil ha tak i enzymer til eget bruk, sammen ved å bruke nukleotider etter regelen for baseparhar vi forskjellige kilder. Av det som ikke er nevnt tidligere: ing. Dermed pares hver av strengene i DNA opp med en
Bukspyttkjertler, spesielt til gris, inneholder mye fint: nylig syntetisert komplementær streng, og da har man to
trypsin, chymotrypsin, lipaser og amylaser. Magesekker DNA-molekyler. Enzymene som utfører denne operasjonen
inneholder pepsin. En av de nyttigste enzymkildene er heter DNA polymerase.
mikroorganismer, som er veldig greie å ha med å gjøre og
kan gros på laben og i reaktorer - og via genteknologi kan en- Strukturen til RNA RNA ligner mye på DNA, med
zymene skreddersys. Det finnes også mange bruksområder følgende forskjeller:
for enzymene som dannes av ekstremofile mikroorganismer,
• der det er deoksyribose i DNA er det ribose i RNA
for eksempel DNA polymerase, som vi skal se blir nyttig i
• der det er tymin i DNA er det uracil i RNA
analytisk bioteknologi (kapittel 10).
• RNA består av én streng i stedet for to
3
RNA kan ha intrikate sekundærstrukturer, som gjør at
det også kan danne enzymer. Ribosomer, for eksempel, er
komplekser av protein og RNA.
Genteknologi
Proteinsyntese Proteiner dannes som vist i Figur 3.
mRNA (messenger-RNA) syntetiseres fra DNA-et (transkripsjon), som inneholder informasjonen som skal til for
at et ribosom kan sette sammen det riktige proteinet
(translasjon). Under translasjon er det grupper på tre baser,
som kalles kodoner, som bestemmer hvilken aminosyre som
skal settes inn i polypeptidkjeden. At informasjonsflyten er
DNA→RNA→protein, og ikke motsatt, kalles det sentrale
3.1 Strukturen til DNA og RNA
dogmet i molekylærbiologi. Likevel kan noen virus synteByggecellene i DNA og RNA DNA er molekylet som tisere DNA fra en RNA-mal gjennom reverstranskripsjon
inneholder den genetiske informasjonen til organismer. I (kapittel 5).
Dette kapittelet Del 1 forklarer strukturen til organismers arvemateriale, og hvordan kroppen bruker DNA til å
lage proteiner. Del 2 forklarer hvordan man kunstig kan
modifisere arvematerialet med genteknologi. Del 3 tar for
seg historien til kunstig fremstilt insulin, som tar opp en
del plass i boka.
6
Kloning av gener med plasmider Konjugering kan
utnyttes til å klone gener: ved å klippe opp DNA med et
gen man ønsker å kopiere, samtidig som man kløyver et
plasmid, og så prøver å “smugle inn” det ønskede genet i
plasmidet med ligaser, vil det modifiserte plasmidet spre
seg i bakteriekolonien slik at man etter hvert har en bakteriekoloni full av bakterier med det ønskede genet (inni et
plasmid).
Restriksjons-endonukleaser Klippingen som ble
beskrevet over, gjøres med restriksjons-endonukleaser
- molekylære “sakser”.
Restriksjons-endonukleasene
er hentet fra bakterier som bruker enzymet som en
forsvarsmekanisme til å klippe opp virus-DNA. Det er
mer enn 1200 kjente restriksjonsendonukleaser, og hver av
dem er svært spesifikke (de kutter ved bestemte sekvenser
på en bestemt måte). Enzymet lager et “skjevt kutt” slik
at det er “klebrige” ender med enkelt-streng-DNA på hver
side av kuttet. Se figur i Renneberg om akkurat hvordan
dette kuttet er. Dette gjør at andre DNA-fragmenter med
like ender kan hektes på (med andre enzymer som kalles
DNA-ligaser). Ved å kombinere forskjellige restriksjonsendonukleaser som danner DNA-fragmenter som passer
sammen på riktig måte, kan man altså overføre gener fra
ett sted til et annet.
Figur 3: Genetisk informasjonsflyt i cellen.
En noenlunde nøyaktig beskrivelse av veien fra DNA
til protein (med korrekte molekylmodeller) finnes her:
https://www.youtube.com/watch?v=D3fOXt4MrOM
Strukturen til et gen Strukturelle gener inneholder informasjonen som skal til for å kode enkeltproteiner, for eksempel enzymer. Ved siden av de strukturelle genene er det
sekvenser som kontrollerer om genet skal uttrykkes (det vil
si om det faktisk skal dannes proteiner basert på informasjonen som ligger i genet). En slik sekvens - en start-sekvens
(promoter ) - en kort sekvens som enzymet RNA-polymerase
kan binde seg til, før det vandrer langs DNA-kjeden og
syntetiserer RNA fra og med start-sekvensen. Etter hvert
møter RNA-polymerase på en stopp-sekvens (terminator )
som avslutter transkripsjonen. Mellom promoteren og det
strukturelle genet finnes det ofte en operator-region der et
repressorprotein kan sette seg fast og forhindre at genet blir
uttrykt. En inducer kan binde seg til dette proteinet på
en slik måte at proteinet endrer form og forlater operatorregionen. Et eksempel på en slik inducer er sukker, som
kan binde seg til repressorproteiner for gener for sukkernedbrytende enzymer. Dermed kan forskjellige gener uttrykkes
avhengig av hvilke stoffer som befinner seg i organismen.
Introner For å klone et eukaryot gen kan man ikke akkurat kutte opp DNA-et, fordi det er fullt av ikke-kodende
sekvenser (introner). I RNA danner slike introner sløyfer
som kuttes av før det dannes proteiner av RNA-et, så intronene har ikke noen effekt på hvordan genet uttrykkes,
men det fører til kaos når man prøver å klone genet med
restriksjons-endonukleaser.
Kloning av eukaryote gener Derfor trenger man
heller såkalt “voksent” mRNA der de ovennevnte sløyfene
har blitt kuttet av. Ved å bruke et enzym fra virus, revers
transkriptase, kan man danne DNA fra slikt mRNA. Det
resulterende kopi-DNAet (cDNA) kan så inkorporeres i
et plasmid på samme måte som beskrevet over, og proteinet man ønsker kan syntetiseres i bakterielle celler. Hvis
riktig mRNA ikke er tilgjengelig er det også mulig å syntetisere akkurat de nukleotidsekvensene man vil med en
DNA-synthesizer (keyboard selges separat).
Rekombinasjon Utveksling av genetisk materiale mellom to DNA-molekyler. Sammen med mutasjon er rekombinasjon den viktigste mekanismen som fører til genetisk
variasjon. Det er mekanismen som gjør at et barn har DNA
som er en blanding av DNA-et til foreldrene. Det er også
en mekanisme som virus bruker for å injisere arvematerialet
sitt i vertens DNA (kapittel 5).
3.2
Hybridisering Man har en DNA-probe som består av
en enkeltstreng med den komplementære sekvensen til den
sekvensen man vet at man ønsker. Den kan for eksempel
lages med en DNA-synthesizer. Proben markeres med et
radioaktivt eller selvlysende molekylært “flagg”. Proben
legges til en bakteriekultur der man har ødelagt cellemembranene med vaskemiddel og spaltet dobbeltheliksen med
natronlut, slik at man har en masse enkeltstrenger. Proben
vil kun pare opp med sekvensen man ønsker seg, som resulterer i et hybridisert DNA av typen man ønsker seg. Så
vasker man ut probene som ikke har bundet seg til noe.
Hvis man har selvlysende flagg kan man enkelt identifisere
en del av en bakteriekoloni som har rekombinant DNA ved
å lyse på den med røntgenstråler og se på den i et mørkt
rom.
Genmodifisering
OBS! Teknikkene som diskuteres i dette delkapittelet
er ekstremt viktige, og dukker opp igjen og igjen i senere
kapitler. Særlig bruken av restriksjons-endonukleaser og
plasmider er fundamentale verktøy.
Plasmider Små ring-formede biter av DNA som finnes
utenfor den mye større DNA-kjeden til bakteriene. En
celle har ofte 50-100 små og 1-2 store plasmider, og de
fleste kan reprodusere i cellen uavhengig av hoved-DNAet.
De store plasmidene kan utveksles mellom bakterier i en
prosess som kalles konjugering.
7
Affinitetskromatografi En form for kromatografi der
man utnytter at forskjellige stoffer binder seg forskjellig
til spesifikke antistoffer (kapittel 5). Dette kan brukes for
å foredle rekombinante proteiner man har laget fra resten
av proteinene i bakterieekstraktet. For eksempel binder
insulin seg mer til insulin-antistoffer enn andre proteiner
gjør. Ved å la bakterieekstraktet renne gjennom en kolonne
med slike insulin-antistoffer, vil kun insulinet sette seg fast
i antistoffet og forbli i kolonnen. Deretter løser man opp
antistoff-insulin-bindingen med en spesifikk svak syre, slik
at man ender opp med en løsning insulin er det eneste
proteinet.
og ender opp med griseinsulin der alanin er erstattet med
treonin, det vil si menneskelig insulin.
Rekombinant insulin fra E. coli Insulin består av 2
separate kjeder som er bundet til hverandre med disulfidbindinger. Disse to kjedene kommer fra det samme
proteinet, som har blitt spaltet i to i bukspyttkjertelen.
Bakterier og gjær har ikke evnen til å gjøre dette, så direkte syntese av insulin med rekombinante plasmider er ikke
mulig. For å syntetisere insulin med bakterier gror man
heller to kjedene separat og setter dem sammen etterpå. På
grunn av Frederick Sangers arbeid med DNA-sekvensering
(kapittel 10) er basesekvensen i genet for DNA kjent, så
ved å manuelt syntetisere de riktige oligonukleotidene for
de to kjedene, og sette det inn i plasmid-DNA, kan man
syntetisere de riktige kjedene.
Ved Asilomar-konferansen i 1975 diskuterte noen
forskere mulige risikoer ved genteknologi. For eksempel:
hva om man kunne lage antibiotikaresistente karsinogene
tarmbakterier og forårsake en kreft-epidemi? Eller hva om
man fikk bakterier til å produsere aktivt insulin, og de ved
et uhell kom seg inn i mennesker og overlevde der? Det
ville forårsaket insulinsjokk. Disse hypotetiske situasjonene
ble blåst opp til skremmehistorier i mediene, og National
Institute of Health satt ned strenge retningslinjer for genteknologi. En konsekvens av dette var at de to kjedene i
insulin måtte gros separat i forskjellige bakteriekulturer.
Genmodifisering av eukaryote celler Genmodifisering av eukaryote celler er mye mer komplisert enn det
tilsvarende for prokaryote celler, fordi genmaterialet er
pakket inn som kromosomer i en cellekjerne. Genet man
ønsker å introdusere må injiseres inn i DNAet via en
eller annen vektor (gjerne et bakterielt plasmid med et
antibiotikaresistens-gen, av grunner som blir åpenbare
senere i avsnittet), men man må også sørge for at genet
faktisk uttrykkes i cellen. DNA-genet man ønsker å introdusere, introduseres til plasmidet med kloningsmetodene
som er beskrevet over (restriksjonsendonukleaser og ligaser). Samtidig må en startsekvens/promoter legges inn
rett før genet, slik at man i sluttproduktet får et gen som
faktisk blir uttrykt. Så lar man dette plasmidet forplante
seg gjennom en bakteriekoloni i en løsning med et antibiotikum. Kun bakterier med det ønskelige plasmidet vil
ha resistansgenet som gjør at de kan vokse og replisere på
tross av antibiotikumet. Når man så har massevis av det
rekombinante plasmidet, kan det introduseres i den eukaryote cellen på forskjellige måter: enten ved mikroinjeksjon
(fysisk injisere plasmidet med en veldig tynn nål, rett inn i
cellekjernen, slik at plasmidet, om man er heldig, blir en
del av kromosom-DNAet) eller fagocytose (at man på et
eller annet vis utnytter cellens egne mekanismer som den
bruker for å “spise opp” partikler). Deretter gror man de
eukaryote cellene i et selektivt medium som kun lar cellene
med rekombinant DNA overleve.
Menneskeskapte insulinvarianter Det har blitt produsert varianter av insulin som ikke eksisterer i naturen,
og som har litt andre egenskaper enn vanlig insulin. Et
vanlig problem med insulin er at det når blodomløpet for
sakte: høye konsentrasjoner av insulin danner heksamerer,
men insulin kommer ikke inn i blodomløpet med mindre
det er i form av dimerer eller monomerer. Dermed blir
insulinnivået for lavt i begynnelsen, og etter hvert som
insulinet brytes opp i mindre komponenter, holder nivået
seg for høyt for lenge. Derfor har man produsert insulin
der man har byttet plass på prolin og lysin på plass 28
og 29. Denne typen insulin fungerer raskere enn naturlig
insulin. Andre varianter som fungerer enda tregere enn
3.3 Kunstig fremstilt insulin
vanlig insulin, som varer i opp til 24 timer, forskes det også
Konvertering av griseinsulin til menneskelig in- på. I slike trege varianter har man forlenget én av kjesulin Insulin til behandling av diabetes ble i begynnelsen dene for å danne insulin som danner enda mindre løselige
tatt ut fra bukspyttkjertelen til ku og gris. Slikt insulin heksamerer.
er ikke helt likt vårt - griseinsulin er forskjellig i en av
aminosyrene på enden: de har alanin der mennesker har
4 Industriell bioteknologi
treonin - og dette fører til bivirkninger og immunreaksjoner fordi immunsystemet kjenner igjen dyreinsulinet
som forskjellig fra dens eget insulin.
En metode for å konvertere den terminale aminosyra Dette kapittelet Del 1 beskriver hvordan celler responi griseinsulin til treonin ble funnet på 80-tallet. Det viser derer på endringer i omgivelsene. Del 2 forklarer metoder
seg at trypsin, et proteinnedbrytende enzym i magesekken, vi har for å få cellene til å lage kjemikalier vi ønsker oss.
spesifikt hydrolyserer proteiner og peptider ved siden av Del 3 er eksempler på industrielle produkter. Det siste
aminosyrene lysin og arginin. I griseinsulin er alaninet man eksempelet, antibiotika, er stort nok til å få sin egen del.
ønsker å konvertere rett ved siden av lysin, og dermed kan
alaninet kløyves av insulinet ved å tilsette trypsin. Sam4.1 Adaptasjon
tidig behandler man insulinet med en treonin-tertbutylester
i organisk løsning, slik at treonin setter seg der alaninet var. Taktisk og strategisk adaptasjon Vi skiller mellom
Til slutt tilsetter man vann for å kløyve av tert-butanol, to kategorier av mekanismer som celler har for å tilpasse
8
seg endringer i miljøet. Kort og godt er forskjellen mellom
dem at:
• Taktisk adaptasjon er endring i enzymaktivitet:
miljøet påvirker hvordan og i hvor stor grad et enzym
fungerer.
• Taktisk adaptasjon går raskt, gjerne i løpet av noen
sekunder.
• Strategisk adaptasjon er endring i genuttrykk :
miljøet påvirker hvorvidt genet for et enzym uttrykkes.
• Strategisk adaptajon går tregt, gjerne i løpet av timer
eller dager.
glukose til et medium der eneste sukkerart er laktose, vil
slutte å vokse (fordi de ikke har enzymene som kreves
for å bryte ned laktose) i 20 minutter, før de begynner å
vokse igjen (fordi de nå har klart å lage disse enzymene).
Fenomenet, som kalles induksjon, skjer fordi laktose er en
inducer (kapittel 3, “Strukturen til et gen”) som binder seg
til repressorproteinet som sitter på genet for laktosenedbrytende enzymer. Repressorproteinet endrer form slik at
det ikke lenger sitter fast på DNA-et, og kan ikke lenger
blokkere RNA polymerase fra å transkribere genene for
laktosenedbrytende proteiner. Et tilsvarende eksempel er
gjær, som beskrevet mot slutten av kapittel 1.
Å motvirke endringer i miljøet ved å midlertidig hemme
hemmingen av syntesen av et enzym kalles, noe forvirrende,
“negativ kontroll”, og må for all del ikke forveksles med
negativ feedback.
Strategisk adaptasjon lar cellen bruke ressursene sine
effektivt - for en bakterie ville det vært uøkonomisk å til
enhver tid produsere alle enzymene den noensinne trenger,
og for en høyere organisme er strategisk adaptasjon en
absolutt nødvendighet (det hadde jo ikke vært så fint hvis
nerveceller drev og produsere magesyre-enzymer).
Taktisk adaptasjon Når cellen regulerer metabolismen
ved å bruke enzymene som er tilgjengelig for å utføre reaksjonene som kreves der og da. Et eksempel på taktisk
adaptasjon er hvis produktet av en enzymdrevet reaksjon
forhindrer enzymets funksjon, slik at konsentrasjonen av
produktet kontrolleres ved negativ feedback.
Allosteriske enzymer Proteiner som i tillegg til det
aktive setet har et allosterisk sete med høy affinitet for
bestemte små molekyler. Når slike molekyler er tilstede,
forandrer de formen til proteinet slik at virkemåten forandres (det vil si at proteinet aktiveres eller deaktiveres). Det
allosteriske setet trenger ikke å ligne på det aktive setet, så
aktiviteten til allosteriske enzymer kan påvirkes av stoffer
som ikke på noen måte ligner på substratet eller produktet
til enzymet. Allosteriske enzymer representerer en type
taktisk adaptasjon i celler.
Samtidig er mange enzymer laget av flere underenheter,
der alle inneholder et aktivt sete og minst ett allosterisk
sete. Disse enhetene er så tett bundet sammen at kjemisk
binding på ett allosterisk sete vil forandre den romlige strukturen til både den gjeldende enheten og de andre enhetene.
Denne koblingen mellom underenheter gjør det mulig å
forsterke responsen på de hemmende eller aktiverende signalstoffene (altså stoffene som binder seg til de allosteriske
setene) som organismen tar opp. Slike allosteriske enzymer
fungerer som regulatorer i organismen, og har en viktig
rolle flere steder i den metabolske prosessen.
For eksempel kan ett enkelt allosterisk “pacemaker”enzym i begynnelsen av prosessen bestemme takten på
hele metabolismen. Et eksempel på dette er syntesen av
glutamin i bakterier: når sluttproduktet akkumulerer i
cellen, trigger det en negativ feedack-mekanisme. Vi skal
se i senere eksempler at negativ feedback i mikrober blir et
problem når vi ønsker å bruke organismene til å produsere
kjemikalier for oss.
Konstitutive enzymer Essensielle metabolske enzymer
som alltid er til stede og produseres med en omtrentlig
konstant rate.
Induserbare enzymer Enzymer som kun produseres
når de trengs. Ellers er det repressorproteiner til stede som
forhindrer at genet for det induserbare enzymet uttrykkes.
4.2
Industriell bioteknologi
Industriell bioteknologi Bioteknologi som brukes i industrielle prosesser. Også kjent som “hvit bioteknologi”.
Black box model Den enkleste matematiske modellen
av cellevekst, der alle cellereaksjoner grupperes sammen
i én enkelt reaksjon, og cellen ses på som en “svart boks”
der man ikke bryr seg om mekanismene for reaksjonen.
En energikilde, en karbonkilde, en elektronakseptor og nitrogen går inn (energikilde og karbonkilde er som regel,
men ikke alltid, den samme); cellen transformerer reaktantene; og biomasse, CO2 , vann og et metabolsk produkt
kommer ut. Med denne modellen kan de 6 hovedtypene
cellemetabolisme illustreres som i figur 4, hvor vi har henholdsvis
1. Fullstendig oksidasjon.
2. Aerob cellevekst. Forholdet mellom karbon, hydrogen, nitrogen og oksygen i biomassen er 10:18:2:5.
3. Aerob cellevekst med produktdannelse. Eksempel på
produkt er glutamat.
4. Anaerob cellevekst med produktdannelse. Eksempel
på elektronakseptor er NO3 , eksempel på redusert
elektronakseptor er NO2 .
5. Fermentering: metabolisme i mangel av både oksygen og en elektronakseptor. Gir minimal cellevekst.
Forskjellene mellom aerob metabolisme og fermentering ble beskrevet i kapittel 1.
Strategisk adaptasjon Alle celler i en organisme inneholder den komplette genetiske informasjonen til organismen i DNA-et, men spesialiserte celler i høyere organismer
trenger ikke å uttrykke alle genene i DNA-et. Derfor er
mye av den genetiske informasjonen undertrykt, avhengig
av celletype. Strategisk adaptasjon er cellens metoder
for å uttrykke de genene det er ønskelig å uttrykke, og
undertrykke resten av genene.
Også enkle organismer har strategisk adaptasjon.
Enkelte bakterier, når de flyttes fra et vekstmedium med
9
6. Crabtree-effekten (i gjær). Skjer når det er såpass Utbytte kan oppgis som gram biomasse pr. gram suboverskudd av glukose at cellen må produsere etanol strat; gram produkt pr. gram substrat; eller teoretisk
for å unngå intracellulær akkumulering av metabolit- maksutbytte, maks gram produkt pr. gram substrat.
ter.
Utvikling av bioprosesser Den tradisjonelle måten å
utvikle organismer som produserer et kjemikalium man
ønsker seg, kalles klassisk mutagenese (“classical mutagenesis”) og består av følgende trinn:
1. Identifisere og isolere organismen som produserer det
kjemikaliet man ønsker seg.
2. Avle frem organismer med mutasjoner som fører til
overproduksjon av produktet. Teknikker for å øke
mutasjonsraten beskrives senere, i avsnittet om mutagener.
3. Lab- og pilotprosjekt, der man finner optimale vekstforhold og slikt.
4. Til slutt, produksjon på industriell og kommersiell
skala.
Alternativer til denne fremgangsmåten innebærer målrettet
modifisering av DNA-et til en organisme for å frembringe
det ønskede produktet (“metabolic engineering”).
Figur 4: Forskjellige typer cellemetabolisme.
I “black box”-modellen anter vi at veksten i biomasse er
proporsjonal med biomassen (altså enkel eksponensiell
vekst). Proporsjonalitetskonstanten µ kalles spesifikk veksthastighet, og er et resultat av at man dumper alle faktorer
som kan påvirke veksthastigheten i én og samme parameter.
Ligningen for biomassen blir
dm
= µm,
dt
der m er biomassen. Hvis biomassen er m0 ved t = 0, er
løsningen på differensialligningen at
Bioreaktorer Større ståltanker der man lager optimale
vekstforhold for ønskelige mikrober ved å kontrollere
• Temperatur: høy temperatur steriliserer utstyret og
forhindrer forurensning. Lav temperatur hindrer
vekst av mikrober, men dreper dem ikke - derfor kan
kulde brukes for å oppbevare mikroorganismer.
• Trykk: høyt trykk inni reaktoren forhindrer
forurensende organismer fra å komme inn i reaktoren.
• Fuktighet: det finnes et optimalt fuktighetsnivå for
mikroorganismene.
• pH: ved å kontrollere pH kan man forhindre vekst
av uønskede mikrober og oppfordre til vekst av
mikrobene man ønsker.
4.3
m = m0 eµt .
Hvis vi måler tiden td som det tar biomassen å fordoble
seg, kan vi regne ut µ. Siden m = 2m0 ved t = td , blir
ligningen
2m0 = m0 eµtd ,
så
td =
ln 2
ln 2
=⇒ µ =
.
µ
td
En slik enkel modell har naturligvis sine begrensninger for eksempel forutsier den at en E. coli -bakterie med masse
m0 = 3 × 10−13 g som deler seg etter td = 20 min (realistisk ved optimale vekstbetingelser) i løpet av 44 timer vil
rekke å vokse til en koloni på størrelse med jordkloden.
Produktivitet kan oppgis som total produktivitet i milligram pr. sekund eller tonn pr. år; volumetrisk produktivitet som gram pr. liter pr. time; eller spesifikk
produktivitet som gram pr. gram biomasse pr. time.
10
Eksempler
Lysin Essensiell aminosyre som i naturen kun finnes i
små mengder i korn. Man ønsker derfor å produsere lysin
industrielt til f.eks dyrefôr. Lysin kan blant annet hentes
fra Corynebacterium glutamicum. For å få organismen
til å produsere lysin i store mengder, må man forhindre
negativ feedback: proteinet som lager lysin, aspartatkinase, blir deaktivert dersom det er både lysin og treonin til
stede (treonin blir produsert litt senere i den metabolske
prosessen via homoserin dehydrogenase). Hvis man finner
en organisme med en mutasjon som forårsaker defekter i
denne selvreguleringen, kan man produsere lysin i store
mengder. To slike mutasjoner har blitt funnet: det finnes
mutanter med
• en mutasjon i homoserin dehydrogenase forhindrer
produksjon av treonin, slik at det alltid er lave treoninnivåer og aspartatkinase aldri blir deaktivert, og
en med
• en mutasjon i aspartatkinase som gjør at det ikke
deaktiveres av lysin.
Glutamat Aminosyre som kan brukes som tilsetning i
mat for å få umami-smak. Glutamat dannes i sitronsyresyklusen. Den samme bakterien som ble brukt for produksjon
av lysin, Corynebacterium glutamicum, har en lite aktiv
variant av enzymet oksoglutarat dehydrogenase. Dette ville
forårsaket en opphopning av 2-oksoglutarat i cellen hvis
det ikke hadde vært for et annet enzym, glutamat dehydrogenase, som konverterer 2-oksoglutarat til L-glutamat når
det er ammoniumioner tilgjengelig. Ved å boble ammoniakk gjennom en bakteriekoloni kan man dermed produsere
store mengder glutamat. Et siste problem er hvordan man
får cellen til å skille ut glutamat i stedet for å la det hope
seg opp i cellen. Løsningen kommer fra at bakterien ikke
kan produsere biotin, en viktig komponent i cellevegger,
men er avhengig av at det finnes i omgivelsene. Ved å
gro bakteriene i et medium med minimale mengder biotin
(akkurat nok til å tillate cellevekst) får man bakterier som
slipper glutamat gjennom celeveggene.
Mikrobiell produksjon av aminosyrer Syntese via
mikrober fungerer gjerne mye bedre enn kjemisk syntese
hvis man skal produsere stereokjemisk komplekse molekyler,
for eksempel biologiske aminosyrer som finnes i L-form
som er biologisk aktiv og D-form som er biologisk inaktiv. Med kjemisk syntese ender man opp med rasemater
- 50/50-blandinger av L- og D-formen, slik at halvparten
av produktet er ubrukelig. Mikrobiell produksjon gir et
produkt i 100% L-form (siden enzymene i mikrobene er
laget for å produsere L-formen).
Vitamin C Også kjent som L-askorbinsyre. Vitamin
C kan ikke produseres av menneskekroppen og må derfor
være i maten man spiser. Reichstein-metoden for å produsere Vitamin C er en kombinasjon av kjemisk syntese
og bioteknologi som består i å
D-glukose
til
D-sorbitol
med
1. redusere
nikkelkatalysator,
2. la Acetobacter suboxydans konvertere D-sorbitol til
L-sorbose med sorbitol dehydrogenase (nesten 100%
effekt etter 2 dager), og til slutt
3. kjemisk oksidere L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre,
som i sur løsning danner L-askorbinsyre.
Aspartam Søtningsstoff som kan dannes av aspartat og
fenylalanin, som begge produseres av bakterier eller med
enzymer i bioreaktorer. Varer kun i 6-9 måneder, og er
noget dyrere enn sakkarin og enzymprodusert fruktose men hvis noen en dag finner en måte å bruke rekombinant
genteknologi til å lage aspartamproduserende bakterier
vil det trolig få en større markedsandel. Her er det gode
muligheter, folkens.
Kortison Smertedempende stoff som kan produseres syntetisk med en komplisert prosess på 37 trinn, der noen av
trinnene krever ekstreme forhold, til en pris på $260 pr.
gram. Ved å ta i bruk mikrobiell hydroksylering kan syntesen kuttes ned til 11 trinn som alle skjer ved normale
betingelser, og prisen faller til $1,30 pr. gram.
Frem til 1975 hadde den meksikanske produsenten Proquivenex monopol på utgangsstoffet som ble brukt til å
produsere kortison (diosgenin). Da de tidoblet prisen,
svarte markedet ved å se etter alternative metoder som
etter hvert erstattet den meksikanske råvaren, og markedet
for diosgenin kollapset.
4.4
Antibiotika
Penicillin Etter at Alexander Fleming oppdaget penicillinens bakteriedrepende egenskaper, var det tre problemer som måtte løses for å kunne produsere penicillin billig
og i store mengder:
1. Man måtte finne Penicillium-stammen som produserte mest penicillin.
2. Man måtte finne en metode for å gro store mengder
av bakterien.
3. Man måtte finne en metode for å isolere penicillin
fra vekstmediet.
Det første problemet ble “løst” ved at man fant en svært
effektiv penicillium-sopp på en cantaloupe i Peoria, Illinois
- all sopp som brukes for å produsere penicillin i dag, er
muterte etterkommere av denne soppen. Det andre og
tredje problemet løses med bioreaktorer.
Mutagener For å finne sopp med mutasjoner som øker
penicillin-produksjonen, ønsker man å øke mutasjonsraten
- det er dessverre umulig å gjøre en målrettet mutasjon av
bare ett gen, så man peiser på med mutasjoner og satser
på at en av mutasjonene fungerer. Mutagener som øker
mutasjonsraten inkluderer
• UV-stråling, som gjør at nabo-tymin i DNA dimeriserer.
• ioniserende stråling (røntgenstråler, gammastråler,
nøytronstråler).
• diverse kjemikalier som reagerer med DNA-basene
eller påvirker kopieringsprosessen.
Bruk av mutagener er en generell teknikk som er spesielt nyttig når man bare ønsker en mutasjon i ett gen.
Det er litt verre med produksjon av sopp og bakterier
som skal lage antibiotika, siden produksjonen avhenger av
mange forskjellige gener. Derfor var det nødvendig med
mange runder med seleksjon over et par tiår for å kunne gå
fra penicilliumsoppen på cantaloupen i Peoria, til dagens
penicillin-produsenter som produserer opp til 2000 ganger
så mye penicillin.
For å skape virkelig effektive organismer kan man avle
frem flere forskjellige stammer parallelt, og etter flere generasjoner med kunstig seleksjon lage hybridorganismer av
de forskjelilge datterkoloniene. Se boks 4.7.
Merk at superproduserende organismer ikke selv tjener
noe på å lage en masse penicillin - de har bare dukket opp
fordi mennesker i hvert trinn har valgt ut organismene
som tilfeldigvis produserte litt mer penicillin.
11
Virkemåten til penicillin Penicillin dreper (Gramnegative) bakterier ved å forhindre produksjon av cellevegger. Dette gjør den ved å ha en β-laktamring som imiterer
peptidbroa i celleveggen. Resultatet er at celleveggen blir
så svak at cellen sprekker.
Streptomycin og cephalosporiner Alternative antibakterielle stoffer som er nødvendige for å drepe Gramnegative bakterier, samt Gram-positive bakterier som har
blitt resistente til penicillin.
Lytisk angrep Viruset binder seg til overflaten av cellen
og injiserer det genetiske materialet. Cellens egne enzymer
og ribosomer sørger for å lage mange kopier av virusets
bestanddeler ved å replikere det virale genmaterialet og
produsere de virale proteinene. Til slutt setter de forskjelResistens Bakterier kan bli penicillin-resistente ved å lige bestanddelene seg sammen til mange nye, hele virus,
produsere β-laktamaser som bryter ned β-laktamringen i som destruerer cellen som skapte dem og sprer seg videre i
penicillin. Som svar på dette har man laget nye semisyn- miljøet (eller, hvis cellen er del av en flercellet organisme,
tetiske varianter av mikrobiell antibiotika, men hvert nye resten av organismen).
antibiotikum er bare en midlertidig løsning før det dukker
opp nye bakterier som er resistente til dét også.
Sovende viralt DNA Etter å ha infiltrert verten kan
viruset, i stedet for å umiddelbart reprodusere og destruere
Hvorfor er overforbruk av antibiotika farlig? Over- cellen, forbli inaktivt. Det virale DNAet blir replikert samforbruk av antibiotika vil føre til at resistente bakterier men med resten av cellen når cellen deler seg. Først senere,
dannes, fordi man skaper et miljø der kun de antibiotikare- etter flere celledelinger, slår viruset til.
sistente bakteriene overlever. Siden bakterier kan utveksle
arvemateriale horisontalt via plasmider, vil et antibiotikare- Ikke-lytisk angrep Viruset angriper på andre måter
sistansgen kunne spre seg raskt gjennom bakteriekolonien. enn å ødelegge cellen, for eksempel når et “enveloped virus”
tar med seg litt cellemembran. Enkelte virus kan også
Cyclosporin I jakten på nye former for antibiotika op- angripe celler ved å integrere genomet sitt i verten.
pdaget man at Tolypocladium inflatum lager et ringformet
peptid som, i tillegg til å være et OK antibiotikum, har
en immundempende effekt. Peptidet, cyclosporin, var det
første immundempende stoffet som ikke var så kraftig at
det satte hele immunsystemet ute av spill. Cyclosporin
binder seg spesifikt til visse reseptorer på T-celler og forhindrer reaksjonen av interleukin-2 (et signalmolekyl som setter i gang betennelsesreaksjoner). Oppdagelsen førte til
en dramatisk økning i vellykkede organtransplantasjoner,
fordi man på noenlunde kontrollert vis kunne forhindre
immunsystemet i å avvise det transplanterte organet.
Antivirale medisiner Antibiotika har ingen effekt på
virus, siden virus ikke har noen egen metabolisme som
antibiotika kan angripe. I stedet forsøker man å tukle med
hver av de forskjellige stegene i virusets reproduksjonssyklus:
• Fusjonshemmere: forhindrer viruset fra å trenge inn
i cellen ved å binde seg til de samme reseptorene som
viruset binder seg til når det skal trenge inn i cellen.
• Transkriptasehemmere: molekyler som stikker kjepper i hjulene for reverstranskriptaseenzymet til retrovirus ved at de ligner på nukleotider, slik at enzymet
feilaktig setter inn transkriptasehemmeren i polynuk5 Medisinsk bioteknologi
leotidkjeden. Dette fører til ubrukelig DNA som ikke
kan leses.
• Integrasehemmere/antisense RNA: RNA som er ekDette kapittelet handler om virus og hvordan de funsakt komplementært til virusets RNA, og binder seg
gerer, immunforsvaret, og hvordan vi kan bruke vaksiner
til det. Dermed dannes et ubrukelig RNA/RNAtil å sette immunforsvaret på rett kurs.
hybrid som ikke kan brukes til å danne nye viruskomponenter.
• Proteasehemmere: klipper opp de virale polypepti5.1 Virus
dene i små fragmenter akkurat når de skal settes
Virus Et
virus
er
en
liten
genetisk
ensammen til nye virus.
het/agens/dingsboms som benytter seg av den reproduktive
mekanismen til verten den infiserer for å reprodusere seg
Naturlige strategier mot virus Blant menneskelige
selv. Siden virus ikke har sin egen metabolisme, regnes de
cellers naturlige forsvarsmekanisme mot virus finnes inikke som levende organismer i seg selv (de er i beste fall
hibitorer som blokkerer reversskriptase (mot retrovirus),
på grensen). Nakne virus er beskyttet av en proteinkjerne
antistoffer (senere avsnitt), og interferoner (neste avsnitt).
som kalles et kapsid. “Enveloped viruses” beskytter seg
selv ved å ta med seg en bit av vertens cellemembran
som et ekstra lag med beskyttelse. Noen virus koder for Interferon Signalprotein som produseres av virusinfisenzymer som de trenger for å reprodusere - blant annet har erte celler for å si ifra til immunsystemet om at cellen er
retrovirus revers-transkriptase, som brukes for å lage DNA infisert og skal destrueres.
fra RNA. Kort sagt klarer virus å pakke inn utrolig mye
sluhet i et vanvittig lite volum (de har typisk en lengde på
5.2 Immunforsvar
rundt 50 nanometer).
Virus kan enten inneholde RNA eller DNA. Eksem- Immunsystemet Det komplekse systemet som gjør orpler på RNA-virus er HIV, meslinger, rabies, tobakkmo- ganismen i stand til å skille mellom “selv” og “ikke-selv”.
saikkvirus, poliovirus, forkjølelse og SARS. Eksempler på Immunsystemet består av den humorale immunresponsen
DNA-virus er kopper, kukopper, herpes og bakteriofager. og den cellulære immunresponsen. Man kan også dele det
12
inn i medfødt og adaptiv immunrespons - mer om det
senere.
Her er en fin video som forklarer immunsystemet:
https://www.youtube.com/watch?v=zQGOcOUBi6s. En
del av det som står i Renneberg nevnes også i videoen, og
gjentas derfor ikke her. På samme Youtube-kanal finnes
også beskrivelser av mekanismene til forskjellige virus (meslinger, HIV, ebola). #viralvideo
Adaptiv immunrespons Den delen av immunresponsen som husker hvilke antigener som har vært til stede
tidligere. Ved første eksponering for et patogen vil den
adaptive immunresponsen være tregere - men ved senere
eksponeringer vil den adaptive immunresponsen være like
rask som, og mer effektiv enn, den medfødte immunresponsen, se Figur 5. Dette fordi det da finnes “minne-celler”
(dette er spesialiserte T- og B-celler) som “husker” den
første eksponeringen og “vet” hvordan immunsystemet må
Den humorale immunresponsen bruker antistoffer - handle for å raskt og effektivt eliminere akkurat dét patoproteiner som produseres av B-celler (eller mer presist: genet. Det er denne egenskapen til immunsystemet som
B-celler produserer plasmaceller, som produserer antistof- utnyttes med vaksiner.
fer) for å beskytte mot fremmede stoffer (for eksempel fra
infiserende virus/bakterier) som i denne sammenhengen
kalles antigener. Antistoffer binder seg til antigener på
svært spesifikt vis for å markere dem som inntrengere og
oppfordre makrofager til å spise dem opp.
Epitop Den delen av et antigen som antistoffet binder
seg til. Kalles også antigendeterminant.
Strukturen til et antistoff Antistoffer består av 4 proteinkjeder - to “lette” L-kjeder og to “tunge” H-kjeder.
Proteinkjedene holdes sammen av disulfidbindinger. Disse
settes sammen til en Y-form (se figur i bok/internett). Bunnen av Y-en er en “fot” som kalles Fc (fragment constant)
som holder antistoffet til overflaten av B-cellen. Samtidig
har de en variabel region - Fv - som er antigen-spesifikk.
Cellen har standardiserte polypeptidelementer som den
kan bruke for å bygge molekylære antistoffer for opp til
100000000 forskjellige antigener (men man har altså ikke
gener for hvert eneste antigen - det ville vært uøkonomisk).
Den cellulære immunresponsen består av T-cellene.
Blant disse har man cytotoksiske T-celler (“killer T-cells”)
som er på utkikk etter fremmede komponenter på overflaten
til cellene de møter - og hvis de finner fremmede komponenter, destruerer de cellen. Mange celler hjelper til med
dette ved å kutte ut et fragment av peptider som stammer
fra nedbrytningen av proteinene til en inntrenger. Dette
fragmentet transporteres til overflaten av cellemembranen,
der MHC-proteiner (major histocompability complex) viser
frem fragmentet til omverdenen. I tillegg til cytotoksiske
T-celler finnes det T-hjelpeceller som fremmer vekst av
B-celler og cytotoksiske T-celler når de trengs.
Figur 5: Skisse av immunrespons ved første og andre eksponering for et patogen. Rødt: medfødt immunrespons.
Blått: adaptiv immunrespons.
5.3
Vaksine
Vaksine Immunogent materiale som gjør at immunsystemet produserer “minne-celler” for en bestemt type patogen (sykdomsfremkallende virus eller mikroorganisme).
Dette gjør at immunsystemet raskt kan produsere riktig type antistoffer dersom patogenet skulle angripe på et
senere tidspunkt. Dermed blir man (i det ideelle tilfellet)
immun mot patogenet.
Den første vaksinen var mot kopper, og ble utført ved
at Edward Jenner testet sin hypotese om at det å overleve
kukopper gir en livslang immunitet mot både kukopper
og kopper: han injiserte en liten dose puss fra en kukoppinfisert jente i blodet til en gutt. To uker senere injiserte
han den samme gutten med en potensielt dødelig dose
kopper. Gutten overlevde dette, og begynte antakelig å
gruble over hva i alle dager det var han hadde gjort for
Neopterin En liten molekylær forbindelse som skilles at det var akkurat han som ble valgt ut til et slikt latut av makrofager når de stimuleres av interferon-γ (som terlig uetisk eksperiment. Grunnen er at kukopper er nært
skilles ut av T-hjelpeceller). Dette skjer allerede før immun- beslektet med kopper, og de samme antistoffene som virker
systemet har identifisert intrengeren, så å teste neopterin- mot kukopper virker også mot kopper.
nivåene i blodet gir en rask test for virusinfeksjoner: en
høy konsentrasjon av neopterin indikerer at det foregår et Moderne vaksiner tar i bruk
eller annet viralt angrep. Siden det skilles ut uavhengig
• toksoider: nøytraliserte ekstrakter av toksinene som
av hvilket virus som angriper, er det spesielt nyttig for å
patogenene skiller ut
teste bloddonorer.
• døde eller svekkede patogener som er harmløse, men
fortsatt trigger en immunrespons
• genmodifiserte varianter av patogener, som det for
Medfødt immunrespons Betegnelsen for den delen av
tiden forskes på
immunresponsen som er rask, men uspesifikk. Dette er den
evolusjonært eldste delen av immunsystemet, i motsetning Prinsippet er det samme i hvert tilfelle: kroppen produserer
til...
de riktige antistoffene før en eventuell infeksjon.
13
Polyklonale antistoffer Ved å immunisere et dyr mot
et antigen kan man (ofte etter flere omganger med immunisering) hente ut og isolere antistoffer for antigenet fra
dyret. Hvis man gjør det på denne enkleste mulige måten
får man polyklonale antistoffer - en blanding av forskjellige antistoffer som alle reagerer på det samme antigenet,
men som har forskjellig aminosyresekvens og binder seg til
forskjellige steder (epitoper) på antigenet med forskjellig
styrke.
billigere og raskere, og ved å bruke E. coli kan man utnytte
alt man vet om bakterien i produksjonen.
6
Miljøbioteknologi
Dette kapittelet begynner med en lengre innføring i
forurensning av ferskvann og hvordan vi kan forhindre det.
Så går vi nærmere på hvordan vi kan bruke mikroorganismer som mer miljøvennlige energikilder og kjemikalieproMonoklonale antistoffer Antistoffer med identisk dusenter.
molekylær struktur og spesifisitet, som stammer fra én
enkelt type B-celler. Disse kan man få tak i ved å ta Bceller og fusjonere dem med tumorceller for å få en hybrid- Avløpsvann Det er litt terminologi i forbindelse med
celle som er udødelig og deler seg raskt (som en kreftcelle), avløpsvann:
1. 5-dags Biochemical Oxygen Demand (5-day BOD):
men også produserer de samme antistoffene som B-cella.
mengden O2 (aq) som metaboliseres av mikrobene
Monoklonale antistoffer er et kraftig analytisk verktøy fordi
i en vannprøve i løpet av 5 dager for å fullstendig
man kan bruke dem til å oppdage små mengder av et antibryte ned de organiske forurensningene i prøven.
gen (for eksempel ved å sette en radioaktiv markør på
2.
Population equivalent (PE): den gjennomsnittlige orantistoffene, slik at områder med antigenet “lyser opp”).
ganiske forurensningen, altså 60 gram 5-dags BOD.
Dermed kan man for eksempel finne størrelsen og posisjoSiden
løseligheten til O2 i vann er 10mg O2 pr. liter vann,
nen til en tumor. Kombinert med annen teknologi kan man
trenger
man 6000 liter rent vann for å fjerne forurensningen
også levere medikasjon spesifikt til der antigenet befinner
som
én
gjennomsnittlig bybeboer produserer i løpet av 5
seg (targeted drug delivery).
dager.
ELISA-testen Står for “enzyme-linked immunosorbent
assay” og kan brukes til å finne ut om pasienten har produsert antistoffer mot et bestemt virus - det vil si, om
pasienten er infisert. Prosessen er som følger:
1. Man gror viruset og isolerer kapsidet ved at det adsorberes på en plate.
2. Kroppsveske fra pasienten legges til på platen.
3. Man legger til enzym-markerte monoklonale antistoffer mot pasientens antistoffer.
4. De monoklonale antistoffene som ikke har bundet seg,
vaskes vekk.
5. Man legger til et substrat som er fargeløst, men som
skifter farge i møte med enzymet på de monoklonale
antistoffene.
Løsningen vil bli farget hvis det er noe enzym der, som
kun kan være tilfelle dersom det var noen antistoffer de
monoklonale antistoffene kunne binde seg til - altså hvis
pasienten har vært infisert. Ellers vil alle de monoklonale
antistoffene vaskes ut, og løsningen forblir fargeløs.
Konsekvensene av urenset avløpsvann som slippes
ut i innsjøer og elver, er at
• aerobe mikroorganismer bryter ned organisk materiale og bruker samtidig opp tilgjengelig oksygen,
• fisk og de fleste andre oksygenavhengige organismer
dør av oksygenmangel, og til slutt
• anaerobe mikroorganismer tar over og produserer
giftig ammoniakk (NH3 ) og hydrogensulfid (H2 S) som
dreper de resterende vannlevende organismene.
Dermed ender man opp med at elvene blir til illeluktende
kloakk.
Aerob vannrensning Et vanlig kloakkrenseanlegg
bruker aerobe mikroorganismer til å bryte ned forurensninger i vannet før det slippes ut i ferskvannskildene.
Dette krever en del plass.
Trickling filters En annen metode for å rense
avløpsvann. Dette er tanker fylt med porøst materiale
Rekombinante antistoffer Det er ofte nyttig å gjøre med et stort indre overflateareal der mikroorganismer kan
antistoffet er så lite som mulig. Dette har tradisjonelt blitt sette seg. Dette store overflatarealet gjør at man sparer en
gjort ved å kløyve av alt annet enn den variable delen del plass.
(Fv) av antistoffet. Hvis du ser på Box 5.3 ser du at en
slik enkeltstående Fv-bit ikke vil være sammenhengende, Aktivert slam En tredje metode for å rense avløpsvann.
og faller fra hverandre uten ekstra stabilisering. Derfor Her har man latt aerobiske bakterier, fungus og andre
bruker man en ekstra peptidkjede for å lenke sammen de mikroorganismer danne store flak som andre mikrober kan
to halvdelene, for å få en scFv (Box 5.3, nederst til høyre). sette seg på. I tillegg rører man i vannet for å stadig tilTradisjonelt har dette blitt gjort med proteaser, men nu til føre oksygen fra luften. Vannrensning med “aktivert slam”
dags lager man dem heller fra scratch med rekombinante består av følgende trinn (se gjerne på figur på slide):
organismer.
1. Avløpsvann går inn i en oppbevaringstank.
En fordel med rekombinante antistoffer er at det er
2. Større objekter fjernes med mekanisk filter.
mer etisk å lage antistoffer slik, enn det er å la dyr eller
3. I et “gruskammer”: væskeflyt justeres, og større parmennesker produsere antistoffene man vil ha. Det er også
tikler som grus, sand og glass fjernes.
14
4. I en sedimenteringstank: flakene av mikroorganismer, samt den løselige komponenten av avløpsvannet,
separeres fra uløselig bunnfall (sedimenter).
5. Flakene og den løselige komponenten av avløpsvannet
brytes ned under aerobiske forhold for å lage “aktivert
slam” (som beskrevet i starten av avsnittet).
6. Rent vann separeres fra slammet. Deler av slammet
resirkuleres.
7. Slammet sendes til et “fordøyelsestårn” der det produseres biogass.
8. Rent vann separeres fra restene av slam fra
fordøyelsestårnet. Det siste slammet kan ende opp i
spesialiserte dynger, der lukt kan bli et problem.
9. Drikkbart vann behandles med klor eller ozon for å
drepe bakterier, før vannet sendes ut i elva.
Eutrofiering Avrenning av fosfor og nitrogen (i gjødsel) fra landbruk, med påfølgende opphopning av slike
næringsstoffer i miljøet. Dette fører til ukontrollert oppblomstring av alger, som igjen degraderes av aerobiske
mikroorganismer som bruker opp det som er av tilgjengelig
oksygen. Til slutt ender man opp i samme situasjon som
man får fra å slippe ut urenset avløpsvann i ferskvannsområdene.
Det går bedre med biogass i Kina, der det kjøres mange
hundre tusen bioreaktorer, ofte som kommunale prosjekter.
I den industrialiserte verden kan bioreaktorer hjelpe
til med å løse avfallsproblemene til industrielle gårdsbruk.
På grunn av begrenset mengde biomasse kan ikke biogass
dekke stort mer enn 1-5% av energibehovet.
Husholdningsavfall som ellers ville havnet på avfallsdynger er en annen potensiell kilde til biogass - det produseres
allerede så mye metan på avfallsdynger at det kan være
farlig, så det kan være gunstig å dekke dem opp og ekstrahere metan derfra.
Naturlig forekommende metan Mikroorganismer
som enten lever fritt eller i fordøyelsessystemene til større
organismer, produserer totalt mellom 500 millioner til 1
milliard tonn metan i året, omtrent det samme som det
som ekstraheres fra naturgassfelt. Eksempler er
• I myrer og sumper kommer det en del metan fra bakterier som dekomponerer organisk materiale i fravær
av oksygen.
• Mikroorganismer i magen til en ku produserer 100200 liter metan.
• Termitter er de største produsentene av metan: en
maur produserer 0.5 milligram metan om dagen, som
blir til en årlig produksjon på 150 millioner tonn.
Fjerning av nitrogen Først bruker man Nitrosomonas
til å oksidere ammoniakk til nitritt (NO2– ). Deretter bruker
man Nitrobacter til å oksidere nitritt til nitrat (NO3– ). Til Bioetanol I Brazil finnes det en del bioetanoldrevne
biler som går på hydrert etanol (93% etanol/7% vann).
slutt reduseres nitratet til nitrogengass1 .
Dette ble satt i gang på grunn av oljekrisene i 1973/4 og
1979.
Prosjektet heter Proalcool og var en både politisk
Fjerning av fosfor Det finnes to metoder: fosforet
og
økonomisk
motivert affære som har vist seg å være
kan enten tas opp av bakterier (som man så lagrer som
kontroversiell
fordi
“biosolids” som brukes som gjødsel), eller det kan presip• bioetanolproduksjon konkurrerer med matprodukiteres ut kjemisk med jern- eller aluminiumsalter.
sjon: én bil krever like mye råmateriale som mat for
30 mennesker.
Biogass Metanogene arkebakterier kan konvertere organ• produksjonen har en alvorlig effekt på miljøet: hver
isk materiale til metan, som kan brukes som en energikilde.
liter etanol som produseres danner 12-15 liter sukkerDette skjer i en anaerob prosess:
rester og 100 liter skittent vann, som av økonomiske
1. Hydrolytisk fase: ekstracellulære enzymer bryter ned
grunner slippes ut i elver uten å renses. Bioetanolstore organiske molekyler til enklere bestanddeler som
produksjonen fører også til erosjon av jordsmonnet.
monosakkarider, aminosyrer, glyserol og fettsyrer.
Problemet med vannforurensning er på bedringens vei: et2. Acidogen fase: de enkle bestanddelene brytes ned
ter at forurenset vann fra bioetanolindustrien forurenset
til H2 , CO2 , eddiksyre og andre organiske syrer og
drikkevannforsyningen til hele byer, beordret den brazilalkoholer.
ianske regjeringen alkoholindustrien til å holde vannet i en
3. Metanogenese: Hydrogen, eddiksyre og karbondioklukket syklus og til å bruke sukkerrestene som gjødsel.
sid reagerer med hverandre for å danne vann og
metan i to reaksjoner: CH3 COOH −−→ CH4 + CO2
og CO2 + 4H2 −−→ CH4 + 2H2 O.
Oljedegraderende bakterier Etter å ha oppdaget at
Biogass er en fin energikilde dersom det eneste andre al- det finnes bakterier som kan degradere plantegiften Agent
ternativet er å brenne ved eller annen biomasse. Biogass Orange, klarte Ananda Chakrabarty å produsere oljekan dannes i små reaktorer som fylles med ekskrement fra spisende bakterier ved å kombinere plasmider fra fire Pseumennesker og dyr.
domonias-stammer som hver for seg var i stand til å deMen: da man prøvde dette med Gobarprosjektet i India, gradere enten kamfer, oktan, xylol eller naftalen. Plasmible prosjektet forringet av at det kun er rike bønder som dene ble kombinert til superplasmider som ble reintrodusert
har råd til de rustfri ståltankene man trenger og har nok i bakterier slik at de ble i stand til å degradere alle de fire
avfallsstoffer til å fylle tankene. Det endte opp med at stoffene. Disse organismene var ment til å raskt spise opp
rike bønder kjøpte opp kumøkk i store kvanta og dermed oljeutslipp og så bli spist opp av organismer høyere opp i
brukte opp biomassen som de fattige ellers ville brent for næringskjeden. Organismene er de første genmodifiserte
varme.
organismene som har blitt patentert i USA.
1 Slides
strider med Renneberg og internett: reduksjonen av nitrat gjøres ikke biologisk.
15
Organismene har riktignok aldri blitt brukt, på grunn
av restriksjoner på bruk av genmodifiserte organismer. I
stedet gror man konvensjonelt fremavlede bakterier for å
degradere olje på oljedekte steiner, som er det eneste som
er lovlig å gjøre i dag.
•
Sukker og alkohol fra trevirke Den ideelle råvaren
for å lage glukose og alkohol er stivelse, et polysakkarid
som brukes som energilager i planter. Stivelse er et viktig
næringsstoff og er derfor kontroversielt å bruke industrielt.
Den nest beste råvaren er lignocellulose fra trevirke,
som ikke kan brukes som en matressurs, men er et råmateriale i papirindustrien. Lignocellulose er en 4:3:2-blanding
av cellulose, hemicellulose og lignin, eller kan hentes fra
levende planter, og som biprodukt fra jordbruk og trevirke
(sagflis).
Noen problemer med lignocellulose som sukker- og alkoholkilde, er:
• Cellulose er krystallint, uløselig i vann og vanskelig
nedbrytbart for de fleste organismer. Men treormer,
termitter og visse sopper kan degradere cellulose med
cellulaser.
• Degraderingsproduktene til lignin er giftige, slik at
lignocellulose må syrebehandles før enzymdrevet nedbrytning.
• Cellulaser hemmes av sine egne produkter (glukose
og cellobiose), og er uansett temmelig treige.
Hvitråte-sopp kan degradere 60 til 70 prosent av ligninet
til karbondioksid, vann og hvit cellulose. Dette gjør de med
ekstracellulære peroksidaser som bryter bindingene mellom
fenolene i lignin. Hvor hvitråte får hydrogenperoksiden
som trengs for å drive denne reaksjonen fra, er et lite mysterium, men man lurer på om ikke det kan komme fra
ekstracellulære oksidaser som glukoseoksidase, som lager
H2 O2 som biprodukt ved oksidering av glukose.
Mulige strategier for å forbedre prosessen er å
• fremtvinge mutasjoner som fjerner negativ feedback
i cellulaser
• klone cellulaser fra fungus til mer økonomiske bakterier
• gi bakterier evnen til å bryte ned 5-ringede sukkerarter
• bruke mikrober som metaboliserer lignocellulose direkte for å danne etanol og organiske syrer
• lage nye enzymer som åpner opp krystallstrukturen
til cellulose
Eksempler på kjemikalier fra biomasse De 100 mest
brukte kjemikaliene i industrien utgjør omtrent 99% av
massen av alle kjemikalier som brukes, og de 5 mest brukte
kjemikaliene (eten, propen, benzen, toluen og xylen) utgjør
omtrent 75% av alle kjemikalier som brukes. Kjemikaliene
kommer for det meste fra petrolium og naturgass, men
alternativt kan de fleste kjemikaliene utvinnes fra bioteknologi:
• Etanol: brukes som løsemiddel, antifrys, og som
utgangsstoff for syntese av mange andre organiske
forbindelser. Det kan som kjent utvinnes med fermentering, og destillasjonsprosessen kan i dag hjelpes
•
•
•
•
•
på vei med termofile og etanoltolerante mikroorganismer.
Eddiksyre: produseres fra oksidering av etanol
av Acetobakter, men høykonsentrert eddiksyre produseres ved kjemisk karbonylering av metanol. Et
miljøvennlig bruksområde for eddiksyre er dannelse
av kalsiummagnesiumacetat til salting av veier. I
motsetning til natriumklorid fører det ikke til korrosjon i biler eller til tredød ved å konkurrere med
næringsstoffene til planter.
n-butanol: viktig organisk løsemiddel. Clostridium
acetobutylicum produserer n-butanol med aceton som
biprodukt. n-butanol er giftig for bakterier, men det
problemet løses ved å bruke immobiliserte mikroorganismer.
Glyserol: løsemiddel og lubrikant. Kan produseres
med de samme mikrobene som man bruker for å
produsere etanol, ved å legge til natriumsulfitt som
binder seg til et viktig mellomprodukt i biologisk
etanolsyntese.
Sitronsyre: konserveringsmiddel, smakstilsetning og
vaskemiddel. Produseres av Aspergillus-soppen.
Melkesyre: syreregulerende middel og konserveringsmiddel. Produseres av Lactobacillus. Kan dehydreres til den sykliske laktonen laktid, som videre kan
polymeriseres til den bionedgraderbare polyesteren
polylaktat.
Glukonsyre: lages av Aspergillus niger fra glukose
via glukoseoksidase. Kan brukes som biosensor for å
måle glukoseinnhold. Binder metallioner og forhindrer kalsiumflekker på glass.
Er produksjon av industrielle kjemikalier fra fornybare kilder realistisk? Produkter med høy verdi som
skal produseres i lite volum, for eksempel aminosyrer, er
det ofte bedre å få tak i bioteknologisk. For kjemikalier
som skal produseres i store volumer er det gjerne billigere
å bruke fossile kilder - bruk av bioteknologiske løsninger
avhenger da i stor grad av oljeprisen og økonomisk lønnsomme bioprosesser.
Bakterier i gruvedrift Levende organismer kan brukes
til å ekstrahere metaller fra årer i en prosess som kalles “bioleaching”. Omtrent 25% av kopperproduksjonen, 10% av
gullproduksjonen og 3% av kobolt- og nikkelproduksjonen
bruker levende organismer på denne måten.
Mikrobene som brukes i kopperproduksjon er svovelbakteriene Acidithiobacillus ferrooxidans, som oksiderer Fe(II)
til Fe(III) og angriper løselig svovel og uløselige sulfider for
å konvertere dem til sulfater, og Acidithiobacillus thiooxidans, som vokser på svovel og løselige svovelforbindelser.
I “direct leaching” får bakteriene energi ved å overføre
elektroner fra jern og svovel til oksygen på cellemembranen.
De oksiderte produktene, som er mer løselige, kan dermed
lettere hentes ut. I “indirect leaching” oksideres Fe(II) til
Fe(III), som i seg selv kan oksidere andre metallioner til
lettere løselige former. I praksis er det noe overlapp mellom
disse to prosessene.
16
MEOR står for “Microbially Enhanced Oil Recovery”,
og er en betegnelse for tertiære oljeproduksjonsmetoder
som brukes til å hente ut den siste oljen man ikke får tak i
med primære og sekundære metoder. Én slik metode er
å injisere bakterier som produserer gass og dermed øker
trykket i reservene.
En annen metode er å injisere mikroorganismer som
lager biosurfaktanter (bio-Zalo), som bryter opp oljen i
vannløselige dråper som lettere kan hentes ut fra porer i
stein. En utfordring med slike løsninger er de ekstreme
forholdene ved oljereservoarene: det er lite næringsstoffer
og oksygen, høy saltkonsentrasjon, høyt trykk og høy temperatur, så kun ekstremofile mikroorganismer kan overleve
der.
Oljeprodusenter forsker også på bruken av biopolymerer
som Xanthan, som produseres av plantepatogenet Xanthomonas campestris. Xanthan er et fortykkende stoff som
gjør vann mer tyktflytende. Etter at biosurfaktanter har
blitt pumpet inn i steinen, legger man til xantanfylt vann
som utøver et trykk på oljen og presser den ut. Xanthan
er fortsatt for dyrt til å være lønnsomt til slik bruk.
Bioplast Plast som utledes fra fornybare kilder til
biomasse, for eksempel vegetabilsk olje, stivelse og mikroorganismer. Mange, men ikke alle typer bioplast er laget
for å kunne brytes ned biologisk i enten anaerobiske eller
aerobiske miljøer.
Eksempel på bioplast:
• Pullulan er et cellofan-lignende polysakkarid som
ikke kan fordøyes av mennesker eller degraderes av
stivelsesnedbrytende amylaser, og brukes derfor som
en kalorifattig tilsetning til mat for å øke viskositeten.
Xanthan, som ble nevnt i forbindelse med oljeutvinning, brukes til det samme. Pullulan er også en bra
lufttett matfolie som løser seg opp i varmt vann og
kan nedbrytes mikrobielt når det er vått. Pullulan
lages med Pullularia pullulans-soppen.
• Polyhydroksybutyrat (PHB), med navnet Biopol, har
de samme egenskapene som petroleumsproduktet
polypropylen og produseres av bakterier som energilager (i så stor grad at bakteriene hovedsakelig består
av plast). PHB fra Alcaligenes eutrophus-bakterien
er en høykrystallin bioplast med smeltepunkt nær 180
celsiusgrader. Det brytes ned i en slik hastighet at
det kan brukes i kapsler for medisin som skal slippes
ut i kroppen over lengre tid, eller i sting (slik at de
etter hvert fjerner seg av seg selv).
• Man forsøker å produsere edderkoppsilke med recombinant E. coli under navnet Biosteel.
• Polylaktat, under navnet NatureWorks PLA, dannes
ved naturlig fermentering av kornstivelse og kan
brukes til å lage miljøvennlige konvolutter, dørmatter,
CD-er og lignende.
“Grønn” er her i sammenheng med at vi snakker om planter,
ikke at vi prøver å lage miljøvennlige løsninger (det var
kapittel 6).
7.1
Mikrober
Alger Blant alger har vi makroalger og mikroalger. Alger som er store nok til at man kan se dem med det blotte
øye kalles makroalger, resten kalles mikroalger. Makroalger er mer økonomisk lønnsomme enn mikroalger. Blant
makroalger har vi
• brunalger, for eksempel tang og tare. Brunalger er
råvaren for å lage alginat, agar, carrageenan og Lglutamat. Brukes i salater, supper, nudler eller med
kjøtt.
• rødalger, som har blitt kultivert i Japan siden middelalderen.
• grønnalger, som antakelig er grønne.
Blant mikroalger har vi blåalger som Spirulina, som
egentlig ikke er alger, men cyanobakterier. De ble spist
av indianerstammer i Sør-Amerika og i Afrika, og tas si
dag som kosttilskudd for å redusere kolesterol og rense
blodet. 100 gram spirulina inneholder 70 gram protein, 20
gram sukker, 2 gram fiber, 2 gram fett, samt en del viktige
vitaminer og mineralsalter. Spirulina kan gros i algefarmer
- store, flate vannbasseng - men det er fortsatt dyrere enn
soyaprotein.
Spiselige mikrober Mange mikrober inneholder verdifulle proteiner, fettsyrer, sukkerarter og vitaminer, og kan
brukes som matkilder for å redusere sult. Eksempler på
slike mikrober er mikroalger som Spirulina, samt gjær og
bakterier. Som matkilde har mikrober den fordelen at de
vokser svært fort: tiden det tar for en organisme å fordoble sin biomasse er 2 måneder for en kalv, 6 uker for en
grisunge, 4 uker for en kylling, 2 uker for gress, 6 timer for
mikroalger, 4 til 6 timer for gjær og 20 minutter til 2 timer
for bakterier. Dessuten blir nesten alt fôret konvertert til
spiselig protein, i motsetning til en ku som bare inneholder
kjøtt tilsvarende 9% av planteproteinet den spiser.
Single Cell Protein Produksjon av protein med
mikroorganismer begynte under 1. verdenskrig, da man
avlet store mengder gjær som proteinkilde i pølser og supper. Gjær var nyttig fordi gjær benytter seg av ellers
ubrukelige sukkerløsninger, og kan konvertere sukker til
nyttig protein.
Senere har man opdaget lignende organismer som spiser
andre “ubrukelige” stoffer i råolje og konverterer dem til
nyttig protein:
• i Øst-Europa konsentrerte man seg om Candidagjærceller som spiste alkaner. Bruken av slike er begrenset, i frykt for at cellene lager kreftfremkallende
biprodukter.
7 Grønn bioteknologi
• i Vest-Europa fant man gjær og bakterier som gikk på
metanol, som man tenkte å bruke som dyrefôr. Dette
Dette kapittelet handler om hvordan bioteknologiske
ble ikke noen suksess, fordi EU-subsidier gjorde det
løsninger kan øke matproduksjonen, redusere feilernæring
billigere å bruke pulver av skummetmelk som tilskudd
og produsere medisiner som består av komplekse molekyler.
i dyrefôr, så da gjorde man heller det.
17
Oljekrisen bidro også til at begge prosjektene endte uten Somatisk hybridisering Siden protoplastene mangler
suksess.
cellevegg kan de relativt enkelt fusjoneres, enten med
kjemisk cellefusjon eller med elektriske felt (elektrofusjon).
Mykoprotein Quorn er et vellykket matprodukt basert Slike teknikker, som kalles somatisk hybridisering, ble brukt
på det smak- og luktløse proteinet fra fungusen Fusarium for å lage pomatplanter - hybdrider av potet og tomat.
venenatum. Men det kan transformeres til imitasjoner av Pomatene var uspiselige og ingen stor suksess, fordi de
fisk samt hvitt og rødt kjøtt fordi det består av omtrent forskjellige karakteristiske komponentene i de to plantene
det samme som kjøtt (50% protein, 13% fett, 25% fiber), ikke fungerer godt sammen. Slike problemer vil svært
og man kan kontrollere lengden og finheten til fibrene ved å sannsynligvis dukke opp når man prøver seg på en somakontrollere hvor lenge man lar cellene vokse. En fordel med tisk hybridisering.
fungus i forhold til bakterieceller er at cellene gjerne er mye
større og enklere kan separeres fra vekstmediet. Fusarium
Planteceller i bioreaktorer Man trenger ikke differgror i en blanding av glukosesyrup og ammoniakk.
ensierte plantedeler for å produsere plantemateriale i en
reaktor - callus er nok, hvis man leverer det som trengs
7.2 Planter
av inorganiske salter, vitaminer, sukker og hormoner,
Totipotente celler Planteceller er totipotente, som be- samt rister på løsningen for å få overført nok CO2 til
tyr at man kan gro en helt ny plante fra en enkelt celle, plantene. Plantene vil da fortsette å gro, reprodusere og
så lenge man har de riktige planteveksthormonene. Disse produsere planteprodukter i reaktoren. Planteceller i biorehormonene inkluderer auxiner, som regulerer vekst og dif- aktorer brukes for å produsere mange ekstremt kompliserte
ferensiering, og cytokiner, som fremmer vekst av skudd og forbindelser, særlig medisiner (steroider, kodein, atropin,
forhindrer vekst av røtter. Forholdet mellom auxiner og reserpin, digoksin, digitoksin, quinin og Hyperzin A).
cytokiner blir dermed en viktig størrelse.
Meristem Den delen av en plante som aktivt deler seg
(altså der planten begynner på et utskudd). Det er her
cellene er minst differensiert (analogt med stamceller i
mennesker) Meristem kultur er bruk av celler fra meristem
til å gro nye planter. Da skjærer man vekk en meristem
og planter den på nytt i et vekstmedium.
Siden planteceller er totipotente, særlig ved meristemene, er det på denne måten mulig å lage opp til 500000
kloner av den samme planten i løpet av ett år. Ved å gro
dem in vitro (i testtuber med cellekultur) kan man raskt
produsere nye varianter av den samme planten og avle frem
egenskaper som resistans mot sykdommer og plantegift.
Haploide kulturer Pollenknappene (anthers) til planter
er plantenes mannlige kjønnsceller, og inneholder kun ett
sett kromosomer. Fruktknutene (ovaries) er de hunnlige
kjønnscellene, og inneholder det andre settet med kromosomer. Slike celler som kun inneholder ett av de to settene
med kromosomer, kalles haploide (i motsetning til vanlige,
diploide celler). Ved å gro celler fra pollenknapper i vekstmedium med hormoner kan man lage komplette, sterile
planter der alle cellene er haploide. Disse er nyttige til
planteavl fordi recessive mutasjoner blir synlige.
Callus En “celleklump” med plantemateriale; den uorganiserte massen av celler som vokser der man har laget
et kutt i en plante. Slik callus kan tas ut og gros videre i
vekstmedium.
Suspensjonskultur Det står ingenting om “suspensjonskultur” er, verken i Renneberg eller på slides, men det
nevnes i forbindelse med protoplastkultur, så jeg antar at
det er synonymt med det.
Agrobacterium En “bakteriell genteknolog” som brukes
for å genmodifisere planter. Bakterien tiltrekkes av
molekyler som planten slipper ut når den er skadet. Denne
bakterien har et såkalt Ti-plasmid (“Tumor-inducing plasmid” fordi plasmidet forårsaker tumorvekst i planter). Tiplasmidet har gener som koder for opin-detekterende proteiner. Opiner er spesielle aminosyrer som kun bakterien
kan bruke, så bakterien “reprogrammerer” dermed plantecellen til sitt eget formål. I tillegg har Ti-plasmidet gener
for proteiner som overfører DNA til skadede celler. Dette er
et skjeldent eksempel på at gener overføres fra en prokaryot
til en eukaryot.
Ti-plasmider kan “temmes” ved å fjerne genet for opindetekterende proteiner og plantehormoner (det er de plantehormondannende genene som forårsaker tumorene). Samtidig setter man inn de genene man måtte ønske i Tiplasmidet. Det er vanlig å inkludere et antibiotikaresistensgen, slik at rekombinante celler kan velges ut enkelt (ved å
bruke vekstmedium med antibiotika som dreper de ikkerekombinante bakteriene). De rekombinante plasmidene
settes enten direkte inn i protoplaster, eller de settes inn i
Agrobacterium igjen (det sistnevnte er standardmetoden).
Protoplast Plantecelle der man har fjernet celleveggen
(ved hjelp av cellenedbrytende enzymer som pektinaser og
cellulaser). Når protoplaster vokser i vekstmedium vil de
gjendanne celleveggene sine og danne calluser. Når plantehormoner dannes vil disse callusene få utskudd, og med
andre hormoner vil disse utskuddene så slå røtter. Dermed
kan man lage hele nye planter fra enkeltceller.
18
DNA-pistol En metode for å genmodifisere planter.
Gull- og wolframpartikler dekkes med plasmid DNA, og
partiklene skytes inn i vev på en måte som ikke skader
cellene. Av og til integreres plasmid-DNAet i plante-DNAet
selv om partiklene selv passerer gjennom cellene. Denne
metoden kan også brukes for å sette inn DNA i kloroplaster,
eller i andre organismer enn planter.
• Noen driver og lager poppeltrær som samler opp
tungmetaller.
• Det gjøres forsøk på å lage planter som tåler tørke
og høye konsentrasjoner av salt.
Eksempler på transgene planter
• Planter kan gjøres resistante til glyfosfat ved å øke
produksjonen av visse enzymer. Glyfosfat er en del
av urgressmiddelet “Round-Up” som skader planter
ved å hemme EPSP-syntase, et viktig enzym for
aminosyremetabolisme. Genet for EPSP-syntase kan
inkorporeres i rekombinant E. coli og overføres til
planter via Agrobacterium. Dette gir planter med
mye høyere konsentrasjon av EPSP, som gjør at de
tolererer konsentrasjoner av “Round-Up” som dreper
andre planter i området.
• Planter kan gjøres resistante til fosfinotricin (PPT)
med PPT acetyl transferase. Fosfinotricin dreper
planter ved å hemme syntesen av glutamin, med den
konsekvens at ammoniakk akkumulerer og dreper
cellen. PPT acetyl transferase, et enzym i blant
annet tobakk, poteter og raps, nøytraliserer denne
hemmelsen.
• Luciferase, enzymet som gjør ildfluer selvlysende,
har blitt introdusert i tobakkplanter. Hvis det er
luciferin og mye næringsstoffer i vannet til plantene
(for eksempel hvis de vannes med avløpsvann), lyser
de genmodifiserte plantene med en gulgrønn glød.
• Man har klart å lage blå nellik ved å introdusere
genene for det blå pigmentet i petunia. Blå roser har
man dessverre ikke kommet helt i mål med.
• Tomater kan få tykkere skinn med mer stivelse (fint
for å lage ketchup) ved å slå av polygalaktuonidase
(PG) med antisense-RNA.
• Transgen raps og soya har høyere innhold av
lysin (som beskrevet tidligere er lysin en essensiell
aminosyre, så høyere innhold av lysin betyr høyere
næringsverdi). Transgen raps inneholder også et annet spekter av fettsyrer enn vanlig raps, blant annet
noen av fettsyrene i palmeolje. Det kan derfor hende
at transgen raps erstatter palmeolje.
• Det gjøres forsøk på å lage planter som er resistante
mot tørråtesopp. Slike planter produserer cellulase
som angriper og løser opp celleveggen til tørråtesoppen.
• Genmodifiserte vindruer er et forsøk på å unngå de
sykdomsfremkallende soppene som er et stort problem for tradisjonelle vindruesorter som Riesling, Merlot og Chardonnay.
• “Golden rice” er ris som har blitt modifisert til å
inneholde en høy konsentrasjon av β-karoten (provitamin A). Det er kjekt å ha, fordi vitamin A-mangel
er vanlig blant folk som hovedsakelig lever på ris: 800
millioner mennesker lider av akutt vitamin A-mangel
som forårsaker at synet, immunsystemet, blodet og
skjelettveksten svekkes, og er en stor grunn til blindhet og anemi. Med de nyeste variantene av “golden
rice” kan man dekke opp til halvparten av det daglige
vitamin A-behovet ved å spise ris.
• Man prøver å lage koffeinfrie kaffeplanter. Sikkert
kjekt for de 20 prosentene av verdens befolkning som
drikker decaf-kaffe.
Biologisk insektmiddel Insektmidler har en del ulemper: de dreper andre insekter enn insektmiddelet er beregnet på og forstyrrer dermed balansen i økosystemer, de
akkumulerer i større fugler og dyr, og insektene blir etter
hvert resistente (som tradisjonelt “løses” ved å bruke større
mengde insektmiddel, slik at insektene etter hvert blir enda
mer resistente, og så videre).
Det biologiske insektmiddelet Bt-toksin er et mikrobeprodusert krystallinsk protein som blir til gift i
fordøyelsessystemet til larver og dermed perforerer dem
fra innsiden. Bt-toksin er harmløst mot mennesker, fisk og
varmblodige dyr. Ved å bruke de ovennevnte teknikkene
for å inkorporere Bt-genet i planter får man et insektmiddel
som kun påvirker insekter som er parasitter på planten.
“Refuge crops” Man ønsker å unngå spredningen av
Bt-gener samt utviklingen og spredningen av Bt-resistente
insekter. Dette gjøres ved å gro de transgene plantene
ved siden av ikke-transgene planter. Dermed sørger man
for at ikke-resistente insekter overlever og parrer seg med
eventuelle resistente insekter; recessive resistensgener vil
ikke komme til syne i avkommet til disse.
Trusler med transgene planter Kan genmodifiserte
planter spre seg til andre områder og bli til ugress der,
på samme måte som kaniner ble til skadedyr da de ble
introdusert til Australia? Trolig ikke: det ser ikke ut til at
genmodifiserte planter kan overleve i naturen - det har i
hvert fall aldri blitt vist at de kan det2 .
Eller kan transgene planter overføre sine resistensgener
til ugress gjennom krysspollinering, og dermed forverre
ugressproblemet? Spørsmålet undersøkes for tiden.
En tredje bekymring er pollenspredning av genmodifiserte planter til ikke-genmodifiserte avlinger. Når det
gjelder Bt-korn viser det seg at andelen genmodifiserte
planter faller under 0.9% (som er terskelen for når genmodifisert mat skal markeres i en del land, for eksempel Norge)
når man er 10 meter unna et felt med Bt-planter. Derfor
skal bønder som gror Bt-korn ha en tjue meter tykk separerende stripe rundt avlingen, for å utelukke økonomisk
skade for nabobøndene.
Merking av genmodifisert mat Skal genmodifisert
mat merkes? DNAet i seg selv har ikke noen metabolsk
effekt, da det blir brutt ned raskt i fordøyelsessystemet.
Hvis genmodifisert mat har noen effekt som gjør at den bør
markeres, vil det være på grunn av proteinene som dannes
av de innsatte genene, og det varierer naturligvis fra tilfelle
til tilfelle. Dermed er ikke “maten er genmodifisert” i seg
selv en god nok helsemessig grunn til å markere genmod-
2 Renneberg sier at det er slik “as a general rule”, men forklarer ikke hvorfor. Nå er det jo slik at genene vi avler frem i transgene planter
er til nytte for oss, ikke for plantene selv. Det er derfor ikke noen grunn til å bekymre seg for at genmodifiserte planter får egenskaper som
gjør dem mer levedyktige i naturen enn sine ikke-genmodifiserte søsterplanter. Se også Genetically Modified Foods Are Nothing New, lenket
til i Tonsill B.
19
ifisert mat. Derfor er genmodifisert mat FDA-godkjent i har fått et dårligere omdømme enn teknologien kanskje
USA.
fortjener.
Man kan riktignok argumentere for at den skal markeres
av andre grunner enn helse, for eksempel for å hensynta
8 Kloning og embryoer
enkeltpersoners religiøse innvendinger mot genmodifisering.
Regulering i Norge Med enkelte unntak gjelder de
samme reglene i Norge som i andre europeiske land. Vi har
matloven, som regulerer bearbeidede mat- og fôrprodukter som ikke inneholder levende, genmodifisert materiale,
samt genteknologiloven om levende genmodifisert materiale
(inkludert spiredyktige frø). Hittil har ingen genmodifiserte
produkter blitt godkjent som mat eller fôr i Norge; før en
eventuell godkjenning skal norske myndigheter ha gjennomført en risikovurdering. Dersom fôr- eller matvarer med
mer enn 0.9% genmodifisert materiale tilbys på markedet i
Norge, skal den være merket.
Genopdrett Planter er 10-50 ganger billigere å gro enn
E. coli, og 100 ganger billigere enn dyreceller. Det er også
færre etiske kvalmer med å genmodifisere planter enn det
er med å genmodifisere dyr, spesielt til medisinske formål.
En annen viktig fordel med å bruke planter (og andre
høyere organismer) til å gro gener, er at de kompliserte
proteinene i høyere organismer modifiseres i cellen etter at
de produseres (som vi så med insulin i kapittel 4).
Det har allerede blitt laget tobakk med antistoffer mot
karies, og poteter og bananer med “innebygd vaksine”. Slik
mat, om den blir vellykket, kan ikke spises i for store doser
og må derfor merkes tydelig, for eksempel ved å farge maten
med en egen farge. Renneberg foreslår blå. Undertegnede
er helt enig, og har alltid syntes at det er for lite blå mat
på markedet.
Dette kapittelet handler om kloning av høyere ordens
organismer. Mot slutten, litt diskusjon rundt bruk av
embryoer til andre ting enn kloning.
Kloning Når en organisme får avkom som er genetisk
helt identisk. Eksempler på naturlig kloning er den aseksuelle reproduksjonen til bakterier, samt noen insekter og
planter.
Somatisk celle En celle som er en del av kroppen til en
organisme, det vil si alle andre celler enn kjønnsceller og
stamceller (kapittel 9).
Overføring av kjerne En måte å lage kloner på, er å
overføre kjernen fra en somatisk donorcelle til en eggcelle
der man har fjernet kjernen. Eggcellen blir så til et embryo,
som settes inn i en surrogatmor. Kloner som produseres
slik er ikke egentlig genetisk identiske med organismen
som donorcellen kom fra, siden klonen vil ha mitokondrielt
DNA fra eggcellen.
De første eksperimentene med overføring av kjerne ble
gjort med frosker og salamandre. Da man klarte å lage
kloner med denne metoden, viste man at voksne somatiske
celler
• inneholder all den genetiske informasjonen som trengs
for å skape hele organismen
• har evnen til å aktivere fosterutvikling
• kan “glemme” spesifikasjonene sine og oppføre seg
som et totipotent (kapittel 9), befruktet egg
Antifrost-bakterier Frost skader planter ved at iskrystaller dannes på bladene og bryter opp det levende vevet.
Det viser seg at Pseudomonas syringae-bakterier spiller en Reproduktiv kloning Innebærer at man, etter overviktig rolle i denne prosessen: de har “frost-proteiner” som førig av kjerne, lar den nye hybridcella vokse til et embryo
stimulerer krystallvekst. Ved å populere planter med P. sy- som settes inn i en surrogatmor med det formål å lage en
ringae-bakterier der man har slettet DNAet som koder for ny organisme.
frost-proteinene, beskyttes plantene fra frostskader fordi de
skadelige naturlige bakteriene utkonkurreres av de harm- Terapeutisk kloning Innebærer at embryoet, i stedet
løse genmodifiserte bakteriene.
for å implanteres i en surrogatmor, las vokse in vitro til
Samtidig brukes de ikke-genmanipulerte frostbakteriene en blastocyst. Så høster man cellene fra innsiden av blastil å produsere kunstig snø. De gros i bioreaktorer og øde- tocysten og overfører dem til et medium som fremmer
legges (antagelig for å gjøre frost-proteinene tilgjengelige i vekst av visse typer celler (for eksempel muskel-, benmargløsning). Dette øker snøproduksjonen med 45% og sparer eller nerveceller) med det hensyn å produsere vev som kan
energi som ellers ville blitt brukt på nedkjøling av naturlig brukes i transplantasjoner.
snø.
Sauen Dolly Det første klonede pattedyret, født i 1996.
Andre etiske problemer med genmodifisert mat Dolly ble laget med overføring av kjerne, der kjernen kom
Potensielle økologiske trusler er nevnt i avsnittet om fra jurene til en voksen sau. Dolly var det ene vellykede
“Trusler med transgene planter”. Samtidig kan store felt forsøket ut av de 277 kloningsforsøkene som ble gjort, hvomed genmodifisert mat undergrave fornybart og alternativt rav 29 forsøk nådde stadiet der man hadde et embryo som
jordbruk. Et problem som ikke er nevnt i Renneberg, men kunne overføres til en surrogatmor (men i alle andre tilsom er hintet til på slides, er at bruk av genmodifisert mat feller enn Dolly ble fostrene spontanabortert på et tidlig
kan være mer lønnsomt for store bedrifter enn det er for stadium).
små produsenter. Interesserte kan for eksempel lese seg
Et problem med voksne celler er at mye av genmateopp på den kontroversielle businessmodellen til Monsanto, rialet er undertrykt (kapittel 4, “Strategisk adaptasjon”).
som er en viktig grunn til at bioteknologi og genteknologi For å lage Dolly ble denne “genblokkaden” fjernet ved å
20
sulte donorcellene i et næringsfattig medium. Sannsyn- Preimplantasjonsdiagnostikk (PID) Prosedyrer inligvis gjorde dette at DNA-innpakkingen ble revertert til nenfor medisin og genetikk som utføres på embryo før de
sin opprinnelige tilstand.
settes inn i en livmor. Når embryoet er på 8-cellestadiet
kan man fjerne 2 celler (en for analyse, en for backup av
analysen) uten at embryoet tar skade. Denne embryoniske
Årsaker til begrenset levetid Klonede dyr har en ten- cellen kan så destrueres for å studere genmaterialet inni.
dens til å dø tidligere enn andre (Dolly døde 6 år gammel Informasjon som man kan finne ved slik analyse inkluderer
av en lungesykdom som er typisk for eldre sauer).
kjønn (siden man kan se forskjell på X- og Y-kromosomet
Én mulig årsak er at cellene til kloner har kortere telom- fordi Y-kromosomet er mindre) og alvorlige kromosomfeil
erer (repeterende DNA-sekvens på endene av kromosomene (fordi det er lett å finne et ektra eller manglende kromosom beskytter kromosomene fra skade, som blir kortere som). I prinsippet skal det også være mulig å lese hele
ved hver celledeling og dermed er en indikator for cellens DNA-et, men med dagens teknologi ville det vært ekstremt
alder) enn andre dyr.
dyrt.
En annen mulig årsak er at DNA-skade som er usynlig
PID innebærer naturligvis et lass med etiske problemi en voksen celle kan komme frem når genmaterialet skal stillinger, fremst blant dem: er vi egentlig tjent med å
brukes til å lage forskjellige celler (tenk for eksempel hva kunne bruke slik teknologi til å kunstig velge fostere med
som skjer hvis man bruker en levercelle som ser helt fin ut, spesielle egenskaper (som kjønn, og etter hvert som teknolomen som har skade i genene som er aktiverte i nerveceller, gien forbedres, andre genetiske egenskaper)? Det kan i
men ikke i leverceller).
ytterste konsekvens føre til selektiv abort og et sorterEn tredje mulig årsak er feil i interaksjonen mellom ingssamfunn. I likhet med problemstillingene rundt kloning
cellen man har fjernet cellekjernen fra og cellekjernen man diskuteres ikke disse i alt for stor detalj i Renneberg.
har injisert inn i cella.
Hvor mye forteller genmaterialet ditt om deg?
Det vet man ennå ikke helt sikkert, siden mange arvelige
Kloning av utryddede dyr Det gjøres forsøk på å
egenskaper ikke avhenger av bare ett gen, men flere gener
klone mammut med somatiske mammutceller som har blitt
og interaksjonene mellom dem. Men man vet også at det
bevart i den sibirske permafrosten. Hvis kjerner fra slike
meste er avhengig av miljøet man vokser opp i: størrelse og
celler kan settes inn i eggcellene til en elefant, bør det i prinhelse avhenger av ernæring, intelligens er sterkt påvirket
sippet være mulig å lage en ny mammut. Forhåpentligvis
av de hva som skjer de tre første leveårene, og man kan
prøver man ikke å lage dyrepark av det denne gangen.
være genetisk predisponert for mange sykdommer som bare
kommer til syne hvis man lever usunt eller under stressede
Kloning av mennesker På tross av påstander fra di- leveforhold.
verse konspirasjonsteoretikere og andre tullinger rundt
omkring i verden, er det trolig ingen som har klart å Bruk av genetisk data Det er umulig at en DNA-profil
overvinne de tekniske utfordringene med å klone men- kan gi en komplett beskrivelse av et menneske og deres
nesker. Siden det skjer ganske mange spontanaborter og personlighet, fordi de rundt 3 milliarder basepar i DNAmisdannelser for hver vellykkede kloning, og siden kloning et umulig kan kode for de rundt 100 milliarder nevroner
av mennesker har en tendens til å være ulovlig (blant annet som hver er koblet til rundt 1000 andre nevroner. Siden
i EU gjennom Lisboa-traktaten), er ikke klonede mennesker en DNA-profil ikke er en personlighetsprofil, må det være
noe som forskes på i noen særlig grad.
strenge regler som forbyr arbeidsgivere, forsikringsselskaper
og andre aktører å bruke genetiske data til andre formål
enn det formål som gjorde at man samlet dataene i utEtikk rundt kloning Det er tynt med diskusjon rundt gangspunktet.
de etiske konsekvensene av kloning i Renneberg. To arguMed tanke på personvern kan man ikke si så alt for mye
menter som presenteres mot reproduktiv kloning av men- om en person basert på genene deres (i hvert fall ikke i dag),
nesker, er (i) at måten mennesker lages på blir en teknisk men det kan bli et farlig verktøy i kombinasjon med anprosess, og (ii) at man prøver å skape mennesker i sitt eget nen informasjon som pasientjournaler, nettlesningslogger,
bilde.
telefonsamtaler og bankkontoaktivitet.
Også kloning av andre dyr enn mennesker har etiske
konsekvenser knyttet til dyrevelferd.
Lovgivning rundt kloning I Norge er forskning på befruktede egg og kloning av mennesker forbudt ved den
norske bioteknologiloven siden 2004. Terapeutisk kloning,
altså kloning av celler til bruk i medisin, er tillatt, men
ofte bruker man heller stamceller til det samme formålet.
I USA er kjøtt og andre produkter fra klonede dyr FDAgodkjent uten at maten må merkes på noen spesiell måte,
fra og med 2006. Dette fordi mat fra klonede organismer
er identisk med mat fra organismene som ble klonet.
21
9
Medisinsk bioteknologi II
Dette kapittelet går litt i dybden på to forskjellige ting:
stamceller, som er lovende verktøy for reparering av vev
og behandling av sykdommer, og genterapi, som er modifisering av pasientens DNA for å behandle eller forebygge
sykdommer.
9.1
In vitro kan differensiering av stamceller kontrolleres
med faktorer som
• komposisjonen til cellekulturen som stamcellene gror
i
• overflatematerialet og -formen til beholderen man
gror stamcellene i
• genmodifisering
Stamceller
Stamcelle Pluripotente celler, som kan spesialisere seg
(gjennom differensiering) til å bli forskjellige typer celler
ved behov. Dette gjør dem til lovende verktøy for reparering av vev og behandling av sykdommer. Hvis stamceller transplanteres til et sykt organ, kan de lage det
riktige erstattende vevet på stedet.
9.2
Typer stamceller De tre viktigste typene stamceller er
• Embryoniske stamceller (ESC): stamcellene i en blastocyst (et embryo på stadiet der det består av ca.
100 celler). Disse hentes fra “overskudds-embryoer” i
forbindelse med kunstig befruktning. Fordeler med
ESC er at de vokser lett i cellekultur, og at de kan
bli til absolutt alle typer celler i kroppen. En annen
stor fordel er at de ikke aldrer, men forblir friske
og pluripotente gjennom mange runder med celledivisjon (fordi de har høye nivåer av telomerase, som
bevarer lengden på telomerene). Ulemper med embryoniske stamceller er at man risikerer dannelse av
teratoma (se under), etisk kontrovers rundt det å
hente celler fra embryoer, og risiko for avvisning fra
immunsystemet.
• Voksne stamceller: finnes i alt vev, men har begrenset
levetid og vokseevne. Siden de ikke kan bli til alle
typer celler i kroppen, men bare celler som finnes i
vevet stamcellen kom fra, kalles de multipotente i
stedet for pluripotente. Fordeler med bruk av voksne stammceller er at de er pasientens egne celler og
dermed har mindre sannsynlighet for å bli avvist av
kroppen, og man unngår det kontroversielle aspektet
ved ESC. Problemer med bruk av voksne stamceller
er at det finnes veldig få av dem, de har begrenset
evne til å vokse in vitro, og de er begrenset i hvilke
celler de kan bli til.
• Induserte pluripotente stamceller (IPSC), som dannes
fra spesialiserte voksne celler ved genetisk teknologi.
Fordeler med slike celler er de samme som med voksne stamceller, men man er også mindre begrenset
i hvilke celler man kan bruke, siden de pluripotente
cellene kan blir til hva som helst. Utfordringer med
IPSC er at de er vanskelige å produsere, resultatene
man har oppnådd så langt er variable, man har ikke
funnet ut hvilket potensial de har i forhold til ESC, og
man risikerer i likhet med ESC dannelse av teratoma.
Teratom Tumor med vev eller organkomponenter som
ligner på vanlig vev, altså ikke en krefttumor. Ukontrollert
differensiering av stamceller kan føre til dannelse av teratoma. Derfor er det nødvendig med streng kontroll på
selvfornyelsen og differensieringen til stamceller når man
skal bruke dem terapeutisk.
Genterapi
Genterapi Modifisering av en organisme sitt DNA for å
behandle eller forebygge sykdommer. Fordelen genterapi
har over tradisjonell medisinbasert terapi, er at man løser
de underliggende genetiske problemene som forårsaker sykdommen i stedet for å kun behandle symptomene. Innen
genterapi finnes det 3 vanlige metoder:
• Erstatte et sykdomsfremkallende mutert gen med en
frisk versjon av genet. Dette er den vanligste formen
for genterapi.
• Inaktivere et mutert gen som fungerer feil.
• Introdusere et nytt gen i kroppen for å hjelpe til med
å nedkjempe en sykdom.
De to første skal vi se nærmere på senere.
Eksempel: ADA-syndrom Mangel på adenosin deaminase (ADA), som hvite blodceller trenger for å vokse og
dele seg, fører til immunsvikt. Proteinet kan administreres
til pasienten, men dette er ekstremt dyrt fordi det er en
sjelden sykdom. Mangelen er forårsaket av en defekt i
ett enkelt gen, og derfor klarte man i 1990 å behandle
sykdommen med genterapi.
Prosedyren bestod i å injisere genet som koder for
adenosin deaminase i et bakterielt plasmid (som beskrevet
i kapittel 3), og så overføre plasmidet til et genetisk deaktivert retrovirus. Så lot man viruset angripe en kultur
av T-celler fra pasienten, slik at retroviruset satt inn det
fungerende ADA-genet i T-cellene. De virusinfiserte Tcellene, som nå kunne produsere adenosin deaminase, ble
så sprøytet inn i pasienten igjen.
Genvektor Mekanismen man bruker for å smugle et gen
inn i en celle. En god vektor
• går inn i de riktige cellene
• integrerer genet i cellen
• aktiverer genet
• har ikke skadelige bivirkninger
Virale vektorer Virus er fra naturens side allerede
maskiner som er laget for å sette inn gener i celler. Fordeler
med å bruke virus som vektorer er at de er gode på å finne
og infiltrere celler, noen av dem går målrettet på bestemte
typer celler, og de kan modifiseres slik at de ikke repliserer
og destruerer celler. Problemer med å bruke virus som
vektorer er at de er begrenset i hvor mye genetisk materiale
de kan ta med seg (fordi de er små), og at de kan forårsake
immunrespons i pasienter slik at pasienten enten blir syk
eller forhindrer viruset fra å levere genet til cellene.
Differensiering av stamceller Differensiering av stamceller kontrolleres i kroppen av gener og epigenetiske forandringer, samt til tider av eksterne signaler som cytokiner
og vekstfaktorer som slipper ut av celler i nærområdet,
og fysisk kontakt med nabooceller og den ekstracellulære
matriksen.
Ikke-virale vektorer Andre måter å levere gener på, er
22
• Plasmider. Disse kan være pakket inn i liposomer
(små membranbundne pakker som leverer innholdet
sitt ved å smelte sammen med cellemembranen). En
fordel er at de kan ta med seg store gener, og de fleste
forårsaker ikke en immunrespons. En ulempe er at
de er mye mindre effektive enn virus for å overføre
gener til celler.
• Virosomer : liposomer dekket med virale overflateproteiner (disse proteinene hjelper virosomet med å
trenge inn i cellen, og kan også bidra til spesifisitet).
Disse kombinerer plasmiders evne til å ta med seg
store gener og unngå immunsystemet med virusenes
spesifisitet.
• Polykationer: positivt ladde polymere som danner
komplekser med det negativt ladde DNAet for å
danne en partikkel som kan spises av cellen (fagocytose).
SiRNA “Small interfering RNA”, små RNA-tråder på
21-23 nukleotider, som binder seg til mRNA og lager
dobbeltstreng-RNA som destrueres av cellen. Så lenge
RNA-trådene er korte nok, slipper de unna immunsystemet. Dette er den mest effektive måten man har for å
slå av individuelle gener uten immunrespons.
SiRNA er det samme som antisense-RNA. Ikke la noen
fortelle deg noe annet. Eller, SiRNA er et subsett av
antisense-RNA, det subsettet av antisense-RNA som faktisk fungerer.
Reparasjon av mutasjoner Det har blitt utviklet
forskjellige virale vektorer som reparerer mutasjoner direkte
i DNAet. Disse bruker enzymer som målrettet går inn på
spesifikke DNA-sekvenser, kutter ut den defekte sekvensen
og setter inn en fungerende kopi. En annen teknologi,
SMaRT (“Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing”) retter seg mot mRNA-et som har blitt transkribert fra det
muterte genet, og reparerer den delen av mRNAet som
inneholder mutasjonen.
Dette kapittelet forklarer bioteknologisk måling og
analyse, herunder: hvordan vi kan bruke enzymer og organismer til å teste nivåer av spesifikke molekyler; forskjellige
metoder for å analysere DNA; og genomikk, en disiplin
innen genetikken der man analyserer funksjonen og strukturen til hele genomer.
Genterapi i fremtiden Det er omtrent 5000 gener som
er av interesse i genterapi-sammenheng. Genterapi virker
lovende for en del genetiske sykdommer, noen typer kreft
og enkelte virusinfeksjoner, men det er fortsatt uvisst om
teknikken er trygg og effektiv nok til å kunne bli vanlig.
Genterapi testes for tiden kun på sykdommer som ikke har
noen andre kjente kurer.
Ex vivo og in vivo genterapi Gener kan enten leveres
I 2012 ble den første genterapibehandlingen akseptert
til pasienten in vivo, ved at pasienten injiseres direkte med for klinisk bruk i Europa og USA; Glybera er en genterapivektoren, eller ex vivo, ved at genet leveres til celler som behandling som kompenserer for mangel på lipoproteinhar blitt tatt ut av kroppen og gror i en cellekultur, og disse lipase, som er nødvendig for effektiv nedbryting av
cellene settes så inn i pasienten igjen. Ex vivo genterapi fettsyrer.
har mindre sjanse for å trigge en immunrespons fordi man
ikke setter inn virus i pasienten, samtidig som man kan
følge med på cellene og se at de fungerer som de skal før
10 Analytisk bioteknologi
de settes inn i pasienten igjen.
Gene silencing Hvis det er like greit at man ikke produserer det feilaktige genet i det hele tatt, finnes det
forskjellige teknikker for å “slå av” genet slik at det ikke
produseres noe protein fra det. Dette kan gjøres med
oligonukleotider som binder seg til åpningen mellom de to
DNA-strengene og blokkerer DNAet fra å transkriberes til
mRNA.
Det går også an å påvirke mRNAet etter at det har
blitt transkribert. En måte å gjøre dette på, er å introdusere en liten bit RNA med en nukleotidsekvens som er
komplementær til mRNAet som ble transkribert fra genet
man ønsker å slå av. Det to bitene RNA vil binde seg
til hverandre og lage en “ubrukelig” RNA/RNA-hybrid
som cellen destruerer (dette kalles antisense-RNA, og ble
brukt for å motvirke virus i kapittel 5). En annen metode
kalles ribozym-genterapi, der man designer RNA-enzymer
(ribozymer) som finner og destruerer mRNA som er transkribert fra det muterte genet.
Denne typen RNA-interferens kan også brukes analytisk: ved å slå av gener på en systematisk måte kan man
finne ut hvilke gener som fremkaller hvilken effekt når de
uttrykkes.
10.1
Biologiske tester
Enzymbaserte biologiske tester er basert på reaksjoner som katalyseres av spesifikke enzymer. Testen innebærer at et enzym, som regel produsert av en rekombinant mikroorganisme, konverterer et spesifikt molekyl til
et produkt som kan detekteres og måles. En slik test må
være sensitiv nok til å detektere små mengder av spesifikke
molekyler.
Et eksempel på en slik test er å bruke glukoseoksidase til å teste for diabetes. Glukoseoksidase tar elektroner fra glukose og bruker dem til å redusere oksygen
til hydrogenperoksid. Denne reaksjonen kjøres samtidig
med en peroksidasekatalysert reaksjon, der en indikator
skifter farge i reaksjon med hydrogenperoksid. Dermed kan
aktiviteten til glukoseoksidase, som er proporsjonal med
glukosenivået, måles med kolorimetri. Testen brukes for å
måle glukosenivå i blod og kroppsvæsker. Responsen til
testen kalibreres med prøver med konstant mengde enzym
og forskjellige mengder glukose.
23
Biosensor Enzym- og mikroorganismebaserte innretninger som brukes til å detektere spesifikke molekyler i en
prøve. Disse kombineres som regel med elektronikk for å
tolke og kvantifisere et signal.
Et eksempel på en engangs-biosensor er glukoseoksidase
som immobiliseres på en chip. Glukose i prøven binder
FAD på det aktive setet i glukoseoksidase, og elektroner
trekkes fra glukose gjennom FAD. Disse elektronene tas opp
av ferrocen (en artig organisk forbindelse der et jernatom
er klemt mellom to syklopentadienylringer i en sandwichkonfigurasjon), som diffunderer til chip-en og donerer elektronene sine der. Den resulterende elektriske strømmen,
som er proporsjonal med glukosekonsentrasjonen, måles.
Et eksempel på en gjenbrukbar biosensor er glukoseoksidase som immobiliseres på en membran som dekkes med
en gel - se figur i Renneberg for oppsettet. Kun oksygen
og andre små molekyler kan slippe gjennom membranen til
siden med glukoseoksidase. Glukoseoksidase konverterer
glukose til glukonolakton og reduserer oksygen til hydrogenperoksid, som vanlig. Hydrogenperoksid donerer så
elektronene sine til en elektrode og genererer en elektrisk
strøm som kan måles og er proporsjonal med glukosekonsentrasjonen.
Organismebasert biosensor Også levende immobiliserte mikrober kan brukes i biosensorer. Vanligvis bruker
man gjærceller i en polymer-gel på en oksygenelektrode.
Det vanligste bruksområdet er måling av bionedgraderbare
forurensninger. Som beskrevet i kapittel 6 vil mikrober
konsumere en mengde oksygen som er proporsjonal med
mengden degraderbare organiske forbindelser i prøven. Derfor kan man bruke en slik test til å måle forurensningsnivåer
indirekte ved å måle oksygennivået i en prøve der man har
tilsatt gjærceller. Immobilisering av gjærcellene gjør at
man kan måle testen på 5 minutter i stedet for å gjøre en
5-dags BOD-test.
Immunologisk testing Antistoffer gjør det mulig å utføre diverse tester:
• Graviditetstest: graviditet medfører en dramatisk
økning i hormonet hCG (“human chorionic gonadotropin”). hCG kan detekteres i urin på en papirstripe med monoklonale antistoffer for hCG. På
den ene siden av papiret binder antistoffet seg til en
bestemt epitop på hCG, og det resulterende komplekset beveger seg, på grunn av kapillærkrefter, til
motsatt side av papiret. I midten av papiret er det
en stripe med immobiliserte antistoffer som binder
seg til en annen epitop på hCG. Det resulterende
“sandwich-komplekset” av hCG og to antistoffer er
synlig som en stripe på papiret. Hvis det ikke er hCG
til stede vil ikke de immobiliserte antistoffene kunne
binde seg til resten av antistoffene, som blir dratt
videre av kapillærkreftene helt til den andre siden
av papiret. Det er alltid én kontrollstripe ved siden
av for å bekrefte at testen fungerer, så to striper
indikerer graviditet.
• Virusinfeksjon-tester: virusinfeksjoner kan detekteres
med ELISA-testen som ble beskrevet i kapittel 5.
• Hjerteinfarkt-tester: Døende hjerteceller slipper ut
spesifikke proteiner som kreatinkinase og troponiner,
som er pålitelige indikasjoner på hjerteinfarkt og kan
måles direkte - men disse kan tidligst detekteres når
hjerteinfarktet har pågått i en time. Med monok-
lonale antistoffer kan man måle andre proteiner som
slippes ut tidligere, men som er vanskeligere å måle,
for eksempel det lille proteinet h-FABP. Testen fungerer på en lignende måte som graviditetstesten.
• Point-of-Care-tester (POC): ved å måle forskjellige
typer lipider i blodet kan man finne ut av risikoen
for hjerteinfarkt eller hjerneslag.
10.2
DNA-analyse
Gel-elektroforese DNA kan identifiseres ved å bruke
de samme restriksjons-endonukleasene som vi brukte for å
lage rekombinante bakterier i kapittel 3. Siden enzymene
kutter på svært spesifikke steder, vil man få en blanding DNA-fragmenter med forskjellig fordeling av størrelser
avhengig av DNA-sekvensen. Dermed kan man, ved å
separere DNA-fragmentene basert på størrelse, danne et
“genetisk fingeravtrykk” som gjør det mulig å se om to
DNA-prøver kommer fra det samme individet. Se figur i
bok/internett for å forstå oppsettet. Dette er prinsippet
som brukes i rettsmedisinsk DNA-analyse.
Ved DNA-testing er intronene, de “ubrukelige” delene
av DNA-et som ikke koder for gener, nyttige. Siden mutasjoner i intronene som regel ikke har noen effekt på
organismen, vil mutasjoner i introner lettere videreføres
fra en generasjon celler til den neste (i motsetning til mutasjoner i DNA som koder for gener, som sannsynligvis
vil føre til at immunsystemet destruerer cellen). Denne
høyere mutasjonsraten i introner gjør at de er kan være
svært forskjellige fra individ til individ. Dermed kan de
genetiske fingeravtrykkene til forskjellige individer, til og
med eneggede tvillinger, være ganske forskjellige.
Southern blotting En dramatisk forbedring av gelelektroforese som gjør det mulig å detektere spesifikke
gensekvenser. Før elektroforese denatureres DNA-et (det
deles opp i de to enkeltstrengene det består av) med natronlut. Etter elektroforese plasseres gelen på et nitrocellulosefilter, og det påføres trykk (for eksempel ved å
putte papirtørkler oppå). Da vil kapillærkrefter føre til
at DNA-strengene fester seg på filteret og binder seg der,
slik at man ender opp med et bilde av DNA-et i gelen på
filteret.
Så hybridiserer man DNA-et ved hjelp av DNA-prober
med sekvensene man ønsker å teste (som beskrevet i kapittel 3). Hvis man for eksempel har en fluorescerende probe,
vil påfølgende røntgenstråleeksponering gjøre at det hybridiserte DNAet “lyser opp”.
Grunnen til at man må gjøre alle greiene med nitrocellulosefilter før hybridisering, er at DNAet er lettere
tilgengelig og mindre mobilt på filteret enn i gelen.
24
PCR står for “Polymerase Chain Reaction”, og er en
metode for å produsere mange kopier av et DNA-molekyl
fra ett enkelt stykke DNA. Metoden bruker DNA polymerase, det samme enzymet som brukes for å kopiere DNA
under celledeling i naturen. Metoden utføres slik:
1. Løsningen med DNA varmes opp til 92-94 grader.
Dette fører til at DNA-molekylet spaltes opp i sine
to enkeltstrenger.
2. Løsningen kjøles ned til 42-55 grader, og “primers”
legges til. Dette er små oligonukleotuder som binder
seg på DNA. Primers er nødvendig fordi de gir DNA
polymerase et startpunkt - DNA polymerase trenger
et startpunkt der det finnes dobbeltstrenget DNA.
3. Nukleotider legges til i overskudd, og DNA polymerase syntetiserer datter-DNA på hver av de to
enkeltstrengene fra det opprinnelige DNA-molekylet.
4. Prosessen repeteres: løsningen varmes opp igjen, og
hver av de to DNA-molekylene gir opphav til to nye
molekyler. I løpet av noen minutter har man massevis av kopier av det ene DNA-molekylet man begynte
med.
DNA polymerasen som brukes, er ikke fra mennesker, men
en genmodifisert variant av det tilsvarende enzymet fra
den ekstremofile bakterien Thermus aquaticus. Dette enzymet tåler det første steget der løsningen varmes opp
til 92-94 grader (i motsetning til menneskelig polymerase,
som blir ødelagt av slike temperaturer). Før man fant
på den lure løsningen om å bruke ekstremofile enzymer,
måtte man legge til nytt DNA polymerase en gang per
oppvarmingssyklus.
Se boks 10.5 i tillegg til seksjonen om PCR i Renneberg!
første basen i sekvensen (etter primer-seksjonen) den komplementære basen T. Det nest nederste merket gir informasjon om den nest første basen i sekvensen, og så videre.
Hvorfor fungerer det? Renneberg og slides er ikke veldig
gode for å beskrive Sangers kjede-termineringsmetode
og hvorfor det fungerer.
Disse videoene forklarer det bedre: https://www.youtube.com/watch?v=
nudG0r9zL2M og https://www.youtube.com/watch?v=
vK-HIMaitnE. Den viser også hvorfor det er begrenset
hvor store sekvenser som kan leses med én iterasjon av
metoden (grensen er på ca. 400 basepar). Det er riktignok
mulig å lese lengre sekvenser ved å gjennomføre metoden
flere ganger og sette sammen resultatene fra hver runde
som i et puslespill.
Automatisk DNA-sekvensering Datamaskiner gjør
det mulig å lese ut lengre DNA-sekvenser. Med den automatiske metoden putter man fluorescerende merkelapper
på de modifiserte nukleotidene (ddNTP). Man har forskjellige merkelapper på hver av nukleotidene, så reaksjonen
kan skje i én prøve i stedet for 4. Reaksjonen utføres
på samme måte som i Sangers kjede-termineringsmetode,
men produktene separeres med kappilær elektroforese i
stedet for gel-elektroforese. Så eksiterer en laser de fluoDNA-sekvensering er metodene man har for å finne rescerende merkelappene, og de modifiserte nukleotidenes
den eksakte nukleotidsekvensen i DNA. Dette er nyttig respons måles med en detektor. Basert på kombinasjofor å utlede aminosyresekvensene i proteiner, finne den ek- nen av plassering i den kapillære tuben (som gir inforsakte sekvensen til et gen, finne regulerende elementer som masjon om reaksjonsproduktets størrelse, det vil si når
promotere, finne forskjeller i gener og å finne mutasjoner. polymerasereaksjonen terminerte) og signalet fra detektoren (som gir informasjon om hvilken modifisert nukleotid
Sangers kjede-termineringsmetode er den vanligste som forårsaket termineringen) kan man, med tilstrekklig
metoden for å sekvensere DNA, og ble funnet opp av Fred- lur software, finne DNA-sekvensen.
erick Sanger i 1977.
1. DNA denatureres, som beskrevet i Southern Blotting FISH står for “fluorescence in situ hybridization” og er en
og PCR. En av de to strengene tas ut, denne kalles metode for å finne ut på hvilket kromosom et gen ligger, og
en “template”-streng
om det finnes mange kopier av genet spredt utover forskjel2. Template-strengen hybridiseres med en radioaktivt lige kromosomer. Genene spres ut på en glassplate, og man
merket primer, for å tillate at nukleotider legges til legger til en DNA-probe med det komplementære DNA-et
senere.
til genet man skal undersøke, med en fluorescerende markør.
3. Man lager 4 separate løsninger. Til alle løsningene Proben hybridiserer med de relevante genene, slik at de
legger man til DNA-et som skal sekvenseres, som nå lyser opp under fluoerescensmikroskop.
har en primer på seg.
FISH kan brukes til å identifisere kreftceller, som
4. DNA polymerase legges til i de 4 løsningene.
har karakteristiske forvrengninger i DNA-et; blant annet
5. Frie nukleotider (dNTP, deoksyribonukleotider) er rekkefølgen av de 23 kromosomparrende mikset opp.
legges til i de 4 løsningene. Alle de 4 nukleotidene i Teknikken er spesielt effektiv når man bruker forskjellige
DNA (A, T, G, C) legges til i alle 4 løsningene.
markører med forskjellige farger (da kalles det “multicolor
6. Modifiserte nukleotider (ddNTP, dideoksyribonuk- banding”).
leotider) legges til i de 4 løsningene. Kun én type
FISH-tester kan også brukes til å studere strukturen til
modifisert nukleotid legges til i hver løsning. Vi kan kromosomer eller finne kromosomfeil.
kalle de modifiserte nukleotidene A*, T*, G* og C*.
ddNTP er som dNTP, men en OH-gruppe er erstat10.3 Genomikk
tet med et H-atom. Dette gjør at DNA polymerase
må stoppe etter at det har slengt på et modifisert
Genom En komplett kopi av den genetiske informasjonukleotid i kjeden, fordi det ikke er noe OH-gruppe
nen til en organisme kalles organismens genom.
som den kan hekte neste nukleotid på.
7. Prøver tas ut av alle løsningene, og DNA-fragmentene
i de 4 løsningene sammenlignes basert på størrelse Genomikk Disiplinen innenfore genetikk som innebærer
ved hjelp av gel-elektroforese.
å kartlegge, sekvensere og analysere funksjonene til hele
Nå kan nukleotidsekvensen leses ut direkte fra gel-en! Hvis genomer. Analysen av genomets funksjon kalles funksjonell
det nederste merket i gel-en er fra A*-løsningen, var den genomikk.
25
The Human Genome Project Et prosjekt som
foregikk fra 1990 til 2005, med det formål å kartlegge
hele det menneskelige genom - alle de 3.4 milliarder baseparene -, konstruere et detaljert fysisk kart over genomet og
å bestemme nukleotidsekvensen til alle de 23 menneskelige
kromosomene.
Presis kunnskap om det menneskelige genomet er et
viktig verktøy for å behandle og forebygge genetiske og
genetisk påvirkede sykdommer. Blant disse har man de
monogenetiske sykdommene som forårsakes av en feil i
ett enkelt gen (som Huntington’s, fenylketonuri og cystisk
fibrose), men også sykdommer som kreft og astma har
genetiske komponenter.
Genomisk kartlegging Siden genomet til en organisme
består av milliarder av basepar, men sekvenseringsteknologien som er beskrevet over er begrenset til sekvenser på
750 basepar, må genomet settes sammen som et puslespill.
For å hjelpe til med puslespillet trengte man genomiske
kart som inneholder informasjon om bestemte jevnt fordelte
“markører”. Slike genomiske kart finnes i to typer - genetiske
kart og fysiske kart.3
Genetiske kart I genetiske kort er markørene korte
stykker der sekvensen CACACA repeteres. Slike sekvenser
kalles STRs for “short tandem repeats”. Slikt DNA finnes
på alle kromosomer, og antallet repetisjoner i en STR
kan man finne ut ved å bruke komplementært DNA
med forskjellige lengder (f.eks Primer-CACACA-Primer
og Primer-CACACACACACA-Primer) og kjøre det gjennom PCR og gel-elektroforese. Hvor langt det hybridiserte
DNAet kommer i gel-en avhenger av hvor lang STR-en er.
eller tilsvarende, og prøv å sette det hele sammen
basert på genetiske markører. En annen metode
er “Shotgun”-metoden til Craig Venter sitt firma
Celera Genomics, som man tidligere hadde brukt
for å sekvensere genomet til Haemophilus influenzae-bakterien. Shotgun-metoden er å tilfeldig fragmentere genomet med ultralyd, sekvensere fragmentene, og prøve å se etter overlapp. Dette fungerer
bare hvis man finner overlapp mellom alle sekvenser.
Det går fint med prokaryote celler som inneholder
få repeterende sekvenser, men eukaryote celler har
mange STR-er som gjør at man kan få falske positive
resultater. Venter måtte utvikle kompliserte algoritmer for å løse problemet, og måtte til slutt støtte
seg på resultatene fra Contiq-metoden til Human
Genome Project.
• Bioinformatikk: utviklingen av softwarealgoritmer
som finner, setter sammen og analyserer DNAsekvenser.
• Transkriptomikk: studiet av genuttrykk, et verktøy
for å studere endringer i genaktivitet og hvordan de
kan fremkalle sykdommer. Her studerer man voksent
mRNA, hentet fra både friskt og sykt vev. Slikt voksent mRNA inneholder kun genetisk informasjon for
uttrykte gener, så ved å sammenligne genuttrykket
i friskt og sykt vev kan man vise hvilke endringer
i genuttrykket som forårsaker sykdom. Til dette
brukes DNA-chips - matriser med tusener av kjente
genfragmenter. Reverstranskriptase brukes for å lage
DNA (med fluorescerende eller radioaktive markører)
som kan hybridisere med det komplementære DNAet
på chip-en, slik at man kan se hvilke gener som er
uttrykt.
• Proteomikk: identifisering av alle proteinene i en celle;
hvordan uttrykkes proteiner, og hvordan fungerer og
interagerer de? Proteomikk består av å isolere enkeltproteiner, og så gjøre detaljert strukturell analyse av
proteinene.
Fysiske kart viser posisjonen til bestemte DNAsekvenser på DNA-molekylet. Disse sekvensene finner man
ved å bruke revers-transkriptase på voksent mRNA for
å lage DNA. Dette DNA-et brukes som prober i FISH
eller andre teknikker for å finne posisjonen til genet på
kromosomet.
Farmakogenomikk Personalisert medisin basert på individets genetikk. Forskjellige pasienter har forskjellige
Avansert genomanalyse Noen aspekter ved avansert gener som interagerer med medisin, og derfor vil medisin
analyse av det menneskelige genomet er:
fungere forskjellig for forskjellige pasienter. Dette med• DNA-sekvensering: her finnes det to metoder. fører at svært mange pasienter ikke har noen nytte av
“Contig”-metoden, som ble brukt i Humane Genome medisinene sine. Den genetiske profilen til pasienten blir
Project, er: lag kloner av genomet, kutt opp dermed et enormt nyttig verktøy for å bestemme hvilken
med restriksjons-endonukleaser, introduser de re- medisin pasienten skal ta, og gjør at man kan ta medisin
sulterende fragmentene i plasmidet til bakterier, som er mer effektiv og har færre bivirkninger. I tillegg er
sekvenser hver av segmentene med Sangers metode det et nyttig verktøy for diagnostisk risikoanalyse.
3 Rennebergs beskrivelse av genomisk kartlegging oppleves av undertegnede som en ugjennomtrengelig ordsalat som overhodet ikke
forklarer forskjellen mellom genetiske og fysiske kart, noe som kommer til uttrykk i de noenlunde intetsigende avsnittene jeg har skrevet om
temaet. Artikkelen What type of genome maps are there?, lenket til i Tonsill B, gir en mye mer forståelig forklaring av den prinsipielle
forskjellen mellom genetiske og fysiske genomkart, men den er så annerledes fra det Renneberg sier at jeg lurer på om de to beskrivelsene
engang er enige. Ifølge en slik beskrivelse handler genetiske kart om hvilke gener som ofte arves sammen (som gir et mål på “genetisk
avstand”), mens fysiske kart er basert på den faktiske fysiske avstanden mellom to sekvenser, målt i antall basepar fra det ene til det andre.
Den eksamens-engstelige leser kan beroliges med at det trolig bare er nødvendig med overordnet kunnskap om genomikk og The Human
Genome Project.
26
Tonsill
A
Video
• Kurzgesagt forklarer det menneskelige immunsystemet med fin minimalistisk grafikk. https://www.youtube.
com/playlist?list=PLFs4vir_WsTyY31efyHdmtp9l7DpR0Wvi
• 3D-animasjoner som forklarer mye av det som beskrives i kapittel 3 og 10. http://www.dnalc.org/resources/
3d/
B
Andre linker
• Genetically Modified Foods Are Nothing New : en litt bedre og grundigere forklaring enn den som står i Renneberg
på hvorfor truslene med transgene planter ikke er så ille som enkelte skal ha det til. http://www.agbioworld.
org/biotech-info/articles/agbio-articles/GM-food-nothing-new.html
• What type of genome maps are there? : en rimelig enkel forklaring av den prinsipielle forskjellen mellom genetiske
og fysiske kart av genomet. http://www.genomenewsnetwork.org/resources/whats_a_genome/Chp3_2.shtml
C
Spekulering rundt eksamensoppgaver
Det har vært et par eksamensoppgaver der man skal presentere en teknologi som en bioteknologisk løsning. Tidligere
tema har vært genterapi og kloning. Disse oppgavene har en oppdelt struktur, der man skal presentere
• Problem: Hvem sitt problem er dette? Er problemet presserende? Hvordan kan problemet formuleres anderledes?
• Løsning: Hvem tjener eller taper på løsningen? Hvilke andre løsninger kunne vært valgt? Hvorfor er denne
løsningen best?
• Argument: Er tekniske løsninger optimale? Hvilken samfunnsmessig infrastruktur forutsettes? Er dette en stabil
og realistisk løsning? Hvilke alternativer finnes?
• Implikasjoner : Er det knyttet miljømessige eller andre risikoer til løsningen? Vil teknologien i praksis forsterke eller
løse problemet? Hvilke konflikter kan oppstå? Er samfunnsmessige verdikonflikter involvert? Får utforksningen
av implikasjonene følger for argumentet?
Utdypningene på de tre punktene er hentet fra forelesning om bioetikk.
D
Forbedringspotensiale
Det er ikke alt jeg var like sikker på (eller like interessert i å skrive om) da jeg skrev dette kompendiet:
• Jeg vet ikke om jeg egentlig helt har forstått mekanismen for hvordan antibiotikaresistens induseres i rekombinante
bakterier (kapittel 3).
• DNA-replikasjon og slikt (kapittel 3) er ikke gjennomgått i detalj. Dette fordi det finnes hundre tusen millioner
figurer og videoer om dette i bøker og på Internett.
• Screening (kapittel 4) er hoppet over.
• Strukturen til antistoffer (kapittel 5) er beskrevet noe knapt.
• Rekombinante antistoffbibliotek (kapittel 5) er hoppet over.
• Deler av kapittel 10, særlig om genomikk, er noe knappere enn de kanskje fortjener.
Hvis noen vil skrive et avsnitt eller to om dette som jeg kan legge inn i dokumentet, mottas dette med takk.
E
Takk
Takk til
• Reinhard Renneberg, for at han har puttet masse bilder av kjæledyrene sine, samt personlige anekdoter, inn i
Biotechnology for Beginners
• De som startet på Nanoteknologi på NTNU i 2013, for å være en bra gjeng
• Jeg har fått en forespørsel om å legge inn en dedikasjon. Jeg dediserer derfor herved dette kompendiet til meg
selv, for uten meg hadde jeg aldri kunnet skrive denne teksten. Takk til meg for mange gode innspill under
skriveprosessen
F
LaTeX
Her er .tex-filer og bilder til dette dokumentet: http://folk.ntnu.no/jonathrg/biotex/
27
Register
α-heliks, 4
β-flak, 4
5-day BOD, 14
Acetobakter, 16
Acidithiobacillus, 16
ADA-syndrom, 22
adaptasjon, 8
adaptiv immunrespons, 13
aerob vannrensning, 14
aerobe organismer, 2
affinitetskromatografi, 8
Agrobacterium, 18, 19
aktivert slam, 14
aktivt sete, 5
alger, 17
allosterisk enzym, 9
aminosyrer, 4
amylaser, 5
anaerobe organismer, 2
anoksygenisk fotosyntese, 2
antifrost-bakterier, 20
antigendeterminant, 13
antisense-RNA, 12, 19, 23
antistoff, 13, 24
antiviral medisin, 12
arkebakterier, 1, 15
arvemateriale, 6
Asilomar-konferansen, 8
aspartam, 11
Aspergillus, 5, 16
ATP, 3
autotrofer, 2
auxin, 18
avløpsvann, 14
Bacillus licheniformis, 6
bakterier, 1
basepar, 6
bioetanol, 15
biogass, 15
bioinformatikk, 26
bioleaching, 16
biologisk test, 23
bioplast, 17
Biopol, 17
bioreaktor, 10, 18, 20
biosensor, 23
Biosteel, 17
biosurfaktanter, 17
blå nellik, 19
black box model, 9
Bt-toksin, 19
callus, 18
Candida, 17
cDNA, 7
celle, 1
celleånding, 2
cellekjerne, 2
cellemorfologi, 2
cellevegg, 1
cellulær immunrespons, 13
Clostridium acetobutylicum, 16
contig-metoden, 26
Corynebacterium glutamicum, 10,
11
cyclosporin, 12
cytokin, 18
cytoplasmamembran, 1, 2
cytotoksiske T-celler, 13
D- og L-stereoisomeri, 4, 11
deoksyribose, 6
det sentrale dogmet i molekylærbiologi, 6
differensiering, 1, 22
DNA, 6
DNA polymerase, 6
DNA-ligase, 7
DNA-pistol, 18
DNA-probe, 7
DNA-profil, 21
DNA-sekvensering, 25, 26
DNA-synthesizer, 7
Dolly, 20
E. coli, 14, 17, 19, 20
eddiksyre, 16
ekstracellulære hydrolaser, 5
ekstremofile organismer, 3, 25
ELISA-testen, 14
endoplasmatisk retikulum, 2
endring i enzymaktivitet, 9
endring i genuttrykk, 9
enzym, 5
enzymkatalyserte reaksjoner, 5
enzymkilder, 6
epitop, 13
essensielle aminosyrer, 4
etanol, 16
eutrofiering, 15
ex vivo, 23
FAD, 3, 24
fagocytose, 8, 23
farmakogenomikk, 26
ferrocen, 24
FISH, 25
fjerning av fosfor, 15
fjerning av nitrogen, 15
flagella og pili, 1
fosfinotricin, 19
fosfodiesterbinding, 6
fosfolipider, 2
fototroper, 2
Frederick Sanger, 25
Fusarium, 18
28
fusjonshemmer, 12
fysisk kart, 26
fytase, 6
gel-elektroforese, 24
gene silencing, 23
genetisk kart, 26
genetisk variasjon, 7
genetiske funksjoner, 1
genmodifisert mat, 19, 20
genom, 25
genomikk, 25
genomisk kartlegging, 26
genoppdrett, 20
genterapi, 22, 23
genvektor, 22
glukonsyre, 16
glukoseisomerase, 6
glukosemetabolisme, 3
glukoseoksidase, 5, 23
glutamat, 11
Glybera, 23
glykogen, 3
glyserol, 16
Gobarprosjektet, 15
golden rice, 19
golgiapparat, 2
graviditetstest, 24
hånd-i-handske, 5
Haemophilus influenzae, 26
haploid, 18
hCG, 24
hemoglobin, 5
Heterotrofer, 2
hjerteinfarkt, 24
hopanoider, 2
horisontal genetisk utveksling, 1
Human Genome Project, 26
humoral immunrespons, 13
hvit bioteknologi, 9
hvitråte, 16
hydrolase, 5
ikke-lytisk angrep, 12
ikke-viral vektor, 22
immobilisering, 6, 24
immunforsvar, 12
immunologisk testing, 24
in vitro, 18, 22
in vivo, 23
inducer, 7, 9
induserbart enzym, 9
industriell bioteknologi, 9
insulin, 8
integrasehemmer, 12
interferon, 12
intron, 7, 24
isomeraser, 5
katabolisme, 2
katalytiske funksjoner, 1
kjemikalier fra biomasse, 16
kjemolitotrofer, 2
kjemoorganotroper, 2
kjemotrofer, 2
klassisk mutagenese, 10
kloning, 20
kloning av gener, 7
kloroplaster, 2
kodon, 6
koenzym, 5
kofaktor, 5
kombinasjon av kjemisk syntese og
bioteknologi, 11, 15
konjugering, 7
konstitutivt enzym, 9
kopper, 13
kortison, 11
kunstig snø, 20
kvartærstruktur, 5
Lactobacillus, 16
laktose, 9
ligaser, 5
lignocellulose, 16
liposom, 23
luciferase, 19
lyaser, 5
lysin, 10
lysozym, 5
lytisk angrep, 12
mammut, 21
medfødt immunrespons, 13
melkesyre, 16
membranproteiner, 2
MEOR, 16
meristem, 18
metabolic engineering, 10
metabolisme, 2
metabolsk diversitet, 2
metan, 15
metanogenese, 15
mikroinjeksjon, 8
minne-celler, 13
mitokondrier, 2
monoklonale antistoffer, 14
motilitet, 1
mRNA, 6
multicolor banding, 25
mutagen, 11
mutasjon, 11, 23
mykoprotein, 18
n-butanol, 16
nøkkel-i-lås, 5
NAD, 3
negativ feedack, 9
negativ kontroll, 9
neopterin, 13
Nitrobacter, 15
Nitrosomonas, 15
nukleoid, 1
nukleotid, 6
oksidoreduktaser, 5
oksygenisk fotosyntese, 2
oljedegraderende bakterier, 15
operator-region, 7
overføring av kjerne, 20
passiv diffusjon, 2
PCR, 24
pektinase, 5
penicillin, 11
peptidbinding, 4
peptider, 4
personalisert medisin, 26
planter, 18
plasmid, 1, 7, 8, 12, 18, 23
pluripotens, 22
polykation, 23
polylaktat, 17
Population equivalent, 14
preimplantasjonsdiagnostikk, 21
primærprodusenter, 2
primærstruktur, 4
produktivitet, 10
prokaryot, 1
promoter, 7
proteasehemmer, 12
proteaser, 5
proteiner, 4
proteomikk, 26
protoplast, 18
Pseudomonas, 20
Pseudomonias, 15
pullulan, 17
Quorn, 18
raps, 19
reduksjon i aktiveringsenergi, 5
refuge crops, 19
regulering i Norge, 20, 21
rekombinante antistoffer, 14
rekombinasjon, 7
repressorprotein, 7, 9
resistens, 12
resonans, 4
restriksjons-endonuklease, 7, 24
revers-transkripsjon, 12, 26
Rhizopus, 5
ribosom, 1, 6
ribozym, 5, 23
Round-Up, 19
Sangers kjede-termineringsmetode,
25
29
sekundærstruktur, 4
selektivt medium, 8
short tandem repeats, 26
shotgun-metoden, 26
Single Cell Protein, 17
SiRNA, 23
sitronsyre, 16
SMaRT, 23
somatisk celle, 20
somatisk hybridisering, 18
Southern blotting, 24
sovende viralt DNA, 12
soya, 19
spesifikk veksthastighet, 10
Spirulina, 17
spiselige mikrober, 17
stamcelle, 22
stereoisomeri, 4
steroler, 2
strategisk adaptasjon, 9
strukturelt gen, 7
substrat, 5
substratspesifikt enzym, 5
subtilisin, 6
suspensjonskultur, 18
T-celle, 13
tørråte, 19
taktisk adaptasjon, 9
telomer, 21
teratom, 22
terminator, 7
tertiærstruktur, 4
Thermus aquaticus, 25
Ti-plasmid, 18
titin, 4
toksoider, 13
Tolypocladium inflatum, 12
totipotens, 18
transferaser, 5
transgen plante, 19
transkripsjon, 6
transkriptasehemmer, 12
transkriptomikk, 26
translasjon, 6
trickling filters, 14
utbytte, 10
utvikling av bioprosesser, 10
vaksine, 13
vin, 19
viral vektor, 22
virosom, 23
virus, 12
vitamin C, 11
voksent mRNA, 26
Xanthan, 17
Xanthomonas campestris, 17