1. No category

BIONANOTEHNOLOGIJA
Navodila za vaje
Vera Župunski in Gregor Gunčar
Maj 2013
UVOD
Protitelesa so približni 150 kDa veliki glikoproteini, ki so sestavljeni iz dveh težkih in dveh lahkih
verig, povezanih z disulfidnimi vezmi (Slika 1). Lahka veriga (25 kDa) ima na N-koncu variabilno
domeno (VL) in konstantno domeno (CL) na C-koncu. Težka veriga (50 kDa) pa ima na N-koncu
variabilno domeno (VH) in nato tri ali štiri konstantne domen (CH). Imunoglobuline lahko strukturno
razdelimo na Fab – fragment, ki se veže na antigen (VL-CL in VH-CH1; 50 kDa), in konstantno regijo Fc
(CH2-CH3, 25 kDa). Variabilni regiji težke in lahke verige imata značilno trodimenzionalno strukturo,
imenovano imunoglobulinsko zvitje, ki predstavlja sendvič iz dveh antiparalelnih β struktur,
povezanih z disulfidno vezjo. Vsaka variabilna domena ima tri CDS (complementarity determining
sequnce), to so zanke, ki se vežejo na antigen. Zanke so zelo varabilne regije, ki se razlikujejo po
dolžini in zaporedju aminokislin. Površina protitelesa, ki se nekovalentno veže na antigen (epitop), se
imenuje paratop.
Slika 1: Imunoglobulini (IgG) in nanotelesa (Nb). Prikazana je shema protiteles, ki so v serumu
kamelid. IgG1 so klasična protitelesa z dvema lahkima in dvema težkima verigama. IgG2 in IgG3 pa so
protitelesa s težko verigo (havy chain antibodies – HCAbs), ki se razlikujejo v dolžini verige med VHH
in CH2. Nanotelesa (Nb) so samostojne VHH verige, ki so topni proteini in prepoznajo antigen. VLvariabilna regija lahke verige, VH-variabilna regija težke verige, CH-konstantna regija težke verige, Fcfragment, ki kristalizira (crystallizable fragment), scFv-enojna veriga variabilnega fragmenta (single
chain variable fragment), VHH-variabilna regija težke verige v imunoglobulinih s težko verigo, Nbnanotelo (nanobody).
Posebna protitelsa, ki imajo le težko verigo, so odkrili pri kamelidah (kamele, lame) in ribah
hrustančnicah (morski pes). Iz seruma kamelid so izolirali tri vrste protiteles (Slika 1): IgG1, IgG2 in
IgG3. IgG1 so klasična heterotetramerna protitelesa, IgG2 in IgG3 pa so homodimeri z dvema težkima
verigama in jih imenujemo protitelesa s težko verigo (HCAb – havy chain antibody). Težka veriga je
manjša od klasične, ker nima CH1 regije. Antigen prepozna le ena domena (VHH) - variabilna regija
težke verige. Delež protiteles s težko verigo je pri kamelidah starega sveta približno 50 %, pri
kamlidah novega sveta pa približno 30 %. Nastala so iz klasičnih protiteles z adaptivnimi
spremembami in prispevajo k imunskemu odgovoru lam in kamel.
Nanotelesa so rekombinantne topne VHH domene, velika nekaj nanometrov z molekulsko maso
približno 15 kDa. So najmanjše molekule, ki prepoznajo antigen, in imajo v primerjavi z variabilno
regijo težke verige zamenjanih 5 aminokislin. Spremembe nekaterih hidrofobnih aminokislin v
hidrofilne omogoča nanotelesom, da so topni proteini. Enostavno jih pridobivamo v bakterijah v
topni frakciji, v večjih količinah pa jih pripravljajo v kavsovkah ali listih tobaka. Nanotelesa imajo
klasično imunoglobulinsko zvitje z nekaj razlikami, ki jim omogoča večjo variabilnost. Nanotelesa se
ne vežejo le na epitope na površini antigenov, ampak prepoznajo tudi mesta, ki ponavadi niso
antigenska kot so aktivna mesta encimov ali vrzeli v biomarkerjih virusnih in bakterijskih bolezni.
Številne lastnosti dajo nanotelesom prednosti pri uporabi pred klasičnimi protitelesi. Nanotelesa so
majhne – enodomenske molekule, ki se hitro sintetizirajo in lažje prodrejo skozi tkiva. Njihovo
rekombinantno izražanje je enostavno in tudi cenovno bolj ugodno. Molekule so zelo obstojne, tudi
pri 4°C ali celo sobni temperaturi, in se lahko po denaturaciji ponovno zvijejo (refolding). Poleg tega
so slabo imunogena. Uporabljajo se kot raziskovalno orodje za blokiranje interakcij med proteini,
pomoč pri kristalizaciji, za lokalizacijo molekul v celici. Na nanotelo je pripet GFP – zeleni
fluorescenčni protein, s pomočjo katerega nanotelo označi iskani antigen v celici. V diagnostiki se
nanotelesa uporabljajo kot biosenzorji, ker se na nasprotno stran od paratopa lahko veže senzorna
molekula. Nanotelesa, povezana z magnetnimi nanodelci omogočajo večjo občutljivost pri določanju
analita. Ker so majhni in imajo kratko življensko dobo v krvi, so zelo primerni za radioimunoterapijo in
in vivo slikanje. Uporabljajo se kot protistrupi za živalske toksine. Številna nova zdravila na osnovi
nanoteles, ki prepoznajo viruse, bakterije in molekule, ki povzročajo bolezni (IL6R, TNFα...), so v
kliničnih študijah.
NAVODILA ZA EKSPERIMENTALNO DELO
Izražanje hipervariabilne vezavne domene za kofein
I.
Gojenje celic BL21 DE3 bakterije E. coli z vektorjem za zapis hipervariabilne vezavne
domene za kofein (pripravi asistent)
Vektor pE-SUMO z zapisom za hipervariabilno vezavno domeno za kofein smo vnesli v ekspresijski sev
BL21 DE3 bakterije E. coli. Za prekonočno kulturo smo iz trdega gojišča LBA prenesli eno kolonijo
bakterij v 30 mL medija MDB (25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM
MgSO4, 0,5 % glukoza, 0,25 % aspartat) z ampicilinom in približno 18 h stresali pri 37°C. Prekonočno
kulturo smo shranili pri 4°C, kjer je obstojna do 4 tedne.
V veliko (2 L) stresalno erlenmajerico smo dali 400 mL avtoinducirajočega medija ZYM-5052 (1 % N-Zamin AS, 0,5 % kvasni ekstrakt, 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM
MgSO4, 0,5 % glicerol, 0,05 % glukoza, 0,2 % laktoza) z ampicilinom, v katerem smo 1000x redčili
prekonočno kulturo. Bakterije smo stresali približno 24 h na 37°C pri 160 o/min, dokler je naraščala
absorbanca pri valovni dolžini 595 nm (optična gostota - OD595). Celice smo iz gojišča odcentrifugirali
pri 8000 g 20 min pri 4°C in jih resuspendirali v 40 mL vezavnega pufra (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 20
mM imidazol, pH 7,5) za Ni-kelatno kromatografijo. Shranili smo alikvot za analizo na NaDS PAG (1lizat). Celice smo homogenizirali s homogenizatorjem ter resuspendirali s pipeto in jih shranili na 80°C.
Potek dela:
II.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Izolacija hipervariabilne vezavne domene za kofein iz celic
Celice BL21 DE3 bakterije E. coli, v katerih se je izražala hipervariabilna vezavna domena za
kofein odmrznemo v hladni vodi. Vsebino vseh centrifugirk združimo v hladno čašo, ki mora
biti ves čas na ledu. Celični lizat v čaši na ledu sonificiramo 4x po 5 min z vmesnim intervalom
dveh minut (na ledu!). Medtem pripravite pufer S.
Ko lizat ni več viskozen (DNA, ki se sprosti iz celic, povzroči viskoznost), ga centrifugiramo v
alikvotih po 20 mL 20 min pri 13.000g in 4°C. Shranimo alikvot usedline (2-netopno) in
supernatanta (3-topno) za analizo na NaDS PAG.
Supernatante združimo in prefiltriramo s pomočjo črpalke najprej skozi filter s porami
velikosti 0,45 m, nato še skozi filter s porami velikosti 0,2 m.
Če je kolona shranjena v 20 % etanolu, jo najprej 15 min spiramo z vodo, nato še 15 min z
vezavnim pufrom (v katerem je pripravljan vzorec). Kolono spiramo z 10. do 15. volumni
kolone (volumen kolone je 1 mL).
S črpalko (počasi) nanesemo vzorec na Ni kolono, kamor se veže hipervariabilna vezavna
domena za kofein s histidini, ki so na N-terminalnem koncu. Pod kolono postavimo čašo,
kamor lovimo nevezano frakcijo. Shranimo alikvot za analizo na NaDS PAG (4-nevezano) in
celoten nevezan vzorec shranimo na ledu.
Kolono spremo s pufrom S (20 mM Tris pH 8,0 in 150 mM NaCl) (10 volumnov kolone), da
odstranimo nevezane proteine (shranimo alikvot za analizo na NaDS PAG – 5-sprano) in v
koloni zamenjamo pufer, v katerem je encim SUMO-peptidaza najbolj aktiven (pufer S + 1
mM DTT).
Na kolono nanesemo 1 mL (kolikor je volumen kolone) raztopine SUMO-peptidaze (pufer S, 1
mM DTT, koncentracija SUMO-peptidaze je:____________) in inkubiramo preko noči pri 4°C.
SUMO-peptidaza bo cepila fuzijski protein tako, da SUMO ostane vezan na koloni,
hipervariabilno vezavno domeno(VHH) za kofein pa eluiramo s kolone z 2x po 1 mL pufra S.
Shranimo alikvot za analizo na NaDS PAG (6-vezano-VHH). Izmerimo koncentracijo vzorcev z
Nanodrop aparaturo. Iz 800 mL bakterijskih kultur smo izolirali_______mg nanoteles proti
kofeinu.
9.
Regeneracija Ni-kelatne kolone: na kolono z brizgalko počasi nanesemo 2x po 1 mL
elucijskega pufra (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, pH 7,5), da eluiramo SUMO
protein. Shranimo alikvot za NaDS PAG (7-SUMO). Kolono dobro speremo z več volumni
kolone z vodo in shranimo v 20 % etanolu.
III.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Vezava hipervariabilne vezavne domene za kofein na nanocevke in detekcija kofeina s
HPLC
Nanocevke (vrsta:_____________) v mikrocentrifugirki sonificiramo v 1 mL pufru S z 1 mM
DTT 5 min (na ledu!) in dodamo raztopino VHH za kofein ter inkubiramo preko noči pri 4°C,
stresamo.
1 mL raztopine nanocevk prenesemo v mikrocentrifugirko in centrifugiramo 3 min na 3000 g.
Shranimo alikvot za merjenje koncentracije nanoteles v supernatantu (to so nanotelesa, ki se
niso vezala na nanocevke).
Nanocevke 3x speremo z 1 mL pufra S z DTT, resuspendiramo s pipeto in vsakič
centrifugiramo 3 min na 3000 g. Supernatant zavržemo.
Pripravimo 1,5 mL 10x redčitve filtrirane kave. Redčimo s pufrom S z DTT. 1 mL nanesemo na
nanocevke, jih resuspendiramo in 30 min vrtimo.
Ponovno centrifugiramo kot prej in supernatant prenesemo v novo mikrocentrifugirko.
Centrifugiramo 2 min pri 13000 g. Supernatant prenesemo v novo centrifugirko.
S HPLC metodo z reverzno fazo bomo določili količino kofeina v vzorcu, ki smo ga nanesli na
nanocevke z nanotelesi. Vsi pufri in vzorci morajo biti filtrirani ali centrifugirani, da se kolona
ne zamaši. Na C18 kolono najprej nanesemo standard: 100 L 5 mg/mL kofeina.
Nato nanesemo še 2 vzorca: 200 L 10x redčene kave in 200 L 'nevezane' kave (10x redčena
kava, ki se ni vezala na nanocevke). Mobilna faza je 0,1 % trifluorocetna kislina, eluirano z
gradinetno elucijo do 90 % acetonitrila. Primerjajte površino pod pikom za kofein obeh
vzorcev.
IV.
Analiza vzorcev med izolacijo VHH za kofein z NaDS PAGE
18.
Pripravite 12,5 % akrilamidni gel vsem sedmim vzorcem dodajte ustrezno količino NaDS
nanašalnega pufra, vzorce inkubirajte pri 100°C 5 min, kratko centrifugirajte in nanesite na
gel skupaj s standardom.
Elektroforeza naj teče pri 35 mA toliko časa, da gre barvilo iz gela.
Po navodilih pobarvajte gel in ga nato razbarvajte.
19.
20.
Komentirajte rezultate!
Vprašanja za razmislek:
Koliko kofeina se je vezalo na nanocevke? Je metoda za detekcijo ali dekofeinizacijo pijač primerna?
Ali se je VHH izražala v BL21 sevu? Ste dobili ustrezne, dovolj veliko količino VHH?