1. No category

‫האוניברסיטה העברית בירושלים‬
‫הפקולטה למתמטיקה ומדעי הטבע‬
‫המכון לכימיה‬
‫דינאמיקה מושרית אור בקסנטורודופסין ‪ -‬משאבת פרוטונים‬
‫עם אנטנת קרוטן‬
‫‪Light-Driven Dynamics in Xanthorhodopsin - a‬‬
‫‪Proton Pump with Carotenoid Antenna‬‬
‫מגיש איתי גדור‬
‫בהנחיית פרופסור סנפורד רוכמן‬
‫"עבודת גמר לתואר מוסמך במדעי הטבע"‬
‫‪ 8‬בדצמבר ‪9002‬‬
‫יום שלישי כא' כסלו תש"ע‬
‫‪1‬‬
‫תקציר‬
‫חלבון הקסנטורודופסין (‪ )xanthorhodopsin - XR‬הינו תוספת חדשה למשפחות החלבונים‬
‫הרטינליים‪ .‬החלבון בודד מהארכאיה ‪ ,Salinibater rubber‬בה הוא מתפקד כמשאבת פרוטונים‬
‫המופעלת על ידי אור השמש כחלק מתהליך הפוטוסינתזה‪ .‬יחודו של חלבון זה מגיע מהקרוטן‬
‫סליניקסנטין (‪ ,)salinixanthin - SX‬מולקולת צבע (צבען) נוספת‪ ,‬הקשור לאתר הפעיל בחלבון בנוסף‬
‫לרטינל המאפיין את כל חברי המשפחה‪ .‬הצבען הנוסף מתפקד כאנטנה הקולטת אור באזור הירוק ‪ -‬כחול‬
‫של הספקטרום הנראה ומעבירה את האנרגיה הנאספת אל מולקולת הרטינל‪.‬‬
‫עבודה זו עוסקת בדינאמיקה הראשונית בפוטוכימיה של חלבון הקסנטורודופסין והקרוטן‬
‫סליניקסנטין באתנול‪ ,‬שנמדדו באמצעות ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה רחבת פס‪ .‬לאחר עירור לרמת‬
‫הסינגלט השנייה (‪ )S2‬במולקולת הקרוטן‪ ,‬ספקטראות טרנזיאנטיים תועדו בקיטובים שונים בטווח שבין‬
‫‪ .430-850nm‬ניתוח התוצאות המתקבלות משתי הדוגמאות מראה כי‬
‫‪‬‬
‫בהתאם למחקרים קודמים שבוצעו על חלבון ה ‪ ,XR‬האנרגיה זורמת אל הרטינל מרמה ‪ S2‬של‬
‫הקרוטן בלבד‪ ,‬כאשר זמן החיים של רמת ‪ S2‬בקרוטן הינה כ ‪ ,25fs‬זמן קצר משמעותית‬
‫מדיווחים קודמים‪.‬‬
‫‪‬‬
‫יחס הסיעוף מרמת ‪ S2‬לרמות ‪ S*,S1‬בקרוטן ולרמה ‪ S1‬ברטינל נמדדו תוך שימוש באנליזה‬
‫גלובלית מבוססת מודל‪ ,‬שאפשרה חילוץ הספקטראות הזמניים המשויכים לרמות השונות‬
‫(‪.)SADS‬‬
‫‪‬‬
‫יחס האנאיזוטרופיה המגיע מפס הבליעה של רמות ‪ S1‬ו *‪ S‬מקבל ערך של ‪ ,r=0.0‬יחס נמוך‬
‫בהרבה מיחס של ‪ r=0.4‬הצפוי להתקבל מרמות מעוררות של פוליאנים‪ .‬יחס זה מצביע על זווית‬
‫של כ‪ 25°‬בין דיפול המעבר ‪ S0→S2‬לדיפולי המעבר ‪ S1→Sn‬ו ‪ .S*→Sn‬יחס האנאיזוטרופיה‬
‫השונה מאפשר את שיוך *‪ S‬כרמה מעוררת במולקולת הרטינל‪ ,‬בניגוד לרמת יסוד חמה‬
‫וויברציונית ‪.S0h‬‬
‫לאור ההיפוך הפנימי (‪ )IC‬הסופר מהיר של רמת ‪ S2‬לרמות הסינגלט הנמוכות יותר‪ ,‬האפשרות כי‬
‫מעבר האנרגיה בין הצבענים השונים כולל שימור הקוהרנטיות האלקטרונית נדונה בעבודה‪ ,‬כמו גם‬
‫הגורמים האפשריים ליחס האנאיזוטרופיה המפתיע‪ ,‬המגיע מרמות הסינגלט החשוכות במולקולת‬
‫הרטינל‪.‬‬
‫‪9‬‬
‫תודות‬
‫ברצוני להודות לפרופ' סנדי רוכמן על ההנחיה המסורה במהלך העבודה‪ ,‬על העידוד והתמיכה לאורך כל‬
‫המחקר וכתיבה העבודה‪.‬‬
‫תודה לד"ר ג'ינגי זו על העזרה‪ ,‬התמיכה והחברות במהלך לילות ארוכים וקרים‪.‬‬
‫תודה לפרופ' מודי שבס וללנה סמולנסקי ממכון ויצמן על החומרים שסופקו בכל עת ועל שיתוף פעולה‪.‬‬
‫כמו כן ברצוני להודות לד"ר אדוארד מסטוב על עזרתו‪ ,‬פתרונותיו היצירתיים והמקוריים לבעיות טכניות‬
‫ולמר מרסלו פרידמן על התמיכה הטכנית והעזרה בכל עת ומכל הלב‪.‬‬
‫תודה לחבריי למעבדה – אמיר ונד‪ ,‬פבל קום‪ ,‬בוריס לויבסקי‪ ,‬אושרת ביסמות‪ ,‬אופיר שושנים ומירב בן‬
‫לולו‪ ,‬על הגשת עזרה בכל עת שנדרשה‪.‬‬
‫ואחרונה חביבה לאפרת חברתי‪ ,‬על הסבלנות והתמיכה‪.‬‬
‫‪0‬‬
‫תוכן העניינים‬
‫‪ .1‬מבוא‬
‫‪4............................................................................‬‬
‫‪ 1.1‬רקע ביוכימי‬
‫‪4............................................................................‬‬
‫‪ 1.9‬חלבון ה ‪XR‬‬
‫‪19..........................................................................‬‬
‫‪ 1.0‬רקע ספקטרוסקופי‬
‫‪17..........................................................................‬‬
‫‪ .9‬מטרות המחקר‬
‫‪92..........................................................................‬‬
‫‪ .0‬מערכת ניסיונית ושיטות העבודה‬
‫‪97..........................................................................‬‬
‫‪ 0.1‬האוסצילטור‬
‫‪97..........................................................................‬‬
‫‪ 0.9‬הפורש‬
‫‪98..........................................................................‬‬
‫‪ 0.0‬בורר פולסים‬
‫‪98..........................................................................‬‬
‫‪ 0.4‬המגבר‬
‫‪92..........................................................................‬‬
‫‪ 0.3‬המדחס‬
‫‪92..........................................................................‬‬
‫‪ 0.2‬המרת אורך גל – מגברים פרמטרים‬
‫‪00..................................................‬‬
‫‪ 0.7‬הקונפיגורציה הניסיונית ניסוי ה‪TOPAS-‬‬
‫‪01..................................................‬‬
‫‪ 0.8‬הקונפיגורציה הניסיונית ניסוי ה‪NOPA -‬‬
‫‪04..................................................‬‬
‫‪ 0.2‬הדוגמא והתא‬
‫‪ .4‬תוצאות‬
‫‪02..........................................................................‬‬
‫‪07..........................................................................‬‬
‫‪ 4.1‬בליעת מצב היסוד‬
‫‪07..........................................................................‬‬
‫‪ 4.9‬ספקטראות טרנזינטים‬
‫‪08..........................................................................‬‬
‫‪ 4.0‬התאמה גלובלית‬
‫‪02..........................................................................‬‬
‫‪ 4.4‬עירור סלקטיבי של הרטינל בחלבון ה‪XR‬‬
‫‪41..................................................‬‬
‫‪ 4.3‬חקירה באמצעות ברירה פוטונית‬
‫‪41..................................................‬‬
‫‪ 4.2‬ניסוי ‪ NOPA‬ברזולוצית זמן אולטרה גבוהה‬
‫‪40 .................................................‬‬
‫‪ 4.7‬התאמה למודל ‪target analysis‬‬
‫‪42..................................................‬‬
‫‪ .3‬דיון בתוצאות‬
‫‪42..........................................................................‬‬
‫‪ .2‬סיכום ומסקנות‬
‫‪34..........................................................................‬‬
‫‪Abstract .7‬‬
‫‪33..........................................................................‬‬
‫‪ .8‬מראה מקום‬
‫‪32..........................................................................‬‬
‫‪4‬‬
‫‪ .1‬מבוא‬
‫‪ 1.1‬רקע ביוכימי‬
‫קסנטורודופסין (‪ )XR‬הוא חלבון טרנס ממבראנלי (‪ )tarnsmembrane‬שבודד לאחרונה‬
‫מהארכאיה )‪ Salinibater rubber (SR‬המשגשגת בתנאי מליחות גבוהים ומאופיינת בצבע ורוד‬
‫אדמדם‪ .1‬לחלבון זה תפקיד ראשי בתהליך הפוטוסינתזה של ה‪ ,SR‬המאפשר את המשך קיומה בסביבה‬
‫עוינת זו‪.‬‬
‫תהליכים מושרי אור בחלבונים רטינליים‪.‬‬
‫ה‪ XR‬שייך למשפחת החלבונים הרטינליים‪ ,‬המאופיינים באופסין (‪ )Opsin‬בעל מבנה שלישוני‬
‫המורכב משבעה סלילי אלפא (‪ ,)α helix‬החוצים את הממבראנה‪ .‬סלילי האלפא מאוגדים בצורת גליל‬
‫הכולא בתוכו מולקולת רטינל (‪all-‬‬
‫‪ )trans retinal‬אחת‪ .‬הרטינל ממוקם‬
‫באלכסון‬
‫לכיוון‬
‫האופסין‬
‫ומחובר‬
‫קוולנטית לחומצה האמינית ‪Lysine‬‬
‫‪ 240‬דרך ‪Protonated Schiff– Base‬‬
‫)‪ (PSB‬במרכז האופסין‪ .‬הרטינל הינו‬
‫איור ‪ :1‬מבנה הרטינל החץ מסמן את כיוון ומיקום הפוטואיזומריזציה‪.‬‬
‫נגזרת של ויטמין ‪ – A‬זוהי מולקולה בעלת ‪ 2‬קשרים מצומדים וטבעת משושה (ראה איור ‪ ,)1‬הבולעת‬
‫אור בתחום הנראה לאחר פרוטונציה בעת קישורה לאתר הפעיל בחלבון‪ .‬פס הבליעה הספציפי תלוי‬
‫באופסין ומשתנה בין חברי המשפחה‪.‬‬
‫בהתאם לתפקידם בתא‪ ,‬ניתן לחלק את משפחת החלבונים הרטינלים בארקיאות לשתי קבוצות‪:‬‬
‫חיישני אור (‪ )photoreceptors‬ומשאבות יונים (‪ .)ion pumps‬קבוצת חיישני אור מפעילה חלבונים‬
‫המאפשרים לבקטריה לנוע לצורך חיפוש אור בעוצמה ובתדר הרצויים לתהליך הפוטוסינתזה; קבוצת‬
‫משאבות פרוטונים‪ ,‬הכוללת את ה‪ ,XR‬מבצעת שינוי מבני מושרה אור המתבצע תוך העברת יון ספציפי‬
‫דרך ממברנת התא‪ .‬קבוצה שלישית שאיננה מופיעה בארקיאות אך שייכת למשפחת חלבונים רטינלים‬
‫הינם חישני האור המשמשים לראייה בבעלי חיים להם אותו המבנה אך המנגנון פעולה שלהם מעת שונה‬
‫כפי שהזכיר בהמשך‪.‬‬
‫‪3‬‬
‫פעולת המשאבת הפרוטונים בחלבון ה‪:XR‬‬
‫כתוצאה מבליעת פוטון עובר הרטינל פוטואיזומריזציה מ ‪ all-trans‬ל ‪ ,13-cis‬שמתחילה מעגל‬
‫משרה אור המתרחש בסקאלת זמנים של מילישניות‪ ,‬במהלכו פרוטון )‪ (H+‬נשאב מתוך הציטופלזמה של‬
‫התא )‪ (intracellular‬אל מחוץ‬
‫(‪)extracellular‬‬
‫לממבראנה‬
‫והרטינל חוזר למצבו הראשוני‬
‫(‪ )all-trans‬עם סיום המעגל ללא‬
‫השקעת אנרגיה‪ .‬זאת בניגוד‬
‫לחלבונים הרטינליים המשמשים‬
‫לראייה בהם המצב ההתחלתי הינו‬
‫‪11-cis‬‬
‫ההופך‬
‫פוטואיזומריזציה‬
‫ל‬
‫בעקבות‬
‫‪all-trans‬‬
‫כאשר על מנת להחזיר את הרטינל‬
‫איור ‪ :9‬המעגל הפוטוכימי של הרטינל;‬
‫למצבו הראשוני (‪ )11-cis‬יש‬
‫‪2‬‬
‫צורך ביציאת הרטינל מהחלבון וטיפולו בחלבון נוסף (‪ )RPE65‬המצריך השקעת אנרגיה ‪.‬‬
‫שאיבת פרוטונים בחלבון ה‪ XR‬יוצרת מפל ריכוזים משני צידי ממברנת התא‪ .‬הפרוטון יכול‬
‫לחזור לתא רק דרך האנזים ‪ ATP synthase complex‬המנצל את הפוטנציאל הכימי ליצירת ‪ ATP‬מ‬
‫‪ ,ADP‬המשמש כ"מטבע האנרגיה" בבקטריה‪.‬‬
‫ניתן לחלק את מעגל האור למספר שלבים‪ ,‬כאשר תוצרי הביניים מקוטלגים אלפביתית מ ‪ I‬ל ‪,O‬‬
‫כפי שניתן לראות באיור ‪.9‬‬
‫הרטינל מעורר ממצבו התחלתי ‪-‬‬
‫קונפיגורציית ‪ ,all trans‬למשטח הפוטנציאל‬
‫העליון‪ ,‬צורון ‪ .I‬איזומריזציה סלקטיבית סביב‬
‫הקשר הכפול ‪ ,C13=C14‬מובילה לתוצר‬
‫הביניים ‪ K‬בסקאלת זמן של פיקושניות (‪.)ps‬‬
‫המעגל ממשיך לתוצרי הביניים ‪ L‬ו ‪M‬‬
‫בסקאלת‬
‫זמן‬
‫של‬
‫מילישניות‪,‬‬
‫כאשר‬
‫היווצרותו של ‪ M‬כוללת העברת פרוטון מה‬
‫‪ PSB‬לחומצה האמינית ‪( Aspartic 236‬כפי‬
‫שניתן לראות באיור ‪ ,)0‬הממוקמת בצד‬
‫איור‪ :0‬פרוטונציה של ה ‪ Schiff base‬במעגל האור של הרטינל‬
‫הפונה לחוץ התא‪ .‬איבוד הפרוטון מה ‪PSB‬‬
‫(‪ )Deprotonation‬גורר היסט בבליעה האלקטרונית לכיוון הכחול (‪ ,)blue-shift‬שנותן לצורון זה צבע‬
‫‪2‬‬
‫צהבהב‪ ,‬בשונה משאר צורוני המעגל‪ .‬כדי להשלים את מעבר הפרוטון בסיס השיף עובר פרוטונציה‬
‫מחדש (‪ )reprotonation‬על ידי פרוטון שמקורו בציטופלסמה של התא‪ ,‬בסקאלת זמנים של מספר‬
‫מילישניות‪ ,‬לקבלת תוצר הביניים ‪ .N‬בשלב זה הרטינל עובר איזומריזציה חזרה לקונפיגורצית ‪all-trans‬‬
‫לקבלת תוצר ביניים ‪ ,O‬שלאחריה עוזב הפרוטון שמקורו ב ‪ PSB‬את החומצה האמינית ‪Aspartic 96‬‬
‫אל מחוץ לתא והחלבון חוזר למצבו ההתחלתי מוכן לסיבוב חדש‪.‬‬
‫פוטוכימיה של קרוטנים‬
‫למרות הכתוב בפסקה הקודמת‪ ,‬מרבית הפוטוסינתזה המבוצעת בעולמנו על ידי חיידקים איננה‬
‫מבוצעת כפי שתואר קודם‪ ,‬אלא על ידי מערכת ביולוגית שונה לחלוטין‪ .‬קומפלקסים פוטוסינתזה‬
‫(‪ ,)photosynthetic unit -PSU‬הינם המערכת הנפוצה בטבע לניצול אנרגית השמש לצרכים ביולוגים‪.‬‬
‫קליטת האור והעברתו בחלבונים אלו מבוצעת בעיקר על ידי מולקולות קרוטן (‪.)CAR‬‬
‫הקרוטנים‪ ,‬המשמשים כאנטנה עבור האור הכחול ירוק‪ ,‬משלימים את הבליעה האדומה של הכלורופיל‬
‫לניצול מלא של הספקטרום הנראה‪ .‬בנוסף לתפקידם כאנטנה המעבירה את האנרגיה הנאספת אל ידה אל‬
‫המרכז הפעיל‪ ,‬לקרוטנים תפקיד מבני חשוב כ"פיגומים" המחזיקים את המבנה השלישוני של החלבון;‬
‫כמו כן‪ ,‬הקרוטנים מגינים על הכלורופיל מפני חמצון על ידי שיכוך מצבי הטריפלט שנוצרים במהלך‬
‫הפוטוסינתזה בכלורופיל ועלולים להגיב עם חמצן ליצירת חמצן סינגלטי המזיק לחלבון‪.3‬‬
‫הקרוטנים הינם פיגמנטים אורגאניים (‪ )Terpene‬המכילים בדרך כלל ‪ 40‬פחמנים ( ‪) C40‬‬
‫המסונטזים בצמחים וחיידקים (אך‬
‫לא בבעלי חיים) משמונה יחידות‬
‫של איזופרן‪ .‬בדומה לרטינלים‪,‬‬
‫הקרטונים הינם פחמימנים בעלי‬
‫שרשרת קשרים כפולים מצומדים‬
‫איור ‪ : 4‬מבנה הקרוטן ‪Beta-carotene‬‬
‫(אלקנים)‪ .‬השונים זה מזה הן במספר הקשרים המצומודים והן הקבוצות הפונקציונאליות בקצות‬
‫השרשרת‪.‬‬
‫בשל תפקידם המרכזי בתהליך הפוטוסינתזה‪ ,‬מבנה רמות האנרגיה של הקרוטנים נחקר רבות‬
‫בארבעת העשורים האחרונים‪ ,4‬כאשר אספקטים מסוימים שידונו בעבודה זו עדיין שרויים במחלוקת‪.‬‬
‫קרוטנים‪ ,‬בדומה למולקולות ‪ ,polyen‬שייכים לחבורת הסימטריה ‪ C2h‬ולכן רמת היסוד )‪ (S0‬שלהם‬
‫מקבלת את הסימטריה ‪ . Ag‬עבור פוליאנים בעלי יותר מ ‪ 0‬קשרים כפולים (‪ ,)n>3‬רמת הסינגלט‬
‫המעוררת הראשונה (‪ (S1‬הינה בעלת סימטרית ‪ Ag‬גם כן‪ ,‬ולכן עירור אליה הינו אסור סימטריה –‬
‫‪ symmetry-forbidden‬ורמה זו חשוכה‪ .‬לכן‪ ,‬ספקטרום הבליעה בתחום הנראה של מולקולות אלו‬
‫מתקבל עקב עירור מרמת היסוד לרמת הסינגלט השנייה (‪ )S2‬בעלת סימטרית ‪ Bu‬ולכן מותר‪.‬‬
‫‪7‬‬
‫לפי מודל רמות פשוט‪ ,‬לאחר העירור לרמת ‪ S2‬מתרחש היפוך פנימי ( ‪internal conversion -‬‬
‫‪ )IC‬מהיר לרמה ‪ S1‬בסקאלת זמנים של כמה עשרות עד מאות פמטושניות (‪ .)fs‬זמן החיים של רמת ‪S1‬‬
‫ארוך יותר ‪ -‬מסדר גודל של מספר פיקושנית ‪ -‬ולאחריו המערכת חוזרת לרמת היסוד‪ .‬זמני החיים‬
‫והאנרגיות של שתי רמות אלו משתנים בהתאם למספר הקשרים הכפולים‪ .5‬אלא שמודל פשוט זה‬
‫מסתבך; חישובים תיאורטיים מראים כי עבור קרוטנים בעלי יותר מ ‪ 8‬קשרים מצומדים‪ ,‬רמה חשוכה‬
‫נוספת (בעלת סימטריה ‪ ) Bu‬יורדת מתחת לרמת ‪ ,6S2‬כמו כן‪ ,‬רמת אנרגיה חשוכה (המעבר אליה אסור‬
‫אופטית) נוספת המסומנת על ידי *‪ S‬נתגלתה בשנים האחרונות באמצעות שימוש בספקטרוסקופיה‬
‫אולטרה מהירה‪ ,‬כאחד מערוצי הרלקסאציה המאפשרים למערכת לחזור לרמת היסוד לאחר ערור לרמת‬
‫‪ .S2‬היות שרמה זו מעוררת ויכוח מדעי שגם עבודה זו לוקחת בו חלק‪ ,‬ארחיב עליה‪.‬‬
‫הבליעה המגיע רמת *‪ S‬מופיעה בדרך כלל ככתף בצד הכחול של בבליעה הטרנזיאנטית של‬
‫רמת ‪ ,S1‬ומתאפיינת בזמן חיים מעט ארוך יותר ממנה‪ .‬עדויות ראשונות לרמה זו התגלו לראשונה‬
‫בהומולוג של ‪  -carotene‬ושויכו תחילה למצב יסוד חם וויברציונית‪ 7‬כפי שניתן לראות באיור ‪( 3‬א)‪.‬‬
‫מחקרים שבוצעו על ‪( 8spirilloxanthin‬קרוטן בעל ‪ 10‬קשרים מצומדים המתפקד כאנטנה בכלורופיל‬
‫של ‪ )Rhodospirillum rubrum‬עם רזולוצית זמן גבוהה יותר זיהו את מאפייני רמת *‪ S‬כעבור כ‬
‫‪ 100fs‬בלבד‪ ,‬ובאמצעות‬
‫אנליזה גלובלית זיהו את‬
‫רמה זו כרמה אלקטרונית‬
‫מעוררת‪ ,‬כפי שניתן לראות‬
‫באיור‬
‫‪3‬‬
‫(ב)‪.‬‬
‫כאשר‬
‫ניסויים שבוצעו באמצעות‬
‫‪Pump-Deplete-Probe‬‬
‫החיו את הטענה כי מדובר‬
‫במצב יסוד חם‪ .9‬מחקר‬
‫איור ‪ : 3‬שלושה מודלי רמות אלקטרוניות אפשריים במולקולת קרוטן‪ ,‬החץ העבה‬
‫מסמן את העירור לרמת ‪ S2‬מרמת היסוד‪ ,‬והחץ המקווקו מסמל את מסלולי ההיפוך‬
‫הפנימי חזרה למצב היסוד‪ .‬מודל א‪ :‬רמת *‪ S‬הינה רמת יסוד חמה וויברציונית‪ .‬מודל‬
‫ב‪ :‬רמת *‪ S‬הינה רמה אלקטרונית מעוררת נפרדת‪ .‬מודל ג‪ :‬רמת *‪ S‬הינה רמה‬
‫אלקטרונית מקבילה לרמת ‪ S1‬הנובעת מחוסר הומוגניות במצב היסוד‪.‬‬
‫שבוצע על קומפלקסים שואבי אור בבקטריה סגולה‬
‫‪10‬‬
‫הראו קשר ישיר בין רמת *‪ S‬ליצירת מצבי‬
‫טריפלט‪ ,‬וסללו את הדרך למודל נוסף שמוצג באיור ‪( 3‬ג) הגורס כי רמת *‪ S‬הינה מקבילה של רמת ‪S1‬‬
‫הנוצרת בשל חוסר הומוגניות במצב היסוד‪ .‬למרות מחקר רב בנושא‪ ,‬הוויכוח לגבי אופייה של רמה זו‬
‫ממשיך עד היום ללא הכרעה‪.‬‬
‫‪8‬‬
‫איסוף וניצול אור במערכות פוטוסינטטיות בקטריאליות‬
‫בבקטריות‪ ,‬האור המנוצל ליצירת אנרגיה זמינה נאסף על ידי קומפלקסי פוטוסינתזה ‪.(PSU) -‬‬
‫קומפלקסים‬
‫אלו‬
‫מורכבים‬
‫ממרכז‬
‫פעיל‬
‫(‪ )Reaction Center - RC‬המוקף במספר רב‬
‫של חלבונים אוספי אור (‪ .11)LH1, LH2‬ה‪-‬‬
‫‪ (LH) light harvest‬הינם חלבונים המורכבים‬
‫מעשרות עד מאות צבענים (בעיקר קרוטנים‬
‫ומולקולות‬
‫בקטריו‪-‬כלורופיל‬
‫‪-‬‬
‫‪,)BChl‬‬
‫המסודרים במבני ענק דמויי טבעת על ממברנת‬
‫התא‪ ,‬כפי שניתן לראות באיור ‪ .2‬במבנה זה‪,‬‬
‫חלבון ה‪ LH1‬מקיף ישירות את המרכז הפעיל‬
‫וה‪ LH2‬מופיע כטבעות הסובבות את ה‪LH1‬‬
‫(בבקטריות מסוימות מופיע גם חלבון ‪,LH3‬‬
‫איור ‪ :2‬מבנה קריסטלוגרפיה של קומפלקסים קולט אור‬
‫בבקטריה סגולה‬
‫המסודר כמעגל נוסף מסביב לקומפלקס)‪ .‬לבד מההבדלים במבנה ובמיקום‪ LH1 ,‬ו ‪ LH2‬נבדלים זה מזה‬
‫גם בסוג הכלורופיל – ‪ B875‬ו ‪ ,B850‬בהתאמה (עבור בקטריה סגולה)‪ .12‬המספר מציין את אורך הגל‬
‫המרכזי בספקטרום הבליעה של הכלורופיל‪ .‬הבדל זה מאפשר את זרימת האנרגיה בקומפלקס ‪.PSU‬‬
‫זרימת אנרגיה זו מתוארת סכמטית באיור ‪ 7‬בפנל ‪ .A‬כפי ניתן לראות‪ ,‬הכיוון הכללי של זרימת האנרגיה‬
‫בין החלבונים השונים בקומפלקס הינו ‪ . LH 2  LH1  RC‬בכל אחד מהחלבונים בנפרד‪ ,‬האור יכול‬
‫להיקלט או על ידי הכלורופיל או על ידי מולקולות הקרוטן‪ .‬במקרה זה‪ ,‬האנרגיה תועבר בתהליך פנים‬
‫חלבוני מהיר (כמה מאות ‪ fs‬בהתאם לקרוטן והרמה ממנה זורמת האנרגיה‪ ,‬ארחיב על נקודה זו בהמשך)‬
‫אל הכלורופיל‪ ,‬כאשר העברת האנרגיה בין החלבונים המרכיבים את ה‪ PSU‬מתבצעת רק דרך‬
‫הכלורופילים‪ ,‬המעבירים את האנרגיה מחלבון לחלבון‪ .‬זאת ניתן לראות באיור‪.‬‬
‫איור ‪ :7‬דיאגרמת רמות וסכמת מעבר האנרגיה בקומפלקס ‪ A :PSU‬נראים מסלולי זרימת האנרגיה בקומפלקס‪,‬‬
‫כאשר קווים מרוסקים מייצגים את מעברי האנרגיה התוך חלבוניים וקווים מלאים מייצגים את מסלולי העברת‬
‫האנרגיה בין החלבונים המרכיבים את הקומפלקס; ‪ ,B‬דיאגרמת רמות של הרטינל ‪ spheroidene‬ו‪.BChl850‬‬
‫‪2‬‬
‫עבודות שחקרו את האינטראקציות בין מולקולות הקרוטן והכלורופיל‪ ,‬הראו כי ישנם מספר‬
‫מסלולים בהם האנרגיה יכולה לעבור לכלורופיל‪ ,‬וכי האנרגיה יכולה לעבור הן מ ‪ S2‬ו‪ S1‬והן מ*‪.S‬‬
‫התרומה היחסית של כל אחד מהמסלולים משתנה בין החלבונים השונים‪ ,‬בהתאם למבנה ה‪ LH‬וסוג‬
‫הקרוטן‪ .‬באיור ‪ 7‬בפנל ‪ B‬מוצגות רמות האנרגיה הפעילות בהעברת האנרגיה בכלורופיל ובקרוטן‪.‬‬
‫יעילות העברת האנרגיה יכולה לנוע בין ‪ ,13%‬למקרים בהם ‪ 100%‬מהאנרגיה הנבלעת על ידי‬
‫הקרוטנים מועברת למרכז הפעיל‪ .13‬במולקולות כלורופיל‪ ,‬בשל הסימטריה הגבוהה‪ ,‬רק ‪ 9‬מתוך ‪12‬‬
‫רמות הסינגלט המעוררות הנמוכות מותרות אופטית ופעילות בתהליך‪.‬‬
‫פעילות ה ‪:RC‬‬
‫המרכז הפעיל בבקטריות מכיל מספר מולקולות פעילות בתהליך הפוטוסינתזה‪ :‬ארבע מולקולות‬
‫בקטריו‪-‬כלורופיל ‪ ;)BChl-b( b‬שתי מולקולות ‪ - )BPh( Bacteriophaeophytin‬מולקולה פורפרין‬
‫הזהה למולקולות ה ‪ ,BChl‬למעט החלפת יון המגנזיום המרכזי בשני פרוטונים; ארבע מולקולות הם‬
‫(‪ – )Heme‬מולקולת פורפרין בעלת אטום ברזל (להבדיל ממגנזיום ב‪ ) BChl‬ושתי מולקולות קינון (‪-Q‬‬
‫‪ .)Quinone‬אציין כי המבנה של המרכז הפעיל בבקטריה סגולה פוענח לראשונה באמצעות דיפרקצית‬
‫קרני ‪ X‬שהתקבלו מגבישים שהוכנו מהחלבון‪ ,‬על ידי ‪ H. Michel, J. Deisenhofer‬ו‪, R. Huber‬‬
‫בתחילת שנות השמונים‪ ,14‬גילוי שזיכה אותם בפרס נובל לכימיה בשנת ‪.1288‬‬
‫תהליך הפוטוסינתזה במרכז הפעיל מתחיל כאשר אחת מזוג מולקולות הבקטריוכלורופיל‬
‫החיצוניות (‪ )special pair‬מעוררת‪ ,‬או על ידי קליטת ישירה של פוטון‪ ,‬או על ידי אנרגיה שהגיעה אליה‬
‫מקומפלקס ‪ .LH1‬פס הבליעה של ה ‪ BChl‬נמצא ב ‪ IR‬הקרוב‪ ,‬בניגוד לכלורופילים המגיעים מצמחים‬
‫ירוקים‪ ,‬להם פס בליעה‬
‫המולקולה‬
‫באדום‪.‬‬
‫פולטת‬
‫המעוררת‬
‫אלקטרון המועבר דרך‬
‫מולקולת ‪ BChl‬נוספת‬
‫למולקולת ‪ BPh‬בסקאלת‬
‫זמנים של ‪ ps‬בודדות‪ .‬כך‬
‫שבשלב‬
‫זה‬
‫קיבלנו‬
‫הפרדת מטען; מטען חיובי‬
‫על‬
‫מולקולת‬
‫‪BChl‬‬
‫איור ‪: 8‬תיאור סכמטי של תהליך הפוטוסינתזה בבקטריה סגולה‪ .‬המרכז הפעיל (ורוד)‬
‫מוקף ב ‪ LH1‬ו‪( LH2‬ירוק)‪ .‬קומפלקס ‪ BC1‬מסומן בצהוב‪ ,‬כמו כן באיור מסומנים‬
‫מסלולי מעבר הפרוטונים (אדום) והאלקטרון (כחול)‪.‬‬
‫הראשונה ומטען שלילי על מולקולת ‪.BPh‬‬
‫האלקטרון ממשיך למולקולת הקינון הראשונה (‪ ,)QA‬התפוסה היטב במרכז הפעיל‪ .‬המטען על‬
‫מולקולת ה ‪ BChl‬מנוטרל באמצעות אלקטרון נוסף‪ ,‬המגיע ממולקולת הם‪ ,‬הממוקמת בציטופלסמה מעל‬
‫‪10‬‬
‫המרכז הפעיל‪ .‬האלקטרון עובר ממולקולת הקינון הראשונה למולקולת הקינון השנייה (‪ .)QB‬מולקולה זו‪,‬‬
‫העוברת את התהליך פעמיים (עירור כפול)‪ ,‬יכולה להתנתק מהחלבון בקלות יחסית לאחר חיזורה ל‬
‫‪ QBH2‬באמצעות שני פרוטונים מהציטופלסמה‪ .‬המולקולה נעה בחופשיות בממבראנת התא לעבר‬
‫קומפלקס נוסף (‪ ,)cytochrome bc1-complex‬שם היא עוברת חימצון חזרה למולקות קינון‪ ,‬כאשר‬
‫האנרגיה המתקבלת מתהליך זה משמשת להעברת שני פרוטונים נוספים דרך הממבראנה‪ .‬המעגל נסגר‬
‫כאשר האלקטרונים העודפים מעוברים מ ‪ cytochrome bc1‬דרך ‪ cytochrome c2‬חזרה למולקולת‬
‫ההם‪ .‬גרדיאנט הפרוטונים שנוצר בתהליך‪ ,‬מנוצל על ידי ‪ ATP synthase complex‬ליצירת ‪ ATP‬מ‬
‫‪ ,ADP‬בדומה למתרחש במיטוכונדריה האנושית‪.‬‬
‫‪11‬‬
‫‪ 1.1‬חלבון ה ‪XR‬‬
‫העניין שמעורר חלבון הקסנטורודופסין והחשיבות של חקירתו נובעים מהיותו שילוב של שתי‬
‫המערכות שתוארו לעיל‪ .‬באתר הפעיל של חלבון זה‪ ,‬בנוסף לרטינל‪ ,‬קיים כרומופור נוסף ‪ -‬קרוטן הנקרא‬
‫)‪.Salinixanthin (SX‬‬
‫ספקטרום‬
‫הפעולה (‪ (Action spectrum‬של חלבון‬
‫ה ‪ XR‬המוצג באיור ‪ ,10B‬מוכיח כי‬
‫בחלבון זה בדומה לתפקידו בחלבוני‬
‫ה‪ LH‬הקרוטן מתפקד כאנטנה קולטת‬
‫אור‪ ,15‬המעבירה את האנרגיה הנקלטת‬
‫על ידה לרטינל ביעילות של כ‪.40%-‬‬
‫חתך הפעולה לבליעה המושג באמצעות‬
‫השילוב בין שני הכרומופורים גדול פי‬
‫איור ‪ :2‬ספקטום בליעה של ‪ Salinibater rubber‬ב ‪ PH‬של ‪3.3‬‬
‫שלוש מאשר הרטינל לבדו‪ .‬כמו כן‪ ,‬השימוש במולקולת ה‪ SX‬מאפשר לחלבון לנצל את הצד הכחול ירוק‬
‫של הספקטרום הנראה‪ ,‬שכמעט שאינו נבלע על ידי הרטינל‪ .‬זאת ניתן לראות בספקטרום הבליעה המוצג‬
‫באיור ‪3‬‬
‫‪16‬‬
‫המציג את הבליעה של הארכיאה המורכבת‬
‫משילוב של שני הכרומופורים המוכלים בחלבון ה ‪;XR‬‬
‫בצד הכחול בליעה חזקה עם מבנה וויברציוני ברור של‬
‫הקרוטן ובצד האדום בליעה רחבה המגיעה מהרטינל‪.‬‬
‫בעוד שתהליכי העברת האנרגיה ( ‪Energy‬‬
‫‪ )Transfer- ET‬בין קרוטנים לכלורופילים נחקרו לעומק‬
‫במספר מערכות שונות‪ ,‬חלבון הקסנטורודופסין הינו‬
‫המערכת הראשונה בה ניתן ללמוד על העברת אנרגיה בין‬
‫קרוטן לרטינל‪ .‬היתרון של מערכת זו נמצא בפשטותה;‬
‫בעוד שחלבוני ה ‪ LH‬מכילים מספר גדול של מולקולות‬
‫צבע‪ ,‬חלבון ה‪ XR‬מכיל רק שני צבענים‪ .‬חלבון זה הוכר‬
‫כמערכת הביולוגית הפשוטה ביותר המשלבת ‪donor-‬‬
‫‪ acceptor‬במצב המעורר‪.‬‬
‫מציאת תפקיד הקרוטן בחלבון היה אחד היעדים‬
‫החשובים לאחר גילויו‪ .‬זהו המקום לציין כי חלבון ה ‪XR‬‬
‫איור ‪ :10‬ספקטרום הפעולה של חלבון‬
‫‪ ,A .xanthorhodopsin‬שינויי ה ‪ pH‬בדגם‬
‫כתלות בזמן לאחר הארה ב ‪,B .550nm‬‬
‫ספקטרום הפעולה להעברת פרוטון‪.‬‬
‫איננו החלבון הרטינלי היחיד בעל קרוטן ‪ -‬גם ב‬
‫‪ 17Archaerrhodopsin‬קיים הקרוטן ‪ Bacterrioruberin‬שהינו בעל מספר קשרים מצומדים זהה לזה‬
‫של ‪ SX‬אך אינו מתפקד כאנטנה‪ ,‬אלא בתפקיד מבני בלבד‪.18‬‬
‫‪19‬‬
‫תפקידו של הקרוטן כאנטנה קולטת אור המעבירה את האנרגיה שלה אל הרטינל בוסס באמצעות‬
‫שתי מדידות בלתי תלויות – ספקטרום פעולה ומדידת פלואורסצנסיה‪.‬‬
‫ספקטרום הפעולה הינו מדידה המתבססת על הקרנת הדוגמה המכילה תאים של הארכיאה ‪SR‬‬
‫באורכי גל שונים‪ ,‬ומדידת פעילות החלבון באמצעות מדידת עוצמת שינויי ‪ .pH‬שינויים אלה נגרמים‬
‫בעקבות העברת הפרוטון החוצה מהממברנה‪ ,‬כפי שניתן לראות באיור ‪ - 10‬פנל ‪ A‬מייצג תוצאות מדידה‬
‫שהתקבלו על ידי ‪Balashov at el‬‬
‫‪1‬‬
‫לאחר הארה ב‪ .550nm‬כפי שניתן לראות‪ ,‬ספקטרום הפעולה‬
‫המוצג באותו איור בפנל ‪ B‬מראה כי עירור הדוגמה באורכי גל בו רק הקרוטן בולע גורר העברת פרוטון‪.‬‬
‫דינמיקה זו אפשרית רק אם קיימת העברת אנרגיה בין הצורונים‪ .‬השוואה בין ספקטרום הבליעה של‬
‫החלבון המוצג באיור ‪ 2‬וספקטרום הפעולה שלו‪ ,‬מגלה כי הספקטראות דומים מאוד; תרומות שני‬
‫הכרומופורים ניכרת בשניהם‪ ,‬רק שכצפוי‪ ,‬המשקל המגיע מתרומת הרטינל גבוהה יותר בספקטרום‬
‫הפעולה בשל היעילות המוגבלת של העברת האנרגיה בין הקרוטן לרטינל‪ ,‬העומדת על כ ‪.40%‬‬
‫ספקטרום פלואורסצנסיה הינו מדידה בה מעררים את החלבון ומודדים את הפליטה הספונטנית‬
‫המתקבלת‪ .‬מדידות אלה עבור חלבון ה‪XR‬‬
‫שהתקבלו על ידי ‪Balashov at el‬‬
‫באיור‬
‫‪12‬‬
‫מוצגות‬
‫‪ 11‬בפנל ‪ A‬מוצגת פלואורסצנסיה‬
‫המתקבלת מהחלבון לאחר עירור ב‪( 470nm‬עקומה‬
‫‪ ,)1‬זהו עירור כמעת בלעדי של הקרוטן‪ .‬ניתן לראות‬
‫כי ספקטרום הפלואורסצנסיה מורכב מפליטה חזקה‬
‫בין ‪ 620nm‬ל‪ 800nm‬המקבילה לפליטה של חלבון‬
‫ה ‪ 20,19 BR‬ומגיעה מרמת ‪ S1‬של הרטינל‪ ,‬ולמעשה‬
‫מוכיחה מעבר אנרגיה בין קרוטן לרטינל‪ .‬בנוסף‪,‬‬
‫ניתן להבחין במבנה טריפלטי המופרד באיור‬
‫למרכיביו השונים (ספקטרום ‪ ,)9,0,4‬המגיע מרמת‬
‫‪ S2‬של הקרוטן (רמת ‪ S1‬איננה פלואורסנטית‬
‫מכיוון שהמעבר ממנה למצב היסוד אסור סימטריה)‪.‬‬
‫בפנל ‪ B‬מוצג ספקטרום הבליעה של החלבון (‪ )1‬עם‬
‫ספקטרום המתקבל ממדידת עוצמת הפליטה‬
‫שנמדדה ב ‪( 720nm‬פליטה מהרטינל בלבד)‬
‫כפונקציה של אורך גל העירור‪ .‬כפי שניתן לראות‪,‬‬
‫איור ‪ :11‬מדידות פלואורסנציה של חלבון ה‬
‫‪ .A .xanthorhodopsin‬הפליטה הפלואורוסנטית‬
‫לאחר עירור ב ‪ .(1(570nm‬התאמת גאוסיאן לפליטות‬
‫מרמת ‪ S2‬של הקרוטן וסכימתן (‪ .)9-3‬הפלואורסנציה‬
‫לאחר שהדוגמה טופלה ב ‪ .B .)2( NH2OH‬ספקטרום‬
‫הבליעה של חלבון ה ‪ )1( XR‬מושווה לספקטרום‬
‫המתקבל ממדידת עוצמת הפלואורסנציה ב‪720nm‬‬
‫בהתאם לאורך גל העירור‪.‬‬
‫תמונה זו מזכירה את ספקטרום הפעולה‪ .‬גם כאן המבנה נשמר‪ ,‬רק התרומה היחסית של כל אחד‬
‫מהצורונים משתנה לטובת הרטינל כתוצאה מיעילות העברת האנרגיה שעומדת בניסוי זה על ‪,43%‬‬
‫בדומה לתוצאה המתקבלת מספקטרום הפעולה‪ .‬מידע נוסף שחולץ מניסויי הפלואורסנציה הינו הזווית‬
‫שבין מומנטי דיפול המעבר ‪ S0  S2‬בקרוטן ו ‪ S1  S0‬ברטינל באמצעות מדידת האנאיזוטרופיה‬
‫‪10‬‬
‫(מושג עליו ארחיב בהמשך) של הפלואורסנציה המגיעה מהרטינל בעקבות עירור הקרוטן ועומדת על‬
‫‪.32±0º‬‬
‫נושא נוסף שנחקר בחלבון ה ‪ XR‬היו יחסי הגומלין שבין הצבענים‪ .‬את האינטראקציה החזקה‬
‫ביניהם ניתן לראות כאשר מוציאים את הרטינל מהחלבון באמצעות )‪hydroxylamine (NH2OH‬‬
‫שמפרק את קשר ה‪ Schiff– Base‬או חיזור הקשר באמצעות )‪ sodium borohydride (NaBH4‬כפי‬
‫שניתן לראות באיור ‪ 19‬בפנל העליון והתחתון‬
‫בהתאמה‪ ,‬מושווים לספקטרום הבליעה של המולקולה‪.‬‬
‫לאחר חיזור הקשר באמצעות ‪ NaBH4‬הרטינל נשאר‬
‫במקומו‪ ,‬קשור בקשר יחיד לחלבון‪ ,‬אך ספקטרום‬
‫הבליעה שלו משתנה – הבליעה הרחבה ב‪570nm‬‬
‫נעלמת ובמקומה מופיעה בליעה בעלת מבנה טריפלטי‬
‫ברור ב ‪.345nm , 360nm ,378nm‬‬
‫לעומתה‪,‬‬
‫בליעת הקרוטן איננה מושפעת מהחיזור‪ .‬לעומת זאת‪,‬‬
‫לאחר טיפול עם ‪ ,NH2OH‬הגורם לניתוק מוחלט של‬
‫הקשר בין הרטינל לחלבון וליציאתו‪ ,‬בנוסף להעלמות‬
‫הבליעה ב‪ 570nm‬והופעת הבליעה ללא מבנה ב‬
‫‪ 367nm‬גם בליעת הקרוטן משתנה‪ :‬עוצמתה יורדת‬
‫בכ ‪ 30%‬והמבנה הוויברציוני כמעט נעלם‪ ,‬כך‬
‫שמתקבל ספקטרום המזכיר את ספקטרום הקרוטן‬
‫החופשי כפי שניתן לראותו באיור ‪ .00‬כמו כן גם‬
‫איור ‪ :19‬האינטראקציות בין הרטינל לקרוטן‬
‫בחלבון ה ‪ )A( .xanthorhodopsin‬ספקטרום‬
‫הבליעה של החלבון ליפני (‪ )1‬ואחרי טיפול‬
‫‪ )9( NH2OH‬המסיר את הרטינל‪ )B) .‬ספקטרום‬
‫הבליעה של החלבון ליפני (‪ )1‬ואחרי חיזור הקשר‬
‫הין החלבון לרטינל באמצעות ‪)9( NaBH4‬‬
‫הפלואורסנציה הנמדדת לאחר הטיפול מאבדת את המבנה שלה ועוצמתה יורדת‪ ,‬כפי שניתן לראות באיור‬
‫‪( 11‬פנל ‪ A‬עקומה ‪ ,(2‬וכמובן שהפלואורסנציה המגיעה מהרטינל נעלמת‪ .‬שינוי דרמטי זה בספקטרום‬
‫הבליעה של הקרוטן‪ ,‬המתרחש רק לאחר יציאת‬
‫הרטינל מהחלבון‪ ,‬מלמד כי כפי שהוכח מאוחר‬
‫יותר באמצעות מבנה קריסטלוגרפי‪ ,‬הרטינל נמצא‬
‫באתר הקושר של הקרוטן‪ .‬אציין כי שינויים אלו‬
‫הפיכים וכי ניתן לשטוף את ההידרוקסילאמין‬
‫‪ NH2OH‬ובהוספת מולקולות רטינל‪ ,‬הספקטרום‬
‫משחזר את עצמו (אינדיקציה כי הרטינל נקשר‬
‫חזרה לחלבון)‪.‬‬
‫לאחר ביסוס תפקידה של מולקולת הקרוטן‬
‫בחלבון כאנטנה‪ ,‬נשאלת השאלה מאיזו רמת‬
‫איור ‪ :10‬מודל המוצע למעבר האנרגיה בחלבון ה‬
‫‪ xanthorhodopsin‬בין הרטינל לקרוטן‪ .‬לאחר ההארה‬
‫הקרוטן מעורר לרמת ‪ S2‬מרמה זו יש הסתעפות‪ ,‬כאשר‬
‫האנרגיה יכולה לעבור אל רמת ‪ S1‬של הרטינל (‪ )ET‬או‬
‫לעבר לרמת ‪ S1‬של הקרוטן לאחר היפוך פנימי‪.‬‬
‫אנרגיה אלקטרונית האנרגיה זורמת לרטינל‪ .‬לאחר שבוחנים את רמות האנרגיה האפשריות‪ ,‬התשובה‬
‫‪14‬‬
‫ההגיונית המתבקשת הינה רמת ‪ ,S2‬כפי שניתן לראות באיור‪ ,10‬רמה זו היא הרמה היחידה המסוגלת‬
‫להעביר אנרגיה לרטינל‪ ,‬וזאת משום שהאנרגיה הדרושה לעירור מולקולת הרטינל לרמת ‪ S1‬הינה כ‬
‫‪ ,)560nm( 2.2eV‬הרבה מעל רמת ‪ S1‬ו*‪ S‬של הקרוטן‪ .‬כלומר‪ ,‬מעבר האנרגיה הינו תהליך מתחרה‬
‫להיפוך הפנימי לרמת ‪ .S1‬קביעה זו נתמכת על ידי מדידות ספקטרוסקופיה מהירה שבוצעו לאחרונה על‬
‫החלבון‬
‫‪21‬‬
‫ומדידות פלואורסנציה המראות התחזקות בפס הפליטה של רמת ‪ S2‬לאחר טיפול ב ‪NaBH4‬‬
‫שכאמור אינו משפיע על ספקטרום הבליעה של הקרוטן‪.‬‬
‫לאחר תחילת המחקר שמתואר בעבודה זו גילויים חדשים פורסמו על חלבון ה‪ ;XR‬הרצף הגנטי‬
‫המלא של הארכיאה ‪ Salinibater‬פוצח‬
‫ב ‪Institute for Genomic Research‬‬
‫‪ gene bank‬ונמצא כי הוא אכן מכיל גנים‬
‫ההומולוגים למשאבות פרוטונים ידועים כגון‬
‫‪ BR‬ו ‪PR‬‬
‫‪23,22‬‬
‫‪ .‬המבנה הראשוני של ‪XR‬‬
‫מעיד על קירבה גדולה יותר ל ‪ BR‬מאשר ל‬
‫‪ 38( PR‬לעומת ‪ 48‬מקטעים זהים)‪ ,‬אך‬
‫החומצה האמינית תורמת הפרוטון הראשונית‬
‫הינה ‪ Glu‬כמו ב‪ PR‬ולא ‪ Asp‬כמו ב ‪.BR‬‬
‫בנוסף‪ ,‬אחת משתי החומצות הגלוטמיות‬
‫המרכיבות את אתר שיחרור הפרוטון ב ‪BR‬‬
‫חסרה כמו ב ‪ .24PR‬דבר זה נותן אינדיקציה‬
‫כי שיחרור הפרוטון במעגל הפוטוכימי דומה‬
‫יותר לזה הנצפה ב‪ .PR‬החלבון גובש‬
‫בהצלחה והמיבנה הקריסטלוגרפי שחולץ‬
‫איור ‪ :14‬מבנה חלבון ה ‪ xanthorhodopsin‬והסידור‬
‫המרחבי של שני הצבענים הקרוטן (בכתום) והרטינל (בסגול)‬
‫כפי שהתקבל ממדידות קריסטלוגרפיות‪.‬‬
‫ממנה מגלה יחודיות במבנה השמרני של משפחת החלבונים הרטינליים; סלילי ‪ A α‬ו‪ G‬ארוכים יותר ב ‪4‬‬
‫ו ‪ 2‬שיירים בהתאמה‪ ,‬ומוטים בהשוואה ל‪ BR‬ומתוך ‪ 98‬השיירים שמרכיבים את הליקס ‪ 4 B‬שיירים‬
‫מוסטים אל ה ‪ .extracellular‬ההבדל המשמעותי ביותר במבנה ה‪( XR‬מחוץ לאנטנת הקרוטן כמובן)‬
‫הינו כי ה ‪ β-sheet‬הנוצר מקצוות ‪( C-B‬מוקף בעיגול אדום באיור ‪ 14‬המציג את מבנה החלבון) מוסט‬
‫בכ ‪ 00Å‬לשאר החלבונים הרטינלים‪ .‬הסטה זו יוצרת בקע עמוק בחלבון המגיע כמעט עד הרטינל‪ ,‬כך‬
‫שחלק מחומצות האמינו הלוקחות חלק פעיל בהעברת הפרוטון חשופות לפאזה המימית של חוץ התא‪.‬‬
‫הקרוטן ‪ salinixanthin‬מורכב מ ‪ 40‬פחמנים (‪ )C40‬ובמבנהו ישנם מספר אתרים פוקציונליים‬
‫בנוסף לשרשרת המצומדת (ראה איור ‪ :)13‬קבוצה קרבונילית (‪ )Ketone‬על טבעת משושה המעורבת‬
‫בקשירת הקרוטן לאתר הפעיל בחלבון באמצעות קשרי מימן‪ glycoside ,‬שנמצא על פני השטח של‬
‫הממברנה וקבוצת ‪ Acyl‬ההידרופובית שממוקמת בין שתי שכבות הממברנה‪.‬‬
‫‪13‬‬
‫הקרוטן שוכב באלכסון כנגד סליל ‪ F α‬בזווית של ‪ 34º‬מהאנך לממברנה כאשר טבעת הקטון‬
‫מקובעת על ידי קצוות סלילי ‪ E α‬ו‪ F‬ועל ידי הטבעת של הרטינל כפי שניתן לראות באיור ‪ .14‬העובדה‬
‫כי הרטינל הינו חלק מאתר הקשירה של‬
‫הקרוטן מסבירה את ההשפעה הדרמטית‬
‫של קישור הרטינל על ספקטרום הבליעה‬
‫של הקרוטן שהוזכרה קודם‪ .‬כפי שניתן‬
‫לראות באיור ‪ 12‬הטבעת מסובבת בזווית‬
‫איור ‪ :13‬מבנה הקרוטן ‪ salinixanthin‬החץ מסמן את הקשר סביבו‬
‫מתבצע העיוות בעת הקשירה לחלבון‬
‫של ‪ 89º‬ביחס לשלד הפוליאן‪ ,‬כך שהן הקטון והן הקשר הכפול על הטבעת כמעט אינם משתתפים בענן‬
‫ה‪ π‬של הפוליאן‪ ,‬דבר המסביר את היעדר ההסטה לאדום בספקטרום הבליעה של הקרוטן בעת הקשירה‬
‫לחלבון‪.‬‬
‫המרחק בין מרכזי שני הצבענים הינו ‪ 11.7Å‬כאשר בקצותיהם המרחק מתקצר לכדי ‪ 0.8 Å‬כפי‬
‫שניתן לראות באיור ‪.12‬‬
‫הזווית שנמדדה בין צירי המולקולות (שלד‬
‫הפוליאן) במחקרים קריסטלוגרפים‪ ,‬עומדת על ‪ .46º‬זווית‬
‫זו קטנה משמעותית מזווית של ‪ 56º‬שנמדדה באמצעות‬
‫מדידת האנאיזוטרופיה המתקבלת מפלואורסנציה מקוטבת‪.‬‬
‫הבדל זה יכול לנבוע מכך שכיוון מומנט דיפול המעבר‬
‫איננו ככיוון ציר המולקולה כמצופה‪ ,‬אלא סוטה בכמה‬
‫איור ‪ :12‬אתר הקישור של הקרוטן בחלבון ה‪XR‬‬
‫מעלות‪ ,‬נושא שאדון בו בהמשך עבודה זו‪.‬‬
‫העברת אנרגיה בין שני הצבענים הינה אופטימלית כאשר הם מקבילים זה לזה‪ ,‬מכיוון שבסידור‬
‫מרחבי זה ישנה אינטראקציה מקסימאלית בין דיפולי המעבר של המולקולות השונות‪ .‬כיוון שיש חפיפה‬
‫ספקטראלית בין הצבענים‪ ,‬זווית קטנה תגרום לתחרות על אותם פוטונים בין שני הכרומופורים (ניתן‬
‫לומר כי הכרומפורים יצלו זה על זה) בעוד שזווית ישרה ביניהם תגרום לכל כרומופור להעדיף אור‬
‫בקיטוב שונה ובכך לאפשר לחלבון לנצל אור בקיטובים שונים‪ ,‬לניצול מקסימלי של האור הנופל על‬
‫הארכיאה‪ .‬אלא שזווית של ‪ 90º‬איננה מאפשרת אינטראקציה בין דיפולי המעבר ולכן לא תעבור אנרגיה‬
‫בין הצבענים‪ .‬יש להניח כי זווית של ‪ 46º‬הינה פשרה בין שתי הקונפיגורציות המתקבלת ממיליוני שנות‬
‫אבולוציה‪.‬‬
‫‪12‬‬
‫‪ 1.1‬רקע ספקטרוסקופי‬
‫שיטת ‪pump-probe‬‬
‫השיטה הניסיונית למחקר במרחב הזמן שבעזרתה בוצעו התצפיות שיתוארו בעבודה זו‪ ,‬מכונה‬
‫שיטת ‪ .pump-probe‬שיטה זו מבוססת על פולס קצר ועוצמתי (‪ )pump‬המעורר את הדוגמה וקובע את‬
‫זמן האפס של הניסוי‪ .‬לאחר העירור‪,‬‬
‫המולקולות המעוררות מתפתחות בזמן‪ .‬פולס‬
‫קצר נוסף (‪ )probe‬שמגיע בתזמון משתנה‪,‬‬
‫בודק את השינוי שנגרם בבליעה כתוצאה‬
‫מהעירור‪ ,‬וכך מקבלים ספקטרום בליעה‬
‫כתלות בזמן‪ .‬ספקטרום זה מכונה ספקטרום‬
‫הבליעה הטרנזיינטי‪.‬‬
‫איור ‪ :71‬תרשים סכמאטי של מערכת ‪pump-probe‬‬
‫יתרונה הגדול של שיטה זו הוא שרזולוציית הזמן המתקבלת איננה תלויה במהירות התגובה של‬
‫המכשיר אלא במשך זמן הפולסים בלבד‪ .‬יתרון זה משמעותי‪ ,‬היות וזמן התגובה המינימאלי של מכשור‬
‫חשמלי הינו מסדר גודל של ננו שניות‪ .‬על ידי יצירת פולסים אולטרה מהירים (בשיטה שתתואר בהמשך)‬
‫ניתן לחקור דינאמיקה של רמות שזמן חייהם עשרות פנטושניות ( ‪ )1015 sec‬בזמן אמת עם אמצעי גילוי‬
‫איטיים‪.‬‬
‫התזמון היחסי בין שני פולסים‪ ,‬נעשה על ידי שינוי הדרך האופטית של אחת הקרניים ביחס‬
‫לשנייה באמצעות מסוע‪ ,‬כאשר רזולוציה המדידה הזמנית נקבעת לפי משך הפולסים ודיוק המסוע‪.‬‬
‫‪17‬‬
‫עירור אימפולסיבי וספקטרוסקופיה וויברציונית‪.‬‬
‫ספקטרוסקופיה אימפולסיבית במרחב התדר הינה כלי ייחודי בחקר המבנה של מולקולות בפאזה‬
‫מעובה‪ .‬היא מתבססת על פולסים מהירים‪ ,‬היכולים לעורר את‬
‫המולקולה וליצור חבילות גלים קוהרנטיות מאותרות הן במצב היסוד‬
‫והן במצב המעורר‪ ,‬המתנדנדות בזמן ויוצרות שינויים דינאמיים‬
‫בבליעה הטרנזיאנטית‪ .‬המכניזם איתו חוקרנו את מצב היסוד נקרא‬
‫‪Resonant Impulsive Stimulation Raman Scattering‬‬
‫)‪ ,(RISRS‬העירור האימפולסיבי מעביר חלק מחבילת הגלים אל‬
‫משטח הפוטנציאל העליון תוך יצירת "חור" ממוקם במצב היסוד‬
‫ובנוסף מעניק תנע לחבילת הגלים במצב היסוד כפי שניתן לראות‬
‫באיור ‪ .2518‬בהסתכלות סמי קלאסית‪ ,‬מתחילה תנועה וויברציונית‬
‫אוסצילטורית של האוכלוסייה החסרה במשטח הפוטנציאל התחתון‬
‫סביב מצב שיווי המשקל‪ ,‬אותה ניתן לראות באמצעות הפולס הבודק‬
‫כשינויים מחזוריים בעוצמת הסיגנל עקב שינויי החפיפה בין חבילת‬
‫הגלים והרמות המעוררות‪ .‬טרנספורם פוריה (‪ )FT‬על המידע‬
‫שנאסף לאחר החסרת הדינאמיקה‪ ,‬מעביר את המידע ממרחב הזמן‬
‫למרחב התדר ונותן את תמונת התדירויות הפעילות‪ ,‬בדומה‬
‫איור ‪ :18‬תיאור סכמתי של תהליך‬
‫‪ .RISRS‬הפולס המעורר יוצר מצב לא‬
‫סטטיונרי במשטח הפוטציאל היסודי‪.‬‬
‫חבילת הגלים המתפתח בזמן ונבחנת‬
‫על ידי הפולס הבודק‪.‬‬
‫לספקטרום ראמאן (‪ )Raman‬רגיל‪.‬‬
‫כללי ברירה פוטונית בניסוי ‪:pump probe‬‬
‫כפי שהוזכר‪ ,‬בחלבון אותו אנו בודקים‪ ,‬קיימים שני צבענים בעלי תחום ספקטראלי חופף הן‬
‫במצב היסוד‪ ,‬אך בעיקר במצבים המעוררים‪ ,‬דבר המקשה על הבנת התהליכים שעוברים הצבענים‬
‫והשפעתם זה על זה‪ .‬לעזרתנו מגיעים כלי הברירה הפוטונית )‪ -(Photoselection‬מעבר אופטי‬
‫מולקולארי "בורר" בדגם איזוטרופי את אותן המולקולות שדיפול המעבר שלהן תואם אופטימאלית את‬
‫כיוון ווקטור השדה המעורר‪ .‬כך שבדגם צמיגי (פאזה נוזלית) או מוצק בו המולקולות הנבדקות אינן‬
‫חופשיות להסתובב‪ ,‬האוסף המעורר המתקבל מסודר מרחבית למרות שמלכתחילה היה איזוטרופי‪ ,‬חלק‬
‫ניכר מהמחקר שיתואר בעבודה זו מתבסס על תופעה זו‪ ,‬ולכן יש צורך בהבנה עמוקה של תופעה זו‪.‬‬
‫הסבר כמותי של התופעה מחייב הגדרה של הגיאומטריה הניסיונית; נשתמש ב ‪ X,Y,Z‬עבור‬
‫צירי המעבדה וב ‪ x,y,z‬עבור צירים המוצמדים לגוף המולקולה (ראה איור ‪ .)12‬לשם פשטות‪ ,‬העירור‬
‫(‪ )pump‬מבוצע על ידי קרן הנעה בציר ‪ Y‬ובעלת קיטוב במישור ‪ .ZY‬כמו כן‪ ,‬נניח כי המעבר האופטי‬
‫מקוטב לאורך ציר המולקולה(‪ - )z‬הנחה המתאימה הן למולקולת הקרוטן והן לרטינל ‪ -‬וכי אנו מעוררים‬
‫ובודקים את אותה הרמה המעוררת‪ .‬הקרן הבודקת (‪ )probe‬נעה גם היא בציר ‪ Y‬אך הקיטוב שלה יכול‬
‫‪18‬‬
‫להיות או במישור ‪( ZY‬כמו הקרן המעוררת לקבלת ניסוי מקביל ‪ )VV -‬או במישור ‪( XY‬בניצב לקרן‬
‫המעוררת לקבלת ניסוי מאונך ‪.)VH -‬‬
‫על מנת לכמת את מידת הסדר במצב‬
‫המעורר‬
‫נגדיר‬
‫יחס‬
‫את‬
‫הדפולריזציה‬
‫(‪ )Depolarization‬המסומן באות ‪ ,ρ‬כיחס‬
‫המתקבל בין הסיגנל הנמדד כאשר לשני הפולסים‬
‫(המעורר והבודק) אותו הקיטוב‪ ,‬לסיגנל המתקבל‬
‫כאשר קיטובי הפולסים מאונכים זה לזה‬
‫)‪(1‬‬
‫‪I t ‬‬
‫‪I  t ‬‬
‫‪.  t  ‬‬
‫את‬
‫)‪)Anisotropy‬‬
‫נגדיר‬
‫‪I  t   I  t ‬‬
‫)‪(2‬‬
‫האנאיזוטרופיה‬
‫‪I  t   2  I  t ‬‬
‫איור ‪ :12‬מולקולת רטינל במערכת צירי המעבדה לעומת‬
‫מערכת הצירים העצמית‪.‬‬
‫לפי‬
‫‪ . r (t ) ‬מכיוון‬
‫ר‬
‫שאנו עובדים עם מולקולות גדולות יחסית בפאזה מעובה (נוזל) המבצעות פוטוכימיה מהירה‪ ,‬ניתן להניח‬
‫כי במשך זמן הבדיקה המולקולות עצמן לא הסתובבו ולכן נזניח שינויים באנאיזוטרופיה הנגרמים בשל‬
‫אפקט זה‪.‬‬
‫כדי לחשב את האנאיזוטרופיה המתקבלת אנו צריכים לפרק הן את וקטור השדה המעורר והן את‬
‫וקטור השדה הבודק לרכיביהם העצמיים‪ ,‬בהתאם לקואורדינטות של המולקולה‪ .‬תחת הנחת העבודה כי‬
‫עוצמת הפולס הבודק אינה משפיעה על הסיגנל‪ ,‬ניתן לרשום את התלות בין הסיגנל למשרעת השדה‬
‫המעורר ‪E02‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ IVV  cos2  Zz‬ו ‪ . IVH   cos  Zz  cos  zX  E02‬כאשר ‪  Zz‬הינה הזווית שבין‬
‫ציר ‪ Z‬לציר ‪ z‬ו‬
‫‪2‬‬
‫‪  zX‬הינה הזווית שבין ציר ‪ z‬לציר ‪ .X‬על ידי מיצוע התרומות לקיטוב מאוסף‬
‫מולקולות ללא כיוון – איזוטרופיות‪ ,‬על פני המרחב כולו ‪   4‬נקבל‪.‬‬
‫)‪(3‬‬
‫‪ IVV‬‬
‫‪4‬‬
‫‪ E  cos  Zz‬‬
‫‪ 0‬‬
‫‪‬‬
‫‪ IVH  cos 2   cos 2 ‬‬
‫‪Zz‬‬
‫‪zX‬‬
‫‪ E0‬‬
‫האינטגרל הראשון הוא מיידי ‪:‬‬
‫‪1‬‬
‫‪5‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪0‬‬
‫‪12‬‬
‫‪‬‬
‫‪cos5  Zz‬‬
‫‪1‬‬
‫‪  cos 4  Zz sin  d ‬‬
‫‪20‬‬
‫‪5‬‬
‫‪cos  Zz‬‬
‫‪4‬‬
‫כדי לחשב את האינטגרל השני‪ ,‬נשתמש בכך ש ‪cos2  zX  cos2  Xz‬‬
‫ובמשוואה‬
‫‪( cos2  Zz  cos2  Xz  cos2 Yz  1‬קוסינוסי הכיוון מתנהגים כרכיבי ווקטור יחידה)‪ .‬נעלה‬
‫משוואה זו בריבוע ונקבל‪:‬‬
‫‪1  cos 4  Zz  cos 4  Xz  cos 4 Yz  2  cos 2  Zz cos 2  Xz‬‬
‫‪ 2  cos 2 Yz cos 2  Xz  2  cos 2  Zz cos 2 Yz‬‬
‫מכוון שלאחר מיצוע במרחב אין משמעות לצירים הספציפיים‪ ,‬נוכל לאחד איברים דומים לקבלת‪:‬‬
‫‪1  3  cos4  Zz  6 cos2  Zz cos2  Xz‬‬
‫נציב את תוצאת האינטגרל שחישבנו ונקבל‪:‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪‬‬
‫‪cos 2  Zz cos2  Xz  1  3   / 6 ‬‬
‫‪5‬‬
‫‪15‬‬
‫‪‬‬
‫כך שקיבלנו‪:‬‬
‫‪ IVV 1‬‬
‫‪E 5‬‬
‫‪ 0‬‬
‫‪‬‬
‫‪ IVH  1‬‬
‫‪ E0 15‬‬
‫ולכן עבור מערכת אידיאליות יחס הדפולריזציה צפוי להיות ‪   3‬והאנאזוטרופיות ‪. r  0.4‬‬
‫מכיוון שהקרן המעוררת נעה בציר ‪ Y‬בקיטוב ‪ ,YZ‬ניתן להניח כי מתקבלת סימטריה גלילית‬
‫סביב ציר ‪ .Z‬האנאיזוטרופיה פרופורציונאלית לפולינום לז'נדר (‪ )Legendre‬מסדר שני של קוסינוס‬
‫הזווית בין מומנט המעבר (ציר המולקולה בדוגמה שלנו) לציר ‪:Z‬‬
‫)‪(5‬‬
‫‪ 3cos 2  Zz  1 ‬‬
‫‪r t   ‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫)‪ Pl (2‬‬
‫כעת נדון בבעיה כאשר נשמיט את ההנחה כי אנו מעוררים ובודקים את אותה הרמה (כפי שאכן‬
‫קורה בניסויים שלנו) במקרה זה האנאיזוטרופיה המקבלת תלויה בזווית שבין מומנטי דיפולי המעבר ( ‪) ‬‬
‫של הרמה המעוררת והנבדקת המוכפלת בפקטור נוסף (‪ )953‬המגיע מכללי ברירה לקבלת הנוסחה‪.26‬‬
‫)‪(6‬‬
‫‪2  3cos 2   1 ‬‬
‫‪r t   ‬‬
‫‪‬‬
‫‪5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫אם ניקח לדוגמה מערכת שלוש רמות בה אנו מעוררים לרמה השנייה שלה דיפול מעבר (לרמה‬
‫השלישית) הניצב לדיפול המעבר של רמת היסוד‪ ,‬נקבל מהצבה בנוסחה‪ ,‬כי האנאיזוטרופיות של רמה זו‬
‫הינה ‪. r  0.2‬‬
‫‪90‬‬
‫מוסג נוסף שיש להכיר הינה זווית הקסם " ‪ – " magic angle‬בה תרומת הסיגנל בשני‬
‫הקיטובים זהה ואיננה מושפעת מסיבוב המולקולות או הזווית שבין דיפולי המעבר בין הרמות השונות‪.‬‬
‫‪1‬‬
‫במצב זה האנאיזוטרופיה צריכה להתאפס‪ ,‬על מנת תנאי זה התקיים נרשום‬
‫‪3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪ 1 ‬‬
‫‪   arccos ‬‬
‫הזווית בה אלינו לבדוק הינה ‪  54.73‬‬
‫‪3‬‬
‫‪ 3‬‬
‫‪ - cos 2  ‬ונקבל כי‬
‫‪. cos  ‬‬
‫באמצאות נוסחה זו וידיעת יחסי העוצמות הסיגנל בקיטובי בדירה שונים נוכל לחשב את הזווית‬
‫שבין דיפולי המעבר השונים שכאמור צפויים להצביע על כיוון השלד המוצמד‪ .‬בנוסף לחישוב הזווית‬
‫שבין הצבענים‪ ,‬שימוש בכללים אלו מאפשר לנו לבודד את הסיגנל המגיע מכל אחד מהם בנפרד; הסיגנל‬
‫של כלל המולקולה מורכב מיחסים שונים של תרומות של כל אחד מהצבענים בנפרד‪ ,‬בהתאם לקיטוב‬
‫הפולס הבודק‪ ,‬כך שבאמצעות ידיעת הזווית נוכל לבצע הפחתה של אחת התרומות באלגברה פשוטה כפי‬
‫שאראה בפרוט בהמשך‪.‬‬
‫התאמה קינטית גלובאלית לפי מודל‪:‬‬
‫אנליזה זו מאפשרת לנו להתאים מודל קינטי לנתונים ניסיוניים בשני מימדים (מרחב זמן ותדר)‪.‬‬
‫התאמה זו מספקת אינפורמציה על התפתחות האוכלוסיות בזמן יחד עם הספקטראות התואמים להן‪ ,‬עבור‬
‫כל אחד מהשלבים הקינטיים‪ ,‬בכפוף למודל קינטי מוצע‪.29,28,27‬‬
‫האנליזה הגלובלית מניחה התפתחות ספקטראלית קינטית; הרוב המוחלט של האוכלוסייה אותה‬
‫אנו בודקים נמצאת במצב היסוד או באחד מתוצרי הביניים‪ .‬לכן‪ ,‬בכל רגע נתון הספקטרום המתקבל‬
‫מורכב מתרומות שמגיעות ממספר סופי של צורונים בעלי ספקטראות קבועים‪ ,‬כאשר האבולוציה‬
‫הספקטראלית מתקבלת אך ורק כתוצאה משינויים בריכוזים של צורונים אלו‪ ,‬בהתאם למודל בו אנו‬
‫משתמשים וקבועי הקצב האופייניים להם‪.‬‬
‫הנחה זו בעייתית עבור התוצאות המתקבלות מניסויים בעלי רזולוצית זמן גבוהה‪ ,‬החוקרים‬
‫תהליכים אולטרה מהירים; מכי וון שלא ניתן להזניח את הזמן שלוקח לעבור בין תוצרי הביניים לעומת‬
‫זמן החיים של תוצרי ביניים אלו‪ ,‬לא ניתן להזניח את התרומות המגיעות מאוכלוסיות שאינן נמצאות‬
‫בשלב ביניים מוגדר‪ ,‬אלא בשלב כלשהו ביניהם‪ .‬כלומר‪ ,‬בכל רגע נתון הספקטרום המתקבל מורכב‬
‫מתרומות שמגיעות ממספר אין סופי של צורונים‪.‬‬
‫למרות האמור לעיל‪ ,‬ניתן להצדיק את השימוש בשיטה זו גם עבור המדידות שבוצעו במעבדתנו‪,‬‬
‫מכיוון שעדיין מרבית הצורונים נמצאים באחד מתוצרי הביניים או מספיק קרובים לאחד מהם‪ ,‬כך‬
‫שהתרומה הספקטראלית המגיעה מהם אינה שונה בהרבה‪ .‬האנליזה הגלובלית מסוגלת לחלץ מידע יקר‬
‫‪91‬‬
‫ערך מתוך תוצאות המדידה (כפי שאראה במהלך העבודה)‪ ,‬אלא שיש לזכור את ההזנחות ולהתייחס אל‬
‫התוצאות בחשדנות‪ ,‬במיוחד לאלו המגיעות ממצבי הביניים קצרי החיים‪.‬‬
‫להלן הסבר לשלבי האנליזה העיקריים שבוצעו לנתונים המוצגים בעבודה זו‪:‬‬
‫שלב ראשון ‪SVD -‬‬
‫ניסיונות ‪ pump-probe‬במערכת מדידה רב ערוצית‪ ,‬מספקים מטריצת נתונים דו מימדית של‬
‫שינויי ספקטרום בליעה כתלות בזמן‪ .MT = ΔOD(t, λ) -‬שלב ראשון באנליזה הינו הפיכה של מצב‬
‫מרחבי זה‪ ,‬למרחב מטריצה אחר המתואר ע"י ווקטורים אורתונורמאליים תוך שימוש בשיטת ‪Singular‬‬
‫)‪ 30Value Decomposition (SVD‬לשלוש מטריצות ריבועיות‪ ,U :‬מטריצת בסיס מנורמלת‬
‫‪‬‬
‫שעמודותיה מכילות וקטורים "ספקטראליים" אורתוגונאליים ‪ , V t , un -‬מטריצה המכילה את הדינאמיקה‬
‫‪‬‬
‫המנורמלת שלהם המורכבת מוקטורים "קינטיים" אורתוגונאליים ‪ . vtn -‬ו ‪ ,S‬מטריצה אלכסונית‬
‫המורכבת מהמשקלים של וקטורי הבסיס מסודרים בסדר יורד‪:‬‬
‫‪ vt1 ‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪un   S  vt2 ‬‬
‫‪vtn ‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪u2‬‬
‫‪ mt( 1,ti ) ‬‬
‫‪ mt(  2,ti ) ‬‬
‫‪ U  S  V t  u1‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ mt( i ,ti ) ‬‬
‫‪ v1ti  ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ v2ti  ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ vnti  ‬‬
‫‪‬‬
‫)‪(7‬‬
‫‪v1t 3‬‬
‫‪v1t 2‬‬
‫‪v2t 3‬‬
‫‪v2t 2‬‬
‫‪vnt 3‬‬
‫‪vnt 2‬‬
‫‪‬‬
‫כך שתנאי האורתוגונאליות מקיים‪ u n1  0 :‬‬
‫)‪mt( 1,t 3‬‬
‫)‪mt(  2,t 3‬‬
‫‪‬‬
‫)‪mt( i ,t 3‬‬
‫)‪ mt( 1,t1‬‬
‫‪ mt‬‬
‫)‪(  2,t1‬‬
‫‪MT  ‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫)‪ mt( i ,t1‬‬
‫)‪mt( 1,t 2‬‬
‫)‪mt(  2,t 2‬‬
‫‪‬‬
‫)‪mt( i ,t 2‬‬
‫‪un1 ‬‬
‫‪1‬‬
‫‪  s1 0 0  v t1‬‬
‫‪n‬‬
‫‪u  2  ‬‬
‫‪  2‬‬
‫‪   0 s2 0   v t1‬‬
‫‪‬‬
‫‪  ‬‬
‫‪0 0 sn  v n‬‬
‫‪n  ‬‬
‫‪  t1‬‬
‫‪u i ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫ו ‪. vt1  vtn1  0‬‬
‫‪u 1‬‬
‫‪u21‬‬
‫‪2‬‬
‫‪u  2‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫‪u i ‬‬
‫‪ u11‬‬
‫‪ 1‬‬
‫‪u‬‬
‫‪    2‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪ u1‬‬
‫‪  i ‬‬
‫פירוק מטריצת ‪ MT‬לוקטורי בסיס בשיטה זו‪ ,‬מאפשר טיפול מתמטי במטריצה הקינטית‬
‫באמצעות מודל‪ ,‬ובנוסף מאפשר לנקות רעש ניסיוני על ידי הוצאת וקטורי בסיס בעלי משקל נמוך‪ .‬בדרך‬
‫כלל‪ ,‬מספר נמוך של וקטורים (‪ )0-2‬מספיק לקבלת הדינאמיקה המלאה במדידה‪ ,‬כך שהפעולה האחרונה‬
‫מקטינה משמעותית את מימדי הבעיה‪ .‬אציין כי בדרך כלל מספר וקטורי הבסיס ב ‪ V t c‬ו ‪ Uc‬שנבחר‬
‫להמשך ביצוע ההתאמה משקף למעשה את מימד הבעיה הכימית‪ .‬בנוסף‪ ,‬על מנת לתת משקל גדול יותר‬
‫לצורונים המשמעותיים (‪ U‬ו ‪ V t‬מנורמלות כאמור)‪ ,‬נפרק את מטריצה ‪ S‬בין המטריצות ונקבל‪:‬‬
‫)‪(8‬‬
‫‪‬‬
‫‪Scut V t  Uc V t c‬‬
‫‪99‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪MTc  U  Scut V t  U  Scut ‬‬
‫שלב שני – ‪Decay Associated Spectra‬‬
‫ניתן לתאר בקירוב טוב את המטריצה ‪ , V t c‬באמצעות מכפלה בין מטריצה ששורותיה מכילות‬
‫וקטורי קינטיקה‪ ,‬שתסומן באות ‪ ,T‬לבין מטריצת משקל‪ ,‬שתסומן באות ‪ F‬לפי‪:‬‬
‫‪V t c  F T‬‬
‫)‪(9‬‬
‫על מנת לבצע התאמה מתמטית לתוצאות הניסוי‪ ,‬מלבד הצורונים הנוגעים למודל הפוטוכימי‪ ,‬יש להתחשב‬
‫גם בארטיפקט קוהרנטי ותגובת החומר (ממס וחלונות התא) עם שדות האור בניסוי‪ .‬לפיכך‪ ,‬יש להוסיף‬
‫פונקציות המדמות אפקטים אלו‪.‬‬
‫וקטורי הבסיס בהם נעשה שימוש בניתוח נתונים אלו הינם‪:‬‬
‫‪‬‬
‫גאוסיאן וניגזרותיו לתיאור הארטיפקט הקוהרנטי ותגובת המערכת‪.‬‬
‫‪‬‬
‫מספר אקספוננטים דועכים התואם למספר הצורונים בבעיה עבור הקינטיקה (תחת ההנחה כי כל‬
‫הקינטיקה המעורבת במערכת שלנו הינה מסדר ראשון)‪.‬‬
‫‪‬‬
‫פונקצית תגובה ‪ )"Heaviside function"( -‬לתיאור צורונים בעלי זמן חיים אין סופי‪.‬‬
‫שני האחרונים כוללים קונבולוציה עם פונקצית גאוסיאן (ברוחב ‪ ,)d‬המשקפות את זמן התגובה בחומר‪,‬‬
‫כפי שניתן לראות‪:‬‬
‫‪ t t 0  2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪exp 2 d‬‬
‫‪G  d , t  t 0  ‬‬
‫‪‬‬
‫‪d 2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ t t 0  2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ exp 2 d   t  t 0 ‬‬
‫‪ DG  d , t  t 0 ‬‬
‫‪‬‬
‫‪d 3 2‬‬
‫‪T (d , k , t  t 0)  ‬‬
‫‪‬‬
‫‪i‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ t  t0 ‬‬
‫‪CH  d , t  t 0  1 Erfc  ‬‬
‫‪‬‬
‫‪,‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪2d ‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫‪d 2 ki2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ki  t t 0 ‬‬
‫‪d‬‬
‫‪k‬‬
‫‪‬‬
‫‪t‬‬
‫‪‬‬
‫‪t‬‬
‫‪0‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪1‬‬
‫‪i‬‬
‫‪2‬‬
‫‪Erfc ‬‬
‫‪‬‬
‫‪CExp  d , ki , t  t 0  2 exp‬‬
‫‪2d‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫כעת נחלץ את מטריצת ‪ F‬כתלות בפרמטרי המדידה (‪ )t0, ki, d‬מתוך המשוואה ‪:2‬‬
‫לא ניתן לבודד את ‪ F‬ע"י הכפלת כל המשוואה ב ‪ ,T-1‬מכיוון ש‪ T‬איננה מטריצה ריבועית לכן נגדיר‬
‫מטריצה חדשה‪:‬‬
‫‪M  T T t‬‬
‫נכפיל כל אחד מהאגפים ב ‪ T t  M 1‬ונבודד את ‪:F‬‬
‫‪V t c  T t  M 1  F  T  T t  M 1  F‬‬
‫נציב ונקבל ביטוי עבור ‪: V t c f‬‬
‫‪V t c f  V t c  T f t  M 1  T f‬‬
‫)‪(10‬‬
‫‪90‬‬
‫התכנסות לנתונים הניסיוניים נעשית ע"י חיפוש מינימום לביטוי הבא תוך שינוי פרמטרי ההתאמה‪:‬‬
‫‪V t cdiff  V t c  V t c f‬‬
‫)‪(11‬‬
‫נסתכל על התוצאה‪:‬‬
‫‪MTc  Uc V t c f  Uc  Ff  T f‬‬
‫)‪(12‬‬
‫קיבלנו הפרדה בין מימד הזמן למימד הספקטרום כאשר ‪Decay Associated Uc  Ff  DAS‬‬
‫‪ Spectra‬המתארים את הספקטראות של הצורונים השונים‪ ,‬בהנחה כי כולם דועכים בו זמנית מזמן אפס‪.‬‬
‫שלב שלישי – התאמת מודל – ‪Target analysis‬‬
‫שלב זה הינו החלק המרכזי בהתאמה‪ ,‬ומחייב מודל תיאורטי עבור הפוטוכימיה הנצפית‪ .‬נרצה‬
‫לכפות תלות זמנית בין וקטורי הקינטיקה במטריצה‪.T‬‬
‫לשם הדגמה ניקח מודל פשוט‪:‬‬
‫‪k1‬‬
‫‪k2‬‬
‫‪A ‬‬
‫‪ B ‬‬
‫‪C‬‬
‫סכימה זו מציגה שלושה צורונים קינטיים רלוונטיים הדועכים אקספוננציאלית מאחד לשני בשני קבועי‬
‫זמן עוקבים‪ k1 ,‬ו ‪ . k 2‬על מנת לחלץ את התפתחות האוכלוסייה של כל אחד מהם בזמן‪ ,‬יש לפתור את‬
‫מערכת המשוואות הדיפרנציאליות המצומדות הבאה‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪ A   k1 0 0   A ‬‬
‫‪  ‬‬
‫‪  ‬‬
‫‪ B    k1 k 2 0    B ‬‬
‫‪C   0‬‬
‫‪k 2 0   C ‬‬
‫‪  ‬‬
‫פתרון מערכת זו מתאפשר ע" י מעבר מבסיס ליניארי לבסיס אורתונורמאלי בשיטת גרם‪-‬שמידט‬
‫(‪ )Gram–Schmidt process‬לקבלת‪:‬‬
‫" ‪"T‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪  1 ‬‬
‫‪k1  ‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪k1  k 2    k1t ‬‬
‫‪e ‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪k2‬‬
‫‪  e k 2t ‬‬
‫‪‬‬
‫‪k1  k 2  ‬‬
‫‪0‬‬
‫"‪"R‬‬
‫" ‪"C‬‬
‫‪1‬‬
‫‪k1‬‬
‫‪k1  k 2‬‬
‫‪k2‬‬
‫‪k1  k 2‬‬
‫‪‬‬
‫‪ 0‬‬
‫‪e  k1t‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪ A‬‬
‫‪e  k1t  e  k 2 t k1‬‬
‫‪‬‬
‫‪ 0‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪k1  k 2‬‬
‫‪ B  t   ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪C ‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪ k1  e  k 2 t k1  1  e  k1t k 2  ‬‬
‫‪‬‬
‫‪  1‬‬
‫‪k1  k 2‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫כך שניתן להציג את שינויי הריכוזים לפי הזמן כך ‪ C  R  T -‬בהתאם למודל הקינטי שבחרנו‪.‬‬
‫כעת נוסיף את מטריצת היחידה ‪ I  R1  R‬למשוואה ונקבל‪:‬‬
‫)‪(13‬‬
‫‪MTc  Uc  Ff  Tf  Uc  Ff  R1  R  T f  Uc  Ff  R 1  C‬‬
‫‪94‬‬
‫כאשר ‪ species associated difference spectra - Uc  Ff  R1  SADS‬הינם הספקטראות‬
‫המשויכות לצורונים השונים בהתאם למודל‪.‬‬
‫מספר נקודות‪:‬‬
‫א‪ .‬הפרזה במספר הצורונים במודל זה תביא בהכרח להתכנסות טובה יותר לנתונים הניסיוניים עקב‬
‫הוספת דרגות חופש‪ ,‬אולם לא תיתן אינפורמציה אמיתית לגבי הקינטיקה בתהליך הפוטוכימי‪.‬‬
‫ב‪ .‬עבור מודל מורכב נקבל טולרנטיות גבוהה בהתכנסות לנתונים הניסיוניים עקב ריבוי פרמטרים‪ .‬על‬
‫מנת לפטור בעיה זו ניתן לצמצם את מרחב הפתרונות על ידי חילוץ וקביעת הערכים של חלק‬
‫מפרמטרים אלו באופן בלתי תלוי והכנסתם כקבועים‪.‬‬
‫‪93‬‬
‫‪ .1‬מטרות המחקר‬
‫חלבון הקסנטורודופסין מהווה הכלאה נדירה של שתי משפחות פוטוסינתטיות; משפחת‬
‫החלבונים הרטינלים בארכיאות וקומפלקסי ‪ PSU‬בחיידקים וצמחים‪ .‬במהלך העשור האחרון נאספו‬
‫בשיטות עקיפות עדויות רבות על אופן תפקודו של החלבון‪ ,‬על מנת להבין את הדינאמיקה הגלומה‬
‫במערכת מעניינת זו‪ .‬על מנת שנוכל לצפות בתהליך באופן ישיר‪ ,‬המחקר בחלבון ה ‪ XR‬חייב לכלול‬
‫שימוש בספקטרוסקופיה אולטרה מהירה‪ ,‬המסוגלת לעקוב אחר הדינאמיקה המתרחשת בחלבון בזמן‬
‫אמת‪.‬‬
‫האריזה הצפופה של שני הצבענים בחלבון‪ ,‬האינטרקציות החזקות שבין דיפולי המעבר של‬
‫הרמות השונות וזמן העברת האנרגיה אולטרה קצר‪ ,‬עשרות פמטושניות בודדות‪ ,‬מרמז על אפשרות‬
‫לדינמיקה של מעבר אנרגיה בליסטי‪ ,‬בו חבילת הגלים שומרת על צורתה לאחר המעבר בין הרמות‬
‫השונות של הצבענים השונים‪ .‬מעקב אחר הדינאמיקה המהירה בחלבון ה‪ ,XR‬כפי שהיא מתרחשת‬
‫במערכת טבעית שהשתכללה במיליוני שנה של אבולוציה‪ ,‬נותן הזדמנות פז ללמוד על דינאמיקות שאינן‬
‫קינטיות‪ ,‬השומרות על קוהרנטיות לאחר מעבר בין רמות האנרגיה השונות של המולקולות המעורבות‬
‫בתהליך איסוף ואגירת האנרגית השמש בארכיאה‪.‬‬
‫מטרת המחקר המתואר בעבודה זו היא לעקוב אחר הדינאמיקה הראשונית של איסוף האנרגיה‬
‫ושפעול מעגל האור בחלבון הקסנטורודופסין‪ ,‬באמצעות שימוש מערכת לייזר מתקדמת בעלת רזולוציית‬
‫זמן אולטרה מהירה ומערכת גילוי רב ערוצית‪ ,‬המאפשרת בחינה מדוקדקת ורציפה של האור הנראה‬
‫והתת אדום הקרוב (‪.)NIR‬‬
‫נחקור את התהליכים המתרחשים בדוגמת החלבון לאחר עירור סלקטיבי של כל אחד משני‬
‫הצבענים המוכלים בו‪.‬‬
‫נלמד על אפקטי החלבון והאינטראקציות שבין שני הצבענים‪ ,‬באמצעות חקירת הדינמיקה‬
‫הפוטוכימית במולקולת הקרוטן לבדה‪ ,‬והשוואתה לדינמיקה המתרחשת בחלבון‪.‬‬
‫נחקור את מעבר האנרגיה בין הכרומופורים באמצעות שימוש בקיטובים שונים של הפולס‬
‫הבודק ביחס לפולס המעורר‪ ,‬בהתבסס על הזווית שבין השתי המולקולות‪.‬‬
‫על מנת לחקור את המעבר המהיר בין הצורונים נשתמש ברזולוציה אולטרה גבוהה‪)10fs<( ,‬‬
‫המאפשרת מעקב מדויק אחרי הדינמיקה של הרמה האלקטרונית מעבירת האנרגיה‪.‬‬
‫אף על פי שמחקר זה מתמקד בתהליכים הראשוניים בחלבון ה ‪ ,XR‬חקירת מערכת ביולוגית זו‬
‫מאפשרת קבלת מידע רחב על הדינאמיקה של אנטנת הקרוטן באופן כללי‪ ,‬ולכן יכולה לשפוך אור על‬
‫מערכות פוטוסינתטיות מורכבות יותר‪ ,‬לרבות אלו המתקיימות בחיידקים וצמחים‪.‬‬
‫‪92‬‬
‫‪ .1‬תיאור המערכת הניסיונית‬
‫כדי לדגום את הדינאמיקה של חלבון ה ‪ XR‬אנו זקוקים לרזולוציית זמן קצרה מזמן החיים של‬
‫הרמות שברצוננו לבחון‪ .‬כפי שהוזכר קודם‪ ,‬רמת הסינגלט השנייה של ה ‪ SX‬היא רמת האנרגיה שממנה‬
‫זורמת האנרגיה לרטינל ולכן מהווה את המפתח להבנת תהליך העברת האנרגיה‪ .‬זמן החיים של רמת‬
‫אנרגיה זו הינו מסדר גודל של כמה עשרות פנטושניות בלבד‪ .‬ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה הינה שיטת‬
‫ה מדידה היחידה המסוגלת לעקוב בזמן אמת אחרי ריאקציות פוטוכימיות בסקלת זמנים זו‪ ,‬תוך בחינה‬
‫ישירה של מצבי המעבר‪.‬‬
‫מערכת הלייזר בה ביצענו את הניסוי מבוססת על גביש ‪ Ti;sapphire‬הנשאב באמצעות ‪Nd:‬‬
‫‪ YVO‬מוכפל‪.‬‬
‫בקצרה ניתן לתאר את עקרון פעולת מערכת הלייזר בצורה הבאה‪ :‬פולסים קצרים נוצרים‬
‫בעוצמות נמוכות ובתדירות גבוהה‬
‫באוסצילטור‪ .‬קרן הלייזר נפרשת‬
‫בזמן‬
‫(על‬
‫מנת‬
‫למנוע‬
‫פגיעה‬
‫באלמנטים האופטיים בזמן ההגברה)‬
‫ומוגברת‪ .‬לאחר תהליכי ההגברה‪,‬‬
‫הפולסים מכווצים חזרה קרוב ככל‬
‫שניתן לגבול הטרנספורם‪.‬‬
‫איור ‪ :90‬תרשים המדגים את עיקרון פעולת הלייזר‪ .‬כאשר ה‪ O -‬מציין את‬
‫האוסילטור‪ ,‬ה‪ S-‬את הפורש‪ ,‬ה‪ A-‬את המגבר וה‪ C-‬את הדוחס‪.‬‬
‫תיאור מערכת הלייזר על שלביה השונים‪:‬‬
‫‪ 1.1‬האוסצילטור‪.‬‬
‫האוסצילטור מתבסס על גביש ‪( Ti;sapphire‬גביש ספיר עם אילוח של יוני טיטניום) המהווה‬
‫את התווך הלוזר; הגביש נשאב על ידי לייזר )‪ Nd:YVO ,CW (continues wave‬מוכפל תדר‬
‫(‪)527nm‬‬
‫מסחרי‬
‫הממוקד‬
‫באמצעות עדשה לגביש המצוי‬
‫בין שתי מראות דיכוריות‪.‬‬
‫הלייזר מאלץ פליטה בתחום‬
‫שבין ‪ 600nm‬ל ‪.1100nm‬‬
‫המראות מחזירות וממקדות את‬
‫איור ‪ :91‬תרשים סכמטי של האוסצילטור‬
‫קרינת הלייזר שנוצרת אך מעבירות את קרינת הלייזר השואב‪ .‬את המהוד משלימות שתי מראות קצה‬
‫‪97‬‬
‫דיאלקטריות‪ ,‬האחת ‪ high reflector‬והשנייה ‪ output coupler‬המחזירה ‪ .20%‬בתוך האוסצילטור‬
‫נוצרים גלים עומדים המתאימים לפיתרון המשוואה ‪, L  n   / 2‬הפולסים הקצרים נוצרים כתוצאה‬
‫מנעילת האופנים (‪ )Mode locking‬מצב בו כל הגלים שנוצרים במהוד מקבלים את אותה הפאזה‪.‬‬
‫באוסצילטור שלנו‪ ,‬נעילת האופנים פאסיבית‪ ,‬ומתבססת על תופעה המכונה ‪ 31 Kerr Lensing‬שנגרמת‬
‫בגביש‪ ,‬ומשנה את אינדקס הרפרקציה בהתאם לעוצמה‪ .‬שדה פולסי הינו בעל עוצמה רגעית גבוהה יותר‬
‫מ ‪ CW‬ולכן כיוון נכון של המגבר ייצור העדפה למצב זה‪ .‬בסופו של התהליך הפולסים היוצאים מן‬
‫האוסצילטור מרוכזים ב‪ 790 nm-‬עם משך פולס של כ‪ ,20 fs-‬ברוחב ספקטראלי של ‪ ,45nm‬בתדירות‬
‫של ‪ 86 MHz‬ובעוצמה של ‪.~0.5 W‬‬
‫‪ 1.1‬הפורש‪stretcher -‬‬
‫על‬
‫מנת‬
‫להגביר‬
‫את‬
‫הפולסים בלי לגרום נזק לאלמנטים‬
‫האופטיים‪ ,‬לפני ההגברה נפרש‬
‫הפולס בזמן‪ .‬פרישת הפולס נעשית‬
‫על ידי הפרדת הפולס במרחב‬
‫באמצעות‬
‫שריג‬
‫עם‬
‫‪1900‬‬
‫‪ ,lines/mm‬ומתן דרך אופטית‬
‫איור ‪:99‬תרשים הפורש‪.‬‬
‫ארוכה יותר בצד הכחול של הספקטרום לפני איסופו חזרה במרחב באמצעות אותו הגביש‪ .‬בסופו של‬
‫התהליך הפולס מורחב מ ‪ 17fs‬ל כ ‪.90fs‬‬
‫‪ 1.1‬בורר הפולסים‬
‫כאמור‪ ,‬המגבר מייצר ‪ 86 106‬פולסים לשנייה‪ .‬אין לנו אפשרות או צורך להגביר את כולם‬
‫ולכן אנו צריכים לבודד את הפולסים אותם אנו מעוניינים להגביר‪ .‬לצורך פעולה זו אנו משתמשים בגביש‬
‫אלקטרו אופטי‪ .‬עם הפעלת מתח של ‪ 8kV‬למשך מספר ננושניות‪ ,‬משמש הגביש כלוחית חצי גל‪ .‬אור‬
‫המקוטב במקביל לשולחן עובר דרך לוחית חצי גל המסובבת את הקיטוב ב ‪ 20‬מעלות לפני הגעתו לגביש‪.‬‬
‫מקטב המוצב לאחר הגביש חוסם את כל הפולסים למעט אלו שהמתח שהופעל על הגביש סובב את‬
‫קיטובם חזרה לקיטוב המקורי‪ .‬על ידי הפעלת המתח בתדירות הרצויה ובמשך זמן הנכון אנו בעצם‬
‫פותחים חלון המעביר פולס בודד בתדירות הרצויה לנו‪ .‬כמו כן‪ ,‬על ידי הזזה עדינה של החלון בזמן‪ ,‬ניתן‬
‫לברור את הפולס בעל התזמון האופטימאלי ביחס לפולס של הלייזר השואב‪.‬‬
‫‪98‬‬
‫‪ 1.3‬המגבר‬
‫הגברת הפולסים מתבצעת ע"י קצירת האנרגיה מגביש ‪ Ti:Sappire‬הנשאב באמצעות לייזר‬
‫‪ Q-switch YLF‬מסחרי‪ ,‬מוכפל‬
‫בתדר (‪ )527nm‬ומסונכרן עם‬
‫הפולסים היוצאים מן האוסצילטור‪.‬‬
‫המגבר בנוי משתי מראות דיכוריות‬
‫ספריות המחזירות ומרכזות את‬
‫פולס ה ‪ IR‬ומעבירות את הפולס‬
‫איור ‪:90‬תרשים המגבר‬
‫השואב‪ ,‬ומראת זהב‪ ,‬שבהן הקרן‬
‫‪32‬‬
‫עוברת מספר פעמים לפי תכנון שפורסם על ידי ‪ . Backus et al‬הפולס המגיע מהאוסצילטור נכנס‬
‫באמצעות מראה לקצה המראה הדיכורית הראשונה‪ ,‬הממקדת אותו לגביש‪ .‬לאחר המעבר בגביש‪ ,‬הקרן‬
‫ממשיכה לקצה השני של המראה הדיכורית השנייה ומיושרת (‪ ,)collimated‬שם היא ממשיכה למראת‬
‫הזהב המישורית וחזרה למראה הדיכורית הראשונה‪ ,‬אך מוסטת מעט הצידה‪ .‬המעגל חוזר על עצמו תשע‬
‫פעמים‪ ,‬כאשר במעבר התשיעי‪ ,‬הפולס המוגבר נקטף על ידי מראת זהב נוספת ויוצא מהמגבר‪ .‬מראה‬
‫ספרית נוספת ממוקמת לאחר המראה הדיכורית השנייה‪ ,‬מחזירה את הלייזר השואב לגביש לשם מיקסום‬
‫יעילות ההגברה‪ .‬סידרה של חרירים ממוקמת בין המראה הדיכורית השנייה למראת הזהב מפחיתה את‬
‫הפליטה הספונטאנית ומגינה מפני מיקוד תרמי שעלול לפגוע בגביש‪ .‬המגבר מעלה את אנרגית הפולס ל‬
‫‪ .~1mJ/pulse‬לאחר המגבר‪ ,‬הפולסים מסוננים במרחב ע"י חריר טפלון המעצב ומשפר את פרופיל‬
‫הקרן‪.‬‬
‫‪ 1.3‬המדחס ‪Compressor -‬‬
‫עיקרון הפעולה של ה ‪Compressor‬‬
‫דומה לזה של הפורס –שוב אנו פורסים את הפולס‬
‫במרחב הפעם על ידי מעבר כפול דרך זוג שריגים‬
‫של ‪ 1/1200 lines/mm‬המקבילים זה לזה‪ ,‬תוך‬
‫מתן דרכים אופטיות שונות לצבעים השונים (כפי‬
‫שניתן לראות באיור ‪ .)94‬משחק עדין עם זוויות‬
‫איור ‪ :94‬תרשים המדחס‪.‬‬
‫השריגים מאפשר לנו להתמודד גם עם סדרים‬
‫גבוהים יותר של הדיספרסיה על מנת להשיג את הפולס הקצר יותר‪ .‬בסוף התההליך הפולס מכווץ חזרה‬
‫לכ ‪ 30fs‬בחצי הגובה (‪.)fwhm‬‬
‫ביציאה מהמגבר קיבלנו פולס בעוצמה של ‪ ~0.5mJ/pulse‬עם רוחב זמני של כ‪-‬‬
‫‪fwhm=30fsec‬‬
‫ברוחב‬
‫ספקטראלי‬
‫של‬
‫‪92‬‬
‫‪40nm‬‬
‫המרוכז‬
‫סביב‬
‫‪.790nm‬‬
‫‪ 1.3‬המרת אורך הגל‪:‬‬
‫על מנת לחקור צורונים בעלי ספקטרום בליעה השונה ממוצא הלייזר וההרמוניות שלו‪ ,‬אנו‬
‫זקוקים לכיוונון תדר במערך הלייזר‪ .‬בעבודה המתוארת כאן‪ ,‬ביצענו שתי סדרות שונות של ניסויים‬
‫המבוססים על ספקטרוסקופיית ‪ ,pump-probe‬כאשר תזוזת אורכי הגל מה‪ 790nm -‬לתחום רחב של‬
‫אורכי גל מתקבלת באמצאות מגבר פרמטרי ‪-‬‬
‫‪Optical‬‬
‫‪ .Parametric Amplifier‬המרת אורך הגל במגברים אלו‬
‫נעשית על ידי פיצול כל פוטון שואב לשני פוטונים‪"signal" ,‬‬
‫ו"‪ ,"idler‬בגביש לא ליניארי (‪ ,)nonlinear crystal‬בהתאם‬
‫‪  ‬‬
‫‪  ‬‬
‫לשימור אנרגיה לפי ‪ , k1  k 2  k3‬כאשר ‪ , k 2 , k1‬ו ‪ k 3‬הינם וקטורי ‪ Poynting‬של הקרן השואבת‪ ,‬קרן‬
‫איור‪ : 93‬תאור סכמטי של מגבר פרמטרי‪.‬‬
‫"‪ ,"signal‬וקרן "‪ "idler‬בהתאמה‪ .‬כפי שניתן לראות באיור ‪ ,93‬למגבר מוכנסות שתי קרניים‪ ,‬קרן‬
‫ה‪ ,seed‬שהינה קרן באורך הגל בו אנו מעוניינים לעבוד‪ ,‬וקרן ה‪ ,pump‬המשמשת להגברה‪ .‬אורך הגל‬
‫האופטימלי למגבר תלוי בהתאמת הפאזות (‪ )phase matching‬בגביש; התאמה זו ניתנת לשליטה‬
‫באמצעות שינוי הזווית בין האור הנכנס וציר הגביש‪ ,‬מה שמאפשר התאמת המגבר למגוון אורכי גל‪.‬‬
‫במסגרת המחקר המתואר בעבודה זו עשינו שימוש בשני סוגי מגברים פרמטרים; מכשיר מסחרי‬
‫המכונה ‪Travelling-wave Optical Parametric Amplifier of Superfluorescence - TOPAS‬‬
‫בסדרת הניסויים הראשונה‪ ,‬ו‪ Non collinear Optical Parametric Amplifier -NOPA‬בשנייה‪.‬‬
‫ההבדלים בין המגברים השונים נעוצים בעיקר בדרך בה נוצר ה ‪ seed‬אותו אנו מגבירים‪.‬‬
‫ה‪ TOPAS-‬מבוסס על הגברת של סופר פלואורסנציה הנוצרת בגביש ‪β-BaB2O4 - ( BBO‬‬
‫‪ .)beta Barium Borate‬מעבר ראשוני בגביש לא ליניארי משמש לפליטת סופר‪-‬פלואורסנציה‪ ,‬אשר‬
‫מוגברת לאחר מכן עלי ידי העתקים נוספים של הקרן השואבת‪ .‬היות ובהתאם לשימור אנרגיה ה‪ signal‬ו‬
‫‪ idler‬אנרגטיים פחות מהקרן השואבתי (‪ ,)790nm‬תדירויות בתחום הנראה מתקבלות על ידי הכפלת‬
‫התדר או על ידי שילוב של התדר שנוצר עם התדר המקורי (‪ )mix‬נוסף‪ .‬ה ‪ NOPA‬מתבססת על הגברת‬
‫אור לבן הנוצר בשלב מוקדם יותר על ידי חלק קטן מקרן (‪ )3%‬על גבי חלון ‪ sapphire‬דק (‪,)1.3mm‬‬
‫ההגברה נעשית באמצאות תדר מכפל של הקרן המקורית (על מנת לקבל את קרן ה‪ signal‬בנראה) על‬
‫פני גביש ‪.BBO‬‬
‫הצורך בשימוש בשתי השיטות נובע מעיקרון אי הוודאות וספקטרום הבליעה של הצבענים‬
‫המשולבים בחלבון; כפי שתואר קודם‪ ,‬לחלבון ה‪ XR‬יש שתי מולקולות צבע בעלי ספקטראות בליעה‬
‫שאינם נבדלים זה מזה בצורה משמעותית (ישנו אפילו אזור חופף כפי שניתן לראות באיור ‪ .)3‬שימוש‬
‫ב‪ TOPAS‬מאפשר יצירת פולסים צרים יחסית בתדר – כ‪ 15nm‬בחצי הגובה (כפי שניתן לראות באיור‬
‫‪ 00‬עקומה כחולה ואפורה) המאפשרים עירור סלקטיבי של אחד הכרומופורים‪ .‬אלא שיתרון זה מלווה‬
‫בחיסרון בדמות רזולוציית הזמן שהוא מאפשר‪ ,‬בהתאם לעיקרון אי הוודאות‬
‫‪00‬‬
‫‪2‬‬
‫‪ , E  t ‬פולס צר‬
‫בתדר מוגדר באנרגיה שלו ביחס לפולס רחב ולכן בעל אי וודאות גדולה יותר בזמן‪ .‬לדוגמה‪ ,‬פולס בתחום‬
‫הנראה ברוחב של כ ‪ 15nm‬בחצי הגובה‪ ,‬ייתן רוחב זמני מינימאלי של כ ‪ 30fs‬ולכן אינו מאפשר מעקב‬
‫אחרי הדינאמיקה המהירה בחלבון‪ .‬לעומת ה ‪ ,TOPAS‬שימוש ב‪ NOPA‬מאפשר יצירת פולסים הקצרים‬
‫מ ‪ 5fs‬אך בהתאם לעיקרון אי הוודאות‪ ,‬יתקבלו רחבים בתדר (קו ירוק באיור ‪ )00‬ואינם מאפשרים‬
‫עירור סלקטיבי של אחד הצבענים‪ .‬שני כלים אלו משלימים זה את זה בניסוי שלנו ומאפשרים קבלת‬
‫תמונה מלאה של הדינאמיקה בחלבון‪.‬‬
‫‪ 1.3‬הקונפיגורציה הניסיונית ‪TOPAS -‬‬
‫ניסוי מבוסס אור לבן כפולס בודק (‪ )multi filament white light continuum probe‬ובקרן‬
‫המתקבלת מ ה‪ TOPAS-‬כפולס מעורר (‪ ,)Pump‬המיועדת לעורר את מולקולת ה ‪ SX‬לרמה ‪ S2‬עם‬
‫מינימום עירור ישיר של הרטינל‪.‬‬
‫אחרי ה‪ Compressor-‬הקרן מתפצלת‪ ,‬כשליש ממנה ממשיך ללא שינוי ושני שלישים נכנסים‬
‫אל ‪ TOPAS‬ועוברים המרת אורך גל ע"י שילוב (‪ )mix‬בין הסיגנל לקרן הפונדמנטלית (‪)790nm‬‬
‫לקבלת פולס בצבע ירוק ‪ -‬סביב ‪ 480nm‬ורוחב ספקטראלי של ‪ .fwhm=15nm‬כדי לכפר על אלמנטים‬
‫דיספרסיביים הקרן מכווצת בזמן באמצאות שריג יחיד בעל ‪ 1900‬חריצים למילימטר (צפיפות החריצים‬
‫‪n‬‬
‫קבעת את עוצמת הפריסה בהתאם לנוסחת השריג‪:‬‬
‫‪d‬‬
‫‪ sin( ) ‬כאשר ‪ d‬הינו המרחק בין החריצים ‪‬‬
‫הינה אורך הגל ‪ n‬הינו סדר הפריסה ו ‪ ‬היא זווית הפיזור)‪ .‬עיקרון הפעולה זהה לזה של ‪Compressor‬‬
‫אך מכוון שהוא ייחודי לקונפיגורציה שלי ארכיב עליו; הקרן פוגעת בסריג נשברת לצבעיה השונים‪,‬‬
‫הסדר הראשון איתו אנו עבדים נאסף על ידי מראה מרכזת הנמצאת במרחק המוקד שלה מהשריג כך‬
‫שלאחר הפגיעה בה הקרן עוברת קולימציה (‪ )collimate‬במישור הדיפרקציה ומיקוד במישור המאונך‪.‬‬
‫הקרן ממשיכה למראה פלנארית המאונכת לקרן הנמצאת גם היא במרחק המוקד מהמראה המחזירה על‬
‫המראה המרכזת כך שהקרניים נאספות חזרה על הסריג לאחר שכול צבע עבר דרך אופטית שונה‪.‬‬
‫באמצאות הזזה עדינה של המראה המרכזת קדימה ואחורה אנו שולטים על כהפרשי הדרכים‪ .‬הבחירה‬
‫בסריג כאלמנט כיווץ ולא בזוג בפריזמות כמקובל למרות ההפסד האנרגטי המגיע בשימוש באלמנט זה‬
‫( אנו משמשים רק בסדר הראשון של ההחזרה מהשריג שאר הסדרים כולל החזרת האפס מתבזבזים)‬
‫מצריך הסבר; כפי שתואר קודם בניסוי ה ‪ TOPAS‬אנו מעוניינים לצור פולס מעורר סלקטיבי ככול‬
‫הניתן‪ ,‬פורסת הפולס במרחב מאפשר לנו לקטם את זנבות הפולס (כפי שניתן לראות באיור ‪ )92‬ובכך‬
‫לשלוט על רוכבו בצורה עדינה (קטימה זו טומנת בחובה היתרון מאפשרת לנו לצמצם את האזור‬
‫הספקטראלי בו הגילוי שלנו נפגע כתוצאה מפיזור הפולס המעורר על ידי הדגם ומגיע לגלאי)‪.‬‬
‫לאחר מכן‪ ,‬הקרן מתמקדת על הדוגמה באמצעות מראה מרכזת )‪ .(f=25cm‬עוצמת הקרן‬
‫המעוררת בדוגמה נמדדה כ ‪ 250nj‬לכל פולס‪ ,‬כאשר קוטר הקרן הנמדד בדוגמה היה כ ‪ 900‬מיקרון‪.‬‬
‫‪01‬‬
‫מדידת קוטר הקרן בוצע באמצעות חריר של ‪ 100‬מיקרון תוך הנחה כי הקרן הינה בעלת התפלגות‬
‫גאוסית‪ .‬עוצמת עירור זו נבחרה כפשרה בין סיגנל פליטה משמעותי לבין עבודה בתחום הליניארי‪.‬‬
‫הקרן שהמשיכה ללא שינוי‪ ,‬עוברת דרך מסוע אולטרה מדויק (בעל דיוק של ‪ 0.9‬מיקרון השקול‬
‫להשהיה זמנית של כפנטושניה בודדת) המאפשר שליטה ממוחשבת על התזמון שבין הפולסים‪ .‬לאחר מכן‬
‫הקרן מתמקדת באמצעות עדשה )‪ (f=20cm‬על ספיר דק (‪ )1.5mm‬ליצירת אור לבן בתחום ספקטראלי‬
‫של ‪ .450-950nm‬על מנת לקבל אור אחיד ככל האפשר על פני כל התחום הנראה‪ ,‬הקרן עוברת סינון‬
‫ספקטרלי (‪ )spatial filtering‬באמצעות חריר (‪ )Pin hole‬מתכוונן‪ .‬האור הלבן נאסף באמצעות מראה‬
‫)‪ (f=50cm‬המדמה את האור לדוגמה בזווית מינימלית על מנת למזער את תופעת האסטיגמטיות (מיקוד‬
‫שונה של האור בצירים המאונכים לכיוון כהתקדמותו)‪ .‬מפצל קרן (‪ )Beam Splitter - BS‬הממוקם‬
‫בדרך לדוגמה‪ ,‬מחלק את הקרן לקרן בודקת (‪ )I‬ולקרן יחוס (רפרנס –‪ , )I0‬כאשר הקרן שהוחזרה‬
‫משמשת כקרן בודקת (על מנת שלא להוסיף תווך דיספרסיבי) והקרן שעברה דרך המפצל משמשת‬
‫כיחוס‪ .‬לאחר הדוגמה הקרן נאספת שוב על ידי עדשה אכרומתית על מנת למזער את תופעת האבירציה (‬
‫תופעה בה אורכי הגל השונים מתמקדים בנקודה שונה במרחב)‪ ,‬ומדומה לעבר סיב אופטי של ‪100‬‬
‫מיקרון (קרן היחוס נאספת באותה הצורה רק ללא מעבר בדוגמה)‪ .‬הסיבים מעבירים את הקרן לזוג‬
‫ספקטרוגראפים זהים מבוססי דיודות (‪ )diode array‬המאפשרים את קליטה של ספקטרום רחב הפס של‬
‫שתי הקרניים‪.‬‬
‫איור ‪ :62‬תרשים המערכת הניסיונית בניסוי ‪ pump probe‬מבוסס ‪.TOPAS‬‬
‫קיטובים‬
‫כפי שנכתב קודם לאיכות הקיטוב משמעות מכריעה בחקירת חלבון ה‪ .XR‬על מנת להשיג קיטוב‬
‫אופטימאלי הוצבו מקטבים גם על הקרן השואבת וגם על הבודקת‪ .‬עבור הקרן הבודקת‪ ,‬כדי למנוע‬
‫דיספרסיה‪ ,‬המקטב הוצב לפני יצירת האור הלבן (על ה‪ .)IR‬בשל העוצמה הגבוהה של הקרן‪ ,‬בשלב זה‬
‫הוצב מקטב גלן (‪ )calcite Glan Laser Polarizer‬המבוסס על שתי פריזמות המפרידות בין הקיטובים‬
‫במרחב (בשונה ממקטב רגיל המבוסס על בליעה של אחד הקיטובים‪ ,‬ולכן פגיע יותר)‪ .‬על הקרן השואבת‪,‬‬
‫‪09‬‬
‫בנוסף למקטב ולפניו‪ ,‬הוספנו לוחית גל (‪ )wave plate‬המסובבת את הקיטוב ומאפשרת עריכת ניסויים‬
‫עם עירור במקביל ובמאונך ביחס למישור השולחן האופטי‪ .‬איכות הקיטוב נבדקה עבור שתי הקרניים‬
‫באמצעות מקטב נ וסף ונמצא כי עבור שתי הקרניים היחס בין האור בקיטוב הלא רצוי לרצוי ( ‪contrast‬‬
‫‪ )ratio‬נמוך משני אחוזים‪.‬‬
‫איסוף הנתונים‬
‫תדירות הקריאה של הספקטרוגרפים נקבעת על ידי ‪ chopper‬שמסתובב בתדירות של ‪,115Hz‬‬
‫כאשר התדר מוכפל פי ארבע לפני שליחתו למערכת הלייזר‪ ,‬כך שמה‪ Compressor-‬הקרן יצאת תדירות‬
‫של ‪ .460Hz‬הצ'ופר המקורי (‪ (115Hz‬חותך את התדירות לפני הכניסה ל‪ ,TOPAS-‬כדי למנוע‬
‫מפולסים להגיע בזמן קריאת הדיודות בשני הספקטרוגרפים‪ .‬צ'ופר שני‪ ,‬המסתובב בחצי מהתדירות‬
‫המקורית (‪ ,(57.5Hz‬מונח בדרכה של הקרן המעוררת‪.‬‬
‫בסופו של דבר‪ ,‬אל הספקטרוגרפים מגיעים פולסים‬
‫בודקים בתדירות של ‪ ,230Hz‬כך ששני פולסים עוקבים‬
‫עברו בדוגמה לאחר שעוררה‪ ,‬ושניים עוקבים שעברו‬
‫בדוגמה בלי שעוררה‪ .‬כל זוג פולסים עוקבים כאלה נאסף‬
‫יחד בספקטרוגרף (לצורך מיצוע)‪ ,‬ובסופו של התהליך‬
‫מתקבלים מהספקטרוגרפים אותות הנשלחים למחשב‪,‬‬
‫המגיעים ממדידת הדוגמה עם ובלי עירור לסירוגין‪.‬‬
‫דאגרמת תזמון בניסוי במערכת‬
‫איור ‪:97‬‬
‫‪ ,TOPAS‬בכחול פולסי בדיקה שעברו בדוגמה‬
‫לאחר עירור‪ ,‬בירוק פולסי בדיקה שעברו בדוגמה‬
‫ללא עירור‪ ,‬הקטעים האפורים מסמנים את זמן‬
‫הקראת הדיודות בספקטרוגרפים‬
‫השינויים בצפיפות האופטית )‪ (ΔOD‬נמדדים ע"י‬
‫השוואה בין האותות המתקבלים עם עירור הדוגמה לאלה שבלעדיו תוך נרמול האות לקרן שלא עברה‬
‫בדוגמה כלל לפי הנוסחה‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫)‪(14‬‬
‫‪ I probe ‬‬
‫‪ I probe  pump‬‬
‫‪OD  log ‬‬
‫‪ log ‬‬
‫‪‬‬
‫‪ I 0 probe ‬‬
‫‪ I 0 probe  pump‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫בכל נקודה בה עמד הטרנסלטור‪ ,‬נאספו בין ‪ 900‬ל ‪ 300‬פולסים כדי למזער את הרעש‪ .‬כמו כן במידת‬
‫הצורך המדידה כולה התבצעה מספר פעמים ומוצעה שוב‪.‬‬
‫תיקון זמן (‪)time correction‬‬
‫הצורך בתיקון הזמן מגיע ממהירות שונה של צבעים שונים בטווח דיספרסיבי ( ‪dispersive‬‬
‫‪ ,)media‬כגון עדשות וגבישים‪ .‬ניתן לפצות על הדיספרסיה הנוצרת במערכת באמצאות שימוש בשריג‬
‫כפי שתואר קודם כאשר מדובר בתחום מוגבל יחסית של תדרים (כמו במקרה של הקרן המעוררת) אלה‬
‫שאנרגטית התהליך בזבזני ומסתבך כשמדובר בתחום תדרים רחב כמו במקרה של האור הלבן בקרן‬
‫הבודקת ולכן במקרה זה נעדיף טיפול מתמאטי בתוצאות‪ .‬מכוון שמרבית החומרים נותנים דיספרסיה‬
‫חיובית (הרכיבים האדומים מקדימים את הרכיבים הכחולים) ואנו מתחילים את הסריקות שלנו מזמנים‬
‫‪00‬‬
‫שלילים (בהם הפולס הבודק מגיע ליפני הפולס המעורר) עלית הסיגנל תתחיל בצד הכחול מכוון שהפולס‬
‫המעורר "ישיג" קודם את הצבעים הכחולים האיטיים‪ ,‬ורק לאחר כמה מאות ‪( fs‬בהתאם לכמות הטווח‬
‫הדספרסיבי אותו האור עובר) נראה תגובה גם בצד האדום‪ .‬על מנת לתקן את האפקט נבצעה הסטה‬
‫מתמטית של צירי הזמן של אורכי הגל השונים בהתאם לעקומת דיספרסיה אותה קבלנו מניסוי על הממס‬
‫הנקי‪ .‬על מנת למזער שגיאות ההתאמה בוצעה על ידי התאמת הדיספרסיה המתקבלת בניסוי לדיספרסיה‬
‫התיאורטית של ספיר (המהווה את מרבית החומר הדספרסיבי אותה עוברת הקרן) שחושבה מתוך אינדקס‬
‫הרפרקציה (‪ )n‬כך שהפרמטר היחידי בהתאמה היה עובי הספיר‪.‬‬
‫‪ 1.3‬הקונפיגורציה הניסיונית – ‪NOPA‬‬
‫כפי שנאמר קודם‪ ,‬יתרונה הגדול של מערכת זו טמון בהפרדת הזמן שהיא מאפשרת – פולסים‬
‫קצרים של פחות מ ‪ .5 fs‬לא ניתן להגיע לרזולוציות זמן כאלה על ידי כיווץ סטטי (באמצעות שריג כמו‬
‫בקונפיגורציה הקודמת) בלבד ויש צורך בכיווץ אקטיבי‪ .‬לכן‪ ,‬במערכת שלנו‪ ,‬בנוסף לשני פריזמות מ‬
‫‪ ,BK7‬אנו משתמשים במעצב פולסים (‪ ;)pulse shaper‬בדומה לכיווץ במערכת ה‪ TOPAS‬גם כאן‬
‫הכיווץ מבוצע באמצעות שבירת האור ע"י שריג ומתן דרכים אופטיות שונות לכול צבע‪ .‬אלא שבמקום‬
‫מראה רגילה המחזירה את הקרן למראה המרכזת‪ ,‬אנו משתמשים במראה מתעוותת ( ‪deformable‬‬
‫‪ ,33)mirror‬המאפשרת שליטה בפאזות היחסיות ע"י עיצוב פני השטח של המראה עם אלגוריתם גנטי‬
‫למציאת העיוות האופטימלי‪ .34‬השריג והמראה המתעוותת נמצאים במוקד של העדשה ספרית האוספת את‬
‫הסדר הראשון (בדומה‬
‫לכיווץ‬
‫שתואר‬
‫המערכת‬
‫עבור‬
‫הניסיונית‬
‫הקודמת)‪ ,‬כך שהקרניים‬
‫הנפרשות על ידי השריג‬
‫למראה‬
‫מגיעות‬
‫כשהן‬
‫המתעוותת‪,‬‬
‫מרחבית‬
‫מקבילות‬
‫במישור הדיפרקציה אך‬
‫ממוקדות במשור המאונך‬
‫אליו‪ .‬המראה המתעוותת‬
‫בנויה מממברנה באורך‬
‫של ‪ 38mm‬המחוברת‬
‫בקצוות‬
‫של‬
‫‪12‬‬
‫איור ‪ :98‬תרשים המערכת הניסיונית בניסוי ‪NOPA‬‬
‫אלקטרודות שמשנות את אורכם בהתאם למתח הנופל אליהן‪ ,‬ובהתאם מושכות את המראה אחורנית‪.‬‬
‫מכיוון שהקרניים מגיעות בניצב‪ ,‬ניתן ליצור הבדלי מרחק בין הצבעים ללא עיוות בצורת הקרן‪ .‬המתח‬
‫‪04‬‬
‫הנופל על הדיודות נשלט על ידי מחשב‪ ,‬וכדי להגיע למתח האידיאלי על כל אלקטרודה‪ ,‬אנו משתמשים‬
‫באלגוריתם לומד‪ ,‬המשתמש בהכפלת תדר כקריטריון ‪ fitness‬לכיווץ אופטימלי; מכיוון שעוצמת הכפלה‬
‫תלויה בעוצמת הרגעית של הפולס‪ ,‬ההכפלה העוצמתית ביותר תיווצר כאשר הפולס הוא הקצר ביותר‬
‫(כול האנרגיה של כול אורכי הגל מגיעה באותו הזמן) ‪ .‬לכן על ידי מדידת המתח על דיודה האוספת את‬
‫האור המוכפל נוכל למצוא את המתחים האידיאלייים על מנת לפצות על הדיספרסיה במערכת שלנו‪.‬‬
‫ניסוי שבוצע במערכת ניסיונית זו מתבסס על האור המתקבל מה ‪ NOPA‬הן כפולס בודק והן‬
‫כפולס מעורר‪ .‬כפי שניתן לראות באיור ‪ ,98‬הקרן שיוצאת מה ‪ NOPA‬עוברת כיווץ ראשוני באמצעות‬
‫זוג פריזמות‪ ,‬לאחר מכן עוברות כיווץ נוסף על ידי ה‪ ,shaper‬הקרן המכווצת מתפצלת לשלוש קרניים‪:‬‬
‫מעוררת בודקת וקרן יחוס‪ .‬קרן היחוס נאספת לסיב אופטי‪ ,‬והקרניים המעוררת והבודקת ממוקדות על ידי‬
‫אותה עדשה (‪ (f=200cm‬אל הדוגמה‪ ,‬כאשר הקרן הבודקת עוברת דרך מסוע אולטרה מדויק‪ ,‬המאפשר‬
‫שליטה ממוחשבת על התזמון שבין הפולסים כמו במערכת ה‪ .TOPAS‬לאחר הדוגמה‪ ,‬הקרן המעוררת‬
‫נחסמת והבודקת נאספת גם היא לסיב אופטי של ‪ 900‬מיקרון ונשלחת יחד עם קרן היחוס לספקטרוגרף‪.‬‬
‫איסוף הנתונים‪:‬‬
‫הבדל נוסף בין שתי המערכות הינו מכשיר המדידה – במקום שני ספקטרומטרים מבוססי‬
‫דיודות‪ ,‬אנו משתמשים במצלמת ‪ CCD‬אחת המקבלת את שני הערוצים במקביל בגבהים שונים על‬
‫המצלמה‪ .‬תדירות הקריאה של ‪ CCD‬הינה ‪ 50Hz‬הנקבעת על ידי ‪ ,Stanford pulse generator‬כאשר‬
‫תדר זה מוכפל פי ‪ 8‬לפני שליחתו אל מערכת הלייזר‪ ,‬כך שמה‪ Compressor-‬הקרן יוצאת בתדירות של‬
‫‪ Chopper .400Hz‬ראשון המסתובב בתדירות‬
‫המקורית‪ ,‬חותך את התדירות לפני הכניסה ל ‪;shaper‬‬
‫כדי למנוע מפולסים להגיע בזמן קריאת ה‪.CCD‬‬
‫ה ‪ chopper‬השני‪ ,‬מסתובב בחצי מהתדירות המקורית‬
‫(‪ ,(25Hz‬מונח בדרכה של הקרן המעוררת‪ .‬בסופו של‬
‫דבר‪ ,‬אל הספקטרוגרפים מגיעים שמיניית פולסים‪,‬‬
‫ארבעה פולסים עוקבים עברו בדוגמה לאחר שעוררה‬
‫וארבעה פולסים עוקבים שעברו בדוגמה בלי שעוררה‪.‬‬
‫איור ‪ :92‬דאגרמת תזמון בניסוי במערכת ‪,NOPA‬‬
‫בכחול פולסי בדיקה שעברו בדוגמה לאחר עירור‪,‬‬
‫בירוק פולסי בדיקה שעברו בדוגמה ללא עירור‪,‬‬
‫הקטעים האפורים מסמנים את זמן הקראת ה ‪CCD‬‬
‫כל רביעיית פולסים עוקבים כאלה נאספים יחד בספקטרוגרף‪ .‬בסופו של התהליך מתקבלים‬
‫מהספקטרוגרפים אותות הנשלחים למחשב המגיעים ממדידת הדוגמה עם ובלי עירור לסרוגין‪ .‬השינויים‬
‫בצפיפות האופטית )‪ (ΔOD‬מחושבים באותה הצורה כמו בניסוי ה‪ TOPAS‬ולא יפורטו שוב‪.‬‬
‫‪03‬‬
‫‪ 1.3‬הדוגמה והתא‪:‬‬
‫כל הדוגמאות עליהם ביצענו את הניסויים הוכנו ע"י פרופ' שבס וקבוצתו (‪)Sheves et al‬‬
‫ממכון וייצמן‪.‬‬
‫גידול הארכיאה ‪ S. rubber‬בוצע באינקובציה כאשר מצע הגידול הוכן מהריכוזים הבאים‪:‬‬
‫‪1.25gr ,KCl 5gr/L ,MgCl2·6H2O 20gr/L ,MgSO4·7H2O 25gr/L ,NaCl 195gr/L‬‬
‫‪ 1gr/L ,NaBr 0.65gr/L ,NaHCO3 0.25gr/L ,CaCl2·2H2O‬סוכרוז ובנוסף גרם שמרים ( ‪Yeast‬‬
‫‪ .)Extract‬רמת החומציות (‪ )pH‬במצע הגידול התאמה ל ‪ 7.0‬על ידי הוספת ‪.NaOH‬‬
‫‪ 400‬מ"ל של המדיום עורבב עם ‪ 12‬מ"ל ‪( starter culture‬שעברה ‪ 14‬ימי גידול) וגודלה בכלי‬
‫של שני ליטר מכוסה ברדיד מתכת (תנאי גידול ללא אור) באינקובטור שכוון ל ‪ 37ºC‬תוך ערבוב מתמיד‬
‫למשך שבוע‪ .‬בתום שלב זה הוסף מצע גידול נוסף (עד לכמות של ‪ 9‬ליטר) והגידול המשיך שבוע נוסף‬
‫תחת תנאי אור‪.‬‬
‫לאחר סיום הגידול הממברנות נשתפו עם ‪ dodecylmaltoside 0.01%‬ושלוש בפעמים עם‬
‫‪( DDW‬טיפול זה אינו ממיס את הממברנה אך מוציא חלבונים וליפדים שאינם קשורים לממברנה)‪.‬‬
‫בנוסף על מנת להיפתר מעודפי קרוטן שאינו קשור לחלבון החומר טופל ב ‪ NaBH4‬בריכוז של ‪20mM‬‬
‫בתנאים חושך (על מנת שלא לפגוע בקישור הרטינל)‪ .‬לאחר סיום הניקוי הוספנו לתמיסת החלבון בופר‬
‫‪ )(HOCH2)3CNH2( TRIS‬בריכוז של ‪ 50mM‬על מנת לשמור על ‪ pH‬קבוע של ‪ 8.0‬לאורך הניסוי‪,‬‬
‫היות והחלבון הינו משאבת פרוטונים ולכן רגיש לדרגת החומציות; ‪ 30% w/v‬של סוכרוז על מנת‬
‫להקטין את הפיזור ו ‪ NaCl 100mM‬לייצוב החלבון‪ .‬לקבלת הדוגמה איתה עבדנו‪.‬‬
‫דוגמת הקרוטן המבודד; על מנת לבודד את הקרוטן ל‪ 10‬מ"ל של תמיסת החלבון‪ ,‬הוספו ‪ 20‬מ"ל‬
‫אתנול ‪ 40‬מ"ל אצטון ושני גרם ‪ NaCl‬התמיסה עורבבה בוורטקס והונחה באינקובציה ל ‪ 9.3‬שעות‪.‬‬
‫בסיום ההשרייה מולקולות הקורוטן עברו אקסטרקצייה עם ‪ 930‬מ"ל הקסאן‪ .‬לאחר מיכן הדוגמה נוקתה‬
‫באמצעות פלטת ‪ TLC‬הקסאן‪:‬אצטון ביחס ‪ 9:0‬ואילוציה עם מתנול‪ .‬בסיום התהליך הקרוטן העבר‬
‫לאתנול‪.‬‬
‫התא האופטי ששימש בכל הניסויים הוכן מפלדת אל חלד; התא מצויד בזוג חלונות זכוכית בעובי‬
‫של ‪ 120μm‬ובקוטר של ‪ 12mm‬ובעל דרך האופטית של ‪ .400μm‬במהלך הניסוי הדוגמה רועננה‬
‫באמצעות משאבת מזרק תוצרת עצמית‪ .‬קצב הסירקולציה נבחר כקצב המינימאלי הדרוש על מנת לרענן‬
‫את הדוגמה בין פולס לפולס‪.‬‬
‫‪02‬‬
‫‪ .3‬תוצאות‬
‫על מנת להבין את התהליכים המתרחשים בחלבון ה ‪ XR‬ומקורם‪ ,‬כל מדידות החלבון שביצענו‬
‫כללו גם מדידה השוואתית עוקבת וזהה של מולקולת הקרוטן לבדה (מומסת באתנול)‪ ,‬על מנת שנוכל‬
‫להשוות בין הדינאמיקה של הקרוטן לבדו לעומת הדינאמיקה של הקרוטן בחלבון‪ ,‬וכך ללמוד על אפקטי‬
‫החלבון והאינטראקציות בין שני הצבענים בחלבון הקסנטורודופסין‪.‬‬
‫‪ 3.1‬בליעת מצב היסוד (‪ )ground state absorption‬וספקטרום הקרניים המתקבלות מה‬
‫‪ TOPAS‬ו‪NOPA‬‬
‫ספקטרום הבליעה של חלבון ה‪ XR‬בפאזה מימית ומולקולת ה‪ SX‬באתנול מוצגים באיור ‪.00‬‬
‫כפי שדווח במחקרים קודמים‬
‫‪35‬‬
‫ספקטרום הבליעה בתחום הנראה של החלבון מורכב מתרומות המגיעות‬
‫משני הצבענים המשולבים בו‪ .‬תרומת הרטינל הקשור הינה בליעה רחבה בעלת מקסימום סביב ‪.560nm‬‬
‫בליעה זו מתבטאת ככתף בספקטרום הכולל של החלבון כתוצאה מחפיפה חלקית עם הבליעה של‬
‫מולקולת הקרוטן המתקבלת בשל‬
‫עירור‬
‫מרמת היסוד (‪ )S0‬לרמת‬
‫‪1.0‬‬
‫הסינגלט השנייה (‪ .)S2‬כפי שתואר‬
‫הבליעה של מולקולת הקרוטן כאשר‬
‫‪0.5‬‬
‫היא מחוברת עם מולקולת הרטינל‬
‫לאתר הפעיל של החלבון‬
‫‪Absorption‬‬
‫קודם וניתן לראות כאן‪ ,‬ספקטרום‬
‫מוסט‬
‫לאדום (‪ ,)red shift‬ויותר מובנה‬
‫‪0.0‬‬
‫וויברציונית בהשוואה לספקטרום‬
‫של הקרוטן החופשי המיוצג בקו‬
‫‪700‬‬
‫‪650‬‬
‫‪600‬‬
‫)‪wavelength(nm‬‬
‫אדום‪ .‬בגרף‪ ,‬בנוסף לשני ספקטראות‬
‫הבליעה‪ ,‬מוצג (בכחול) ספקטרום‬
‫הפולס שנוצר בטופז ושימש לעירור‬
‫‪550‬‬
‫‪500‬‬
‫‪450‬‬
‫איור ‪ :00‬ספקטרום המציג את בליעת מצב היסוד של ‪xanthorhodopsin‬‬
‫(שחור) ו‪ salinixanthin‬באתנול (אדום) עם ספקטרום פולס העירור מה‬
‫‪ TOPAS‬ב ‪( 480nm‬כחול) ו ‪( 590nm‬אפור) ומה ‪( NOPA‬ירוק)‪.‬‬
‫שתי הדוגמאות‪ .‬כפי שניתן לראות הפולס מרוכז סביב ‪ ;480nm‬אורך גל זה נבחר על מנת לערר בצורה‬
‫הסלקטיבית ביותר האפשרית את מולקולת הקרוטן בחלבון ה‪ XR‬תוך עירור מינימאלי של מולקולת‬
‫הרטינל‪ ,‬אך למרות זאת‪ ,‬על סמך ספקטרום הבליעה של הרטינל‪ ,‬עדיין יש כ‪ 90%‬עירור ישיר של‬
‫מולקולות הרטינל ממנו לא ניתן להימנע‪.‬‬
‫‪07‬‬
‫‪ 3.1‬ספקטרום טרנזיאנטי‬
‫איור ‪ 01‬מציג מפה תלת מימדית של ספקטראות שינוי טרנזיאנטים ( ‪transient difference‬‬
‫‪ )spectra‬לאחר שעברו תיקון זמן (‪ )time correction‬על מנת לתקן את הדיספרסיה של הקרן הבודקת‪,‬‬
‫עבור ‪( XR‬משמאל) ו ‪ SX‬באתנול (מימין)‪ ,‬בזמני מדידה שונים שהתקבלו מניסוי שבוצע במערך‬
‫ה‪ .TOPAS‬ארבעת הפנלים התחתונים מציג חתכים לפי הזמן של המפה המוצגת מעליו בזמן עלייתו‬
‫ונפילתו של הסיגנל‪ ,‬בהתאם לזמן המופיע במקרא משמאל‪.‬‬
‫איור‪ :01‬מפת מתאר של ספקטראות שינויים טרנזיינטים לאחר ‪ time correction‬עבור זמני בדיקה הנעים בין ‪ -0.2‬ל ‪ 25ps‬עבור‬
‫‪ xanthorhodopsin‬ו ‪ salinixanthin‬לאחר עירור באמצעות פולס המרוכז סביב ‪ .480nm‬הפנלים התחתונים מציגים חתכים במפה‬
‫בעת עלייה וירידה של הסיגנל‪ .‬האיזור הספקטראלי שבין ‪ 470‬ל‪ 490nm‬אינו מוצג בשל הפיזור המגיע מהפולס המעורר‪.‬‬
‫הדמיון הגדול שבין שתי הדוגמאות משקף את התרומה הדומיננטית של הקרוטן לספקטראות‬
‫הטרנזיינטים‪ .‬מיד לאחר העירור מתקבלת עלייה בהעברת האור בשתי הדוגמאות‪ ,‬מהצד הכחול של‬
‫הספקטרום הנבדק עד ל ‪ ,nm 730‬ובצד האדום של הספקטרום מופיעה עליה בבליעה‪ ,‬אלו הן סממני‬
‫רמת ‪ S2‬של הקרוטן‪ .‬סממנים אלו נעלמים במהירות (פחות מ ‪ 70‬פנטושניות) ומפנים את מקומם למאפיין‬
‫הדומיננטי ביותר בדינמיקה ‪ -‬בליעה רחבה של מצב מעורר בתחום בין ‪ 550nm‬ל ‪ .750nm‬כפי שניתן‬
‫להבחין‪ ,‬פס הבליעה מוסט לכחול כאשר הקרוטן משולב בחלבון‪ ,‬בניגוד לבליעה של רמת היסוד‪ ,‬המוסטת‬
‫‪08‬‬
‫לאדום‪ .‬ניתן לראות כי בשתי הדוגמאות‪ ,‬בזמן בנייתה‪ ,‬הרמה מוסטת לכחול‪ .‬התפתחות זו אופיינית‬
‫לירידה בסולם הוויברציוני‪ .‬הסיגנל השלילי בין ‪ 550nm‬לקצה הצד הכחול הנבדק‪ ,‬נובע מירידה באכלוס‬
‫של מצב היסוד כתוצאה מהפולס המעורר ולכן גם ירידה בבליעה של מצב היסוד (לפי חוק בר)‪ ,‬הנראה‬
‫כסיגנל פליטה בספקטרום הטרנזיאנטי (‪ .)bleach‬מאפיינים אלו דועכים בסקאלת זמן של פיקושניות‪,‬‬
‫בעוד ש ב‪ SX‬המערכת חוזרת למצב היסוד והאבולוציה הספקטראלית נגמרת‪ .‬בחלבון‪ ,‬כפי שניתן לראות‬
‫מהפנל התחתון‪ ,‬האבולוציה הספקטראלית ממשיכה; אבולוציה זו מגיעה ממעגל האור של הרטינל ומהווה‬
‫עדות ראשונית למעבר אנרגיה בין הקרוטן לרטינל‪.‬‬
‫‪ 3.1‬התאמה גלובלית – (‪)global fitting analysis‬‬
‫לחקירת הדינאמיקה של המצבים המעוררים בשתי המולקולות‪ ,‬ביצענו התאמה גלובלית‬
‫המשלבת ארבע דרגות של התפתחות ספקטרלית אקספוננציאלית‪ ,‬יחד עם פונקציית גאוסיאן המדמה את‬
‫תגובת המערכת‪.‬‬
‫שתי הדוגמאות הותאמו למודל קינטי רציף הכולל ארבעה שלביים עוקבים‬
‫)‪ )ABCDE‬מהמצב המעורר הראשוני (‪ )A‬עד חזרה למצב היסוד (‪ )E‬לקבלת ספקטראות‬
‫משויכות אבולוציה )‪ .Evolution Associated Difference Spectra (EADS‬כדי להימנע מההשפעה‬
‫של הזוויות בין הצבענים ומנגנוני הרוטציה על הספקטראות המתקבלים‪ ,‬האנליזה בוצעה על תוצאות‬
‫שהוכנו לפי הנוסחה‪(15) :‬‬
‫‪ ODVV  2ODVH ‬‬
‫‪ , ODMagic  ‬במרחב יש שלושה מימדים‬
‫‪‬‬
‫‪3‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫אחד מקביל ושניים מאונכים‬
‫)‪(a‬‬
‫כך שבאמצעות נוסחה זו אנו‬
‫הספקטראות המתקבלים יחד‬
‫עם קבועי הזמן שלהן מוצגות‬
‫באיור ‪:09‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪58fs‬‬
‫‪205fs‬‬
‫‪2.4ps‬‬
‫‪5.8ps‬‬
‫‪-0.05‬‬
‫)‪(b‬‬
‫איני טוען כי מודל‬
‫הקינטיקה‬
‫המולקולארית‬
‫במערכת זו (מודל מדויק יותר‬
‫יובא בהמשך)‪ ,‬אלא שניתן‬
‫להשתמש בו ככלי המאפשר‬
‫את הצגת השלבים השונים‬
‫בהתפתחות‬
‫הספקטראלית‪.‬‬
‫בהתבסס על מחקרים קודמים‬
‫‪0.00‬‬
‫‪68fs‬‬
‫‪365fs‬‬
‫‪2.8ps‬‬
‫‪5.9ps‬‬
‫‪infi.*5‬‬
‫‪720 800‬‬
‫‪-0.10‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪Relative ‬‬
‫רציף‬
‫מתאים‬
‫לתיאור‬
‫‪Relative ‬‬
‫יצרים סט תוצאות איזוטרופי‪.‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪-0.04‬‬
‫‪640‬‬
‫‪560‬‬
‫‪480‬‬
‫)‪Wavelength (nm‬‬
‫איור ‪ :09‬ספקטראות וקצבי הזמן התואמים עבור ‪ )a( salinixanthin‬ו‬
‫‪ )b( xanthorhodopsin‬המתקבלים ממודל רציף עבור תוצאות שהוכנו בזווית קסם‪.‬‬
‫שבוצעו על קרוטנים‪ ,‬אנו משייכים את ‪ EADS‬הראשון (השחור) לרמת ‪ .S2‬הוא מורכב מתרומות‬
‫‪02‬‬
‫הנובעות מריקון רמת היסוד (‪ )ground state bleaching‬בצד הכחול‪ ,‬פליטה מאולצת במרכז‬
‫הספקטרום בשל המעבר ‪ S2-S0‬ובליעה בצד האדום בשל המעבר ‪ .S2-Sn‬בניגוד למצופה‪ ,‬זמן הדעיכה של‬
‫רמה ‪ S9‬שקיבלנו דומה בשתי הדוגמאות (מסדר גודל של כ‪ 20‬פמטושניות)‪ ,‬כאשר הוא אפילו מעט ארוך‬
‫יותר עבור ‪ SX‬בתמיסה‪ .‬תוצאה זו מפתיעה‪ ,‬מכיוון ש ‪ S2‬היא הרמה שממנה זורמת האנרגיה אל הרטינל‬
‫ולכן צפויה להתקצר כתוצאה ממעבר האנרגיה המתחרה עם ההיפוך הפנימי (‪ )IC‬ואדון בה באריכות‬
‫בדיון‪ .‬נקודה נוספת שחשוב לציין הינה שזמן הדעיכה של הרמה קרוב לרזולוציית הזמן המינימאלית‬
‫האפשרית באמצעות מערך ה‪ TOPAS‬ולכן על מנת לחקור רמה זו היה צורך בביצוע ניסוי המתבסס על‬
‫‪ NOPA‬שיתואר בהמשך‪ .‬בשתי הדוגמאות‪ ,‬שלושת הספטקראות הבאים מתארים את האבולוציה‬
‫הספקטרלית אותה עובר הקרוטן בדרכו חזרה למצב היסוד‪ ,‬דרך הרמות החשוכות שתוארו בהקדמה‪.‬‬
‫הספקטראות עצמם מורכבים גם הם‪ ,‬כמו ה ‪ EADS‬הראשון‪ ,‬מסיגנל שלילי בצד הכחול (אורכי גל‬
‫קצרים מ ‪ ,)530nm‬הנובע מירידה באכלוס של מצב היסוד‪ ,‬ובליעה בשאר התחום הספקטרלי הנבדק‬
‫בשל המעבר ‪ .Sx-Sn‬כפי שניתן לראות‪ ,‬ניתוח תוצאות דוגמת ה ‪ ,XR‬מוביל לקבלת ‪ EADS‬נוסף‪ ,‬אותו‬
‫אנו משייכים לצורון ‪ ,K‬המגיע ממעגל האור של הרטינל‪ .‬זוהי עדות נוספת למעבר אנרגיה בין שני‬
‫הצבענים‪ .‬אציין כי הספקטראות המגיעים מהרטינל בזמנים מוקדמים יותר אינם ניתנים להפרדה‬
‫באמצעות מודל רציף‪ ,‬והתרומות המגיעות מהם מעורבבות יחד עם התרומות המגיעות מהקרוטן‪ .‬משום‬
‫כך יש צורך במודל מדויק יותר שיובא בהמשך‪.‬‬
‫‪40‬‬
‫‪ 3.3‬עירור סלקטיבי של הרטינל בחלבון ה ‪XR‬‬
‫בנוסף לעירור הקרוטן באורך גל של ‪ ,480nm‬ביצענו ניסוי נוסף בו עוררנו את מולקולת‬
‫הרטינל ישירות באמצעות עירור סלקטיבי ב ‪( 590nm‬ראה איור ‪ ,)00‬בו ישנה בליעה רק של הרטינל‪.‬‬
‫המוטיבציה בניסוי זה הינה להכיר את הדינאמיקה של האירועים הראשוניים ברטינל לאחר עירור ישר על‬
‫מנת לזהותם ולהשוותם לאלו המתקבלים לאחר העברת אנרגיה מהקרוטן‪.‬‬
‫הפנל העליון (‪ )a‬של איור ‪ 00‬מציג את ספקטרום השינוי הטרנזיאנטי לאחר ‪ 1 ps‬מרגע העירור‪.‬‬
‫בספקטרום המוצג מופיעים מספר פסי בליעה‪ .‬כמו בחלק הקודם‪ ,‬הסיגנל החזק ביותר המגיע מריקון מצב‬
‫היסוד‪ ,‬מופיע כפס בליעה‬
‫המרוכז סביב ‪ ,560nm‬פס‬
‫‪0.003‬‬
‫)‪(a‬‬
‫פליטה רחב בצד האדום –‬
‫מעל ‪ 680 nm‬יחד עם פס‬
‫‪1ps‬‬
‫בליעה בצד הכחול מתחת ל‬
‫‪520nm‬‬
‫שהם‬
‫פסים‬
‫מאפיינים של צורון ‪I‬‬
‫בליעה‬
‫סביב‬
‫‪800‬‬
‫ופס‬
‫)‪Wavelength(nm‬‬
‫‪-0.003‬‬
‫‪=1.2ps‬‬
‫את‬
‫‪-0.006‬‬
‫הדינאמיקה המתקבלת ב ‪560‬‬
‫‪8‬‬
‫‪6‬‬
‫‪ ;nm‬בגרף ניתן לראות את‬
‫העלייה והירידה של הסיגנל‬
‫המגיע מריקון מצב היסוד‬
‫(שחור) והתאמה לפונקצית‬
‫‪OD‬‬
‫התחתון‬
‫‪720‬‬
‫‪560‬‬
‫‪0.000‬‬
‫המאפיין את צורון ‪ .K‬הפנל‬
‫(‪)b‬‬
‫‪640‬‬
‫‪480‬‬
‫)‪(b‬‬
‫‪630nm‬‬
‫מציג‬
‫‪-0.003‬‬
‫‪OD‬‬
‫‪0.000‬‬
‫‪4‬‬
‫)‪Delay time (ps‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫איור ‪ )a(:00‬ספטקרום טרנזיינטי של קסנטורודופסין לאחר ‪ 1ps‬מרגע העירור‬
‫באמצעות פולס המרוכז ב‪ )b( .590nm‬הקינטיקה המתקבלת בעקבות עירור זה‬
‫ב‪ ;560nm‬העקומה האדומה הינה התאמה לדעיכה אקספונציאלית עם קבוע זמן‬
‫של ‪.1.2ps‬‬
‫מעריכית שעברה קונבולוציה עם פונקצית גאוסיאן‪ ,‬המדמה את תגובת המערכת (אדום)‪ .‬כפי שניתן‬
‫לראות‪ ,‬הקינטיקה מתיישבת באופן מושלם עם דעיכה אקספוננציאלית בעלת קבוע דעיכה של ‪.1.9ps‬‬
‫זמן דעיכה זה מיצג את זמן החיים של מצב הסינגלט המעורר מצב (‪ )I‬וישמש אותנו בהמשך ‪.‬‬
‫‪ 3.3‬חקירה באמצעות ברירה פוטונית‬
‫כדי לבודד את תרומתו של הרטינל לספקטראות הטרנזיאנטים‪ ,‬ביצענו את המדידות בקיטובים‬
‫שונים (‪ VV‬ו ‪ )VH‬של הפולס המעורר והבודק‪ .‬ההיגיון שמאחורי ביצוע ניסוי זה הינו כי גם במולקולת‬
‫קרוטן וגם במולקולת הרטינל‪ ,‬כל דיפולי המעבר צפויים להיות בכיוון השלד המצומד (כמו כל מולקולת‬
‫פוליאן)‪ .36‬ולכן בהתאם לפיתוח המתמטי המובא בהקדמה‪ ,‬הסיגנל המגיע ממולקולת הקרוטן והרטינל‬
‫שעוררו ישירות על ידי הפולס המעורר ונאסף בקיטוב מאונך (‪ )VH‬צפוי להיות חלש בפקטור שלוש‬
‫‪41‬‬
‫בהשוואה לסיגנל הנאסף בקיטוב מקביל (‪ .)VV‬לעומת זאת כפי שהראה בהמשך הסיגנל המגיע‬
‫ממולקולת הרטינל שעוררה בעקובת מעבר אנרגיה צפוי לתת יחס שונה בין הקיטובים השונים בהתאם‬
‫לזווית שבין הכרומופורים‪ .‬הכפלת הסיגנל המגיע מהניסוי בקיטוב המאונך בפקטור שלוש והפחתת‬
‫הסיגנל המגיע מהניסוי המקביל (‪ )3ODVHODVV‬צפוי לבודד את הסיגנל המתקבל מהרטינל‬
‫המעורר בעקבות ממעבר אנרגיה‪.‬‬
‫הפנל העליון באיור ‪ 04‬מציג את התוצאות שהתקבלו עבור מולקולת הקרוטן באתנול לאחר ‪1ps‬‬
‫מרגע העירור‪ .‬למרבה ההפתעה‪ ,‬כפי שניתן לראות התוצאות הניסיוניות אינן מתיישבות עם הצפי; הכפלת‬
‫הסיגנל המגיע מהמדידה המאונכת בפקטור שלוש (ירוק) איננה חופפת לסיגנל המגיעה מהמדידה המקביל‬
‫(שחור)‪ .‬כפי שניתן לראות‪ ,‬יחס של אחד לשלוש מתאים לסיגנל המגיע מריקון מצב היסוד (בצד הכחול‬
‫של הספקטראות הנמדדים)‪ ,‬אך‬
‫לא לסיגנל המגיע מהבליעה של‬
‫)‪(a‬‬
‫‪2.3VH‬‬
‫‪3VH‬‬
‫‪VV‬‬
‫הרמה המעוררת בקרוטן‪ ,‬כך שלא‬
‫ניתן לחפוף את הסיגנלים בהכפלה‬
‫יחידה‪ .‬התאמת הסיגנל המגיעה‬
‫‪-0.05‬‬
‫)‪(b‬‬
‫‪2.3 VH -VV‬‬
‫‪2.3 VH‬‬
‫‪3 VH‬‬
‫‪VV‬‬
‫המעבר של הרמות השונות נושא‬
‫בו אדון בהרחבה בהמשך‪.‬‬
‫הצפוי להתקבל ממולקולת הקרוטן‬
‫‪-0.03‬‬
‫שעוררה בעקבות מעבר אנרגיה‬
‫נשתמש‬
‫בנוסחה‬
‫‪2  3cos 2   1 ‬‬
‫‪ , r  t   ‬כפי‬
‫‪‬‬
‫‪5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪‬‬
‫שניתן‬
‫לראות‬
‫האנאיזוטרופיה‬
‫תלויה בזווית שבין דיפולי המעבר‬
‫‪0.03‬‬
‫‪0.00‬‬
‫על מנת לחשב את היחס‬
‫‪2‬‬
‫‪OD‬‬
‫הכפלה בפקטור של ‪( 9.0‬אדום)‪.‬‬
‫‪-‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪0.00‬‬
‫מבליעת המצב המעורר מצריכה‬
‫יחס זה מצביע על זווית בין דיפולי‬
‫‪0.10‬‬
‫‪720 800‬‬
‫‪640‬‬
‫‪560‬‬
‫‪480‬‬
‫)‪Wavelength(nm‬‬
‫איור ‪ :04‬ספקטראות שנלקחו בקיטוב מקביל ומאונך לאחר ‪ 1ps‬מרגע‬
‫העירור בדוגמת סליניקסנטין (‪ )a‬וקסנטורודופסין (‪ .)b‬הקו השחור הינו‬
‫ספקטרום ‪ ,VV‬הקו הירוק הינו ספקטרום ‪ VH‬מוכפל ב ‪ ,0‬הקו האדום הינו‬
‫ספקטרום ‪ VH‬מוכפל ב ‪ 9.0‬והקו הכחול ב (‪ )b‬הינו ההפרש ‪2.3VH-VV‬‬
‫המגיע מהרטינל כתוצאה מהעברת אנרגיה‪.‬‬
‫השונים‪ ,‬הצבת ערך של ‪( 31º‬ערך ממוצע בין המדידות הפלואורוסנטיות לאלה המגיעות מהמדידות‬
‫הקריסטלוגרפיות)‪ ,‬נותן ערך של ‪ r=0.04‬המתורגם ליחס של ‪ 1:1.1‬בין הקיטובים השונים בהתאם‬
‫לנוסחה )‪(16‬‬
‫‪ 2r  1 ‬‬
‫‪ .   ‬משום כך‪ ,‬הסיגנל המגיע מרטינל שלא עורר ישירות‪ ,‬צפוי‬
‫‪‬‬
‫‪ 1 r ‬‬
‫לתת תרומה דומה תחת שני קיטובי הבדיקה‪.‬‬
‫‪49‬‬
‫הפנל התחתון באיור ‪ 04‬מציג את התוצאות שהתקבלו עבור דוגמת החלבון לאחר ‪ 1ps‬מרגע‬
‫העירור‪ .‬השהיה זו נבחרה מכיוון שהעברת האנרגיה כבר התרחשה‪ ,‬אך מעגל האנרגיה של הרטינל רק‬
‫התחיל ולכן ההבדל צריך להיות ניכר‪ .‬כפי שניתן לראות‪ ,‬המגמה נמשכת גם בחלבון; הכפלת הסיגנל‬
‫מהניסוי בו קיטוב הבדיקה מאונך בשלוש מתאים באזור הכחול (בו הסיגנל מגיע מריקון מצב היסוד)‪,‬‬
‫בעוד שבצד האדום יש צורך בפקטור הכפלה נמוך יותר‪ .‬בהתבסס על התוצאות המגיעות מדוגמת הקרוטן‬
‫הנקי קבענו יחס הכפלה של ‪( 9.0‬קו אדום) שאכן גורר התאמה טובה יותר בצד האדום‪ .‬באיור‪ ,‬בנוסף‬
‫לניסוי המקביל ולשתי ההכפלות של הניסוי המאונך‪ ,‬מוצגת גם ההחסרה בין ‪ODVHODVV‬‬
‫(כחול) הצפויה לחלץ את התרומות המגיעות מהרטינל‪ .‬ההחסרה נותנת סיגנל שלילי בעל פיק מרכזי ב‬
‫‪ 560nm‬המגיע מריקון רמת היסוד של הרטינל ומהווה את המאפיין הבולט בספקטרום הטרנזיאנטי של‬
‫הרטינל‪ .‬כפי שראינו בחלק הקודם‪ ,‬בצד הכחול הסיגנל החיובי מגיע מהכפלה בפקטור לא מתאים עבור‬
‫תחום זה (הפקטור המתאים כאן הוא ‪ ,0‬כמו שניתן לראות בדוגמת הקרוטן)‪ .‬אציין כי הכפלה בפקטור‬
‫השונה מ ‪ 0‬גורר מצב בו הסיגנל המגיע מרטינל שעורר ישרות אינו מצטמצם לחלוטין‪ .‬לכן חלק מההפרש‬
‫בין הקיטובים השונים לאחר הכפלה בפקטור מגיע מרטינל שעורר ישירות ולא בלעדית מרטינל שקיבל‬
‫אנרגיה ממולקולת קרוטן‪ .‬לאור האמור‪ ,‬קשה להוציא מגרף זה מסקנות כמותיות לגבי העברת אנרגיה‪ ,‬אך‬
‫בהחלט ניתן לראות בו ראייה חזקה לגבי מעבר אנרגיה בחלבון‪.‬‬
‫‪ 3.3‬ניסוי ‪ NOPA‬ברזולוציות זמן אולטרה גבוהה‪.‬‬
‫כפי שנכתב בהקדמה‪ ,‬רמת ‪ S2‬הינה הרמה האלקטרונית שדרכה זורמת האנרגיה מהקרוטן‬
‫לרטינל‪ ,‬ולכן רמה זו מחזיקה במפתח להבנה מלאה של תהליך העברת האנרגיה בחלבון ה ‪ .XR‬זמן‬
‫האבולוציה הקצר שהתקבל עבור רמת ‪ S2‬בשתי הדוגמאות בניסוי ה ‪ TOPAS‬מעלה את הצורך בשימוש‬
‫בכלים בעלי רזולוציות זמן גבוהה אף יותר‪ ,‬על מנת לנטר את הדינאמיקה של רמה זו באמינות‪ .‬לשם‬
‫ביצוע משימה זו‪ ,‬השתמשנו בפולסי ‪ NOPA‬כדי לערר ולבדוק את הדוגמה‪ .‬שימוש ב‪ NOPA‬לקבלת‬
‫פולסים אולטרה קצרים ‪ -‬כ ‪ - 5 fs‬מאפשרת רזולוציית זמן הנמוכה מ ‪ ,10 fs‬אך מציגה חיסרון גדול‬
‫בדמות פולסים רחבי תדר‪ ,‬לפי עקרון אי הוודאות‪ .‬משום כך‪ ,‬לא ניתן לקבל פולס שיהיה גם קצר בזמן‬
‫וגם צר בתדר‪ .‬ספקטרום פולס ה ‪ NOPA‬שאיתו עבדנו מוצג באיור ‪( 00‬ירוק)‪ .‬כתוצאה מרוחב הפולס‪,‬‬
‫לא ניתן לערר סלקטיבית את הקרוטן ולכן ניתוחנו בפרוט בעיקר את התוצאות שהתקבלו עבור דוגמת ה‬
‫‪ SX‬באתנול‪ ,‬כאשר התוצאות שהתקבלו מהחלבון מוצגות להמחשת הדמיון שבין הדוגמאות בלבד‪ .‬איור‬
‫‪ 03‬מציג את ההתפתחות הקינטית ב ‪( 600nm‬פנל עליון) שנמצא במרכז הבליעה של הרמה החשוכה‪ ,‬וב‬
‫‪( 520nm‬פנל תחתון)‪ ,‬בו ניתן לעקוב אחרי העלייה והדעיכה של הפליטה המאולצת המתקבלת מרמת ‪S2‬‬
‫של הקרוטן‪.‬‬
‫‪40‬‬
‫‪0.03‬‬
‫)‪(a‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.01‬‬
‫‪=21 3fs‬‬
‫‪400‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.00‬‬
‫)‪(b‬‬
‫‪OD‬‬
‫‪300‬‬
‫‪200‬‬
‫‪100‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪=23 5fs‬‬
‫‪400‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪300‬‬
‫‪1250‬‬
‫‪200‬‬
‫‪100‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫‪0‬‬
‫‪500‬‬
‫‪750‬‬
‫]‪Time[fsec‬‬
‫‪250‬‬
‫‪0‬‬
‫איור ‪ :03‬תוצאות מדידת קינטיקת דעיכה ברזולוציית זמן גבוהה בסליניקסנטין‬
‫(שחור) וקסנטורודופסין (כחול) ב ‪)a( 600nm‬ו ‪ .)b( 520nm‬הקו האדום הינו‬
‫התאמת הדינאמיקה בסליניקסנטין עם קונבולוציה של ‪ 14fs‬בשני אורכי הגל‪.‬‬
‫קבוע הזמן המוקדם בשני אורכי הגל הוא כ ‪ 23fs‬עבור ה‪.SX‬‬
‫התאמת הקינטיקה של ה ‪( SX‬שחור) לפונקצית דעיכה בי‪-‬אקספוננציאלית שעברה קונבולוציה‬
‫עם פונקצית גאוסיאן ברוחב של ‪ 14 fs‬המדמה את תגובת המערכת (אדום)‪ ,‬נותנת ערך נמוך בהרבה‬
‫מהצפוי‪ ,‬לא יותר מ ‪ .23 ±5 fs‬אותה תוצאה מתקבלת גם עבור הדינאמיקה המוצגת בפנל העליון‪ ,‬עבור‬
‫עליית הסיגנל המגיע מהרמות החשוכות אליהן זורמת האנרגיה מרמת ‪ .S2‬כפי שניתן לראות באיור‪ ,‬על‬
‫הסיגנל בשני אורכי הגל רוכבות‬
‫מודולציות‬
‫הנובעות‬
‫מתנודות‬
‫‪1518‬‬
‫‪SX‬‬
‫‪1155‬‬
‫)‪(A‬‬
‫מחזוריות המגיעות מוויברציות של‬
‫(באמצעות הפחתת הדינאמיקה –‬
‫‪XR‬‬
‫הפחתת הקו האדום מהשחור באיור‬
‫‪)03‬‬
‫ושימוש‬
‫באנליזת‬
‫‪1157‬‬
‫‪1516‬‬
‫)‪(B‬‬
‫)‪Fourier power (a.u.‬‬
‫מצב היסוד‪ .‬לאחר בידוד תרומתן‬
‫פורייה‬
‫(‪ )Fourier‬התקבלו הספקטראות‬
‫המוצגים באיור ‪ .02‬כפי ניתן‬
‫לראות‪ ,‬שתי הדוגמאות מציגות שני‬
‫אופני תנודה עיקריים ב ‪1156 cm-1‬‬
‫‪2000‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪500‬‬
‫‪-1‬‬
‫) ‪Freq (cm‬‬
‫איור ‪ :02‬ספקטרום ראמאן וויברציוני שחולץ באמצעות טרנספורם פורייה‬
‫על קינטיקה ב ‪ 560nm‬ב סליניקסנטין )‪ (a‬וקסנטורודופסין )‪.(b‬‬
‫ו ‪ 1518 cm-1‬המשויכים למתיחת הקשרים ‪ C=C‬ו ‪ C-C‬בהתאמה‪.37‬‬
‫‪44‬‬
‫כתוצאה ממשך הזמן הקצר של הפולסים‪ ,‬בזמנים קצרים מופיעים סיגנלים שמקורם מהתאבכות‬
‫בין שני הפולסים ומתגובות לא ליניאריות בממס ועל זכוכית התא‪ .39,38‬מכיוון שהתוצאות המעניינות‬
‫בניסוי‬
‫ה‪NOPA‬‬
‫מגיעות‬
‫דווקא‬
‫אמינות‬
‫התוצאות‬
‫‪Normalized OD‬‬
‫מזמנים קצרים אלו‪ ,‬יש צורך לבסס את‬
‫)‪(a‬‬
‫שהתקבלו‬
‫ברזולוציית הזמן הגבוהה‪ .‬כדי לבצע‬
‫זאת‪ ,‬נשווה את התוצאות שהתקבלו‬
‫בניסוי זה‪ ,‬עם אלו שהתקבלו באמצעות‬
‫‪NOPA data‬‬
‫‪TOPAS data‬‬
‫‪convoluted NOPA data‬‬
‫‪400‬‬
‫‪600‬‬
‫‪200‬‬
‫)‪Delay time (fs‬‬
‫ה‪ TOPAS‬עם רזולוציית זמן נמוכה‪,‬‬
‫הן במרחב הזמן והן במרחב התדר‪ ,‬כפי‬
‫‪0‬‬
‫)‪(b‬‬
‫‪10 fsec‬‬
‫שניתן לראות באיור ‪ .07‬בפנל העליון‬
‫בגרף מוצגת ההתפתחות הספקטרלית‬
‫כפי שנמדדה בשתי המערכות‪ ,‬באורך‬
‫‪0.01‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪TOPAS data‬‬
‫‪NOPA data‬‬
‫‪-0.02‬‬
‫ונפילתו של סיגנל הפליטה המאולצת‬
‫‪0.00‬‬
‫מרמה ‪ ,S2‬שמסתיים בסיגנל המגיע‬
‫‪-0.03‬‬
‫מריקון מצב היסוד‪ .‬בנוסף לשתי‬
‫‪0.03 1 psec‬‬
‫העקומות המגיעות מהמערכות השונות‪,‬‬
‫מוצגת בגרף עקומה נוספת המציגה את‬
‫‪0.00‬‬
‫תוצאת ניסוי ‪ NOPA‬לאחר שעברה‬
‫‪-0.03‬‬
‫קונבולוציה עם פונקציית גאוסיאן‬
‫בעלת רוחב בחצי גובה של ‪ .80fs‬כפי‬
‫שניתן לראות‪ ,‬לאחר המניפולציה‬
‫המתמטית‪ ,‬שני הקווים חופפים בצורה‬
‫מושלמת‪ ,‬עדות לכך כי ההבדל היחיד‬
‫שבין הניסויים מגיע מרזולוציית הזמן‬
‫‪mOD‬‬
‫גל של ‪ ,520nm‬המציגה את עלייתו‬
‫‪0.03 100 fs‬‬
‫‪650‬‬
‫‪625‬‬
‫‪600‬‬
‫‪575‬‬
‫‪550‬‬
‫)‪wavelength(nm‬‬
‫‪525‬‬
‫איור ‪ :07‬קינטיקה וספקטראות טרנזיאנטים של ‪ salinixanthin‬כפי‬
‫שנמדדו באמצעות ה‪ TOAPS‬וה‪ (a) .NOPA‬קינטיקה ב ‪520nm‬‬
‫שנמדדה ב ‪( TOPAS‬כחול)‪( NOPA ,‬שחור)‪ ,‬פונקצית גאוסיאן עם‬
‫רוחב של ‪ ,FWHM 80fs‬וסיגנל ה‪ NOPA‬לאחר קונבולוציה עם‬
‫פונקצית הגאוסיאן‪ ,‬המדמה הרחבה בזמן (אדום)‪ )b( .‬ספקטרום‬
‫טרנזיאנטי בשלושה זמנים שונים מרגע העירור‪ ,‬כפי שהתקבלו‬
‫מה‪( TOAPS‬שחור) וה‪( NOPA‬אדום)‪.‬‬
‫השונה‪ .‬שלושת הפנלים התחתונים‬
‫מציגים השוואה של הספקטראות הטרנזיינטים בזמנים שונים‪ ,‬כפי שהתקבלו ב ‪ NOPA‬עם הספקטרום‬
‫האקוויוולנטי ממערכת ה‪ .TOPAS‬הזמנים השונים נבחרו‪ ,‬שכן בכל אחד מהם הספקטרום מגיע מתרומה‬
‫עיקרית של אחד ממצבי המעבר; לאחר ‪ 10fs‬רוב התרומה מרמת ‪( S2‬אציין כי ספקטרום זה דומה‬
‫להפליא לספקטרום ה‪ EADS‬הראשון שיוצג בהמשך)‪ ,‬לאחר ‪ 10fs‬רוב התרומה מרמת ‪ S1‬חמה‬
‫וויברציונית ולאחר ‪ 1ps‬התרומה מגיעה מרמת ‪ .S1‬התוצאות מראות התאמה טובה בין שתי המערכות‬
‫בשלושת הזמנים השונים‪ ,‬ומוכיחות כי המצבים המעוררים והדינאמיקה שלהם זהה‪ ,‬למרות העירור‬
‫והבדיקה השונה‪ .‬ראיה נוספת לכך שמדובר בהתפתחות ספקטראלית אמיתית מגיעה מכך שהיא איננה‬
‫‪43‬‬
‫נעלמת כאשר משמשים בקיטוב בדיקה מאונך‪ ,‬אלא מפגינה את ההיחלשות הצפויה בפקטור ‪ ,0‬בעוד‬
‫שלעומתו ל סיגנלים שמקורם מהתאבכות בין שני הפולסים ומתגובות לא ליניאריות בממס‪ ,‬תלות חזקה‬
‫יותר בקיטובי הבדיקה‪ .‬לכן‪ ,‬אין לחשוד כי התוצאות המתקבלות בניסוי ה‪ NOPA‬מגיעות מאפקטים‬
‫שאינם קשורים לפוטוכימיה של הרטינל והחלבון‪.‬‬
‫‪ 3.3‬התאמה למודל ‪Target analysis‬‬
‫כפי שנאמר בסעיף ‪ ,4.0‬מודל רציף אינו יכול לתאר בצורה נכונה דינאמיקה הכוללת מעבר‬
‫אנרגיה‪ ,‬מכיוון שתהליכים אלו כוללים נקודת הסתעפות‪ ,‬בה המודל אינו מתחשב‪ .‬ולכן ה‪EADS‬‬
‫המוצגים אינם מייצגים את הספקטראות האמיתיים של מצבי הביניים המעורבות בתהליך‪ .‬למעשה‪,‬‬
‫מחקרים חדשים מגלים כי גם הפוטוכימיה של הקרוטן החופשי איננה חפה מהסתעפויות‪ ,‬ומצריכה גם היא‬
‫מודל מסועף על מנת לנתח את התוצאות כראוי‪ .‬נתחיל את האנליזה עם התוצאות המתקבלות מהקרוטן‬
‫המבודד בו המודל פחות מורכב‪ .‬כפי שתואר בהקדמה‪ ,‬המבנה האלקטרוני של מולקולת הקרוטן משמש‬
‫קרקע פורייה לויכוחים בשני העשורים האחרונים‪ ,‬כאשר המודל בו השתמשנו בניתוח מסתמך על מספר‬
‫שפורסמו‬
‫מאמרים‬
‫‪Scheme 2‬‬
‫לאחרונה בנוגע לרמות‬
‫הסינגלט‬
‫הנמוכות‪,8,4‬‬
‫ובהמשך‬
‫את‬
‫*‪k‬‬
‫הבחירה בו וניתן סימוכין‬
‫*‪S‬‬
‫נצדיק‬
‫‪S2‬‬
‫מהתוצאות שלנו‪ .‬המודל‬
‫הסיעוף‬
‫דעיכת‬
‫מתרחש‬
‫רמת‬
‫השנייה‬
‫מעוררים‪,‬‬
‫עם‬
‫הסינגלט‬
‫אליה‬
‫‪J/S1‬‬
‫המערכת יכולה לחזור‬
‫‪h‬‬
‫‪k1‬‬
‫*‪S‬‬
‫‪k2‬‬
‫‪kI‬‬
‫‪S1‬‬
‫‪h‬‬
‫‪k4‬‬
‫‪k3‬‬
‫‪k3‬‬
‫‪T‬‬
‫‪S0‬‬
‫אנו‬
‫כאשר‬
‫*‪k‬‬
‫‪R‬‬
‫‪S1‬‬
‫‪k4‬‬
‫‪S2‬‬
‫‪kET‬‬
‫‪k1‬‬
‫‪k2‬‬
‫מוצג בסכמה ‪ 1‬של איור‬
‫‪ .08‬כפי שניתן לראות‪,‬‬
‫‪Scheme 1‬‬
‫‪K‬‬
‫‪S0‬‬
‫איור ‪ :08‬סכמת זרימת האנרגיה במודל ששימש לצורך ‪ Target analysis‬עבור‬
‫סליניקסנטין (‪ )scheme 1‬וקסנטורודופסין (‪.)scheme 2‬‬
‫למצב היסוד באחת משתי הדרכים המתוארות בסכמה; או דרך רמת ‪ S1‬או דרך רמת *‪.S‬‬
‫על מנת לקבל את הספקטראות האופייניים המתאימים לרמות האנרגיה השונות של מולקולת הקרוטן ‪-‬‬
‫)‪ Species Associated Difference Spectra (SADS‬נבצע ‪ target analysis‬על התוצאות שהוכנו ב‬
‫‪ magic angle‬עבור הקרוטן המבודד‪ ,‬בהתאם למודל המוצע בסכמה הראשונה‪ .‬לצורך ביצוע האנליזה יש‬
‫לבצעה מספר הנחות על מנת לצמצם את דרגות החופש ולפשט את הבעיה; אנו מזניחים בליעה של רמת‬
‫‪ S1‬ו*‪ S‬בצד הכחול של הספקטרום ‪ -‬בתחום ‪ – 430-500nm‬כך שהסיגנל באזור זה מגיע אך ורק‬
‫‪42‬‬
‫כתוצאה מריקון מצב היסוד‪ .‬הנחה זו מגובה על ידי התוצאות הניסיוניות שקיבלנו‪ ,‬בהן ניתן לראות כי‬
‫החל מ ‪ 100fs‬ניתן לחפוף את הספקטראות הטרנזיאנטים באזור זה על ידי הכפלה בקבוע‪ .‬תחת הנחה זו‬
‫בוצעה האנליזה לקבלת ‪ SADS‬וקבועי הזמן הנותנים את ההתאמה הטובה ביותר לתוצאות הניסיוניות‪.‬‬
‫הספקטראות המתקבלים מופיעים באיור ‪ 02‬בפנל העליון‪ ,‬כאשר השיוך לרמות מופיע במקרא משמאל‬
‫וקבועי הקצב מפורטים בטבלה ‪ .1‬כפי שניתן לראות‪ ,‬בהתאם להנחה‪ ,‬בצד הכחול הסיגנלים המתקבלים‬
‫מרמות ‪ S1‬ו*‪ S‬יושבים אחד על השני אך רמת ‪ S2‬נותנת סיגנל נמוך יותר באזור זה‪ .‬אנו מאמינים כי‬
‫תופעה זו נגרמת בשל רזולוציות זמן המכשיר שאיננה מספיקה (כפי שראינו בניסוי ה‪ )NOPA‬ולכן‬
‫גורמת להערכת זמן חיים ארוך יותר ובהתאם לסיגנל להיראות כחלש יותר ממה שהוא באמת‪ .‬נקודה‬
‫נוספת בה ניתן להבחין היא כי הסיגנל המגיע מריקון מצב היסוד הינו בעל מיבנה ברור הנובע מפסי משנה‬
‫ווברציונים ברמת *‪ S‬לעומת שאר הרמות‪ ,‬בהן אפקט זה אינו בולט‪ ,‬נקודה זו משמעותית ואדון בה‬
‫בהמשך‪ .‬כל קבועי הקצב שהתקבלו למעט קבוע הקצב ‪ ,k1‬בו אדון בהרחבה בהמשך‪ ,‬הינם אופייניים‬
‫לדינאמיקה מושרית אור בקרוטן בעל ‪ 11‬קשרים כפולים מצומדים‪ .40‬באמצעות ההנחה כי בצד הכחול‬
‫של הספקטרום התרומה היחידה לספקטרום מגיעה מריקון מצב היסוד‪ ,‬חישבנו את מקדמי הבליעה‬
‫(‪ )extinction coefficients‬של צורוני הביניים השונים‪ ,‬מתוך מקדם הבליעה של מצב היסוד כפי שניתן‬
‫לראות באיור‪:‬‬
‫‪S2‬‬
‫)‪(a‬‬
‫‪180‬‬
‫‪S1hot‬‬
‫‪S1‬‬
‫‪90‬‬
‫*‪S‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪-180‬‬
‫‪-1‬‬
‫‪180‬‬
‫‪3‬‬
‫‪S2‬‬
‫)‪(b‬‬
‫‪S1hot‬‬
‫‪S1‬‬
‫*‪S‬‬
‫‪R‬‬
‫‪S1 /I‬‬
‫‪90‬‬
‫‪K*5‬‬
‫‪0‬‬
‫) ‪ 10 (M cm‬‬
‫‪-90‬‬
‫‪-90‬‬
‫‪-180‬‬
‫‪800‬‬
‫‪720‬‬
‫‪640‬‬
‫‪560‬‬
‫‪480‬‬
‫)‪Wavelength (nm‬‬
‫איור ‪ SADS :02‬עבור המצבים המעוררים ב ‪ salinixanthin‬באתנול )‪ (a‬ו‬
‫‪ (b) xanthorhodopsin‬כפי שחולצו בהתאם למודל באיור ‪ .01‬מקדמי הבליעה‬
‫(‪ )extinction coefficients‬חושבו מתוך הסיגנל המגיע מריקון מצב היסוד‪.‬‬
‫כפי שציינתי‪ ,‬יחס הדהפולריזציה שקיבלנו עבור התוצאות הניסיוניות איננו תואם את ציפיותינו‪.‬‬
‫כדי להתעמק בנקודה זו השתמשנו בתוצאות ה ‪ ,target analysis‬שכאמור‪ ,‬בוצעו על תוצאות שהוכנו ב‬
‫‪47‬‬
‫‪ ,magic angle‬על מנת למצוא את תלות הפולריזציה באורכי הגל של צורוני הביניים השונים‪ .‬התוצאות‬
‫שנלקחו במקביל (‪ )VV‬נותחו בהתאם לסכמה ‪ 1‬כאשר קבועי הקצב שהתקבלו באנליזה הקודמת שימשו‬
‫כפרמטרים קבועים בניתוח החדש‪ .‬ה‪ SADS‬בקיטוב המאונך (‪ )VH‬הוכן מתוך שתי האנליזות הקודמות‬
‫לפי‬
‫‪3SADSMagic  SADSVV‬‬
‫‪2‬‬
‫‪. SADSVH ‬‬
‫‪720‬‬
‫על מנת למזער את היחס סיגנל\רעש‬
‫‪660‬‬
‫‪600‬‬
‫‪540‬‬
‫‪480‬‬
‫‪4‬‬
‫‪H‬‬
‫‪s1‬‬
‫התאמנו את ה ‪ EADS‬בקיטוב מאונך‬
‫‪3‬‬
‫לאלה שהוכנו בקיטוב מקביל באמצעות‬
‫‪2‬‬
‫הנוסחה‬
‫‪C‬‬
‫‪s1‬‬
‫הפולינום המתקבל הינו אחד חלקי יחס‬
‫‪3‬‬
‫‪ 1 ‬‬
‫‪ . ‬באיור ‪ ,40‬ניתן‬
‫הדהפולריזציה‬
‫‪     ‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪2‬‬
‫*‪s‬‬
‫‪P(‬‬
‫)‪. SADSVH  SADSVV  polyn    (17‬‬
‫‪4‬‬
‫‪4‬‬
‫לראות את יחס הדהפולריזציה של הרמות‬
‫‪3‬‬
‫‪ S1 , S1h‬ו *‪ S‬כתלות באורך הגל המושג‬
‫מההתאמה‪ ,‬יחד עם היחס המתקבל מחלוקת‬
‫ה‪ SADS‬באורכי הגל המתקבלים במקביל‬
‫באלו המתקבלים במאונך‪ .‬כפי שניתן‬
‫לראות‬
‫עבור‬
‫הדהפולריזציה‬
‫שלוש‬
‫הרמות‪,‬‬
‫המתקבל‬
‫איננו‬
‫יחס‬
‫שלוש‬
‫‪2‬‬
‫‪720‬‬
‫‪660‬‬
‫‪600‬‬
‫‪540‬‬
‫‪480‬‬
‫)‪Wavelength(nm‬‬
‫איור ‪ :40‬יחס בין עירור מקביל (‪ )VV‬למאונך (‪ )VH‬של ה‬
‫‪ SADS‬השונים עבור ‪ salinixanthin‬באתנול כפי שחולצו‬
‫באמצעות התאמה גלובלית‪ .‬היחס הוחלק באמצעות סידרה של‬
‫פולינומים כפונקציה של אורך הגל‪.‬‬
‫כמצופה‪ ,‬אלא ‪ . ~2.3‬ערך כזה עבור יחס‬
‫הדהפולריזציה‪ ,‬מצביע על זווית בין דיפולי המעבר ‪ S0-S2‬ו ‪ ,S1/S*-Sn‬נושא שיידון בהרחבה בדיון‪ .‬לא‬
‫בוצעה על החלבון אנליזה דומה‪ ,‬עקב הסיבוכיות שנגרמת כתוצאה מהכרומופור הנוסף‪ ,‬המקשה על קבלת‬
‫יחס דהפולריזציה נכון‪ ,‬אבל כפי שניתן לראות באיור ‪ 49‬בפנלים התחתונים‪ ,‬התופעה איננה נעלמת‬
‫כאשר הקרוטן נקשר לחלבון‪.‬‬
‫ביצוע ‪ Target analysis‬על תוצאות חלבון ה‪ XR‬הינו מעט מורכב יותר ומחייב את הוספת‬
‫הענף שנוסף לדיאגרמת הרמות עבור העברת האנרגיה לרטינל כפי שמתואר בסכמה ‪ 9‬של איור ‪ .08‬על‬
‫מנת להשתמש בסכמה זו יש להוסיף הנחות לספקטראות המתקבלים מהמודל‪ .‬בנוסף להנחה שתוארה‬
‫קודם עבור הסיגנל הזהה בצד הכחול עבור ‪ SADS‬של רמות האנרגיה של הקרוטן‪ ,‬הוספנו את ההנחה כי‬
‫ב ‪ SADS‬של רמת ‪ S1‬של הרטינל‪ ,‬הסיגנל המגיע מריקון רמת היסוד ב ‪ 570nm‬שווה לשליש מהסיגנל‬
‫המגיע מריקון רמת היסוד של הקרוטן ב ‪ ;460nm‬הנחה זו מתבססת על ספקטרום הבליעה של החלבון‬
‫‪48‬‬
‫המוצג באיור ‪ .00‬הנחה נוספת אותה בצאנו הינה כי קבוע הזמן ‪( kI‬זמן דעיכת המצב המעורר במולקולת‬
‫הרטינל) הינו‪ ,1.2 psec‬ערך זה מגיעה מהניסוי בו הרטינל עורר ישירות‪ .‬כמו כן‪ ,‬הנחנו בהתאם‬
‫לספקטרום הבליעה‪ ,‬כי ‪ 90%‬מהעירור הינו עירור ישיר של הרטינל כתוצאה מההקרנה‪ .‬תוצאות האנליזה‬
‫מוצגות בפנל התחתון באיור ‪ 02‬וקבועי הזמן מוצגים בטבלה ‪ .1‬העלייה במבניות ספקטראות ה‪SADS‬‬
‫הנצפית עבור רמות האנרגיה של הקרוטן הקשור לחלבון לעומת הרמות המקבילות בקרוטן החופשי‪,‬‬
‫מתאימה למבניות של רמת היסוד כפי שניתן לראות בספקטרום הבליעה באיור ‪ .00‬תוצאות נוספות‬
‫המתקבלות מהאנליזה‪ ,‬הינן יחסי ההסתעפות מרמה ‪ S2‬וקבועי זמני הרלקסציה של הרמות השונות‪ .‬טבלה‬
‫‪ 1‬מלמדת כי הקרוטן הכלול בחלבון כמעט שאינו שונה מקרוטן חופשי בכל הנוגע לזמני הדעיכה של‬
‫הרמות השונות‪ ,‬אך במפתיע‪ ,‬יחסי הסיעוף משתנים דרמטית עם הקשירה לחלבון‪ .‬עבור הקרוטן החופשי‬
‫– באתנול קבלנו יחס הסתעפות של ‪ 70‬ל ‪ 30‬בין ה ‪ S1‬ל *‪ S‬בהתאמה‪ ,‬בעוד שבחלבון‪ ,‬היחס המתקבל‬
‫הינו ‪ 20/45/35‬בין ‪ S* ,S1‬והרטינל בהתאמה‪ .‬כפי שניתן לראות‪ ,‬החיבור לחלבון מעלה את סיכויי‬
‫המעבר לרמת *‪ S‬למרות הוספת ערוץ אנרגיה מתחרה‪ .‬ניתוח דומה לתוצאות המקבלות מניסוי ה‪NOPA‬‬
‫לא בוצע מכיוון שאין לנו כיסוי ספקטראלי מספיק‪.‬‬
‫טבלה ‪:1‬‬
‫‪XR‬‬
‫‪SX/ethanol‬‬
‫‪333±52 fs‬‬
‫‪256±29 fs‬‬
‫‪2.8±0.4 ps‬‬
‫‪154±24 fs‬‬
‫‪5.9±0.7 ps‬‬
‫‪192±30 fs‬‬
‫‪1.2 ps‬‬
‫‪85±12 fs‬‬
‫‪205±18 fs‬‬
‫‪2.4±0.1 ps‬‬
‫‪221±33 fs‬‬
‫‪5.8±0.5 ps‬‬
‫‪42‬‬
‫‪Material‬‬
‫‪Rate‬‬
‫‪constant‬‬
‫‪k1-1‬‬
‫‪k2-1‬‬
‫‪k3-1‬‬
‫‪k*-1‬‬
‫‪k4-1‬‬
‫‪kET-1‬‬
‫‪kI-1‬‬
‫‪ .3‬דיון בתוצאות‬
‫התוצאות שלנו מראות כי אכן‪ ,‬מולקולת הקרוטן משמשת כאנטנה לאיסוף אור בחלבון‬
‫הקסנטורודופסין וכי המעבר מתבצע מרמת ‪ S2‬של הקרוטן אל רמת ‪ S1‬של הרטינל‪ .‬בנוסף ליכולתם‬
‫לאפשר לנו לראות את הסיגנל המתקבל‬
‫ישירות (כפי שניתן לראות באיור ‪)04‬‬
‫)‪(a‬‬
‫‪VV‬‬
‫‪VH‬‬
‫המדידות שנעשו בקיטוב מקביל ומאונך‬
‫‪0.003‬‬
‫‪OD‬‬
‫(‪ VV‬ו ‪ )VH‬מאפשרות לנו לבצע מדידה‬
‫‪0.002‬‬
‫כמותית בלתי תלויה לגבי יעילות תהליך‬
‫העברת האנרגיה‪ .‬איור ‪ 41‬מציג את‬
‫‪0.001‬‬
‫הספקטרום המתקבל בשני הקיטובים ואת‬
‫האנאיזוטרופיות הנגזרת ממנו כתלות‬
‫‪0.5‬‬
‫)‪(b‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪ 30ps‬לאחר רגע העירור‪ ,‬זמן רב לאחר‬
‫‪0.2‬‬
‫שהפוטוכימיה של הקרוטן נגמרה‪ ,‬כך‬
‫‪0.1‬‬
‫שהסיגנל המוצג בגרף מגיע מצורון ‪K‬‬
‫במעגל האור של הרטינל בלבד‪ .‬תוצר‬
‫"‪ "K‬יכול להתקבל לאחר עירור חלבון ה‬
‫‪ XR‬משני תהליכים‪ ,‬עירור ישיר של‬
‫)‪r(‬‬
‫באורך הגל עבור זמנים ארוכים – מעל‬
‫‪0.3‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪660‬‬
‫‪680‬‬
‫‪640‬‬
‫‪600‬‬
‫‪620‬‬
‫)‪Wavelength (nm‬‬
‫‪580‬‬
‫איור ‪ )a( :41‬ספקטראות תוצר ‪ K‬שנמדד ‪ 30ps‬לאחר רגע העירור‬
‫בקיטוב מקביל (שחור) ומאונך (אדום) לאחר עירור דוגמת ה‪ XR‬ב‬
‫‪ )b( .480nm‬האנאיזוטרופיה המתקבלת בזמן זה כתלות באורך הגל‪.‬‬
‫הרטינל או עירור הקרוטן ולאחריו העברת אנרגיה לרטינל‪ .‬כפי שניתן לראות‪ ,‬ערך האנאיזוטרופיות‬
‫שמתקבל עבור צורון זה הינו ‪ .r = 0.2‬כפי שהוסבר בהקדמה‪ ,‬עירור ישיר של הרטינל צפוי לתרום יחס‬
‫אנאיזוטרופיות של ‪ 0.4‬עבור כל צורוני הרטינל המעוררים‪ .‬אך מהו ערך האניזוטרופיה עבור תוצר ‪K‬‬
‫שהתקבל כתוצאה מהעברת האנרגיה? כדי לענות על שאלה זו נעזר בנוסחה‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪. r  0.2 3cos2   1‬‬
‫כפי שניתן לראות‪ ,‬ערך האנאיזוטרופיה עבור צורון ‪ K‬תלוי בזווית שבין הרטינל לקרוטן‪ .‬כפי שהוזכר‪,‬‬
‫זווית של ‪ 46º‬נמדדה בין שני צירי המולקולות במחקר קריסטלוגרפי שפורסם לאחרונה‪ ,‬כאשר מדידות‬
‫פלואורסנציה מקוטבות מדדו ערך של ‪ 56º‬עבור זווית זו‪ .‬הצבת זווית ממוצעת של ‪ 51º‬בנוסחה נותנת את‬
‫ערך האנאיזוטרופיה של ‪ 0.04‬עבור צורון ‪ K‬שנוצר בעקבות מעבר אנרגיה‪ .‬מכיוון שהסיגנל המתקבל‬
‫עבור צורון ‪ K‬מורכב מחיבור התרומות של כל אחד מערוצי יצירתו‪ ,‬נוכל לכתוב‪:‬‬
‫‪Acar‬‬
‫‪Aret‬‬
‫‪ 0.04 ‬‬
‫‪ 0.4  0.2‬‬
‫‪Aret  Acar‬‬
‫‪Aret  Acar‬‬
‫‪r‬‬
‫כאשר ‪ Acar‬ו ‪ Aret‬הם אוכלוסיות הקרוטן והרטינל המעוררות ישירות בהתאמה ו ‪ ‬היא יעילות העברת‬
‫האנרגיה בין הקרוטן לרטינל‪ .‬הצבת ‪ 0.25Acar= Aret‬כפי שהוסק מספקטרום הבליעה‪ ,‬נותנת משוואה‬
‫עם נעלם אחד‪ ,‬שפתרונה מגלה כי יעילות העברת האנרגיה הינה ‪ .=0.32‬ערך זה מתיישב היטב עם‬
‫‪30‬‬
‫יעילות העברת אנרגיה של ‪ 0.03‬שהתקבלה מה ‪ .target analysis‬מכיוון שההנחות ששימשו במודל לא‬
‫שימשו בחישוב הנ"ל‪ ,‬הוא מהווה מדידה בלתי תלויה עבור היעילות הקוונטית של תהליך העברת‬
‫האנרגיה מהקרוטן לרטינל‪.‬‬
‫מידע נוסף אותו נוכל לחלץ מהמדידות הקיטוב‪ ,‬מגיע מה ‪ ,target analysis‬כפי שתואר בחלק הקודם‪.‬‬
‫כפי שניתן לראות מניתוח מדידות הקרוטן‪ ,‬שני ה ‪ SADS‬המשויכים לרמת ‪ S1‬החמה והקרה וויברציונית‪,‬‬
‫ערך‬
‫מקבלים‬
‫אנאיזוטרופיות‬
‫של‬
‫תוצאה‬
‫זהה‬
‫‪.0.0‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪2000‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪500‬‬
‫‪2000‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪(b‬‬
‫‪1500‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪0‬‬
‫‪500‬‬
‫)‪(a‬‬
‫‪0.01‬‬
‫‪0.02‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫האנרגיה המשויכת ל‬
‫*‪ .S‬חוסר ההתאמה‬
‫בין‬
‫כיוון‬
‫דיפולי‬
‫המעבר של הרמות‬
‫נוספים‬
‫‪-0.02‬‬
‫)‪(d‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪150‬‬
‫‪100‬‬
‫‪50‬‬
‫)‪(c‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪0‬‬
‫‪150‬‬
‫‪100‬‬
‫‪50‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.4‬‬
‫)‪r(t‬‬
‫השונות נצפה במספר‬
‫קרוטנים‬
‫‪-0.01‬‬
‫‪OD‬‬
‫מתקבלת גם עבור רמת‬
‫‪0.3‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪ ,43,42,41‬אך לא הוצע‬
‫מנגנון‬
‫לתופעה‪.‬‬
‫או‬
‫איור‬
‫הסבר‬
‫‪49‬‬
‫מציג את הדינאמיקה‬
‫‪1200‬‬
‫‪800‬‬
‫‪400‬‬
‫)‪Delay time (fs‬‬
‫‪0‬‬
‫‪1200‬‬
‫‪800‬‬
‫‪400‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪Delay time (fs‬‬
‫איור ‪ :49‬דינאמיקת דעיכה ב ‪ 550nm‬כפי שנמדדה בקיטוב במקביל (שחור) ומאונך‬
‫(אדום) עבור ‪ )a( SX‬ו ‪ )c( .)b(XR‬ו)‪ (d‬האנאיזוטורופיה המתקבלת משתי הדוגמאות‪.‬‬
‫ואת האנאיזוטרופיה הנגזרת ממנה‪ ,‬כפי שנמדדה ב ‪ .550nm‬אורך גל זה נבחר מכיוון שהוא מכיל סיגנל‬
‫ניכר גם מרמת האנרגיה ‪ S2‬בזמנים קצרים (פליטה מאולצת) וגם מרמות ‪( S*/S1‬בליעה) בזמנים‬
‫מאוחרים יותר‪ .‬כפי שניתן לראות באיור‪ ,‬תחילה אנו מקבלים ערך אנאיזוטרופיה של ‪ 0.4‬כצפוי‪ ,‬אלא‬
‫שלאחר כ ‪ ,50 fs‬ישנו שינוי פתאומי שבסופו האנאיזוטרופיה מתייצבת על ערך של ‪ .0.0‬השינוי עצמו‬
‫אינו חלק‪ ,‬מכיוון שהדינאמיקה כוללת מעבר דרך האפס‪ ,‬עם מעבר האוכלוסייה מרמה ‪ S2‬לרמות ‪,S*/S1‬‬
‫הגורם לחלוקה במספר הקרוב לאפס בהתאם לנוסחת האנאיזוטרופיה‪ .‬בדוגמת החלבון‪ ,‬בעוד שהערכים‬
‫הסופיים זהים‪ ,‬המעבר עצמו איטי יותר‪ ,‬כנראה בשל החפיפה עם הסיגנל המגיע מהרטינל‪.‬‬
‫באמצעות נוסחה ‪ 2‬נוכל לחשב את הזווית שבין דיפולי המעבר של המעברים ‪ S0→S2‬ו‬
‫‪ S2→Sn‬לאלו שבין ‪ S1→Sn‬ו‪ .S*→Sn‬הצבת ערך ‪ r=0.3‬נותנת זווית של ‪ 24º‬בין דיפולי המעבר‪.‬‬
‫למרות שאין ברשותי פיתרון מניח את הדעת לתופעה‪ ,‬אתייחס למספר הסברים אפשריים; מכיוון שעבור‬
‫פוליאנים‪ ,‬דיפולי המעבר צפויים להיות במקביל לציר המולקולה‪ ,‬ההסבר הפשוט ביותר לאנאיזוטרופיה‬
‫הינו פוטואיזומריזציה המתרחשת באחד מהקשרים המצומדים בשלד הפחמימני‪ .‬הסבר זה נופל בשל משך‬
‫הזמן הקצר של התופעה‪ ,‬שהרי שינויים מבניים מתרחשים בסקאלת זמנים איטית בהרבה ולכן הסבר זה‬
‫‪31‬‬
‫אינו יכול להתאים לתהליך של עשרות פנטושניות הנצפה כאן‪ .‬הסבר נוסף לתופעה הינו מעבר אנרגיה בין‬
‫מולקולת קרוטן למולקולת קרוטן‪ ,‬אלא שבהסבר זה הסיגנל המגיע מריקון רמת היסוד יקבל גם הוא את‬
‫אותה האנאיזוטרופיה‪ ,‬וכפי שניתן לראות באיור ‪ 04‬זה אינו המקרה כאן‪ .‬למעשה‪ ,‬משך הזמן הקצר וזמן‬
‫הופעתו של התהליך מצביע על כך שהופעת הרמות ‪ S*/S1‬מלווה בשינוי באנאיזוטרופיות‪ .‬הופעה‬
‫משותפת זו מעלה את ההסבר כי התהליך מתרחש כתוצאה מיצירת הפרדת מטען בתוך המולקולה ( ‪ICT -‬‬
‫‪ ,)intramolecular charge transfer‬המשנה את דיפול המעבר‪ ,‬אלא שכפי שפורסם במחקרים קודמים‬
‫אין לזמן החיים של רמות האנרגיה ‪ S*/S1‬תלות בממס‪ ,‬מה שמפריך אפשרות זו‪.‬‬
‫כאמור‪ ,‬אין ברשותנו הסבר ובכוונתנו להמשיך ולחקור את התופעה‪ ,‬אך עדיין ניתן ללמוד ממנה‬
‫מידע חשוב לגבי הרמות השונות‪ .‬ראשית‪ ,‬זיהויה של רמת *‪ S‬כרמה מעוררת ולא כמצב יסוד חם‬
‫וויברציוני‪ ,‬על אף שטענה זו נשמעה בעבר‪ ,‬ערכי האנאיזוטרופיות מוכיחים זאת‪ .‬שנית‪ ,‬ערכי‬
‫האנאיזוטרופיה הדומים עבור פס הבליעה של רמות ‪ S1‬ו *‪ ,S‬מצביעים על כך שמדובר בוריאציות של‬
‫אותו מצב אלקטרוני מעורר‪ ,‬הנובעות‬
‫מקונפורמרים‬
‫המקורית‬
‫שונים‬
‫(מחוסר‬
‫באוכלוסיה‬
‫הומוגניות‬
‫במצב‬
‫‪Normalized intensity‬‬
‫היסוד)‪ .‬עדות נוספת לכך מובאת באיור‬
‫‪ 40‬העוקב אחרי השינוי במבניות‬
‫הספקטרלית של הסיגנל המגיעה מריקון‬
‫מצב היסוד בתחום שבין ‪380-540nm‬‬
‫ומשווה אותו לבליעה של מצב היסוד‪.‬‬
‫כפי שניתן לראות‪ ,‬עם עלית אחוז הסיגנל‬
‫המגיע מרמת *‪ S‬המבניות עולה; עדות‬
‫‪10ps‬‬
‫‪5ps‬‬
‫‪0.5ps‬‬
‫)‪Absorption spec*(-1‬‬
‫‪750‬‬
‫‪650‬‬
‫‪700‬‬
‫)‪Wavelength (nm‬‬
‫נוספת לתופעה זו ניתן לראות באיור ‪,02‬‬
‫בו ניתן לראות כי עבור הקרוטן ל‪SADS‬‬
‫‪600‬‬
‫‪550‬‬
‫‪500‬‬
‫‪450‬‬
‫איור ‪ :40‬שינויים במבנה הסיגנל המגיעים מריקון מצב היסוד‬
‫מושווים לספקטרום הבליעה‪ ,‬מוסחים בעוצמה על מנת לא לחפוף‪.‬‬
‫המגיע מרמה *‪ S‬יש מבנה ברור בצד הכחול‪ ,‬בעוד שעבור ה ‪ SADS‬שמגיעים מרמות ‪ S1C‬ו‪ S1H‬אין‬
‫מבנה כלל‪ .‬תופעה זו נצפתה גם בקרוטנים נוספים‬
‫‪44‬‬
‫ומחזקת את הטענה כי רמת *‪ S‬מגיעה מאוכלוסית‬
‫מצב יסוד שונה מזו היוצרת את רמת ‪.S1‬‬
‫נקודה מעניינת נוספת הנוגעת לרמה זו המגיעה מהאנליזה‪ ,‬הינה היעילות היחסית של יצירת *‪,S‬‬
‫שעולה עם החיבור לחלבון‪ .‬התנהגות דומה נצפתה עבור קרוטנים נוספים הכלולים בחלבונים אוספי אור‬
‫במערכות פוטוסינטטיות‪ .45‬בניגוד ליצירת רמה זו‪ ,‬כפי שניתן לראות בטבלה ‪ ,1‬אין לקישור לחלבון‬
‫השפעה על זמני החיים של הרמות *‪ S‬ו ‪ S1‬וזאת בניגוד לחלבונים אחרים‪ ,‬בהם קישור מולקולת הקרוטן‬
‫משנה דרסטית את קבועי הקצב של הרמות השונות‪.46‬‬
‫‪39‬‬
‫התגלית המשמעותית ביותר במחקר המתואר בעבודה זו‪ ,‬מגיעה מזמן ההיפוך הפנימי (‪ )IC‬של‬
‫רמה ‪ .S2‬רמה זו‪ ,‬כפי שנאמר‪ ,‬היא האחראית על מעבר אנרגיה לרטינל ולכן בעלת תפקיד מכריע‬
‫בפעילות החלבון‪ .‬בניגוד למחקרים קודמים האנליזה שבוצעה על התוצאות שהתקבלו מה ‪ ,TOPAS‬נתנה‬
‫את אותו זמן חיים לרמת ‪ S2‬עבור הקרוטן החופשי וזה הקשור לחלבון‪ ,‬למרות מעבר האנרגיה הפותח‬
‫ערוץ נוסף (התהליך מתחרה) בחלבון הקסנטורודופסין‪ .‬ניתן לתלות את ההסבר לתופעה זו בהשפעת‬
‫הסביבה על קיצבי ה ‪ IC‬במולקולה‪ ,47‬אך סביר הרבה יותר‪ ,‬כי בניסויים אלו אין ברשותנו רזולוצית זמן‬
‫מספיקה‪ .‬כדי לבאר נקודה זו חזרנו על הניסויים עם מערכת ה ‪ NOPA‬בעלת רזולוצית זמן של כ ‪.10fs‬‬
‫כפי שניתן לראות בפנל העליון של איור ‪ ,07‬הדינאמיקה האמיתית של המערכת אכן מהירה יותר ממה‬
‫שנמדד באמצעות ה ‪ ,TOPAS‬כך שההנחה כי זמני החיים הקרובים נובעים מרזולוציות המכשיר‪ ,‬נכונה‪.‬‬
‫זמן חיים המגיע מרמת ‪ S2‬של הקרוטן קצר משמעותית מכול הדיווחים הקודמים שמדדו את זמן‬
‫החיים הן באמצעות פלואורסנציה והן באמצעות ספקטרוסקופיה מהירה‪ .‬למעשה‪ ,‬זמן זה קצר גם ביחס‬
‫למדידות שבוצעו על פוליאנים אחרים בעלי מספר קשרים דומה ובעלי קבוצת קרבוניל‪ .48‬לא סביר כי זמן‬
‫כל כך קצר מצביע על חוזק הצימוד שבין המצבים המעוררים‪ ,‬סביר הרבה יותר כי משך הזמן הקצר‬
‫מצביע על כך שבגיאומטריות ספציפיות קיים ניוון בין רמת ‪ S2‬לרמות המעוררות הנמוכות ממנה‪ .‬אציין‬
‫כי מחקרים שבוצעו ב‪ -carotene‬דיווחו על תופעות ספקטראליות מהירות אף יותר (‪,49)~15 fsec‬‬
‫אלא שמקור תופעות אלו אינו ברור‪ .50‬כמו כן‪ ,‬הספקטראות ששויכו לזמנים קצרים אלו לא התאימו‬
‫לספקטראות שהתקבלו ברזולוציה נמוכה יותר‪ .‬כפי שניתן לראות באיור ‪ ,07‬זה אינו המקרה בעבודה זו‪.‬‬
‫הספקטראות המשויכים לזמן המהיר ואלה שלאחריו חופפים בשתי המערכות‪ ,‬אינדיקציה לכך שהמעקב‬
‫מבוצע על אותן הרמות‪.‬‬
‫ההבדל המשמעותי בין זמני החיים שנמדדו במעבדתנו עבור רמת ‪ )~25fs( S2‬בהשוואה‬
‫לעבודות קודמות דורש התייחסות‪ .‬את תוצאות הניסויים הקודמים שבוצעו בספקטרוסקופיה מהירה ניתן‬
‫להסביר על ידי רזולוצית זמן לא מספיקה שגורמת לתהליך "להימרח" בזמן‪ ,‬שמביא למדידת זמן דעיכה‬
‫ארוך יותר‪ ,‬כפי שקיבלנו גם אנחנו בניסוי עם ה ‪ .TOPAS‬בנוסף לניסויים אלו‪ ,‬זמן החיים של רמת ‪S2‬‬
‫נמדד גם באמצעות יעילות פלואורסנציה (‪ .)fluorescence quantum efficiencies‬ניסויים אלו נתנו‬
‫ערך של כ ‪ .~70 fs‬קשה ליישב תוצאה זו עם תוצאות שהתקבלו במעבדתנו‪ ,‬אנו תולים את הבדלים אלו‪,‬‬
‫בזמן הקצר של התהליך ויעילותו הגבוהה‪ ,‬הגוררים חוסר דיוק בהערכת הזמן בשיטה המבוססת על‬
‫הפלואורסנציה‪.‬‬
‫במרחק של פחות מ‪ ,19 Å‬האינטראקציות החזקות שבין שני דיפולי המעבר יכולות להוביל‬
‫לדינאמיקה לא אקספוננצילית עבור היפוך פנימי‪ ,‬הכוללת מעברי רמות המשמרים את הקוהרנטיות‬
‫האלקטרונית‪ .51,52‬זמן החיים האולטרה קצר הזה‪ ,‬מצביע גם על מעברי אנרגיה בעלי מנגנון שונה בחלבון‬
‫ה ‪ XR‬שכדאי להוסיף ולחוקרו לעומק‪.‬‬
‫‪30‬‬
‫‪ .3‬סיכום ומסקנות‬
‫תהליכים משרי אור אולטרה מהירים בחלבון ה ‪ XR‬וברטינל ‪ SX‬באתנול נחקרו באמצעות‬
‫ספקטרוסקופית ‪ pump- probe‬רחבת פס בקיטובים שונים וברזולוציה זמן גבוהה‪.‬‬
‫באמצעות שימוש בטכניקת התאמה גלובלית ו ‪ target analysis‬וידאנו כי מולקולת הקרוטן ‪SX‬‬
‫מתפקדת כאנטנה קולטת אור המעבירה את קוונטות האנרגיה אל רמת ‪ S2‬של הרטינל ביעילות של כ ‪03‬‬
‫אחוזים‪ .‬זמני החיים של רמות הסינגלט ה"אסורות" ‪ S1‬ו *‪ S‬חולצו יחד עם ספקטרום השינוי הזמני‬
‫שלהם‪ ,‬ונמצאות ‪ ~ 3‬ו ‪ ~6‬פיקושניות בהתאמה עבור מולקולת הרטינל בשתי הדוגמאות‪ .‬בנוסף‪ ,‬קיבלנו‬
‫את זמן הקירור הוויברציוני של רמת ‪ S1‬לאחר שנוצרה בהיפוך פנימי מרמת ‪ S2‬הדומה גם הוא בשתי‬
‫הדוגמאות ומתרחש תוך כ ‪.930fs‬‬
‫יחס האנאיזוטרופיה הנמוך‪ ,‬המתקבל עבור הבליעה של הרמות ‪ S1‬ו *‪ ,S‬הרמות המעוררות של‬
‫הקרוטן‪ ,‬מצביע על זווית של ‪ 94‬מעלות בין דיפול המעבר של ‪ S0→S2‬בו אנו מעוררים‪ ,‬לבין דיפולי‬
‫המעבר ‪ .S1/S*→Sn‬הזמן הקצר עד להופעת יחס האנאיזוטרופיה המופחת‪ ,‬פוסל אפשרות כי הוא נגרם‬
‫כתוצאה מפוטואיזומריזציה‪ .‬יחס האנאיזוטרופיה בבליעה של רמת *‪ ,S‬מבטלת את האפשרות כי מדובר‬
‫במצב יסוד מעורר וויברציונית‪ .‬הדמיון ביחס האנאיזוטרופיה לזו של הבליעה של רמת ‪ ,S1‬מחזק את‬
‫הטענה כי מדובר בקונפורמרים שונים של אותה הרמה‪ ,‬המגיעים מחוסר הומוגניות במצב היסוד‪ .‬יחס‬
‫האנאיזוטרופיה המפתיע של רמות אלו אינו משתנה כתוצאה מקישור הקרוטן לחלבון‪.‬‬
‫באמצעות שימוש ברזולוצית זמן מוגברת מדדנו זמן חיים של ‪ ~ 20 fs‬עבור רמת הסינגלט‬
‫השנייה במולקות הקרוטן‪ ,‬ממנה זורמת האנרגיה לרטינל‪ .‬זמן זה קצר משמעותית בהשוואה למחקרים‬
‫קודמים‪ ,‬ומצביע על דינאמיקה אלקטרונית וגרעינית קוהרנטיות המעורבות בתהליך אסיפת והעברת‬
‫האנרגיה בחלבון ה‪.XR‬‬
‫‪34‬‬
7. Abstract:
Xanthorhodopsin (XR) is a light-driven proton pump isolated from the
extremely halophilic eubacterium Salinibater rubber which grow in brine pools and
salt lakes. It contains two strongly interacting chromophores, an all trans retinal, and a
C40 carotenoid (CAR) salinixanthin (SX) which, acts as a light-harvesting antenna.
Light absorbed by SX is transferred to the retinal chromophore which uses it for transmembrane proton transport, making XR the simplest photosynthetic protein complex
featuring a separate light harvesting function.
The Excited-state dynamics of XR and of SX in ethanol were investigated by ultrafast
pump-hyperspectral probe spectroscopy. Following excitation to the strongly allowed
S2 state of the SX chromophore, transient spectra were recorded photo-selectively in
the range 430-850nm. Global kinetic analysis of these data shows:
1) Efficient energy transfer from S2 of the SX in XR to its retinal moiety is verified
here. The lifetime of S2 in SX is however determined to be ~20fsec, much shorter
than previously reported.
2) Branching ratios of excitation transfer from S2 to S1, to S*, and to retinal in XR are
measured leading to species associated difference spectra (SADS) for all the states
involved. Strong protein effects are detected on these branching probabilities.
3) S1 and S* absorption bands in both systems exhibit anisotropy well below the
expected r=0.4, indicating an angle of ~250 between the S0→S2 and S1→Sn / S*→Sn
transition dipoles. The latter allows confident assignment of the debated S* absorption
band to an excited state of SX, and not to "hot" S0. In light of the extremely fast IC
from S2 to lower excited singlets, possible involvement of ballistic IC in SX, and of
coherent energy transfer in XR are discussed.
33
‫ מראי מקום‬.3
1
Balashov, S. P.; Imasheva, E. S.; Boichenko, V. A. B.; Anton, j.; Wang, J.M.;
Lanyi, J.K. Science. 2005 ,309 ,2061-2064.
2
G. Moiseyev, Y. Chen, Y. Takahashi, B. X. Wu, J. Ma Proc. Natl. Acad. Sci,
2005 ,102 ,35, 12413-12418
3
Conn PF; Schalch W; Truscott TG. Journal of photochemistry and
photobiology. ,1991, 11, 41-7
4
Polıvka, T.; Sundstrom, V. Chem. Phys. Lett. 2009 ,477,1–11
5
Frank H.A. Archives of Biochemistry and Biophysics 2001. 385, 1 ,53–60
6
Mitsuhiro Ikuta, Atsushi Yabushita, Ferdy S. Rondonuwu ,Junji Akahane,Yasushi
Koyama, Takayoshi Kobayashi Chem. Phys. Lett 2006 422, 95-99
7
P.O. Andersson, T. Gillbro, J. Chem. Phys. 1995 ,103, 2509
8
C.C. Gradinaru ;J. T. M. Kennis; E. Papagiannakis; I. H. M. van Stokkum; R. J.
Cogdell; G. R. Fleming; R. A. Niederman; R. van Grondelle. Proc. Natl. Acad.
Sci. 2001, 98, 2364.
9
W. Wohlleben, T. Buckup, H. Hashimoto, R.J. Cogdell, J.L. Herek, M. Motzkus,
J. Phys. Chem. B 2004,108, 3320.
10
E. Papagiannakis, J.T.M. Kennis, I.H.M. van Stokkum, R.J. Cogdell, R.
vanGrondelle, Proc. Natl. Acad. Sci. 2002, 99 ,6017.
11
T. Ritz, A Damjanovic, K. Schulten Chem. Phys. Chem 2002 ,3 ,243-248
12
X. Hu; A. Damjanović; T. Ritz; K. Schulten. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, 95,
5935–5941,
13
T. Polivka, V. Sundstro¨m, Chem. Rev. 2004, 104, 2021
14
J. Deisenhofer, O. Epp, K. Miki, R. Huber & H. Michel. Nature 1985, 318 ,6047,
618–624.
15
V. A. Boichenko; J.M. Wang; J. Anton; J. K. Lanyi; S. P. Balashov Biochimica
et Biophysica Acta 2006, 1757 ,1649–1656
16
S. P. Balashov, E. S. Imasheva, J. M. Wang, J. K. Lanyi. Biophysical Journal
2008, 95, 2402–2414
17
Mukohata Y, Ihara K, Uegaki K, Miyashita Y, Sugiyama Y. Photochem
Photobiol. 1991 ,54,1039-45.
18
Y Mukohata; Y. Sugiyama; K. Ihara M; Yoshida. Biochemical and Biophysical
Research Communications ,1988 ,151, 30, 1339-1345
19
Sineshchekov, V. A.; F. F. Litvin. Biochim. Biophys. Acta. 1977, 462 ,450–466.
20
S. P Balashov; F. F. Litvin; V. A. Sineshchekov. Physicochemical Biology
Reviews. 1988 1–61.
32
21
Polıvka, T.; Balashov, S. P.; Chabera, P.; Imasheva, E. S.; Yartsev, A.;
Sundstrom, V.; Lanyi, J. K. Biophysical Journal. 2009, 96, 2268-2277.
22
Pena A., Valens M., Santos F., Buczolits S.,Anton J., Kampfer P., Busse H. J.,
Amann R. ,Rossello-Mora R. Extremophiles .2005, 9, 151 – 161
23
Mongodin E. F., Nelson K. E., Daugherty S., DeBoy R. T.,Wister J., Khouri H.,
Weidman J., Walsh D. A., Papke R. T.,Sanchez Perez G., SharmaA. K., Nesbo C.
E. Bapteste, W. F. Doolittle, R. L. Charlebois, B. Legault, F. Rodriguez-Valera.
Proc.Natl. Acad. Sci. 2005 102, 18147 – 18152.
24
Balashov S. P. Biochim. Biophys. Acta, 2000 ,1460, 75 – 94.
25
U. Banin, A. Bartana ,S. Ruhman ,R. Kosloff Journal of Chemical Physics 4991
808, 1618-1648
26
Lakowicz, Joseph R. Principles of Fluorescence Spectroscopy 1983 ,112-120
27
9002 ,‫ חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה באוניברסיטה העברית בירושלים‬, ‫שושנים‬.‫א‬
28
N. P. Ernsting, S. A. Kovalenko, T. Senyushkina, J. Saam, V. Farztdinov J. Phys.
Chem. A 2001, 105, 3443-3453
29
Van Stokkum, I. H. M.; Larsen D. S.; Van Grondelle R. Biochimica et
Biophysica Acta – Bioenergetics 2004 ,1657, 82-104.
30
GH Golub, C Reinsch - Numerische Mathematik, 1970 14 ,403-420
31
J. Herrmann. J. Opt. Soc. Am. B , 1994, 11, 498-512
32
S. Backus, J. Peatross, C. P. Huang, M. M. Murnane, H. C. Kapteyn. Optics
Letters 1995 , 20, 19, 2000-2002
33
G. Chériaux, O. Albert, V. Wänman, J. P. Chambaret, C. Félix, G. Mourou
Optics Letters, 2001, 26, 3, 169-171
34
Erik Zeek, Kira Maginnis, Sterling Backus, Ulrich Russek, Margaret Murnane,
G´erard Mourou, and Henry Kapteyn Optics Letters 1999 ,24, 7 ,493-495
35
Boichenko, V. A. ; Wang, J. M.; Anton, J.; Lanyi, J. K.; Balashov, S. P.
Biochimica et Biophysica Acta. 2006 ,1757, 1649–1656.
36
Orlandi, G.; zerbetto, F.; Zgierski M. Z. chem. Rev 1991 ,91 ,867–891.
37
Koyama, Y.; Long, R.A.; Martin, W.G.; Carey P.R. Biochimica et biophysica
acta, 1979, 548, 153-60.
38
S. L. Palfrey and T. F. Heinz J. Opt. Soc. Am. B 1333 2 674-679
39
M. Joffre, D. Hulin, A. Migus, and A. Antonetti Optics Letters 1988, 13, 276278
40
D. Niedzwiedzki, J. F. Koscielecki, H. Cong, J.O. Sullivan, G. N. Gibson, R. R.
Birge, H. A. Frank J. Phys. Chem. B 2007, 111, 5984-5998
37
41
Andersson, P.O.; Gillbro, T. J. Chem. Phys. 2005, 103, 2509-2519.
42
Andersson, O. P.; Cogdell, R. J.; Gillbro, T. Chem. Phys. 1996, 210, 195-217.
43
Krueger, B. P.; Lampoura, S. S.; van Stokkum, I. H. M.; Papagiannakis, E.;
Salverda, J. M.; Gradinaru, C. C.; Rutkauskas, D.; Hiller, R. G.; van Grondelle, R.
Biophysical Journal, 2001, 80, 2843–2855.
44
Chabera, P.; Fuciman, M.; Hrıbeak, P.; Polıvka T. Phys. Chem. Chem. Phys.,
2009, 11, 8795–8803.
45
Papagiannakis, E.; Kennis, J. T. M.; van Stokkum, I. H. M.; Cogdell, R. J.; van
Grondelle, R. Proc. Natl. Acad. Sci. 2002, 99, 6017–6022.
46
Polivka, T.; Kerfeld, C. A.; Pascher, T.; Sundstorm, V. Arthrospira maxima.
Biochemistry 2005, 44, 3994-4003.
47
Ricci, M.; Bradforth, S. E.; Jimenez, R.; Fleming, G. R. Chem. Phys. Lett. 1996,
259, 381-390.
48
Akimoto, S.; Yokono, M,; Higuchi, M.; Tomo, T.; Takaichi, S.; Murakami A.;
Mimuro M. Photochem. Photobiol. Sci., 2008, 7, 1206–1209.
49
Cerullo, G.; Polli, D.; Lanzani, G.; De Silvestri, S.; Hashimoto, H.; Cogdell, R. J.
Science 2002, 298, 2395-2398.
50
Kosumi, C. D.; Komukai, M.; Hashimoto, H.; Yoshizawa, M. Phys. Rev. Lett. 2005,
95, 213601
51
Chachisvilis, M. ; Ku1hn, O. ; Pullerits, T.; Sundstrom, V. J. Phys. Chem. B 1997,
101, 7275-7283.
52
Cheng, Y.C.; Fleming, G.R. Annu. Rev. Phys. Chem. 2009. 60, 241–262.
38