מיקרוביולוגיה - שיעורים 5-8
מיקרוביולוגיה -שיעור1 30 שיעור :05דופן התא המרצה :ד"ר ענת הרשקוביץ' דופן התא בעלת רלוונטיות רפואית חשובה ,היות והיא הדבר הראשון שהמערכת החיסונית באה איתו באינטראקציה ,נוסף על גורמים מורפולוגיים כמו שוטונים ,ריסים או גורמים מסיסים שהחיידק מפריש ולרוב מזוהים בפתוגניות שלו. החיידק הינו יצור חד תאי אשר תוכו מורכב מציטוזול בו קיימים מרכיבי החיים שלו ומבחוץ קיימים גורמים המאפשרים תנועה כמו שוטונים וריסים .הפלזמה סגורה בממברנה פנימית וחיצונית עשויות פוספוליפידים במבנה .bi-layerמעבר לממברנה הליפידים כלפי חוץ נמצאת מעטפת החיידק. החיידקים מתחלקים לשתי קבוצות :גרם חיובי וגרם שלילי .גרם שלילי מכילים שתי ממברנות בעוד שגרם חיוביים מכילים ממברנה אחת ,דבר המשפיעה גם על מעטפת החיידק. צביעת גרם היכולת להבדיל בין חיידק לפי המעטפת פותחה עם צביעת הגרם על ידי הנס כריסטיאן גרם ב.1884- גרם הבחין כי כאשר צובעים חיידקים בשני צבעים תוך טיפול מסויים )ראו פירוט באיור( ,חיידקים מסויימים מכילים את הצבע הראשון )סגול( ובאחרים הצבע נשטף החוצה ולכן הם נצבעים בצבע השני )ורוד(. בעוד שגרם לא הבין את מקור ההבדל ,היום ידוע שהוא נובע ממעטפת החיידק השונה בין גרם חיובי )סגול( לגרם שלילי )אדום(. דופן תא חיידקי באיורים הבאים ניתן לראות את הממברנה והדופן של החיידקים השונים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :05דופן התא 31 ה bilayer-מכיל פוספוליפידים וחלבונים ממברנלים בעלי תפקודים שונים כמו טרנספורטרים ,תעלות, הפרשת חומרים וכו' .מחוץ לממבנה מתחיל ההבדל: • גרם חיובי – דופן תא עשוי שכבה עבה מאוד .הדופן עשויה מסוגים שונים של פולימרים שהעיקרי בהם הוא הפפטידוגליקן .מעבר לכך יש חלבונים שונים ושומנים שמעטרים את הדופן ,כמו חומצות טיכואיות וחומצות ליפו-טיכואיות .הפפטידוגליקן עשוי בעיקר שרשרות של סוכר. • גרם שלילי – מכיל שתי ממברנות ליפידים ) .(each is bilayerעובדה זו מהווה הבדל משמעותי מבחינה אנרגטית )ייצור ממברנה שנייה( ומטבולית וכן מבחינה יכולת הבנייה של הממברנה החיצונית .הממברנה החיצונית שונה מבחינת האלמנטים המוכלים בה מהממברנה הפנימי .החלל הפריפלזמטי הוא החלל הנוצר בין הממברנה ,והוא מכיל גם כן את פולימר הפפטידוגליקן היוצר שכבה דקה מאוד )יחד עם אנזימים וגורמים אחרים הנשמרים בפורמט מידור בחלל זה( .כמו כן על גבי הממברנה החיצונית קיים פולימר סוכרי בשם ליפופוליסכריד ) .(LPSהחומצות הטיכואיות אינן מצויות כלל בחיידקי גרם-שלילי. תפקודי המעטפת החיידקית • צורה מורפולוגית וקשיחות – פולימר המעטפת של החיידק מבקר את צורת החיידק 15 – עגול או מתג ,למשל .המעטפת מספקת גם קשיחות דינאמית ,המאפשרת יחד איתה גם שכפול ודינאמיות. • הגנה מפני הלם אוסמוטי ועקות – החיידק מתמודד עם תנאים משתנים וקשים כאשר הוא בסביבתו הטבעית – כמעט לעולם לא יהיה בתנאים האופטימליים שלו .סביבה מימית שמתייבשת או מתמלאת מים משנה את ערכי ה pH-והאוסמוטיות שלה; הדופן צריכה להתמודד עם ההתרחבות וההיצרות של התא .בחיידקים החיים בגוף חי צריך להתמודד מול המערכת החיסונית ורדיקלים שהגוף המארח מייצר. חיידקים לא מתרבים מסיבית בטבע – אכן ,הם נמצאים במגוון עצום וכמויות אדירות אך העובדה שלא רואים מושבות כמו במצע במעבדה מצביעה על כך שהם אינם מתרבים בקצב אופטימלי – בטבע החיידקים נמצאים במצב עקה והם משקיעים כוחותיהם על מנת לשרוד ולא בהתרבות למספרים עצומים. • מחסום פיזי – כנגד כניסה של חומרים שונים ,כשם שעור הגוף החי מהווה מחסום. • שליטה על מעבר יונים – המעטפת יכולה להיות בעלת מטען הנתון לשינוי בידי החיידק; כמו כן היא מכילה תעלות ואלמנטים המאפשרים כניסה סלקטיבית של חומרים .שימו לב שמכיוון שדופן התא אינו עשוי פוספוליפידים )בגרם חיוביים( ,מעבר מולקולות קטנות טעונות יכולות לעבור והסינון שלהן נעשה על טהרת בקרת המטען. • הגנה מפני מנגנוני המערכת החיסונית של המארח – חיידקים יכולים ליצור קפסולה ,משמשת אותם להסוואה והתחמקות מבליעה ופירוק על ידי פגוציטים המשמשים את מערכת החיסון של המארח .לא כל החיידקים מסוגלים לייצר קפסולה. 15זיכרו כי לממברנה הליפידית אין צורה ,היא מעין "שק" שמקנה לתא צורה כדורית. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 32 • הגנה מחומרים אנטיבקטריאלים – תאים פגוציטים הורגים חיידקים על ידי ייצור חומרים אנטיבקטריאלים ,אשר סוג אחד שלהם הוא פפטידים קצרים הנמשכים לממברנת החיידק ,נכנסים פנימה ומחוררים אותה על מנת להרוג את החיידק .הפפטידים טעונים חיובית ולכן שינוי מטען הדופן יכול להקנות עמידות – מטען חיובי על הדופן הנוצר על ידי קבוצות חיוביות כמו D-Alanineדוחה את הפפטידים האנטיבקטריאלים ומגן על החיידק. • חישת הסביבה – מעטפת התא היא מעין אברון – במיוחד הפריפלזמה של הגרם שליליים .גם שכבת הדופן העבה של הגרם-חיובי היא שכבה שקורים בה דברים – ולכן ניתן להתייחס אליה כסביבה ייחודית .בתוך השכבה הזו יש חלבונים הקשורים בקשרים שונים והינם בעלי פונקציות ספציפיות לחיידק .אחת הפונקציות היא חישה – שטח הפנים של החיידק ,הדופן ,הוא איזור התקשורת עם הסביבה ולכן שם נמצאים הרבה חיישנים החשים את הסביבה – מרגישים פפטידים אנטיבקטריאלים, שינוייםב pH-ותנאים אחרים וכדומה .דופן התא משמשת שלד על מנת להחזיק חיישנים אלו. • תמיכה במנועי שוטון – השוטון של החיידק מעוגן לממברנה הליפידית ,אולם הוא צריך מבנה נוסף שייתמוך בו – אורך שוטון יכול להיות ארוך פי 2מהתא עצמו ולכן צריך מבנה יציב שיחזיק אותו. • אדהזיה – חלק מיכולות החיידקים לתפוס נישה מסויימת נתונה ביכולתם להיצמד למקום מסויים ולא לרחף בעומק הנוזל .במצב זה הם יכולים להשתכפל ולהקים מושבות או לחדור לרקמות .תכונה זו חשובה ,במיוחד בחיידקים פתוגנים .לדופן התא חשיבות רבה לאדהזיה וליכולת ההצמדות למשטח. • תמיכה בפימבריה – פילוסים וגורמים נוספים אשר ,כמו השוטון ,נשלחים החוצה וצריכים תמיכה מכנית. • מעורבות בחדירה לאאוקריוטים – חשובה במיוחד לפתוגנים שצריכים לחדור לתא מאחסן ספציפי ולשם כך צריכים לזהות אותו ,לחדור אליו ,להתחמק מהמערכת החיסונית ולהתחלק במקום המיועד להם. • חלוקה תאית – מצריכה שיתוף פעולה בין הדופן לחלוקה – כאשר חיידק מתארך וצריך להיחתך האנזימים של תהליך החלוקה והאנזימים המנטרים את ייצור הדופן צריכים לתקשר ולקיים תיאום ביניהם. הסיבות לחקר דופן התא • מרכיבי הדופן הם חיוניים – חיידק ללא דופן לא יחיה זמן רב לא ההגנה ,הצורה ,הזיהוי ושאר התכונות שהיא מספקת. • מרכיבי הדופן הם ספציפיים לחיידקים – פפטידוגליקן ו LPS-הם חומרים הקיימים בחיידקים בלבד ולא בגוף המאחסן האאוקריוט .משמעות הדבר היא שיש אלמנטים שניתן להתייחס אליהם כמטרות לתרופות – אשר יוכלו לפגוע בחיידק בלבד ולא במאחסן .דוגמה לתרופה כזו היא אנטיביוטקות התוקפות שלבים שונים בתהליכי הסינטזה של דופן התא – בעיקר את המרכיבים הייחודיים שלו. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :05דופן התא • 33 מרכיבי הדופן גורמים למחלות בבעלי חיים – ה LPS-של הגרם-שלילי הינו חומר רעיל – ואפילו קטלני במצבו הטהור LPS .מזוהה על ידי רצפטורים תאיים,toll-like receptor IV (TLR IV) , הקושר את ה LPS-ומיידע את הגוף אודות קיום החיידקים בו .ההכרה הזו מעוררת תגובה חיסונית חזקה מאוד על ידי שליחת סיגנלים )ציטוקינים( המזמנים תאי מערכת חיסונית .התגובה החזקה עשויה לגרום ל ,Sceptic Shock-הגוף מתקשה לעצור את התהליך שעשוי להיות קטלני .הבנה של מרכיבי דופן התא חשובה לבריאות הגוף שכן גם הם מהווים גורמים פתוגנים .תרופה למצב זה יכולה להיות למשל חומר שייתחרה עם ה LPS-בדם על הקישור ל TLR IV-מבלי לעורר בו תגובה. יש לציין כי גם בצמחים התגלו מרכיבים שמזהים אלמנטי דופן חיידקית וגורמים לתגובה. • הבחנה אימונולוגית – ה LPS-מורכב מאלמנט ליפידי וחיצוני )סוכרים( .חיידקים שונים ,אפילו מאותו המין ,נבדלים בהרכב הסוכרים החיצוני של ה .LPS-תכונה זו משמשת כלי לזיהוי הסרוטייפ בתוך המין .כמו כן הגוף מייצר ,על פי רוב ,נוגדנים כנגד איזורים אלו .גם בקטריופאג'ים מזהים את חיידקי המטרה שלהם לפי הדופן ,ושינויים בדופן עשויים להקנות עמידות לפאג'ים. מבנה דופן התא בחיידקי גרם חיובי הפפטידוגליקן יכול להגיע עד 80%מהמסה היבשה של החיידק בעוד שבגרם שלילי היא יכולה להיות בין 15-20%מהמסה. משמאל :הבדלים המבניים הסכמטיים בין גרם שלילי לחיובי. למטה :מבנים של חיידקים גרם חיובים וגרם שליליים עם קפסולה .ניתן לראות כיצד המבנים מסייעים גם בייצוב מנועי שוטונים ופילוסים – אלמנטים גדולים היוצאים מהחיידק וצריכים תמיכה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 34 גרם שלילי גרם חיובי פפטידוגליקן עבה ,שכבת ממבנה ליפידת כפולה. פפטידוגליקן עבה אלמנטים של .LPS חומצות טכואיות TAו.LTA- אין חומצות טכואיות או מיקוליות. חומצה מיקולית בחיידקים Acid-Fastהיוצרת שכבה דמויית שעווה וגורמת לחיידק לעמידות מפני pHחומצי.16 הפפטידוגליקן הפפטידוגליקן מורכב משני סוגי סוכרים – NAGו – NAM17-יחד עם שרשרות פפטיד קצרות ושרשרות פפטיד צולבות .שרשרות פפטידים צדדיות )ירוק בהיר( מחוברות לסוכר ה NAM-בלבד. קשרי הצילוב )ירוק כהה( מקשרים בין כל שתי שרשרות פפטיד צדדיות ומאפשרים חיבור בין שרשרות הפולימר הרבות שבשכבת הפפטידוגליקן. הגליקן משמאל :היחידה הדו-סוכרית החוזרת. • NAGבנוי בבסיסו מגלוקוז ומכיל קבוצות אמין ואצטיל הקשורות אליו. • NAMנוצר מ NAG-ומכיל קבוצה נוספת מ PEP-המשאירה קבוצה קרבוקסילית חשופה. 16תכונה זו קיימת למשל בחיידק הטוברקולוזיס ,השחפת ,אשר נכנס לתאים דרך פגוזום .פגוזום מאכל חיידקים בעזרת pH מאוד חומצי אבל עמידות זו מאפשרת לחיידק לשרוד את התהליך המאכל. .NAM = N-acetylmuramic acid ,NAG = N-acetylglucosamine 17 חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :05דופן התא 35 שרשרת הפפטיד הקצרה ,המאפשרת את קשרי הצילוב ,תיקשר לאותה קבוצה קרבוקסילית חשופה. הקשר β-1,4מצד אחד בלבד של ה NAM-רגיש לפעילות ליזוזים .משום כך ביקוע פפטידוגליקן על ידי ליזוזים מבודד את היחידה החוזרת .חיידקי גרם שליליים פחות רגישים לליזוזים כי יש להם ממברנה חיצונית ולכן נדרשת כניסה של הליזוזים לפריפלזמה על מנת שיוכל לעשות את פעולתו. הפפטיד ה NAM-מכיל קבוצת קרבוקסיל פנויה אליה נקשר אלמנט הפפטיד, שעשוי להיות טטרא -או פנטה- פפטיד .18רצף חומצות האמינו קבוע ואינו משתנה. הפפטיד מכיל כמה אלמנטים ייחודיים: • חומצות אמינו בקונפיגורציה D בעוד שכל חומצות האמינו המוכרות בתאים הן .L • DAP (meso-diamino-pimelic ) acidהיא מולקולה סימטרית ) (mesoהמהווה פריקורסור במסלול הסינטזה של ליזין ואינה משמשת כחומצת אמינו בתאים אאוקריוטים .חומצת אמינו זו הינה ספציפית לגרם-שלילי ולרוב חיידקי גרם-חיובי תהיה חומצת האמינו ליזין בעמדה זו )למרות שמבין החיידקים הגרם-חיוביים המשתמשים ב DAP-רובם הם דווקא הפתוגנים( .ההבדל בין DAPלליזין הוא קבוצה קרבוקסילית ב DAP-במקום מימן ,לצד קבוצה של אמין חופשי .קשרי הצילוב שנוצרים בין הפפטידים של הפפטידוגליקן נוצרים בקישור לאמין של הליזין.DAP/ גם NAMהוא סוכר ספציפי לחיידקים – לא מוכרות היום מערכות אחרות המשתמשות בסוכר זה ,ולכן גם הוא אלמנט ייחודי. הפפטיד מתחבר לקבוצה הקרבקוסילית החשופה של .NAMהקשר הפפטידי נקשר תמיד בין קרבוקסיל ואמין שהם חלק מהמולקולה – ולא דרך אמין או קרבוקסיל מהשייר של החומצה האמינית .יחד עם זאת, הקשר בין החומצה הגלוטמית לליזין DAP/נוצר דווקא דרך שייר הקבוצה הקרבוקסילית של החומצה הגלוטמית ולא דרך ה COOH-במבנה השלד שלה. 18גם חיידקי גרם-שלילי ,שהם בעלי פנטה-פפטיד ,מכילים קשרי צילוב עם טטרא-פפטיד; ביקוע חומצת האמינו האחרונה מספק את האנרגיה ליצירת קשר הצילוב בחיידקים אלו. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 36 שיעור :06דופן התא החיידקי – המשך מבנה הפפטידוגליקן הפפטידוגליקן הם שרשרות של סוכר הבנוי ליחידת בסיס דימרית של די-סכריד .שרשרות אלו מוחזקות על ידי קשרי צילוב בין שיירי פפטידים היוצאים מיחידת ה NAM-של הדי-סכריד .הקשר הפפטידי שיוצר את קשר הצילוב נעשה תמיד בין ה DAP-או הליזין של פפטיד אחד לבין ה D-Alanine-של פפטיד שני. האנזים שמייצר את הקשר הוא טראנספפטידאז שרגיש לפנצילין .משום כך פניצילין ,בפגיעתו באנזים ,מעכב את יצירת קשרי הצילוב ומוריד את יציבות מבנה הפפטידוליקן .בשל חיוניותו ,ביטול הקשיחות של הפפטידוגליקן תגרום למות החיידק. המבנה במרחב משמאל :אילוסטרציה של שרשרת סוכרית אחת ממנה יוצאים בכיוונים רבים השיירים הפפטידים – המבטיחים שהקשרים המרחביים שנוצרים ייעשו בכיוונים רבים ושונים על מנת להבטיח את היציבות. בחיידקי גרם-חיובי )למטה מימין( הקישור בין הליזין ל D-Alanine-אינו ישיר אלא מתווך על ידי פנטה-גליצין .המרווח שנוצר מאפשר יצירת יותר קשרי צילוב ואכן כמעט כל שני פפטידים מצולבים באופן כלשהו. בחיידקי גרם-שלילי )למעלה משמאל( אין שימוש בפנטה-גליצין .במקרה זה יש DAPהמקושר ישירות ל D-Alanine-הרביעי .מכיוון שהקישור אינו מתווך השרשרות קרובות ודחוסות וישנם פחות קשרי צילוב בין השרשרות.19 19יחד עם זאת יש לזכור כי בגרם-שלילי הפפטידוגליקן דק יותר. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :06דופן התא החיידקי – המשך • • 37 חשוב לזכור שהחיידקים יכולים לשלוט בקשרי הצילוב בהתאם לתנאים – אנזימים שיוצרים ומפרקים קשרי צילוב מצויים בחיידק בכל זמן וקשרי הצילוב נוצרים ומתפרקים באופן דינאמי, כאשר המאזן בין הפירוק והצילוב מקיים את צורכי התא. מסיבה זו תקיפת הפניצילין את האנזים המייצר קשרי צילוב פוגעת בדופן ,כי היא מותירה את האנזימים מפרקי קשרי הצילוב פעילים ומפרה את המאזן לטובת פירוק נטו של קשרי הצילוב וכתוצאה פירוק הדופן. מבנה דופן התא של חיידק גרם-חיובי ניתן לזהות במבנה ממברנה אחת ודופן .הדופן מכילה בעיקר את מבנה ה NAG-NAM-וקשרי הצילוב ביניהם .כמו כן יש חומצות טיכואיות וחומצות ליפו- טיכואיות )כאשר LTAמכילות מרכיב ליפידי שמעגן אותן לממברנה מבעד לדופן(. הפפטידוגליקן אינו רק פולימר; בניגוד לגרם- שליליים שיש להם את "אברון" החלל הפריפלזמטי המכיל אברונים ופונקציות ספציפיות שקורות בו, בחיידקי גרם חיוביים מתייחסים גם לתווך של הדופן כאברון – למרות שאינו חסום בממברנה .הוא מכיל חלבונים הקשורים קוולנטית או אלקטרוסטטית למרכיבי הדופן ,כמו הפפטידוגליקן או החומצות הטיכואיות .חלבוני השטח האלה ) (surface proteinsהינם בעלי תפקידים שונים :בניית הדופן החיצונית ,חישה של הסביבה החיצונית והעברת המידע פנימה וכיוצא באלה. התווך של דופן מכיל ערב רב של חלבונים שונים. חלבוני השטח של חיידקים גרם-חיוביים • חלבון ממברנלי – מכיל איזור ממברנלי )דומיין שחוצה את הממברנה ,לרוב בעלי מבנים שניוניים של אלפא-הליקס( ודומיין גדול שפונה החוצה ,שם מתקיימת פעילות החלבון. • ליפופרוטאינים – החלק הקושר את החלבון לממברנה הוא ליפיד ,ולא חלק הידרופובי של החלבון. • חלבונים בקישור ישיר לפפטידוגליקן – לחלבונים אלו יש רצף שמור בקצות החלבון המכווין אותם לקישור לפפטידוגליקן .רצף זה מכונה LPXTעל שם חומצות האמינו המרכיבות אותו. חלבונים המזהים את הסיגנל ) LPXTבמקור LPXTGאך ה G-מוּסר עם הקישור( ומחברים אותם לדופן התא. • חלבונים המעוגנים לחומצות הטיכואיות – הללו בעלי מוטיב GWחוזרני .הם נקשרים ישירות לחומצות הטיכואיות. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 38 חלבון אחד יכול להכיל מספר סיגנלים :סיגנל ראשון יכול להיות סיגנל להוצאת החלבון מהממברנה )הסיגנל מוסר על ידי פפטידאזות לאחר ששלח את החלבון ליעד( .סיגנל נוסף על אותו חלבון יכול להיות LPXTאשר יחובר על ידי אנזים סורטאז ) (sortaseלפפטידוגליקן .החיבור נעשה על ידי פירוק הקשר של Tל G-וקישור המקטע אל הפנטה-גליצין של החיידק הגרם-חיובי )במקום קישור הפנטה-גליצין בקשר צילוב .יש לציין כי הדבר לא פוגע ביציבות הדופן כי יש הרבה פנטה-גליצין זמינים(. מבנה דופן התא בחיידקי גרם-שלילי ניתן להבחין בשתי שכבות ממברנה וביניהן פפטידוגליקן בחלל הפריפלזמטי; הפפטידוגליקן הדק מחובר לליפופרוטאינים הנמצאים בחלק הפנימי של הממברנה החיצונית .הממברנה החיצונית מכילה גם חלבוני שטח אחרים המעוגנים אליה ואת ה,LPS- הנמצא רק בממברנה החיצונית .הוא מורכב מזנב סוכרי חיצוני ורכיב ליפידי שמעגן אותו לממברנה. בממברנה החיצונית ובממברנה הפנימית יש פורינים – תעלות פחות סלקטיביות מבדרך כלל המעבירות יונים ,מטבוליטים וכדומה ,השומרים על המצב האוסמוליטי של החיידק .ישנם הבדלים גם באופי וגם בריכוז הפורינים בין הממברנה הפלזמטית לממברנה החיצונית. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :06דופן התא החיידקי – המשך 39 - LPSליפופוליסכריד ה LPS-מחולק לשני חלקים: • המרכיב הליפידי ) (Lipid Aהוא המרכיב הטוקסי שגורם לתגובות חיסוניות. • רצף סוכרים מעל המרכיב הליפידי ,לרוב משתנה בין חיידקים שונים .הרצף מחולק למספר חלקים :ליבה פנימית ,ליבה חיצונית ו- Oאנטיגן .זה האחרון הוא זה שנגדו מתפתחים נוגדנים בגוף המותקף על ידי חיידק גרם-שלילי. הנוגדנים מאפשרים להגדיר סרוטייפים שונים של אותו מין חיידק. חיידקים יכולים לשנות את הרכב הסוכרים; חיידקים פתוגנים יכולים לערוך שינויים – ספונטניים או מכוונים – במבנה ה O-אנטיגן כך שהוא כבר לא יזוהה על ידי נוגדנים או TLR4ויוריד את התגובה החיסונית הנגרמת כתוצאה מחדירת החיידק לגוף. ביוסינטזה של פפטידוגליקן הפפטידוגליקן הוא פולימר גדול ,מסיבי ומסועף )במיוחד במקרה של גרם-חיובי( אשר נמצא מחוץ לתא. למרות שיחידות הבנייה הבסיסיות – הדי-סכריד עם הפפטיד – מיוצרות בתא ,הן צריכות להתחבר ולהתפלמר ליצירת פולימר סוכרי הידרופילי גדול שצריך לחצות ממברנה .עד היום היצירה אינה ברורה. הסינטזה התהליך מתחיל בציטוזול ומתווך על ידי מספר אנזימים שלרוב הגנים שלהם נמצאים על אופרונים .התהליך מתחיל ב- Glucosamine-1-Phosphasteשהופך על ידי אנזים GlmUל- NAG1Pועובר ,על ידי אותו אנזים ,התמרה על ידי UTPליצירה סופית של .UDP-GlcNAc NAMהוא נגזרת של .NAGכאשר יש UDP-GlcNAcהוא מותמר על ידי PEPבעזרת האנזים MurAותוך הוצאת פוספט מ- .PEPבעזרת הכוח המחזר NADPHוהאנזים MurBמתבצע השלב השני ליצירת .NAM הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 40 מיקרוביולוגיה -שיעור1 בשלב הבא מוספות חומצות האמינו :האנזים MurCלוקח L-Alanineומוסיף אותו לקרבוקסיל הפנוי של .NAMהאנזים MurDמוסיף ,D-glutamic acidלאחר ש MurI-הפך את הקונפיגורציה של החומצה הגלוטמית מ L-ל .D-האנזים MurEמוסיף את DAPו MurF-מחבר את הסובסטרט D-ala- ) D-alaשנוצר עוד קודם על ידי אנזים שהפך אלאנין Lל D-ואנזים אחר שחיבר שני .(D-alaכך מתקבל הפנטה-פפטיד )בגרם שליליים ,בעיקר(. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :06דופן התא החיידקי – המשך 41 המעבר בממברנת התא בקטטפרנול ) (Bactoprenol = Lipid C55היא מולקולה גדולה והידרופובית מאוד – עשויה 55 פחמנים – הקושרת את תת היחידה הראשונה של הפפטידוגליקן ) (NAMבקשר על ידי שני פוספטים שנמצאים בקצהה. משמאל: ממברנה פלזמטית של גרם-שלילי. הבקטופרנול קושר את ה NAM-בתיווך האנזים .MraYהמולקולה הקשורה מכונה .Lipid I למולקולת NAMהקשורה מתחבר גם NAGבתיווך האנזים .MurGהמבנה הזה מכונה .Lipid II למרות החיבור ,ההיפוך של הבקטופנול כך שיפנה את NAG-NAMכלפי חוץ אינו ברור מאליו; ההנחה היא שחלבון הדומה בתפקודו לפליפאזות המצויות באאוקריוטים הוא שעושה את הפעולה ,אולם האנזים עצמו עדיין אינו ידוע. לאחר ההיפוך של הבקטופנול החוצה ,יחידת הבנייה נקשרת לפולימר דופן התא הקיים בחוץ והבקטופרנול מתמחזר על ידי פליפ-פלופ נוסף שמפנה אותו שוב כלפי הציטוזול .הקישור לפפטידוגליקן הקיים ויצירת קשרי הצילוב נעשים על ידי אנזימים חיצוניים לממברנה. בשלב הראשון טראנסגליקוזילאז )מחבר סוכרים( מחבר את המונומר החדש לפפטידוגליקן הקיים. השלב השני ,יצירת קשרי הצילוב ,נעש על ידי טראנספפטידאז .השלב השלישי נעשה על ידי קרבוקסיפפטידאז שמוריד את ה D-ala-האחרון; כנראה שהורדה זו נותנת אנרגיה לשלבים הראשונים )של חיבור היחידה הבאה(. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 42 הידרוליזה של פפטידוגליקן על מנת שניתן יהיה להכניס מונומרים חדשים לדופן ,צריך שיהיו בה קצוות חופשיים; יצירה של קצוות חופשיים היא תהליך הכרחי בבניית הדופן .האנזימים החותכים את הדופן הם אנזימי הידרולאזות של פפטידוגליקן .הם יכולים לחתוך בתוך הסוכר )טרנסגליקוזילזות( או בתוך הפפטיד )טרנספפטידזות(, בחומצת האמינו האחרונה )קרבוקסיפפטידזות( ,ויש כאלו שמנתקים בכלל את הפפטיד. תהליכי הבנייה והפירוק נמצאים בשיווי משקל; בנייה מקבילה לפירוק בהתאם לצרכי התא .טיפול בפניצילין מעכב את הסינטזה ,חיבור מונומרים חדשים ,אולם לא פוגע בפעילות ההידרולאזות .מסיבה זו הופר שיווי המשקל ויש דגרדציה של הדופן. חלבונים קושרי-פניצילין שמם ההיסטורי של האנזימים המרכיבים את הפפטידוגליקן מחוץ לדופן התא – טראנסגליקוזילאזות, טראנספפטידאזות וקרבוקסיפפטידאזות .החלבונים האלה מעוגנים לממברנה והפפטידוגליקן צף מעל הממברנה; החלבונים הקשורים מוסיפים את הקשרים החדשים ומנהלים את הפפטידוגליקן ודוחפים אותו כלפי חוץ – הגדילה של הפפטידוגליקן היא כלפי חוץ ומן החוץ משוחררים מונומרים ישנים. פניצילין הפניצילין התגלה על ידי אלכסנדר פלמינג ב .1945-המולקולה נמצאה כמעכבת גידול של חיידקים )כפי שניתן לראות באיור( .בתור אנטיביוטיקה שפוגעת במרכיבי הפפטידוגליקן ,חיידקי גרם-חיובי יותר רגישים לה מאשר גרם שלילי, בהם הפפטידוגליקן מוגן על ידי ממברנה חיצונית. המולקולה של הפניצילין מכילה טבעת בטא-לקטם עם אמיד שיוצרת קישור קוולנטי בלתי-הפיך לשייר הסרין באתר הפעיל של הטראנספפטידאז .קשר זה חוסם את פעילות האתר הפעיל והאנזים. האנזימים המרובים הפעילים על הפפטידוגליקן משוערים כעובדים בקומפלקס אחד .האיור מדגים את פעילות הקומפלקס .20הקומפלקס מנתק ומחבר במקביל את השרשרות. החיידק מסנטז את הפנטה-פפטיד לאחר סינטזת ה- .NAMשימו לב שהפפטיד הוא דוגמה לסינטזה של פפטיד שלא בדרך הרגילה – על ידי ריבוזום. הפנטה-פפטיד נוצר על ידי סדרה של אנזימים ולא על ידי ריבוזום; כל אנזים מכיר את הסובסטרט שלו – הפפטיד כפי שהוא לפני שנוסף הרכיב הבא – ומבצע את הפעילות הקטליטית שלו המאריכה את הפפטיד. 20יש לציין כי הקומפלקס מעוגן לממברנה כי חלק ממרכיביו הם חלבונים ממברנליים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שעור :07חומרים אנטיביוטיים 43 שעור :07חומרים אנטיביוטיים המרצה :פרופ' משה מברך )במקומה של ד"ר ענת הרשקוביץ( .חסרה מצגת. שיעור בהיסטוריה ביצירת הדופן קיים איזון בין כניסה של מונומרים חדשים לפירוק של הפפטידוגליקן המפנה מקום לכניסתם לדופן .שבירה של האיזון הזה מערער את עמידות הדופן ולהוביל למות התא. סיפור הפניצילין מתחיל באלכסנדר פלמינג – אשר פירסם ב 1928-את מאמרו על תופעת האנטיביוטיקה .פלמינג היה רופא צבאי במלח"ע I ובקטריולוג והייתה לו מעבדה ניסויית בלונדון .כאשר נסע לחופשה באיטליה וחזר לשולחנו ,הוא מצא פלטות חיידקי סטפילוקוקים רבות שהוא בודד לפני חופשתו; הוא הבחין שהפלטות שלו הזדהמו בתפטיר של פטריה. פלמינג לא זרק את הפלטות המזוהמות ,אלא בחן מה קרה בהן .הוא הבחין בכך שברדיוס מסויים מהפטריה ,מושבות שהיו בצלחת הלכו ודעכו והחיידקים נראו חסרי דופן .פלמינג עבד עם ליזוזים ,הידוע כמפרק דופן ,וכאשר החיידקים נראו כנפגעי ליזוזים הוא חשב שהפטריה מפרישה ליזוזים ,ויוצרת מתחם עיכוב ).(inhibition area פלמינג תיאר את ההבחנה הזו ופירסם אותה במאמרו מ ,1928-אולם המאמר לא זכה לחשיפה רבה במשך 10שנים .זאת עד שארנסט צ'יין, שגם עבד על ליזוזים ,נתקל במאמר והחליט לבקש מפלמינג את הפטריה .הוא הבחין באותה התופעה בה הבחין פלמינג והתחיל למצות מתוך האגר את החומר הפעיל האנטיבקטריאלי .כאשר הוא ניסה אותו בסביבת חיידקים טהורה ראה שאכן יש תגובה אנטיבקטריאלית. צ'יין עבד עם האוורד פלורי ,רופא ,וניסה איתו את התמציות על עכברים מודבקי זיהום שהחלימו; מהר לאחר מכן הם עברו לניסויים קלינים בבני אדם .כך הם הבינו שיש להם "תרופת פלא". היות וב 1940-אירופה מצוייה במלחמה ,צ'יין ופלורי עוברים לארה"ב ומציגים את החומר שלהם לחברות תרופות ומנסים לבצע הליכים גנטיים להשבחת פטריית פניציליום שתוכל לייצר כמויות משמעותיות יותר של החומר ,ומצליחים בכך .בתקופת המלחמה ,המניבה חיילים בעלי פצעים מזדהמים ,התרופה מגיעה לשדה הקרב ופותרת את גורם הסכנה מספר אחד – הזיהומים – שממית לוחמים פצועים. פלמינג ,צ'יין ופלורי מקבלים פרס נובל .בהמשך הבינו שניתן למצוא בטבע חומרים שיכולים לפגוע באורגניזמים אחרים – ועל ידי כך לשמש תרופות .הדבר עודד מדענים לצאת ולחפש חומרים חדשים כאלו .ב 1944-סלמן ווקסמן חיפש חומרים טבעיים נוספים ובודד אנטיביוטיקה נוספת – סטרפטומיצין מהחיידק סטרפטומיציס ,אשר שימשה לטיפול בשחפת )חיידק הטוברקולוסיס( .גם ווקסמן קיבל נובל על פועלו. הפניצילין והסטרפטומיצין הצליחו לרפא מגוון רחב של מחלות והציבור נכנס לאופוריה – הכרזות יצאו שנפתרו כל הבעיות של המחלות הזיהומיות; הבעיה היא שחברות ומפעלים ומדענים הפסיקו לחפש חומרים חדשים והתחילו להתמודד עם מחלות נוספות שעלו – מחלות כרוניות כמו לחץ דם וסכרת ,שהיו בעלות פוטנציאל הכנסה גדול יותר .למרות שנמצאו מאות חומרים אנטיביוטיים הם השתייכו למשפחות ספציפיות ,עם המאפיינים שלהם; ההפסקה בחיפוש שנוצרה יצרה את המצוקה לחומרים אנטיביוטיים שקיימת היום – כאשר זנים פתוגנים רבים כבר עמידים למרבית האנטיביוטיות והרפואה נמצאת במצוקה לחומרים חדשים. היום קיימים 200-250חומרים אנטיביוטיים המתחלקים לכ 10-קבוצות פונקציונאליות ,בהן יש נגזרות שונות של החומרים על מנת לגוון את החומרים אליהם נחשפים החיידקים )ומפתחים עמידות להם(. • צפלוספורינים הם הדור החדש של הפניצילין – כך ששניהם מאופיינים בטבעות בטא-לקטמיות. • התאמות נוספות על חומרים אחרים נעשו על מנת לאפשר מתן בבליעה במקום בזריקה ,הארכת חיי מדף וכדומה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 44 בידוד חומרים אנטיביוטיים מדללים ערב רב של חיידקים ממקום מסוים )למשל חיידקי קרקע( וזורעים על צלחת אגר .מתקבלות מושבות מבודדות ושונות .לאחר מכן זורעים דשא של חיידק הבחן – למשל סטפילוקוקוס – על גבי המושבות .מושבות המפרישות חומר אנטיבקטריאלי הפעיל כנגד זן הבחן ייראו כמושבות שאין סביבן גידול של זן הבחן. שיטה קלאסית נוספת בה משתמשים היא זריעה צפופה של חיידק החשוד כמייצר חומר אנטיבקטריאלי במחצית פלטה; בשארית הפלטה זורעים פסים אנכיים של חיידקים שונים .בצורה זו בודקים מול חיידק אחד ,אנטיביוטיקה אחת ,על אילו חיידקים היא פועלת ובאיזו איכות .ככל שהחיידקים בפס האנכי רחוקים מהחיידק המייצר הם רגישים יותר; כך בוחנים את טווח הפעילות של החומר. השפעת החומר האנטיביוטי מדד ה OD-מודד את עכירות התמיסה המכילה חיידקים ועל פיה את צפיפות החיידקים; אולם הצפיפות הזו כוללת חיידקים חיים וחיידקים מתים שלמים .בגידול רגיל ,מספר התאים החיים ומספר התאים באופן כללי עולים באופן דומה עד שהם מגיעים למצב סטציונרי .במצב זה העכירות יכולה לעלות למרות שמספר החיידקים החיים אינו עולה .בהתאם לכך ,האנטיביוטיקות השונות נחלקות לשלושה סוגים: • אנטיביוטיקות בקטריוסטטיות – הגידול נעצר עם הוספת החיידקים ולכן בו זמנית מגיעים למצב אופקי בגרף העכירות ובגרף הספירה החיה .רוב הסיכויים שלאחר הוצאת האנטיביוטיקה או מהילתה החיידקים יחזרו לתפקד – הם אינם מתים רק נכנסים למצב סטציונרי. • אנטיביוטיקות בקטריוצידליות – האנטיביוטיקה הורגת את התאים אך אינה מפוצצת אותם .יש ירידה בספירה החיה וסטציונריות במדד העכירות. • אנטיביוטיקות בקטריוליטיות – האנטיביוטיקה הורגת את התאים ומפוצצת אותם .יש ירידה בספירה החיה וגם במדד העכירות. MIC = Minimal Inhibitory Concentration ה MIC-הוא מדד הריכוז המינימלי של חומר הדרוש על מנת להרוג/לעכב כמות נתונה של חיידקים בצורה יעילה .מבחן שכזה ייעשה על ידי הכנת מבחנות עם ריכוזי חיידקים זהים )מזן מסויים( והוספת אנטיביוטיקה בריכוזים שונים לכל מבחנה .ככל שריכוז האנטיביוטיקה עולה ,העכירות במבחנה יורדת עד שמגיעים לתמיסה צלולה – זהו ריכוז ה .MIC-המדד תלוי בסוג האנטיביוטיקה וסוג החיידק באופן ספציפי. דרכים נוספות לבחינת אנטיביוטיקות הפועלות על תרבית חיידקים נתונה היא הנחת דיסקיות רוויות חומר אנטיביוטי על גבי פלטת שבה זרועים החיידקים; הדיסקיות שסביבן הגידול של החיידקים נעצר הן הדיסקיות המכילות אנטיביוטיקות יעילות כנגד החיידק .לפי היקף מתחם העיכוב של הדיסקית ניתן לזהות לא רק את האנטיביוטיקה הפעילה אלא גם את היעילה ביותר. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שעור :07חומרים אנטיביוטיים 45 ניתן גם להשתמש בפס נייר הספוג בגרדיינט אנטיביוטיקה; בעזרתו ניתן לראות גם האם הזן רגיש לאנטיביוטיקה וגם להעריך את ה MIC-של אותה אנטיביוטיקה כנגד אותו חיידק. במתחמי עיכוב גם יכולות להימצא מושבות – של חיידקים שפיתחו עמידות לאותה אנטיביוטיקה. מבנה הפניצילין – הטבעת הבטא לקטמית והתמרותיה החותמת של הפניצילין היא הטבעת הבטא-לקטמית המחוברת לטבעת מחומשת המכילה גופרית .בעמדה 6מחובר אמיד עם שייר .כאשר מורידים את השייר מתקבל פריקורסור שניתן להשתמש בו כמבנה בסיס ליצירת נגזרות שונות של החומר האנטיביוטי ,על מנת לשנות את תכונותיו כדי להיטיב את יכולותיו כתרופה – פניצילין יותר פוטנטי ,עמיד לקיבה ,הארכת חיי מדף וכו'. מרבית האנטיביוטיקה בשימוש היום הן סמי-סינטטיות – החומר הופק מהפטריה בתור חומר טבעי אולם עבר מודולציות סינטטיות במעבדה .מולקולות הפניצילין היום עברו שינויים רבים שכל אחד מהם מקבל שם חדש בהתאם לשייר שהוחלף; הדור החדש של האנטיביוטיקות הבטא- לקטמיות הוא הצפלוספורינים ,שהתגלו מפטריה אחרת .באנטיביוטיקה זו ,הטבעת עם הגופרית משושה ולא מחומשת .עוד פטריות בטבע מייצרות חומרים דומים לפניצילין .גם כאן כימאים משתמשים בחומר המיוצר על ידי הפטריה כבסיס למודולציות סינטטיות. נגזרות אחרות ונוספות מופיעות באיורים הבאים )טבעת בטא-לקטמית לבדה ,טבעת מחומשת עם פחמן במקום גופרית וכדומה( .החומר האנטיביוטי ככל הנראה משמש למשהו במחזור חיי האורגניזם – אנטיביוטיקה שמיוצרת בפטריית קרקע אינה מיועדת לתקוף חיידק מעיים ,שהיא אינה נתקלת בו ,וכנראה השימוש הטבעי אינו זה שמשמש ברפואה המודרנית. יש לציין כי הטבעת הבטא-לקטמית ,בהיותה גורם משותף לאנטיביוטיקות רבות ,מהווה מטרה לפיתוח עמידות בחיידק – במיוחד על ידי אנזים בטא-לקטמאז התוקף את הטבעת הבטא-לקטמית ומפרק אותה. חומצה קלאוולנית )(Calvulanic Acid החומצה דומה לפניצילין אולם אינה בעלת פעילות אנטיבקטריאלית .היא מזוהה על ידי בטא-לקטמאז ונקשרת באופן בלתי-הפיך לאנזים – החומצה מהווה מעכב בלתי-הפיך לאנזים הבטא-לקטמאז. החומצה מיוצרת על ידי סטרפטומיצין ,שמייצר גם אנטיביוטיקה .חברות התרופות מנצלות את החומר לעיכוב בטא-לקטמאזות בחיידקים בעלי עמידות מסוג זה על מנת שניתן יהיה להשתמש בו לצד שימוש בפניצילין )כך למשל נוצר החומר אוגמננטין(. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 46 אנטיביוטיקות בטא-לקטמיות • פועלות על מולקולות האנזים שמעורב בקשר צילוב ,המכונים PBP – penicillin binding .proteinsה PBP-הם אנזימים המעורבים בסינטזת פפטידוגליקן ויצירת קשרי צילוב בחיידקים, בעיקר בחיידקים גרם חיוביים. • לחיידקים שונים יכולים להיות PBPשונים ולכן רגישויות שונות לאנטיביוטיקה .טווח הפעילות של החומר תלוי בשאלה האם הוא קושר את ה PBP-הספציפיים של אותו חיידק. ונקומיצין לאחר מיצוי השימוש בבטא-לאקטם ,במיוחד בשל הפצת הגן לבטא-לקטמאז ,החלו להשתמש באנטיביוטיקה נוספת – ונקומיצין .זהו פפטיד עם מודיפיקציה של סוכר .הוא מכוון לD-Ala-D-Ala- של הפנטה-פפטיד. כאשר הוא מתלבש על קצה הפפטיד הוא מעכב את הקישור של קשר הצילוב .במקום לעכב את האנזים היוצר את קשרי הצילוב ,מעכבים את פעולתו על ידי "הסתרת" הסובסטרט שלו .אנטיביוטיקה זו, כמו גם פניצילין ,עובדת רק בחיידקים גדלים – לא במצב סטציונרי ,בו החיידקים אינם עסוקים בפיתוח הדופן. אופן הלחימה של החיידק באנטיביוטיקה הוא פשוט בהחלפת מבנה הסובסטרט D-Ala-D-Ala :הוחלף ב ,D-Ala-lactate-אשר אינו מזוהה על ידי ונקומיצין. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שעור :07חומרים אנטיביוטיים 47 אנטיביוטיקות נוספות • ציקלוסרין – אנטיביוטיקה נוספת המתרכזת באיזור .D-Ala-D-Ala • בקטריזין – לאחר יצירת מונומר ,NAM-NAGבקטופרנול הופך אותו כלפי חוץ .אנטיבוטיקה זו מונעת את השחרור מהבקטורנול וכך נמנע שחרור מונומרים לדופן. • – NB2001סוס טרויאני – המולקולה NB2001נושאת בתוכה חומר בשם טריקלוזן .טריקלוזן הוא חומר מאוד פעיל ורעיל הממית חיידקים ברגע שהוא חודר לחיידק ו NB2001-הוא חומר עם אנטיביוטי בטא-לקטמי .אם החיידק עמיד לפניצילין ,הבטא-לקטמאז תהרוס את ה NB2001-אך על ידי כך משחרר את החומר הרעיל .בצורה כזו הורגים באופן סלקטיבי רק חיידקים עמידים לבטא- לקטם. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 48 שיעור :08חומרים אנטיביוטיים – המשך האנטיביוטיקה הראשונה הייתה ,Salvarsanכנגד עגבת .באותה תקופה הטיפול בעגבת היה בעזרת מלחי כספית ,שהיא חומר טוקסי גם למאחסן .הגישה הטיפולית בזמנו הייתה לסרוק אחר חומר טוקסי ולהעלות את הטוקסיות שלו כלפי החיידק מחד תוך הורדת הפגיעה שלו במאחסן מאידך .האלמנט הטוקסי של סלוורסן הוא ארסן .התרופה עדיין פוגעת במידת מה במאחסן ,אך הייתה הטיפול היעיל ביותר לעגבת עד הופעת הפניצילין. מאז ועד היום זוהי הגישה של פיתוח תרופות אנטיביוטיות – מציאת אלמנטים טוקסיים וייחודיים כך שיהיו פוטנטים מאוד כנגד החיידק והחיידק לבדו. הגישה הינה סריקת ערב רב של חומרים וכאשר מוצאים אחד שמראה רמה מינימלית של פוטנטיות "מסתערים" עליו על מנת לשפר את הפוטנטיות והספציפיות שלו. קיים מגוון רחב של אנטיביוטיקות ,הפוגעות באלמנטים שונים של התא החיידקי היחודיים לו ואינם קיימים בתאים אאוקריוטים: • הדופן – אינה קיימת באאוקריוטים וחיונית להשרדות החיידקים .לחץ הטורגור הגבוה בחיידק מביא לכך שערעור יציבות הדופן מביאה לפיצוצו. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :08חומרים אנטיביוטיים – המשך • 49 ריבוזומים – שתי תת היחידות של הריבוזום הפרוקריוטי שונות בתכלית מאלו של הריבוזום האאוקריוטי ,ולכן אנטיביוטיקות רבות מכוונות כנגד אלמנט זה .יוצא דופן כאן הוא הריבוזום של המיטוכונדריה ,שקרוב יותר לריבוזום הפרוקריוטי מאשר האאוקריוטי. • ה DNA-החיידקי הוא מעגלי ואינו קשור בנוקליאוזומים .כתוצאה ,על מנת ליצור פיתולי-על שליליים המעודדים פרימה הנדרשת לשיכפול/שיעתוק ה ,DNA-נעשה שימוש בטופואיזומראז .DNA-gyraseפגיעה באנזים הזה תפסיק את תהליכי השיכפול/שיעתוק .האנזים הזה אינו קיים באאוקריוטים ,בהם יש רק אנזימים שפותחים פיתולי על ולא כאלו שיוצרים; פיתולי על שליליים נוצרים באאוקריוטים על ידי שחרור הנוקליאוזום ,פעולה שיוצרת פיתול על שלילי באופן ספונטני מעצם הסיבוב של הגדיל סביב ההיסטונים. • פולימראזות חיידקיות גם הן ייחודיות ושונות מפולימראזות אאוקריוטיות. • תהליכי ביוסינטזה ייחודיים של חיידקים – דוגמת תהליכי סינטזת ה) THF-חומצה פולית( ,פוגע בחיידקים בלבד כיוון שהם מסנטזים את החומר בלבד וכמעט ולא קולטים אותו מהסביבה בעוד שבני אדם אינם מייצרים אותו וקולטים אותו ממזונם. תזכורת :תהליך יצירת הפפטידוגליקן האיור מציג את תהליך יצירת הפפטידוגליקן .ניתן לראות את תהליך יצירת ה NAG-מגלוקוז ,הפיכתו ל- ,NAMקשירת הפנטה-פפטיד ,הקישור לבקטופרנול וקישור של יחידת NAGליצירת הדימר NAG- .NAMלאחר מכן הבקטופרנול מבצע היפוך והדימר נקשר לשרשרות הדופן הקיימות מחוץ לממברנה הפלזמטית .שימו לב שעל מנת לעבור היפוך חזרה פנימה ,הבקטופרנול צריך לעבור הידרוליזה של הפירופוספט. כל אחד מהשלבים האלה הוא מטרה לגיטימית לפעילות אנטיבקטריאלית: הידרוליזת הפירופוספט ,פגיעה ביצירת קשרי הצילוב וכדומה. מעכבי סינטזת הדופן • ציקלוסרין – מעכב את הרצמאז שהופך L-alaל .D-ala-הוא מעכב גם את הליגאז שמחבר .D-ala-D-alaמונע את יצירת הפנטה פפטיד ולכן אין קשרי צילוב .זהו אינו חומר אנטיביוטי מהשורה הראשונה כי יש לו תופעות לוואי על גוף המאחסן עקב פגיעה ברצפטור נוירוטרנסמיטור )כנראה בסינפסות גלוטמינרגיות(. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 50 • בציטראצין – מעכב את שלב הפירופוספורוליזה )הידרוליזת הפירופוספט( .הבקטופרנול ,כתוצאה, אינו יכול להתהפך חזרה אל תוך התא וסינטזת הדופן מעוכבת כתוצאה מכך. • ונקומיצין ,בטא-לקטם – פוגעים בתהליכי הצילוב של הפנטה פפטיד. אנטיביוטיקות בטא-לקטמיות הקבוצה הבטא-לקטמית מכילה את הטבעת הבטא- לקטמית שהיא החומר הפעיל והקבוצה הצדדית המשתנה על מנת לייעל את התרופה .הפניצילין הראשון שבודדו לא היה יעיל מכמה סיבות :הוא לא היה מסיס במיוחד ולא היה פוטנטי )היה צריך כמויות גדולות ממנו( .כמו כן הוא לא היה עובר ממברנות בקלות ולכן יעיל רק נגד גרם חיוביים. חברות רוקחות שינו את השייר כך שניתן יהיה לקבל את התרופה בבליעה ,שתהיה מסיסה ,שתהיה יעלה ותחדור ממברנות. דורות חדשים של בטא-לקטמים מכילים טבעת משושה של גופרית )עמידות בפני פירוק הפניצילין על ידי בטא-לקטמאזות( או טבעת עם פחמן ולא גופרית )יותר יציב(. פעילות הבטא-לקטם באיור ניתן לראות שתי שרשרות פפטידיות כאשר השיר של הליזין או ה Meso-יוצר קשר אמידי עם ה D-ala-הראשון .הקישור נעשה על ידי טראנס- פפטידאז שהוא penicillin-binding protein ) .(PBPבשלב הראשון הטראנס-פפטידאז יוצר קשר קוולנטי ל D-ala-בקשר אסטרי .בשלב השני האנרגיה של הקשר האסטרי נתרמת ליצירת הקשר האמידי החדש. הפניצילין מסוגל להיקשר להידרוקסיל של הסרין בטראנס-פפטידאז בקשר אסטרי יציב שמרעיל את הטראנס-פפטידאז – כעת האנזים "מועסק" ואינו מסוגל ליצור קשרי צילוב .התאים הגדלים ימותו מהתרופה – שכן הדופן שלהם מתפרקת לצורך הכנסת דימרים אבל הדימרים אינם נכנסים בפועל. שימו לב :רק תאים במצב גידול ימותו כתוצאה מהתהליך ,ולא תאים במצב סטציונרי! חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :08חומרים אנטיביוטיים – המשך 51 ונקומיצין בעוד שאנטיביוטיקות הבטא-לקטם מעכבות את אנזים הטראנס-פפטידאז, הונקומיצין תוקף את הסובסטרט שלו – האנטיביוטיקה נקשרת לD-ala-- D-alaבקשר חזק מאוד ובשל גודלה מונעת גישה מצד הטראנס-פפטידאז וכך מונעת יצירת קשרי צילוב. עיכוב על ידי תקיפת הסובסטרט ולא האנזים נראה מוזרה תחילה :שהרי אנזים נמצא בכמויות קטליטיות וסובסטרט אמור להיות בכמויות גדולות ,ולכן תידרש הרבה אנטיביוטיקה; בפועל ,יש מעט מאוד מסובסטרט ספציפי זה כי כל פעם נוצרים מעט מאוד דימרים חופשיים לצד הקישור שלהם לפפטידוגליקן. חיידקים מסויימים מסוגלים לשנות את הקשר על מנת להתגבר על האנטיביוטיקה – הם קושרים את D- alaהראשון לחומר Xכלשהו )כמו לקטאט(; כל עוד הוא עדיין מוכר על ידי טראנס-פפטידאז ואינו מוכר על ידי ונקומיצין השינוי מקנה עמידות. מעכבי בטא-לקטמאז חיידקים מסויימים יכולים לרכוש עמידות עקב מוטציה ב PBP-המשמרת את הפעילות שלו אך מונעת את קשירת הבטא-לקטם לטראנס-פפטידאז .עמידות נוספת יכולה להתקבל על ידי רכישת גן לבטא-לקטמאז. בטא לקטמאז הוא אנזים המפרק את הטבעת הבטא-לקטמית. מתברר שישנם חומרים המעכבים את הבטא-לקטמאז .אחד מהם הוא החומצה הקלאוולנית ,שהיא דומה לבטא-לקטם אך נקשרת חזק לבטא-לקטמאז ומונעת ממנו לפרק את הפניצילין .בפני עצמה ,החומצה הקלאוולנית היא אנטיביוטיקה לא יעילה כי היא לא מפרקת את הדופן; משום כך מכינים תערובת של החומצה עם פניצילין – החומצה מעכבת את הבטא-לקטמאז והפניצילין פוגע ביסנטזת הדופן )התרופה אוגמנטין(. אנטיביוטיקות כנגד סינטזת חלבונים רוב האנטיביוטיקות המוכרות כיום פועלות כנגד סינטזת החלבונים והריבוזומים .משפחה אחת היא משפחת האמינוגליקוזידים אליה משתייכים הסטרפטומיצין והקנמיצין .האמין של הקנמיצין וההידרוקסיל )התחתון( של סטרפטומיצין הם מטרות בתהליכי רכישת עמידויות. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 52 אריתרומיצין )משמאל( הוא גם חומר המעכב סינטזת חלבונים .טטראציקלין )למטה( מורכב מארבע טבעות שניתן להתמיר ולשנות על מנת לקבל נגזרות בעלות יעילויות גדולות יותר .הוא פוגע בסינטזת החלבונים על ידי פגיעה בריבוזומים. כלורמפניקול )למטה( מעכב סינטזת חלבונים אולם הוא אינו בקטריוציד אלא בקטריוסטטי – כאשר שוטפים את התאים מה CAM-הם יכולים להמשיך לגדול. פגיעה בסינטזת DNAוRNA- "ציפרו" ,ציפרופלוקסין ,היא אנטיביוטיקה המעכבת את אנזים ה .DNA-gyrase-הג'ייראז מתפקד בשיעתוק RNAעל ידי יצירת סדק בגדיל סדק וליפוף ה DNA-סביב עצמו; האנטיביוטיקה מונעת את הליפוך ולכן הג'ייראז יוצר סדקים ב DNA-בלי לתקן אותם .זוהי אנטיביוטיקה בקטריוצידית ,כי אין סינטזת RNAויש נזקים ל.DNA- פגיעה במסלולים מטאבוליים (THF) Tetrahydrofulateהינו קופקטור חשוב מאוד בחיי התא :הוא משמש ליצירת dTMPמ- ) dUMPבהיעדר טימידין התא מכניס אורציל ל DNA-במקום טימידין ,אולם ב DNA-יכולים להיכנס גם Aוגם Gמול .Uהדבר יוצר עודף מוטציות בתא המובילות להרג – ;(timinless deathגם CoA מכיל פנטוטנאט שהוא נגזרת של ;THFכמו כן ל THF-תפקיד בסינטזת מתיונין. כל החומרים האלה – מתיונין ,טימידין ,פנטוטנאט – ניתן לספק חיצונית .הדבר היחיד שלא ניתן לספק הוא פורמיל-מתיונין .tRNA-זהו ה initiator tRNA-של החיידקים – tRNAשקשור למתיונין שעבר מודיפיקציה על ידי פורמיל .תכונה זו אינה קיימת באאוקריוטים .מכיוון שהפורמיל נתרם על ידי THF והפורמילציה נעשית על גבי ה tRNA-הטעון במתיונין ,לא ניתן לספק את החומר חיצונית .חיידקים ללא THFאינם יכולים ליצור Initiator tRNAולכן סינטזת החלבונים נעצרת. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :08חומרים אנטיביוטיים – המשך 53 THFבנוי משלוש קבוצות :פטירין ,פרא-אמינו בנזואט וגלוטמאט .הסינטזה מתחילה מיצירת הפטירין ,חיבור הבנזואט ואז חיבור הגלוטמאט .לאחר חיבור הבנזואט מחוזר הקשר הכפול באחת טבעות הפטירין על מנת להפוך אותו לטרטאהידרופולאט. כל חומר שייפגע בכל אחד מהאנזימים הפעילים בסינטזה זו הוא חומר אנטיביוטי .אחד החומרים האנטיביוטיים הראשון הוא סולפא )(Sulfanilamide שהוא אנאלוג לבנזואט .הוא נקשר לאנזים שקושר את הבנזואט ומונע את בניית ה.THF- הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 54 מעכב שני מעכב את ה ,DHFR-רדוקטאז של השלב האחרון בסיננטזה .הוא מעוכב על ידי טרימטופרין, אך היופי בחומר הוא שהוא לא מעכב את ה DHFR-ההומני )אשר מחזר את הקשרים הכפולים בחומצה הפולית הנקלטת מהמזון ליצירת .(THFחומר מעכב נוסף הוא מטראטוקסאט ,בו משתמשים בכימותרפיה בסרטן .העיכוב של DHFRבסרטן מונע יצירת טימידין ,הנחוץ לתאים הסרטניים המתחלקים. היום משתמשים גם בטרימטופרין יחד עם סולפא על מנת לעכב שני צעדים במסלול ולהוות אנטיביוטיקה חזקה יותר ,שיש בה פחות סיכוי למנגנוני עמידות. מנגנוני עמידות עם האבולוציה של הפרוקריוטים ,עקב חשיפה לחומרים ,נוצרו עמידויות לחומרים אנטיביוטיים. העמידויות הן ממספר סוגים: • האנטיביוטיקה כבר לא חודרת לתא – עמידות לא שכיחה שאינה מאפשרת חדירה של האנטיביוטיקה לתא .דוגמה היא פניצילין שאינו חודר את המממברנה החיצונית של גרם שלילי. • שינוי אתר המטרה – למשל שינוי אתר המטרה של פניצילין או שינוי אתר המטרה d-ala-d-ala של ונקומיצין .שינויים כאלה הם מורכבים ,כי הם דורשים שיחד עם אובדן יכולת האנטיביוטיקה לזהות את המטרה ,המטרה לא תאבד פעילות )אם היא אנזים( או כושר זיהוייה בתא )אם היא סובסטרט(. • אינאקטיבציה של החומר האנטיביוטי – למשל הבטא-לקטמאז המפרק את הטבעת הבטא-לקטמית. • יצירה של מסלולים עוקפים למסלול המטאבולי המעוכב. • – Effluxתאים רוכשים משאבות שמוציאות את החומר האנטיביוטי החוצה .ישנה משאבה שמקנה עמידות חיידקית לטטראציקלין )וזהו הגן לעמידות לטטראציקלין שנמצא על פלסמידים( .זהו חלבון ממברנלי שתפקידו הנרכש הוא שאיבת טטראציקלין אל מחוץ לתא כך שהריכוז נמוך מכדי לעכב ביעילות את סינטזת החלבונים. חלק מהגנים לעמידויות הם כרומוזומליים – כלומר מוטציה ספונטנית בכרומוזום שהקנתה עמידות. עמידויות אחרות הן גנים שלמים הנישאים על גבי פלסמיד .בשנות ה 70-התגלה חיידק שפיתח כמעט בן לילה עמידות לחמש אנטיביוטיקות מסוגים שונים .מתברר שהחיידק העמיד נשא פלסמיד שעליו היו הגנים לעמידויות לכל האנטיביוטיקות הללו .הפלסמיד היה פלסמיד קוניוגטיבי שיכול לעבור בין מינים וזנים שונים של חיידקים – וכך הופץ בין סוגים שונים של חיידקים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :08חומרים אנטיביוטיים – המשך 55 עמידויות נוספות יכולות להינתן על ידי ייצור יתר :דוגמה לכך היא הטרימטופרין הנקשר ל.DHFR- הטרימטופרין הוא מעכב תחרותי לא-הופכי; אם החיידק ייצר פי 10יותר מהאנזים שהוא מטרת האנטיביוטיקה ,יישארו אנזימים לא-מעוכבים ברמה כזו שהם יוכלו לבצע את תפקידם בצורה יעילה. הגברה כזו יכולה להיעשות על ידי מוטציה בפרומוטור שתגרום לייצור עודפים של mRNAשל האנזים. דרך אחרת היא קבלת גן לאנזים אחר לחלוטין שמסוגל לעשות את הפעולה של DHFRאולם אינו רגיש לאנטיביוטיקה נגדו. אנזים חיידקי אחר עושה מודיפיקציה של ההידרוקסיל בסטרפטומיצין או אצטילציה של האמין בקנמיצין. פעולות אלו גורמות לאינאקטיבציה של האנטיביוטיקה .גם בכלורמפניקול יש מודיפיקציות כאלה. עמידויות נחלקות לשתיים: • עמידויות ספונטניות בכרומוזום שגורמות לשינוי במטרה של האנטיביוטיקה. • עמידויות על ידי גנים חיצוניים שמביאים אנזימים שעושים מודיפיקציה לחומר האנטיביוטי, אנזימים אלטרנטיבים לאנזימי המטרה וכדומה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב
© Copyright 2024