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CURSO DE
RASTROS
Y
HUELLAS INDICIARIAS
EN
CASOS CRIMINALES
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
MÓDULO 7
ÍNDICE

Indicios químicos.

Sangre. Ensayos in situ.

Análisis de patrones hemáticos.

Semen.

Saliva

Capilares pilosos.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Indicios químicos
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Sangre
Antes de comenzar a desarrollar el tema de la investigación de manchas de
sangre, se hace necesario describir las características de la misma, funciones
en el organismo y sistema en donde efectúa dichas funciones.
La sangre podría definirse de manera simple, como un “tejido líquido”,
químicamente como una suspensión celular en un medio acuoso salino.
Tomando esta última definición recordemos que una suspensión en química es
un sistema heterogéneo y como tal presentará más de una fase. Efectivamente
los elementos celulares, sólido, están suspendidos en un medio liquido, que
denominamos plasma, en el cual también están normalmente disueltos
diversos solutos, como electrolitos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, etc.
La función de este tejido es transportar, tanto el oxígeno como el anhídrido
carbónico, productos relacionados con la respiración de cada una de las
células de un organismo vivo, como también, los elementos nutrientes y los
productos de catabolismo de la función metabólica de las mismas. Esta función
puede efectuarse mediante la utilización del aparato circulatorio, el cual es un
sistema cerrado por el que circula la sangre constituido por los vasos
sanguíneos e impulsada por una “bomba” aspirante y propelente, que es el
corazón.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Este sistema está distribuido por toda la anatomía mediante arterias, venas y
capilares de modo de poder abastecer a todas y cada una de la anatomía.
En la sangre básicamente tenemos tres tipos de células, los glóbulos rojos o
hematíes, los glóbulos blancos o leucocitos y las plaquetas.
Los glóbulos rojos o hematíes son células anucleadas, de forma cilíndrica,
bicóncava de aproximadamente 7µ de diámetro. En su interior contienen una
solución concentrada, aproximadamente al 30% de una proteína denominada
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hemoglobina y que es la responsable del transporte e intercambio gaseoso ya
mencionado.
El oxígeno en los pulmones se combina con el grupo hemo de la proteína, que
contiene un átomo de Fe, formándose la oxihemoglobina, dicho oxígeno es
liberado en los tejidos a nivel celular, intercambiando por el CO2 producto de la
respiración celular, formándose ahora la carboxihemoglobina, la cual, ahora
circulará nuevamente hasta los pulmones, en donde se producirá un nuevo
intercambio de los gases para regenerarse la oxihemoglobina ya mencionada.
Este intercambio gaseoso se produce simplemente por acción de la presión
parcial de los gases, siendo a nivel pulmonar, mayor la de O 2 y a nivel tisular,
mayor la de CO2, y por la ley de acción de masas es posible tal intercambio.
Como ya se ha mencionado, la segunda importante función de la sangre es la
de aportar los elementos nutrientes y ayudar a trasladar los productos
metabólicos hasta los órganos de eliminación.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Un ser humano tiene aproximadamente 15g de Hb (hemoglobina) por cada
100ml de sangre. Por supuesto que estos valores son sumamente variables
según sexo, edad y situación; estando disminuidos sensiblemente, en casos de
anemia, e incrementado en individuos con importante actividad física.
La volemia, es decir en volumen total de sangre en un humano, es
aproximadamente el 7% del peso total. Por lo tanto en un sujeto de 70Kg, la
volemia será de aproximadamente 5 litros.
La concentración de glóbulos rojos oscila entre 4 y 5 millones/mm 3, valores
también bastante variables según sexo, edad y condición. Por ej. en una mujer
embarazada es frecuente una disminución de alrededor de un 5%, lo cual es
fisiológico debido a su estado de gestación. También el organismo puede
modificar sustancialmente tal valor según las condiciones de vida. Es típico el
ejemplo de una persona radicada a una importante altura sobre el nivel del
mar, por ej. la ciudad de La Paz (Bolivia), que tendrá aumentado
considerablemente tal concentración a raíz del menor tenor de oxígeno en el
aire que respira y que el organismo
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trata de compensar con tal aumento. Esa misma persona, si se radicara al nivel
del mar, paulatinamente disminuiría su nivel globular.
Los glóbulos blancos o leucocitos tienen núcleo y citoplasma y los podemos
dividir según el aspecto del núcleo en polinucleados y mononucleados;
corresponden a los primeros, los neutrófilos, eosinófilos y basófilo y en los
segundos, linfocitos y monocitos. La dimensión del diámetro de los linfocitos es
un poco menor que la de los hematíes, alrededor de 5µ, mientras que los
restantes son mayores, aproximadamente 10µ.
Se los diferencia claramente en preparados que se denominan frotis o
extendidos, que consiste en depositar una gota de sangre fresca sobre un
extremo de un portaobjetos y apoyando sobre la misma otro portaobjetos con
una inclinación adecuada, realizar un desplazamiento suave y constante de
manera de generar una lámina fina de material, el cual se fija al secarse y se
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colorea con un colorante apropiado. El más común se denomina May
Grunwald-
Giemsa
y
observados
al
microscopio,
por
las
distintas
características morfológicas y tintoriales e incluso sus nombres están
relacionados con las modificaciones que ejercen sobre el colorante por sus
distintos pH.
La concentración leucocitaria en un individuo normal varía de 5000 a
8000/mm3, teniendo una distribución que podríamos establecer así:
 Neutrófilos: 60-70%
 Eosinófilos: 2-4%
 Basófilos: 0-2%
 Linfocitos: 25-35%
 Monocitos: 4-8%
Estos valores pueden modificarse bastante y se deben tomar sólo como
referencia.
En
ciertas
circunstancias
sustancialmente,
la
fundamentalmente
concentración
como
puede
respuesta
a
incrementarse
una
agresión
bacteriana, es típico en casos de infecciones dentales, intestinales o vesicales.
Del mismo modo como la primera defensa ante el agresor bacteriano está
constituida por los neutrófilos, el porcentaje de los mimos también se verá
sustancialmente incrementado en estas situaciones.
Los linfocitos tienen respuestas ante las agresiones virósicas, por ejemplo, en
la mononucleosis infecciosa se nota un notable aumento de su participación,
que llega incluso a invertir la proporción detallada más arriba. Generalmente
acompañados por los monocitos.
Los eosinófilos se incrementan durante un proceso alérgico o una parasitosis y
su proporción puede aumentar considerablemente hasta valores del orden del
20%.
Las plaquetas son pequeñas células que se encuentran en el orden de 200.000
a 300.000/mm3 y cuya función es la de producir obturaciones en las pequeñas
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lesiones que pueden sufrir los vasos por los que circula la sangre, de manera
de anular pequeñas hemorragias que podrían producirse. Cuando por alguna
patología dicha concentración se modifica, pueden producirse alteraciones
importantes, pues una disminución irá acompañada de la aparición de
hematomas, púrpura y un incremento puede producir obstrucciones en el flujo
de los pequeños vasos con las complicaciones de modificar o impedir el normal
reflujo sanguíneo.
Finalmente el medio dispersante, al que hemos denominado plasma, es una
solución acuosa que contiene sales, lípidos, hidratos de carbono, proteínas y
también numerosas sustancias metabólicas, hormonales, etc. que son
fabricadas o absorbidas y modificadas, fundamentalmente en el hígado y que
deben ser transportadas a través de la anatomía de un ser vivo. Como veremos
más adelante la concentración salina es crítica y existe un complejo sistema
regulatorio para su conservación.
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Antígeno y anticuerpo
Se denomina antígeno a cualquier sustancia extraña que, introducida en el
interior de un organismo, provoque una respuesta inmunitaria, estimulando la
producción de anticuerpos.
Los anticuerpos son proteínas pertenecientes al grupo de las gamaglobulinas o
inmunoglobulinas,
constituidas
por
la
asociación
de
cuatro
cadenas
polipetídicas unidas entre sí mediante puentes di-sulfuro, dos cadenas se
denominan pesadas y las otras dos ligeras. A su vez, cada una de las cadenas
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ligeras y pesadas incluye una región variable, cuya secuencia de aminoácidos
es peculiar de cada anticuerpo, y una región constante, con la misma
secuencia en todos los anticuerpos.
La reacción antígeno-anticuerpo
La unión antígeno-anticuerpo es específica, cada anticuerpo reconoce y se une
a un determinado antígeno. Esta unión se realiza por medio de uniones
intermoleculares entre el antígeno y la zona del anticuerpo, y da lugar al
complejo antígeno-anticuerpo según el modelo llave-cerradura.
Las reacciones antígeno-anticuerpo tienen diversas consecuencias y existen
varios tipos de reacciones:
En este caso el antígeno se encuentra disuelto, y al unirse los anticuerpos a los
antígenos se forman unos macro complejos moleculares, formándose como
una red tridimensional que debido a su tamaño precipita.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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En las reacciones de aglutinación, un anticuerpo puede unirse a la vez a dos
antígenos, así mismo cada antígeno puede unirse a varios anticuerpos y formar
entramado de complejos antígeno-anticuerpo.
Si el antígeno es una sustancia tóxica, la
unión
con
el
anticuerpo
provoca
su
neutralización, de modo que no puede ejercer
su efecto tóxico.
El anticuerpo puede recubrir al antígeno
para
que
fagocitos,
sea
esta
reconocido
reacción
por
se
los
llama
opsonización, y es como si los antígenos
fueran
más
“sabrosos”
para
ser
fagocitados.
Algunos ejemplos de la actividad del mecanismo inmunológico
Todos conocemos las características de las denominadas vacunas, tienen la
propiedad de generar defensas para una determinada enfermedad, sarampión,
poliomelitis, tuberculosis, etc. En general el mecanismo consiste en inocular el
agente infectante en condiciones atenuadas, de modo que si bien no puede
generar la enfermedad tiene su capacidad antigénica intacta para generar las
defensas adecuadas, anticuerpos, los cuales podrán defender al organismo si
se plantea la invasión por el agente infectante real. Por supuesto esta
generación es paulatina, y es por ello que la vacunación no puede efectuarse
cuando ya comenzó la enfermedad, sino que debe aplicarse preventivamente,
de modo que haya tiempo para elaborar los anticuerpos.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Otro ejemplo que sirve para entender esta situación, es el caso del nacimiento
de un bebé Rh positivo a partir de una madre que sea Rh negativo. El factor Rh
es una proteína, que como veremos más adelante, puede estar presente o no
en la pared del glóbulo rojo, cuando lo está, se trata de un sujeto Rh positivo,
de lo contrario se tratará de un sujeto Rh negativo. En el caso planteado, el feto
lo tiene, y por consiguiente durante el embarazo, por tener función antigénica
va sensibilizando el mecanismo inmunológico de la madre, que por no tenerlo,
lo reconoce y comienza a reaccionar. Sin embargo, raramente el nivel de
anticuerpos generado es alto durante un primer embarazo y por lo tanto es
probable que no haya demasiados problemas.
Si sucede un segundo embarazo con las mismas características, el mecanismo
inmunológico de la madre está sensibilizado y rápidamente alcanzará el nivel
de anticuerpos una tasa más alta, que comenzará a afectar los glóbulos rojos
del feto y como consecuencia provocará su destrucción. A eso se debe la
necesidad de “cambiar la sangre del bebé”. Sucede que sus glóbulos rojos
están profundamente deteriorados y lisados parcial o totalmente, por lo tanto,
cuando se produce el nacimiento y la necesidad de autonomía respiratoria, la
incapacidad es manifiesta y a ello se debe la necesidad de transfusión
inmediata.
En algunos casos las lesiones se evidencian simplemente por la “ictericia del
recién nacido”, en donde el efecto no ha sido tan profundo pero la hemoglobina
liberada por los glóbulos rojos dañados se ha transformado en bilirrubina la que
es responsable de dicha ictericia.
Nuevamente verificamos que el sistema inmunológico funciona ante un factor
con propiedades antigénicas, pero sin una respuesta inmediata sino paulatina.
Volviendo al tema de la sangre todos conocemos la existencia de diversos tipos
de sangre, en el sistema más común el ABO, conocemos la existencia de
grupos sanguíneos diferentes: A, B, AB y O, ello es debido a la presencia y/o
ausencias de dos antígenos, A y B en la membrana de los glóbulos rojos. Así
los del grupo A, lo son por tener en su membrana el antígeno A, los del grupo
B, el antígeno B, los del grupo AB, tendrán el antígeno A y el B y los del grupo
O (mal denominado grupo 0) se denominan así por no tener ninguno de los
dos.
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Cuando comenzó a experimentarse con transfusiones de sangre, pudieron
verificarse situaciones contradictorias, pues en algunos casos se obtenían
resultados positivos con espectaculares mejorías y en otros el paciente
empeoraba manifiestamente y llegaba hasta la muerte rápidamente.
Posteriormente y con la clasificación de la sangre por grupos pudo explicarse
dichas contradicciones, no obstante no se justificaba la rapidez de la respuesta
obtenida. Esto se explicó cuando se estableció que en el plasma sanguíneo
podían preexistir anticuerpos anti A y anti B, los cuales era responsables de la
inmediata respuesta a la presencia antigénica.
Por consiguiente, de acuerdo al Sistema ABO la sangre contiene según su tipo
la siguiente composición antigénica:
Tipo A
Antígeno A
Anticuerpo anti B
Tipo B
Antígeno B
Anticuerpo anti A
Tipo AB
Antígeno AB
No tiene anticuerpos
Tipo O
No tiene antígenos
Anticuerpos anti A y anti B
En función del cuadro precedente es simple advertir que no pueden
suministrarse glóbulos con característica antigénica incompatible con los
anticuerpos presentes en el receptor. De ese modo podremos concluir que los
glóbulos O, por carecer de antígenos serán compatibles con todos los
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receptores sean del grupo que sean, es por ello su denominación de dador
universal. Los glóbulos AB sólo serán útiles para receptores del mismo grupo,
pues los mismos no tienen anticuerpos mientras que en cualquiera de los otros
existen anticuerpos y por consiguiente serán rechazados. El mismo
razonamiento puede hacerse para los glóbulos A y B, verificándose que eran
útiles para sus respectivos grupos. Es destacable el hecho de que un receptor
AB por no tener anticuerpos podrá recibir sangre de cualquier grupo.
Este concepto de estructura es fundamental para entender con claridad todos
los métodos que veremos para establecer el grupo sanguíneo de una mancha
de sangre, de modo que se sugiere se preste particular atención a su correcta
comprensión.
Determinación de Grupo y factor Rh en sangre fresca
Denominamos sangre fresca a sangre recientemente extraída por punción
venosa y anticoagulada. Seguramente habrán visto en alguna ocasión que se
ofrece efectuar la determinación punzando el pulpejo del dedo y luego aplicar
una gota de sangre sobre una tarjeta de plástico. El método funciona pero para
mayor seguridad numerosos laboratorios efectúan la determinación con sangre
obtenida por punción venosa.
Como ya mencionamos, para evitar la coagulación de la sangre una vez
extraída es necesario utilizar un complejante del calcio, en nuestro caso
utilizaremos EDTA di sódico, de modo de mantener la forma de las células y
evitar el mecanismo de la coagulación. El método consiste en colocar en un
tubo adecuado que contenga II gotas del anticoagulante
mencionado en
solución al 3%, 2ml de sangre recientemente extraída y agitar suavemente para
lograr la mezcla íntima de sangre y solución anticoagulante.
Con el material así obtenido se practica el análisis confrontando sobre una
placa de vidrio limpia y seca, que presenta 3 círculos bien delimitados, una gota
de la sangre homogeneizada con una gota de suero Anti A, otra con suero Anti
B y una vez depositadas ambas gotas en cada círculo, se procede al mezclado
de ambas con un palillo observándose si aparece o no aglutinación en cada
caso, la misma se manifiesta por la formación de “grumos” más o menos
importantes.
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Debemos tener en cuenta que estamos confrontando los anticuerpos presentes
en los sueros Anti respectivos con los antígenos eventualmente presentes en la
sangre investigada. Por consiguiente según los resultados obtenidos
tipificaremos la sangre problema.
En el siguiente cuadro se puede verificar las distintas variantes de resultados
posibles:
Suero anti A
Suero anti B
Suero anti D
Grupo Sanguíneo
(Rh)
Positivo
Positivo
Positivo
AB Rh positivo
Positivo
Negativo
Positivo
A Rh positivo
Negativo
Positivo
Positivo
B Rh positivo
Negativo
Negativo
Positivo
O Rh positivo
Como sabemos, los distintos sueros aportan los anticuerpos respectivos y un
resultado positivo indica que en los glóbulos se estableció la presencia de los
antígenos respectivos, en función de ello es el resultado que se escribe en la
columna Grupo sanguíneo.
Los sueros tipificadores se obtienen mediante la inoculación reiterada de
glóbulos rojos lavados A o B, respectivamente, a animales de experimentación,
habitualmente carneros o caballos. Los glóbulos rojos lavados se obtienen a
partir de sangre anticoagulada de sujetos A o B. Por centrifugación se procede
a separar los elementos celulares del plasma, el cual se decanta y es
reemplazado 2 ó 3 veces con solución fisiológica, de modo de eliminar todas
las proteínas contenidas en el plasma, quedando finalmente una suspensión en
solución fisiológica de hematíes portadores de los respectivos antígenos que
serán los responsables de la generación de los respectivos anticuerpos por
parte del sistema inmunológico del animal de experimentación.
La inoculación sucesiva estimula la producción de anticuerpos y cuando se
alcanza un título (concentración) apropiada, se procede a extraer sangre al
animal, permitiendo su coagulación y obteniéndose así un suero con elevada
concentración de anticuerpos anti A o anti B según el caso.
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Estos sueros se producen de manera comercial de modo que el acceso a los
mismos es sencillo.
Identificación Químico Legal de manchas de sangre
1.
Color y aspecto
Las manchas de sangre difieren según sean recientes o antiguas, puras,
contaminadas, o sometidas a acción de lavado y también según el soporte
sobre el cual se asientan.
Sobre soportes claros y absorbentes, las máculas aparecen de contornos netos
y bien diferenciables. Sobre soportes oscuros pueden pasar desapercibidas,
especialmente si se hallan evolucionadas y aún pueden confundirse con
manchas de herrumbre. Las manchas recientes presentan color escarlata
brillante; a la luz natural se van opacificando y adquieren color castaño, por la
formación de hematina, en forma progresiva. Determinadas condiciones
pueden acelerar esta transformación, por ejemplo prolongada exposición a la
luz solar, calentamiento, tratamiento con diversos agentes químicos, etc.
Cuando se encuentran sobre soportes no absorbentes, pueden conservar su
forma primitiva, según el ángulo de caída y altura, lo cual puede dar un indicio
del movimiento del o de los causantes de su aparición. Por desecación forman
pequeñas masas que suelen presentar fisuras o resquebrajamientos,
produciéndose el levantamiento de sus bordes.
Cuando el asentamiento se efectúa sobre tejidos de color las manchas pueden
pasar desapercibidas y su ubicación puede efectuarse por observación a la luz
ultravioleta, ya que las manchas de sangre acusan color oscuro, casi negro,
que difiere de la fluorescencia que generalmente presentan dichos soportes. El
contraste observado permite, en muchos casos, localizar las manchas cuya
naturaleza deberá determinarse.
2.
Forma:
Variable, según el soporte y mecanismo de producción. Se pueden clasificar
en:
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a) manchas por proyección (gotas, salpicaduras)
b) manchas por escurrimiento (charcos, regueros, etc.)
c) Manchas por contacto.
d) manchas por impregnación
e) manchas por limpiamiento (lavado, enjuagado, etc.)
3.
Levantamiento de manchas y remisión
La forma de levantamiento de manchas de sangre dependerá de las
circunstancias, de todos modos en todos los casos debe ser producto de una
observación meticulosa y prolija, tratando de no modificar para nada la “escena
del crimen”. La búsqueda de las manchas que pueden ser de interés debe
efectuarse con sumo cuidado pues no todas las manchas presentes en el lugar
pueden tener el mismo valor probatorio, en muchos casos la espectacularidad
de un enorme derrame de sangre que razonablemente toda sea originada en la
misma persona, puede atraer la atención del investigador sin que éste observe
la presencia de otras, pequeñas o no tanto en otros lugares, que si pudiesen
tener valor para contribuir al esclarecimiento del hecho.
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En caso de haber grandes derrames, sobre soportes impermeables, es factible
que aún haya porciones de la misma que no hayan coagulado, en tal situación
es conveniente tomar de la misma mediante la impregnación de un trozo de
gasa esterilizada la que se debe acondicionar en un recipiente adecuado, tubo
de vidrio o bolsa de plástico.
Si las manchas ya están secas el levantamiento se efectúa por raspado con
espátula, bisturí, cortaplumas, u hoja de afeitar colocando el polvillo resultante,
en tubos de plástico o vidrio, o en sobres de papel no absorbente.
En caso de tratarse de soportes absorbentes, tapicería, paredes o pisos de
estas características, el material una vez ubicado debe ser “levantado” por
arrastre, para ello puede procederse a raspar la superficie con un trozo de gasa
humedecido con solución fisiológica, o raspado de la superficie con
los
elementos ya mencionados y posterior recolección del polvillo resultante, que
en este caso estará mezclado con el soporte. En casos extremos se debe
recortar una porción del material de tapicería, (tapizado de vehículos, sillas o
sillones, cortinados, alfombras, etc.), teniendo en cuenta si se justifica el daño
que se provocará.
En el caso de tratarse de prendas manchadas, ropa de cama, toallas, etc. el
material debe ser remitido al laboratorio con la mayor premura y tratando de
preservar el material, para lo cual debe guardarse en heladera. Es conveniente
que el material utilizado por su envoltura, sea permeable, papel por ej. para
facilitar la pérdida de humedad durante el traslado y de este modo minimizar la
acción bacteriana.
En todos los casos las muestras convenientemente identificadas deben
acondicionarse de manera individual para impedir la transferencia de material
de una muestra a otra, esta advertencia también debe tenerse en cuenta para
la ropa aunque se sepa que pertenezca toda a la misma persona.
4.
Análisis propiamente dicho
Cuando se hace un estudio de este tipo debe siempre efectuarse una
secuencia de etapas que no debe ser modificada.
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Descripción del material pericial
Como siempre el mismo debe ser claro, concreto
y
descriptivo,
complementándose con vistas fotográficas, esquemas o dibujos aclaratorios si
es posible y cuando las circunstancias lo requieran.
Reacciones de orientación
Se denominan así a reacciones sumamente sensibles, es decir que detectan
mínimas cantidades, pero que por su inespecificidad, tienen valor definitorio en
caso de ser
negativas,
pues
descartan
que
la
muestra
analizada se
trate
de
sangre,
basan
en
se
reacciones
catalíticas
que aprovechan la presencia de peroxidasas que descomponen el agua
oxigenada y liberan oxígeno naciente, que acoplada a diversos substratos
oxidables, bencidina, fenolftaleína, guayaco, piramidón, leucobase de verde
de malaquita, luminol, etc. origina compuestos cromáticos o luminiscentes
revelables aún a grandes diluciones.

Reacción de Adler
Sustrato oxidable, solución acética o alcohólica saturada de bencidina de
preparación reciente. Una pequeña fracción de la mancha o unas partículas
obtenidas del polvo resultante del levantamiento de la mancha se coloca sobre
un vidrio de reloj o una placa de toque, se añaden II a III gotas del reactivo y a
continuación II o III gotas de agua oxigenada al 10 %, aparece de inmediato un
color azul intenso el que estabiliza por cierto tiempo, azul de bencidina, y que
pasa luego al castaño de intensidad variable según el tenor de hemoglobina.
En casos negativos controlar los reactivos, de preferencia el agua oxigenada,
dada su pérdida de actividad con el tiempo, efectuando similar ensayo con
partículas de origen conocido. Esta reacción se utiliza frecuentemente para el
reconocimiento de sangre en materia fecal y en orina.
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 Reacción de Kastle-Scheede-Meyer
El sustrato oxidable es fenolftaleína reducida en medio alcalino.
Para ello en un EM de capacidad adecuada se colocan 100 ml de agua
destilada, 20 g de hidróxido de potasio e incorporar 2 g de fenolftaleína, el
líquido adquiere color rojo intenso. Agregar 20 g de Zinc en polvo fino y
calentar sobre tela con pequeña llama hasta decoloración total por reducción
de la fenolftaleína. Filtrar en caliente y conservar en frasco oscuro, llenos,
conteniendo cierta cantidad de Zn en polvo para mantener las condiciones
reductoras.
Cerrar
herméticamente
con
tapón
de
goma,
renovar
periódicamente y preparar la mínima cantidad necesaria. La técnica es similar a
la de la reacción precedente, desarrollándose una coloración rojiza en casos
positivos por oxidación de la fenolftaleína por acción del oxígeno naciente de la
descomposición del agua oxigenada.
 Reacción del Luminol
Indicada para machas invisibles, altamente sensible, comparativamente
específica, permite tratar rápidamente grandes superficies para la localización
de las máculas y no interfiere en la ejecución de ensayos similares o de otro
tipo.
Rvo.: En 10 ml de agua destilada disolver 0.07 g de perborato de sodio,
agregar 0.01 g de luminol (3-aminoftalil hidracida) y 0.5 g de carbonato de
sodio anhídro.
Con este reactivo recientemente preparado se efectúa en cuarto oscuro una
aspersión sobre la zona sospechada de contener manchas de sangre no
visibles. Aparecen áreas o puntos luminiscentes que se visualizan nítidamente
y desaparecen en forma paulatina, la quimio luminiscencia puede reproducirse
por nuevas aspersiones.
Las manchas de sangre envejecidas reaccionan más intensamente que las
manchas recientes por lo tanto algunos autores sugieren en casos dudosos,
realizar una aspersión previa con sol de Ac.ClH 1-2% dejar secar y luego
hacerlo con el Rvo. de luminol.
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Reacciones de Certeza
Se las puede dividir en: microscópicas, microcristalográficos, cromatográficos y
microespectroscópicas.
Los métodos microscópicos, son los que permiten mediante operaciones de
preparación de especímenes adecuados y coloraciones apropiadas, la
observación de las características morfológicas de los elementos celulares:
hematíes, leucocitos, trombocitos. Para ello deben efectuarse los denominados
extendidos sobre porta objeto con la finalidad de obtener una capa delgada de
material la cual luego de secada se procede a su fijación y coloración mediante
técnicas diversas para finalmente realizar la observación e identificación
microscópica de los elementos figurados. Una de las técnicas utilizadas es la
coloración de May Grunwald-Giemsa que veremos posteriormente. Estas
metodologías son utilizables en casos en donde el levantamiento de las
muestras puede efectuarse al poco tiempo de la hemorragia generadora y por
lo tanto el mecanismo de coagulación no se ha completado.
Los métodos microcristalográficos, se basan en la presencia del grupo hemo,
por lo tanto la obtención de los derivados hemina o hemocromógeno permite
asegurar categóricamente la existencia de sangre en las manchas analizadas.
Ocasionalmente las formaciones cristalinas son atípicas o bien pueden hallarse
inhibidas. El calentamiento excesivo, no controlado, los ácidos fuertes y ciertos
oxidantes suelen impedir la obtención de estas formas de identificación.
 Reacción de Teichman
Se basa en la obtención del clorhidrato de hematina o hemina en forma de
microcristales.
Técnica. Macerar un trozo de la mancha con agua destilada de modo de
obtener una solución netamente coloreada, depositar una gota del macerado
sobre un portaobjetos, desecar cuidadosamente no calentando a mas de 60
grados centígrados, repetir la operación reiteradas veces hasta obtener un
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residuo bien visible, puede utilizarse si se dispone una partícula de la mancha
tratada con I gota de agua destilada. Cubrir y deslizar entre porta y cubre I gota
de ac. acético glacial, se denomina así al acido acético concentrado,
calentando con precaución hasta desecación, se puede reiterar el agregado de
ácido y la posterior desecación. Se observa al microscopio buscando la
aparición de cristales en forma de prismas, de color castaño, translúcidos.
Cristales de Clorhidrato de
hemina (Teichman)
 Reacción de Takayama
Se basa en la obtención de cristales de hemocromógeno
Reactivo: Sol. de glucosa al 10 %
Sol de HoNa 10 %
5 ml
10 ml
Piridina
20 ml
Agua dest. csp.
100 ml
Técnica. Sobre el residuo preparado entre porta y cubre, hacer deslizar I gota
del reactivo, calentar con cuidado sobre llama pequeña hasta percibir cambio
de color (de rojo a carminado), dejar enfriar y observar cristales con forma de
tabla, muy característicos, color rojo o rojo naranja.
Cristales de hemocromogeno (Takayama)
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Los métodos cromatográficos, consisten en realizar una cromatografía en
placa o eventualmente sobre papel, de un extracto de la muestra y una
solución indubitable de sangre diluida en sol. fisiológica (1:1000), como fase
móvil se utiliza metanol-acido acético-agua (90,3,7). Como reactivo revelador
se utiliza una solución de reciente preparación de leucobase de verde de
malaquita en etanol con pequeña cantidad de acido acético para acidificar el
medio, seguida por una aspersión con agua oxigenada de 20 volúmenes. En
caso positivo aparecerá una mancha verde de intensidad variable con un Rf
0,7- 0,8.
El método micro espectroscópico, hoy prácticamente desplazado, fue
utilizado antiguamente como método de elección. Se basa en observar el
espectro de absorción de la hemoglobina en sus distintos estadios, con un
microscopio provisto de un ocular espectroscópico en lugar del ocular corriente.
Esta metodológica tiene utilidad cuando la muestra es fresca, no así cuando ha
sufrido envejecimiento, natural o artificial (calor, pH, exceso de humedad,
exposición a reductores) pues en estas circunstancias la hemoglobina habrá
sufrido
transformaciones
(metahemoglobina,
hematina,
hemocromogeno,
hemoglobina reducida) todo lo cual complica la interpretación.
Diagnóstico específico
Tiende a establecer o descartar la naturaleza humana de la mancha de sangre
en estudio.
La cristalización de la hemoglobina ha dado buenos resultados en manos de
diversos especialistas y algunos mineralogistas, se menciona que es posible
diferenciar estructuralmente hemoglobinas de adultos de recién nacidos y aún
de adultos de distintas razas.
Sin embargo en la práctica es mucho más sencillo efectuar la reacción de las
precipitinas, basada en la técnica de Uhlenhuth, Wasserman y Schultze. Un
resultado positivo indica proteínas humanas, pero no necesariamente sangre si
previamente no se ha demostrado por las técnicas precedentes.
Para su realización se debe efectuar un macerado del material en análisis en
solución fisiológica, durante un tiempo adecuado (1 hora mínimo), dicha
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
solución se debe tomar por capilaridad mediante la utilización de una micro
pipeta o un capilar de los habitualmente utilizados para microhematocritos o
para la siembra de cromatografía en placa, a continuación se debe, también
por capilaridad, tomar una gota de suero antihumano (Suero de Coombs) de
manera que las dos soluciones queden en intimo contacto dentro del tubo
capilar. Se deja en reposo 12 hs. Y luego se observa en la zona de contacto la
aparición o no de una nubecilla blanca producto de las precipitinas,
consistentes en el complejo antígeno-anticuerpo que certifican la naturaleza
humana de la mancha en estudio.
El suero de Coombs se obtiene por inoculación reiterada en animales de
experimentación de una suspensión de células de naturaleza humana, de
manera similar a la que describió para los sueros tipificadores. Se puede
conseguir en el comercio de modo que es de obtención sencilla.
Con el mismo concepto se pueden conseguir sueros anti determinadas
especies animales si resultara de interés en la práctica pericial. El
inconveniente es que dichos sueros deben importarse con la consiguiente
demora, como tienen fecha de vencimiento se hace difícil tenerlos en stock
pues no es muy frecuente su necesidad. El ensayo se efectuaría de la misma
manera descripta confrontando macerados de la mancha con los distintos
sueros anti especie animal disponibles o sospechados.
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Otra determinación actualmente disponible incluye un enzimo inmunoensayo
comercial para establecer la presencia de Hb humana.
Existe un dispositivo comercial (Hexagon OBTI test), como complemento ideal
de BLUESTAR.
Esta prueba es muy simple de usar. Dos o tres minutos son suficientes para
comprobar, si la traza revelada es o no sangre humana.
La hemoglobina humana (hHb), reacciona con un conjugado compuesto de
partículas azuladas y anticuerpos monoclonales de hemoglobina humana.
La muestra obtenida de la presunta sangre humana es introducida dentro del
tubo que se mezclará con el reactivo químico. Esta mezcla se adicionara
mediante unas gotas en la superficie del test. Una muestra positiva es
detectada normalmente a los 2 ó 3 minutos.
Una sola línea roja, significa que el líquido del test está trabajando
correctamente, pero que no ha sido detectada sangre humana, dos líneas
significan que el test ha detectado sangre humana.
El test detecta toda la sangre en una dilución de hasta 1: 2.000.000. Tan
solo 250 células rojas se requieren para un resultado positivo.
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Tubo colector con el reactivo químico, para la muestra de sangre.
Barra de test.
La hemoglobina humana (hHb) reacciona en la muestra con un agente,
consistiendo en partículas de color y anticuerpos monoclonales anti-humanos
Hb. El inmunocomplejo migra hacia la zona del test donde es capturado por un
segundo anticuerpo inmovilizante dirigido contra la hHb, formando una línea
roja/ rosácea en el test que indica un resultado positivo. Puede detectar0.05
µg/ml de hemoglobina y se puede conservar hasta una temperatura de 30ºC.
Determinación del grupo sanguíneo ABO
Como ya se ha mencionado en la sangre existen los antígenos y anticuerpos
que caracterizan a cada una dentro del sistema ABO tal cual como vimos en el
cuadro correspondiente, de Referencias Inmunológicas. En función de ello es
que podemos intentar su caracterización mediante la correcta identificación de
su tenor de anticuerpos o de antígenos. Ambas estructuras proteicas son
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
conservables durante periodos relativamente largos de tiempo, no obstante se
puede afirmar la mayor estabilidad de la estructura antigénica que la de los
anticuerpos.
Los antígenos, como ya hemos mencionado, se encuentran en la pared del
glóbulo rojo, mientras que los anticuerpos se encuentran en el plasma o suero,
en la fracción gama globulina de las proteínas, es decir la fase líquida del
material que deseamos analizar. En el caso de las manchas los restos de las
mismas que hallamos se encuentran conformadas por restos del coágulo que
se formó, mientras que el proceso de secado del suero respectivo pudo haber
generado un residuo, si el soporte es impermeable, en caso de que el soporte
sea permeable, puede haberse absorbido y por lo tanto dichas proteínas ya no
las podremos detectar. Concretamente a pesar de que explicaremos
metodología para detectar cualquiera de las dos fracciones, es recomendable
el tratar de obtener el grupo en una mancha seca mediante la detección de su
constitución antigénica.
 Método de las aglutininas
Se trata de confrontar las eventuales aglutininas presentes en la mancha con
los antígenos A y B, para lo cual se tratan porciones de las manchas
respectivamente con suspensiones de glóbulos rojos lavados A y B.
El material se dispone sobre un portaobjetos en dos círculos imaginarios uno
próximo a cada extremo del mismo. El tratamiento variará según el caso, así
cuando se trata de un polvillo se pondrán varios granos del mismo en cada
zona; si se trata de material textil se colocarán un par de hebras maculadas en
cada zona, otra manera sería macerar la mancha con solución fisiológica y
luego depositar sucesivamente gotas del macerado sobre cada zona y
evaporar a baja temperatura formando una costra en cada zona. El material
obtenido de alguna de las formas descriptas se tapa con cubreobjetos y
finalmente se deja escurrir entre porta y cubre gotas de las suspensiones
respectivas de glóbulos lavados A y B al 3%. Dichas suspensiones se obtienen
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
como se ha descrito anteriormente cuando se describió la obtención de los
sueros tipificadores.
Los preparados así obtenidos se dejan en reposo durante 15-20 minutos a
temperatura cercana a 30 grados centígrados y se observa en el microscopio
de transmisión con 200-400 aumentos. Se verifica en cada zona si hay o no
aglutinación. La misma se manifiesta por al agrupamiento estable de varios
glóbulos rojos formando en algunos casos verdaderos
“racimos” que son
fácilmente reconocibles. Dichos agrupamientos son sumamente estables aún
haciendo vibrar el preparado y se diferencia de ese modo de eventuales
“amontonamientos” de glóbulos que pueden formarse circunstancialmente,
dichas formaciones tienden a evitarse con la utilización de una suspensión de
baja concentración (3-5 %).
En función de lo mencionado las posibilidades de resultados son las siguientes:
Glóbulos lavados A
Glóbulos lavados B
Resultado
Aglutinación
Aglutinación
Grupo O (Anti A y Anti B)
Aglutinación
Negativo
Grupo B (Anti A)
Negativo
Aglutinación
Grupo A (Anti B)
Negativo
Negativo
Grupo AB (Ausencia de anti.)
El análisis de la estadística de los resultados obtenidos por este método
permite verificar que la distribución poblacional difiere de la mencionada,
pudiendo apreciarse un notable incremente del porcentaje de personas con
grupo AB. Esto se explica pues este resultado indica carencia de Anticuerpos
anti A y anti B, pero esa situación puede ser provocada por la pérdida de los
mismos por distintas circunstancias tal como la característica de permeabilidad
del soporte como ya se ha mencionado. Esta limitación indica que la utilización
de esta metodología debe realizarse con suma precaución
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
La experiencia indica que esta técnica es confiable cuando se tenga certeza del
no-envejecimiento de las manchas y en el caso de soportes impermeables que
nos garantizan la no-absorción de las fracciones proteicas.
 Detección de la fracción antigénica
Existen varias técnicas propuestas, en este caso se abordarán dos que
son las más usuales.
a) Método de absorción - inhibición
Este método, también podría denominarse de absorción – dilución,
como
veremos a continuación. Consiste en confrontar porciones de las manchas a
analizar con suero anti A y anti B, respectivamente. Paralelamente se debe
practicar un ensayo en “blanco”,
es decir,
con porciones del soporte sin
manchas para eliminar la posibilidad de que sucedan interacciones
inespecíficas que alterarían la interpretación de los resultados. Una vez
superada esta etapa, durante la cual se producirá, si corresponde, la formación
del complejo antígeno – anticuerpo, se procede a diluir la solución del suero
tipificador donde estarán los anticuerpos no reaccionantes con una progresión
aritmética, 1/2, 1/4, 1/8, etc. Finalmente se determina el título o concentración
de los anticuerpos no reaccionantes mediante el agregado de gotas de
suspensión de glóbulos rojos determinándose hasta que concentración puede
verificarse la formación de aglutinación. Con los blancos no debiera producirse
reacción por lo tanto ese será el título máximo en donde no hubo “consumo” de
anticuerpos originales. De haber en las muestras una disminución de título esa
circunstancia nos estaría indicando la presencia en la muestra del antígeno
respectivo.
Para efectuar el ensayo se requiere una poli cubeta de vidrio transparente, con
4 hileras de excavaciones, siendo lo ideal que cada hilera conste de un mínimo
de 12 pocillos. En la primera excavación de cada hilera se coloca una alícuota
del material a analizar, blancos y muestras respectivamente (2 y 2). En un par
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
se colocan II gotas de suero anti A y en el otro de suero anti B, diluidos 1/32.
Se tapan las excavaciones con una placa de vidrio para impedir la
concentración por evaporación y se deja un mínimo de 2 horas en reposo.
El reactivo utilizado aporta anticuerpos que reaccionaran con el antígeno
correspondiente según el diagrama antigénico de la sangre analizada, durante
esta formación los anticuerpos reaccionantes se adhieren firmemente a los
antígenos respectivos de modo que los anticuerpos sobrantes están en menor
concentración que la original, cosa que se respeta por ausencia de antígeno
en la muestra, tal como sucede en los denominados blancos.
Al finalizar el periodo de incubación, se coloca en cada una de las
excavaciones restantes una gota de solución fisiológica y a continuación se
transfiere una gota del líquido de la primera excavación a la segunda, sé
homogeniza, se pasa una gota de la segunda a la tercera, se homogeneiza y
así sucesivamente hasta terminar. El resultado que en cada excavación la
concentración es la mitad de la anterior. Siendo la concentración original de los
anticuerpos anti A y anti B, 1/32, quedará 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024,
1/2048, 1/4096, 1/8192, etc.
Finalmente mediante el agregado de I gota de suspensión de glóbulos rojos
lavados A y B respectivamente a cada excavación se podrá establecer el título
o concentración remanente en cada hilera observando cual es la dilución
máxima en la cual se produce aglutinación, es decir acumulo de glóbulos rojos
formando el ya mencionado “racimo”. Como ya dijimos, en los blancos no hay
reacción de modo que en esas hileras la concentración original no estará
alterada y por lo tanto allí se observará el mayor título. Por el contrario, si
hubiera interacción antígeno-anticuerpo,
el consumo de anticuerpos que
sucedería en dicha reacción, generará una disminución del título respectivo de
anticuerpos A ó B, o ambos, según el caso. Se establece como disminución
significativa un mínimo de dos niveles. Como vemos una disminución del título
blanco con respecto a la muestra, está indicando la presencia de los antígenos
correspondientes.
En esta metodología la interpretación de los resultados es la siguiente:
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Glóbulos A
Glóbulos B
Resultado
Igual título blanco – muestra
Igual título blanco – muestra
Grupo O
Igual título blanco – muestra
Disminución título
Grupo B
Disminución título
Igual título blanco – muestra
Grupo A
Disminución título
Disminución título
Grupo AB
Glóbulos rojos suspendidos
Glóbulos rojos aglutinados
b) Método de absorción – elución
En esta técnica el fundamento de la reacción es idéntico a la anterior,
nuevamente se trata de identificar el o los antígenos presentes en la muestra,
mediante la confrontación con los anticuerpos correspondientes.
Para su realización debe disponerse de una placa de plástico transparente, es
ideal el poli carbonato, de modo de poder adherir firmemente una hebra
manchada por la sangre a analizar. Si el material lo tenemos en polvillo,
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
debemos macerarlo en solución fisiológica y luego transferir a una gasa parte
del mismo por impregnación. Utilizando acetato de celulosa, se logra una
disolución parcial del soporte de poli carbonato, en el material pastoso
resultante se inserta la hebra a analizar, en 10-15 minutos por evaporación del
solvente, el polímero recuperará su estado sólido pero ahora con la hebra
insertada en su seno.
Sobre cada muestra se practican ensayos con suero anti A y anti B, de modo
que se requieren dos ejemplares de cada una para los ensayos y un tercero sin
macular para la realización del ensayo en blanco. Por agregado de los sueros
anti A y anti B se producirá la reacción antígeno anticuerpo, si es que los
antígenos están presentes, el período de incubación es de por lo menos 3 hs. a
4 grados centígrados, aunque es recomendable dejarlos más tiempo en
cámara húmeda.
A continuación se procede a un cuidadoso lavado con solución fisiológica a 4
grados centígrados para arrastrar el material sobrante y finalmente es
recomendable la inmersión de la hoja de poli carbonato en una cuba plástica
con sol. fisiológica a esa temperatura. Todo el exceso de anticuerpos presentes
será eliminado durante este proceso, quedando solamente los anticuerpos que
hubieran reaccionado con los eventuales antígenos presentes.
Una vez finalizado el lavado, se seca el poli carbonato con papel de filtro, se
coloca nuevamente en la cámara húmeda y se agrega sobre cada muestra I
gota de suspensión de glóbulos A y B previamente lavados. El conjunto se
coloca ahora con la cámara húmeda en estufa a 50 grados centígrados,
durante 15 minutos
En este período se produce el desdoblamiento del
complejo antígeno-anticuerpo, si previamente se hubiera producido.
Finalmente se retira de la estufa, se agita suavemente, y se observa la
presencia o ausencia de aglutinación en cada caso por observación
microscópica.
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
La interpretación de resultados por esta técnica puede efectuarse según el
siguiente cuadro:
Glóbulos A
Glóbulos B
Resultado
Aglutinación
Aglutinación
Grupo AB
Aglutinación
Negativo
Grupo A
Negativo
Aglutinación
Grupo B
Negativo
Negativo
Grupo O
Esta técnica también se utiliza con variantes para determinar el factor Rh en
manchas de sangre seca aunque el método tiene varias modificaciones.
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La cantidad de muestra de sangre es mayor debido a la menor concentración
de sitios antigénicos presentes en la membrana de los glóbulos. La
temperatura de absorción debe ser 37 grados centígrados.
El lavado para eliminar el antisuero no absorbido debe ser más cuidadoso y
exhaustivo.
La elución debe hacerse en ausencia de glóbulos rojos, porque requiere mayor
temperatura, 60 grados centígrados, durante más tiempo y los hematíes
durante esa exposición perderían su capacidad de aglutinación frente a los
antisueros específicos.
Como se utilizan anticuerpos incompletos (Anti D), estos no son capaces de
aglutinar directamente los glóbulos rojos en solución salina, debe tratarse a los
mismos con papaina, que modifica la superficie de los hematíes y contribuye a
favorecer la aglutinación.
Finalmente factores como el calor, luz solar directa, humedad, embalaje
inadecuado y la antigüedad de la mancha, que no debe superar el mes,
disminuyen la posibilidad de llegar a un resultado certero.
Proveniencia de la sangre
Existen diferencias significativas entre una herida venosa y una arterial. Ayuda
a entender el origen, el flujo sanguíneo al considerar heridas o lesiones. Como
ya hemos visto, la sangre es llevada al corazón a través de vasos sanguíneos
llamados venas y es bombeada fuera del corazón en vasos sanguíneos
grandes llamados arterias. Las heridas en las venas tienen un flujo de sangre
continuo de color rojo oscuro o marrón; en cambio, las heridas arteriales por su
parte, "escupen" sangre roja y brillante. Esto también nos sirve como primer
dato cuando en un lugar del hecho nos encontramos con manchas hemáticas
recientes para empezar a interpretar el hecho y la mecánica del mismo, ya sea
con el cuerpo de la víctima presente en el lugar o no.
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Reconocimiento de sangre por medio de luminol
La luminiscencia es un fenómeno producido por las moléculas de materia, que
al ser lo suficientemente excitadas, emiten luz visible. Generalmente, la energía
proviene de fuentes externas, como es el caso de la electricidad en las
lámparas de neón, o el calor proveniente de una combustión. Sin embargo,
también es posible producir luz por medio de reacciones químicas, que tienen
como ventaja la baja producción de calor, aunque la emisión es bastante
breve. Esta es la llamada luz fría.
Existen distintos modos de producir luz fría. Entre los modos de producción de
luz fría, se encuentran la fluorescencia, y la fosforescencia. La fluorescencia se
debe a la absorción de ondas electromagnéticas de alta frecuencia, y la
inmediata emisión de fotones de frecuencia más baja (léase, luz visible), como
por ejemplo, en las lámparas de ultravioletas. La fosforescencia consiste en la
reemisión progresiva de la energía captada inicialmente por el material, como
por
ejemplo,
en
las
pantallas
de
rayos
catódicos.
En
cambio,
la
quimioluminiscencia es propia de reacciones donde uno de los reactivos recibe
una alta excitación, con la posterior emisión de luz visible. En la naturaleza se
encuentran varias proteínas quimioluminiscentes, como las presentes en las
luciérnagas, los peces de la región abisal, y algunas bacterias. Creadas por el
hombre, hay infinidad de compuestos, pero el más usado en la industria y la
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investigación es el luminol (C8H7N3O2. 5-Amino-1,2,3,4-tetrahidro-phtalazin1,4-dion).
El luminol es un derivado del ácido ftálico. Se trata de un sólido verdoso poco
soluble que posee la capacidad de enseñar por medio de luz visible, cuando es
oxidado. Por esto es una herramienta muy utilizada en la investigación forense,
ya que gracias a sus propiedades; puede revelar, en solución con un oxidante,
hasta los rastros más ínfimos de sangre, por medio de un brillo azulado. Esta
peculiar característica facilita el reconocimiento de aquellas sustancias
oxidantes o sus catalizadores en situaciones que requieren rapidez y
efectividad, tal como la escena de un crimen donde se demanda el
señalamiento de cualquier trazo de sangre.
Pulverizando una solución de luminol en un área sospechosa se reduce
quimioluminiscencia en los lugares en que ha habido sangre, incluso si esta ha
sido lavada y no es perceptible a simple vista.
La reacción del luminol precisa de un medio alcalino, el cual sirve para disolver
y cargar negativamente la molécula. El oxidante, que suele ser Peróxido de
Hidrogeno, libera y reemplaza dos de los Nitrógenos, llevando así a la molécula
a el mencionado estado de excitación.
Finalmente se obtiene el luminol oxidado y cargado, el fotón, y Nitrógeno
gaseoso.
Las reacciones de luminol requieren de un catalizador. Usualmente es una sal
o metal de transición, los cuales son muy accesibles. Específicamente en el
caso de la sangre, el Hierro (Fe) de la Hemoglobina es un poderoso
catalizador. Las propiedades de la sangre permiten una excelente optimización
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
de la oxidación del luminol, esta reacción cuenta con la suficiente sensibilidad
como para detectar manchas diminutas de sangre, gracias a que puede
reaccionar a 1ppm (parte por millón).
Las confusiones con otra clase de compuestos que puedan dar falsos positivos
de sangre en la escena de un crimen pueden ser desmentidos con la
observación cuidadosa del color e intensidad del brillo, además de la espuma
formada en muestras frescas de sangre.
Este producto químico es una herramienta muy importante en el desarrollo de
la criminalística de campo, especialmente en el rastreo hemático.
En disolución neutra el luminol está preferentemente en forma de Ion dipolar
("zwitterion"). Sin embargo, en disolución alcalina el luminol está en forma de
dianión. Este dianión, va a ser el verdadero reactivo en el proceso que nos
interesa.
El dianión del luminol puede oxidarse por el oxígeno molecular para dar un
intermedio quimioluminiscente. Se cree que la reacción tiene lugar de acuerdo
con la siguiente secuencia:
1º El dianión del luminol experimenta una reacción con el oxígeno molecular
para formar un peróxido de estructura desconocida.
2º Este peróxido es inestable y descompone, con la pérdida de nitrógeno,
originando el dianión 3-aminoftalato en un estado electrónicamente excitado.
3º El dianión excitado, para estabilizarse, emite un fotón en forma de luz visible
(siendo éste el responsable de la luz azul que se ve).
El fenómeno por el cual se produce la emisión de luz es el siguiente;
cuando una molécula se encuentra en estado excitado, tiene más energía que
la que le corresponde. Ese exceso de energía provoca que la molécula no sea
estable en ese estado excitado, lo que conlleva que la molécula pierda la
energía que le sobra espontáneamente para volver al estado fundamental (que
es el estado energético más estable de una molécula). Esa pérdida de energía
se produce, normalmente, en forma de radiación electromagnética (luz), como
en el caso que nos concierne, o en forma de calor.
El fenómeno de conversión interna es un proceso por el cual la molécula, que
se encuentra en un estado excitado desde el cual no puede emitir radiación,
pasa a otro estado excitado desde el que ya sí puede hacerlo.
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Luminol y sangre
Cuando se empela el luminol para detectar manchas de sangre, lo que ocurre
es que el oxígeno molecular de los glóbulos rojos reacciona con el luminol,
produciéndose las reacciones anteriormente descritas, originando la emisión de
luz al desexcitarse el 3-aminoftalato.
Hemos visto, que para un buen funcionamiento del luminol, éste se debe
encontrar en un medio básico, por lo que a la hora de preparar el spray con
luminol, se añadirá peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) y un hidróxido
(OH-) para generar el medio básico y así obtener el dianión de luminol.
Esta reacción de emisión de luz, puede verse catalizada por ciertos elementos
o moléculas, siendo uno de estos catalizadores el hierro. Debido a la presencia
de hierro en la hemoglobina de la sangre, la emisión de luz va a ser más
intensa de la que se obtiene en una reacción de laboratorio sin el empleo de
catalizadores, por lo que se va a favorecer la detección de menor cantidad de
sangre.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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BLUESTAR
En el año 2000, Jean-Marc Lefebvre-Despeaux, presidente de BlueStar,
encargo a Loic Blum, Ph.D., profesor de bio-química en la Universidad Claude
Bernard-Lyon y director de enzimática e ingeniería biomolecular del laboratorio,
encontrar una nueva fórmula que sería a base de luminol y eliminara todos los
numerosos inconvenientes. Como resultado de ello, Blum descubrió esta nueva
fórmula que fue posteriormente llamado Bluestar® FORENSIC.
Esta nueva formulación ha sido patentada bajo la marca registrada de
BLUESTAR®, no afecta el posterior análisis del ADN y no presenta ningún
peligro para el operador, dado que no es carcinogénico y es biodegradable.
Esto concuerda con los resultados obtenidos con el Luminol, pero la diferencia
con el BLUESTAR® estriba en que dicha formulación da una luminiscencia
azulada más potente y de más larga duración.
BLUESTAR® es un nuevo reactivo cuyo objetivo es revelar manchas de sangre
que han sido lavadas, limpiadas ó son invisible a simple vista. El objeto de este
producto es para utilizarlo en un escenario de investigación de un crimen. La
formulación de BLUESTAR® está basada en la quimioluminiscencia. Esta
fórmula ha sido calificada como el revelador más efectivo de sangre humana
disponible en el mercado, tanto para la escena de un crimen como para los
departamentos de criminalística. El BLUESTAR® no altera el ADN de la sangre
revelada, lo cual facilita el subsiguiente análisis del genotipo.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
La Química del BlueStar ® FORENSE
Un nuevo luminol basado en la fórmula original BLUESTAR® FORENSIC es un
agente de visualización de sangre, sobre la base de luminol, una molécula que
es bien conocido entre la criminalística forense. La constitución del BlueStar ®
ha hecho posible eliminar los inconvenientes de los elementos asociados al
luminol.
Hay que tener en cuenta, que únicamente es ligeramente corrosivo, dado que
su pH es algo superior a 11.
Las manchas invisibles de sangre reaccionan inmediatamente al BLUESTAR®
provocando una intensa reacción azulada luminiscente, visible en la oscuridad
directamente por el ojo humano, a 430nm de Longitud de Onda.
Su sensibilidad evidencia trazas de sangre en cantidades más pequeñas del
mínimo requerido para realizar una tipificación de ADN.
La reacción dura varios minutos y el reactivo de BLUESTAR® pueden
pulverizarse varias veces sobre una misma zona, sin afectar el ADN y tomando
fácilmente evidencias visibles mediante cámaras fotográficas de tipo estándar,
lo cual elimina la necesidad de utilizar equipos sofisticados.
Características más destacables del BlueStar ®
 Mayor sensibilidad
 Mayor intensidad de luz luminiscente
 Mayor duración de la luminiscencia
 La luminiscencia no requiere oscuridad total
 Puede usarse varias veces sobre
una misma muestra
 No requiere ningún tipo de
equipos especiales para tomar
evidencias fotográficas
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 No interfiere la tipificación del ADN
 Estable a lo largo del tiempo
 No es tóxico
 Fácil de usar
Comparación de luminol con bluestar
Estudio de prueba de Sensibilidad
Procedimiento:
La sangre de un animal de aproximadamente dos (2) años (caballo),
almacenada en el refrigerador, fue utilizada como fuente de sangre. Cuarenta y
cinco (45) ml. de agua destilada fue agregada a seis (6) tubos de cincuenta
(50) ml. Cinco (5) ml de sangre fueron agregados al tubo uno (1) para crear una
dilución de 1:10.
Subsecuentemente cinco (5) ml de cada tubo fue transferido al siguiente para
crear una dilución serial. Cada tubo fue mezclado cuidadosamente después de
cada transferencia. La siguiente serie de dilución creada:
- Tubo 1 - 1:10
- Tubo 2 - 1:100
- Tubo 3 - 1:1000
- Tubo 4 - 1:10000
- Tubo 5 - 1:100000
- Tubo 6 - 1:1000000
Cada dilución fue probada con el reactivo Kastle-Meyer antes del uso al
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substrato y directamente después del uso de los reactivos en la detección de la
sangre, además de la prueba del reactivo del realce de la sangre.
Las manchas de sangre fueron esparcidas uniformemente sobre la superficie
entera de seis (6) azulejo de cerámicas y permitidas secarse en un ambiente
interior normal de aproximadamente 73 grados Fahrenheit (23° Celsius). Cada
azulejo entonces fue dividido por la mitad usando cinta negra.
El Luminol fue aplicado al lado derecho de cada baldosa de cerámica con un
resultado positivo para las diluciones de 1:10, 1:100, y 1:1,000. Hubo
resultados negativos para las diluciones de 1:10,000, de 1:100,000 y de 1:1,
000,000.
Un análisis de sangre de Kastle-Meyer fue realizado en cada dilución antes y
después del Luminol aplicado con un resultado positivo para las diluciones de
1:10, de 1:100, de 1:1,000, de 1:10,000 y de 1:100,000 (reacción positiva en
aproximadamente 5 segundos antes del uso, poco después de 5 segundos del
uso del Luminol las reacciones fueron muy débiles). Había un resultado
negativo para la dilución de 1:1, 000,000.
El BLUESTAR® FORENSE fue aplicado al lado izquierdo de cada baldosa de
cerámica con un resultado positivo para las diluciones de 1:10, de 1:100, de
1:1,000 y de 1:10,000. Había resultados negativos para las diluciones de
1:100,000 y de 1:1, 000,000. Una prueba de Kastle-Meyer también fue
realizada en cada dilución antes y después BLUESTAR® FORENSE fue
aplicado con un resultado positivo para las diluciones de 1:10, 1:100, 1:1,000 y
uso
de
1:10,000
antes
y
después,
y
los
resultados
positivos
en
aproximadamente 5 segundos para Kastle-Meyer antes del uso para 1:100,000
con resultados muy débiles. Había un resultado negativo para la dilución de
1:100,000 y de 1:1, 000,000 de BLUESTAR® FORENSE usado.
El BLUESTAR® FORENSE superó al Luminol en esta prueba. Probó ser más
sensible y mucho más brillante que el Luminol.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Análisis de patrones hemáticos
La sangre es una de las evidencias más frecuentes e importantes encontradas
en la investigación criminal.
La existencia de sangre nos permitirá:
a) Ubicar la escena del crimen
La identificación de sangre humana perteneciente a un grupo similar al de la
víctima, puede apuntar con precisión al área de búsqueda en el escenario del
hecho.
b) Determinar la posible comisión de un crimen
Ocasionalmente, la detección de sangre humana en una ruta, en una vereda,
un porche o un automóvil es la primera indicación de la comisión de un crimen.
c) Identificar el arma empleada
El grupo de sangre humana detectado en un martillo, un cuchillo o un elemento
contundente, puede resultar de considerable valor investigativo.
d) Probar o refutar la coartada de un sospechoso
El hallazgo de sangre humana en un elemento que pertenezca a un
sospechoso que argumenta el origen animal de la misma. La detección de
sangre animal puede desvincular de un hecho a una persona inocente.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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e) Eliminar sospechosos
El hecho de demostrar mediante los ensayos correspondientes que las
muestras de sangre levantadas de distintos elementos es diferente a la de
objetos secuestrados, puede facilitar la liberación de un detenido.
Información que pueden brindar los ensayos con sangre:
a) Identificación de manchas como correspondientes a sangre
Los análisis químicos y microscópicos se hacen necesarios para identificar
positivamente la sangre. La apariencia o aspecto de este elemento puede
variar enormemente con la antigüedad de manchas y otros factores.
b) Determinación de si se trata de sangre de origen humano o animal
Si es animal, puede especificarse la familia correspondiente.
c) Determinación del grupo de sangre
Si es humana, la sangre puede clasificarse dentro de los cuatro grupos del
sistema internacional ABO. La sangre seca en suficiente cantidad y
condiciones, puede posteriormente ser caracterizada por otro sistema de
tipificación, así como también enzimas y proteínas que pueden ser ensayadas
por electroforesis.
La raza de una persona o la antigüedad de una mancha seca, no pueden
averiguarse en forma concluyente a través del estudio de la sangre.
Ante la comisión de un delito en el que surjan huellas o manchas de sangre,
debe tenerse mucho cuidado en el registro de la ubicación, forma, dirección,
medida y superficie del área de impacto de tal elemento. Cuando esta
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
información es aplicada a las características físicas conocidas de la sangre, el
investigador podrá descubrir:
a) El origen de la sangre
b) La distancia entre el área de impacto y el origen al momento de la
ocurrencia
c) Tipo y dirección del impacto
d) Posición de la víctima durante el ataque
e) Movimiento y dirección del sospechoso y de la víctima durante y
después de la efusión de sangre.
Leyes de la física respecto de los fluidos
Debido a una atracción molecular llamada fuerza de cohesión, una gota de
sangre conserva su forma como si tuviera una cobertura similar a la de un
globo. En realidad esa cobertura está dada por la tensión superficial, principio
éste que puede apreciarse en otros líquidos, como el agua, cuando apoyamos
suavemente una hoja de afeitar y no se sumerge. Sin embargo, si esa hoja de
afeitar y no se sumerge. Sin embargo, si esa hoja de afeitar se coloca sobre la
superficie aludida con su filo hacia abajo, se corta o se anula la tensión
superficial y la misma se hunde.
Estos elementos son los que originan la forma circular de la gota de sangre en
su caída libre y evitan además la ruptura en el momento del impacto sobre el
piso o cualquier otra superficie. Sin importar la altura de la caída libre, una gota
no se romperá cuando la superficie sea lisa o suave y limpia. Este principio no
se mantiene cuando la superficie es rugosa o actúa alguna otra fuerza o
energía.
Durante el estudio de un hecho, el investigador debería tener presentes las
siguientes características conocidas de la sangre:
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
1) Es de carácter uniforme y puede reproducir patrones o modelos
específicos
2) Una gota de esta sustancia es de forma circular durante la caída libre
3) No se rompe, salvo que actúe una fuerza o energía ajena
4) Una gota de sangre posee un volumen de 0,05 mililitros, salvo que se
vea influenciada por alguna fuerza o energía.
5) La velocidad terminal es de 7,65 metros por segundo (± 0,15) en caída
libre
6) La mayoría de las gotitas con alta velocidad tienen un diámetro menor
de 1mm y usualmente no se desplazan a más de 1,20 metros.
Distancia y dirección
Para estimar con precisión la distancia desde la cual una gota de sangre ha
caído, es necesario llevar a cabo una serie de experimentos sobre la superficie
en cuestión y analizar los resultados como patrones conocidos para comparar
en forma directa con los que se desconocen.
Determinar la direccionalidad de las gotitas resulta posible, dado que el golpe
contra una superficie en ángulo produce un patrón en forma de lágrima. Ello es
provocado por la ley física de la inercia, vale decir, la resistencia que posee
todo cuerpo en movimiento a toda fuerza que opere sobre él para cambiar su
movimiento, dirección o velocidad. De tal manera, dado que la velocidad se
disipa abruptamente debido a la superficie sobre la cual impacta, la gotita se
desvanece poco a poco, con un final puntiagudo de diverso grado, que
depende del ángulo de la superficie. A mayor ángulo, más elongado y angosto
será el patrón de mancha producido. El extremo puntiagudo indica la dirección
de su desplazamiento.
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Gotas secundarias y ángulo de impacto
Las gotitas primarias de sangre pueden producir salpicaduras de abandono
más pequeñas, que señalan por detrás de la fuente. Las gotas más pequeñas
se separan de la principal u original debido
la inercia o resistencia a ser
detenidas. Las mismas viajan próximas a la superficie hasta el impacto,
produciendo marcas similares a signos de admiración, cuyas puntas señalan la
gota madre.
El goteo de sangre sobre una superficie plana y cercana a la horizontal,
producirá manchas elípticas antes que circulares. A medida que el ángulo
decrece, los patrones se hacen más elongados.
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Hay ciertos puntos que recordar cuando se interpretan patrones de manchas
de este tipo:
1) El grado de salpicadura lo determina la textura de la superficie y no la
distancia de caída
2) Las manchas en forma de lágrima (extremos puntiagudos) indican la
dirección del recorrido. Las gotitas más pequeñas y más largas exhiben
sus extremos puntiagudos apuntando a las manchas más grandes de
donde provienen.
3) Cuanto más pequeñas las gotas, mayor la energía de impacto.
4) El ángulo de impacto de una mancha de sangre puede ser estimado por
la geometría de la mancha.
Cuando han intervenido armas de fuego y hay evidencia conformada por
manchas de sangre, se aplican las siguientes reglas:
1) La salpicadura hacia tras usualmente se produce en un área
comprendida entre la boca del arma y el blanco, menor a los 7,70cm,
cuando se encuentra sangre en el interior del cañón.
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2) Cuanto más grande es el calibre del arma mayor será la profundidad de
penetración de la sangre en el interior del cañón.
3) En las armas con retroceso de corredera (o block de cierre), la
penetración y concentración de las salpicaduras hacia aquellas, será
menor que en las que no poseen tal sistema (por ejemplo, revólveres).
4) Las armas munidas de cartuchos con elevada energía producirán mayor
profundidad de penetración de las salpicaduras, que con la munición
común.
5) Cuando se dispara una escopeta de doble caño, con su boca en
contacto con el cuerpo o blanco, se produce una salpicadura
considerable en el cañón que no ha disparado, que puede llegar hasta
12 centímetros.
6) La mayoría de estas salpicaduras de sangre tendrán 1mm, o menos, de
diámetro.
Documentación
El propósito de la documentación es demostrar la localización, la dirección, el
tamaño, la forma, la superficie de impacto, el ángulo, el número de manchas
y/o el volumen y el tipo de sangre humana. Sin embargo, reconstruir la cadena
de eventos ocurridos en un determinado escenario, donde se encuentran
presentes manchas de sangre de diferente aspecto, guarda proporción directa
con la habilidad y cuidado puestos de manifiesto mientras se concretan los
exámenes correspondientes.
Consecuentemente, en primer lugar deberá buscarse la evidencia física oculta
a la vista o destruida. Contrariamente a los pelos o fibras, las manchas de
sangre pueden ser detectadas fácilmente con luz apropiada y, una vez secas,
permanecerán en su lugar en la mayoría de los casos. Sin embargo, pueden
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
llegar a infectarse si no se toman los recaudos necesarios, haciendo a veces
imposible el análisis respectivo (por ejemplo, cuando se contaminan con el
polvo que procede del espolvoreado empleado para detectar huellas latentes).
La evidencia debe ser convenientemente recogida, envasada o envuelta,
señalizada y preservada.
Es de destacar la importancia de la fotografía para mostrar la localización y
relación con el ambiente, de cada mancha; para ello se deberán obtener
acercamientos fotográficos con referencia métrica, con la película de la cámara
paralela a la superficie de que se trate, previa demarcación perimetral de la
huella con cinta o cualquier elemento de color contrastante. A fin de mostrar la
direccionalidad de las salpicaduras o manchas que evidencien un sendero, se
pueden utilizar cintas u otros elementos demarcatorios apropiados. La
convergencia de estas líneas indicará la existencia de un objeto que se
balanceaba u oscilaba.
Si las manchas se encuentran sobre un elemento transportable se las podrá
llevar al laboratorio, aunque, en la mayoría de los casos no será necesario si
han sido debidamente documentadas. No deberá olvidarse señalar en cada
caso la ubicación cardinal de cada espécimen para posibilitar su reconstrucción
en caso de ser necesario.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Examen de las ropas
De resultar factible, es importante la concreción de un estudio de las ropas que
se supone vestía el sospechoso en el momentos del hecho. Una vez más, la
localización, tamaño y forma, puede, en conjunto, ayudar a probar o refutar la
historia de lo que aconteció. Por ejemplo si la víctima fue pateada
repetidamente por el imputado, podrían encontrarse salpicaduras de sangre de
mediana velocidad sobre la porción anteroinferior de la prenda que cubre el
tobillo y la pierna, utilizada en el hecho. También habrá que asegurarse de
observar los zapatos y medias.
De igual manera, lo mismo puede suceder con las prendas que cubran
muñecas y brazos, cuando se han empleado instrumentos de mano.
CLASIFICACIÓN DE LOS PATRONES HEMÁTICOS
En Criminalística, de acuerdo al estado, consistencia, forma y características,
las manchas hemáticas se clasifican en los siguientes tipos de producción:
goteo estático, goteo dinámico, lago hemático, arrastramiento y deslizamiento,
salpicadura, proyección, por contacto y spray.
 Goteo estático
Son pequeñas gotas que se dispersan aleatoriamente. Cuando caen
perpendiculares al plano son redondeadas, en cambio cuando caen sobre un
ángulo inclinado tienen una especie de “cola” debido a la gravedad. Sus
bordes, lisos o estrellados dependen de la altura de la que cae la gota.
Indican que lo que sea que las produjo (un arma ensangrentada, la víctima,
victimario, etc.) estaba en reposo, ya que a las gotas sólo las afecta la fuerza
de gravedad.
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
Goteo dinámico
En este caso las gotas tienen forma de signo de admiración, donde la punta, o
la parte más angosta de la misma señala la dirección de la que provienen. Las
gotas se ven afectadas por la velocidad del sujeto o elemento ensangrentado.
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
Lago hemático
El lago hemático consta de una gran masa de sangre depositada en el piso o
terreno.
 Arrastramiento y deslizamiento
 Salpicadura
Las manchas por salpicadura se forman cuando una gota, probablemente
estática, cae sobre un charco o una gota de sangre previa y aún en estado
líquido, como resultado gotas más pequeñas o satélites se pueden ver
alrededor de esta.
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 Proyección
Las manchas por proyección se crean cuando una fuente de sangre expuesta
es sometida a una acción o fuerza, mayor que la fuerza de gravedad (interna o
externamente producidas).
 Contacto
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Se produce una mancha de la transferencia o del contacto cuando un objeto
con sangre entra en contacto con un objeto o una superficie que no tengan
sangre.
 Spray
El spray es la proyección de alta velocidad de un microgoteado (1mm) que se
origina cuando un arma de fuego es disparada muy cerca de un plano orgánico
muy vascularizado.
En cuanto a las manchas de proyección, es interesante mencionar que
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analizando en profundidad el patrón hemático encontrado podemos hallar el
origen de la proyección.
Generalmente el elemento que provocó el patrón será uno contundente o un
arma blanca, ya que la repetición del acto doloso provocará el patrón de
proyección, que también está dado por una velocidad media a alta.
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
También se hace necesario destacar que en el ambiente de la Criminalística
sobre todo, la ausencia de rastros también puede ser una evidencia. Por
ejemplo, si en un mueble polvoriento encontramos una parte donde hay
ausencia de polvo, esto nos indicaría que en el lugar falta algo. Lo mismo pasa
con la sangre. La pérdida de continuidad de una mancha puede demostrar que
allí había algo que ya no está, pudiendo ser un objeto o una víctima; siendo
esto de gran utilidad en los casos donde el cuerpo fue movido de su posición
final.
VIDEOS
https://www.youtube.com/watch?v=8Zr1CJpxjRc
https://www.youtube.com/watch?v=cmoON67ZGJk
https://www.youtube.com/watch?v=8M2pIkB8ABs
https://www.youtube.com/watch?v=UoXfHUm0h1o
https://www.youtube.com/watch?v=zjfdpenl1Rc
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Semen
Aparato genital masculino
Los genitales se llaman también órganos sexuales o reproductores. El aparato
genital masculino lo formas los órganos externos, pene y escroto, e internos,
que son los testículos, los epidídimos, los conductos deferentes, las vesículas
seminales, la próstata y la uretra.
El pene
Es el órgano copulatorio del hombre destinado a depositar semen en la vagina.
Se trata de un órgano muy complejo en su estructura y funcionamiento.
Está situado en la pared anterior de la pelvis y en estado de reposo es blando y
móvil. Se compone de tres cuerpos cilíndricos: dos cavernosos, unidos
lateralmente y que se comunican entre sí; y uno esponjoso, esencialmente
muscular, situado por debajo. Este cuerpo esponjoso termina en la punta del
pene y tiene forma piramidal o de bellota y por este último motivo recibe el
nombre de glande.
En el glande se abre un orificio: el meato urinal, que es donde desemboca el
conducto de la uretra y por donde sale la orina y el semen. Curiosamente,
gracias a un dispositivo que regula cada función, nunca se mezclan.
La piel que recubre el pene es muy elástica y tiene una zona móvil llamada
prepucio, que es la que recubre el glande. El prepucio tiene la capacidad de
replegarse totalmente para dejar al descubierto el glande cuando se produce la
erección. La piel del prepucio está unida al glande por el frenillo, que es un
delgado ligamento. Debajo del prepucio se acumula una sustancia blanquecina
y sebosa con un olor característico, denominada esmegma que se elimina con
una buena higiene.
El escroto
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El escroto es una bolsa de piel dividida en su interior en dos cámaras que
alojan los testículos o glándulas sexuales masculinas. Su función es
protegerlos.
Los testículos
Los testículos o gónadas masculinas, son las glándulas sexuales masculinas.
Están ubicados debajo del pene, entre los dos muslos. El hecho de que estén
situados por fuera tiene una explicación fisiológica: para que puedan funcionar
correctamente necesitan estar a una temperatura inferior a la del interior del
cuerpo.
Realizan una doble función: reproductora y hormonal. Por un lado, están
destinados a fabricar las células principales del semen: los espermatozoides.
Por otro lado, funcionan como unas glándulas de secreción interna que
producen las hormonas, que hacen posible la activación de las funciones
sexuales masculinas. Una de las hormonas más importantes es la testosterona.
El interior del testículo esta formado por infinidad de pequeños conductostúmulos seminíferos- que se unen a otros más grandes los cuales confluyen en
el epidídimo, un órgano en forma de media luna, situado sobre el testículo.
Desde los túmulos seminíferos, los espermatozoides inician un viaje en
dirección al epidídimo.
En los túmulos seminíferos de los testículos, se forman los espermatozoides
durante un proceso que se llama espermatogénesis, influido por una hormona
llamada testosterona y por la FSH. Al principio los espermatozoides carecen de
movilidad y avanzan gracias a los movimientos peristálticos de estos túmulos.
Pero según van avanzando, se van diferenciando y adquieren movilidad.
Los epidídimos
Están situados en la parte posterior, encima del testículo, por eso se llama
epidídimo (sobre testículo) y, en realidad, no son una parte de los testículos,
sino unas estructuras formadas por la unión de pequeños tubos. Constituyen el
primer segmento del conducto espermático, aquí los espermatozoides son
retenidos durante mucho tiempo, incluso semanas, recorriendo su trayecto
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
lentamente e impulsados por las contracciones peristálticas del músculo liso de
la pared de este conducto. En el epidídimo los espermatozoides aumentan su
capacidad fertilizante. Es el lugar principal de almacenamiento de los gametos
masculinos.
El epidídimo tiene su continuación en el conducto deferente, una estrecha vía
que va a parar a las vesículas seminales, lugar donde se produce el líquido
necesario para que los espermatozoides sigan vivos y en movimiento. Debajo
de la vejiga urinaria se encuentra la próstata, que tiene una función similar a la
vesícula seminal.
Los conductos deferentes
Son dos canales por los cuales los espermatozoides que han madurado inician
el ascenso hacia las vesículas seminales. Los espermatozoides maduros
ascienden por los conductos para instalarse en las vesículas seminales.
Contienen escasos espermatozoides. Su función, con su gruesa capa
muscular, es la de transportar rápidamente el semen durante el coito, hacia la
uretra.
Las vesículas seminales
Como su nombre lo indica, son unos depósitos situados debajo de la vejiga
urinaria. Su misión consiste en acoger a los espermatozoides maduros. Las
vesículas seminales se encargan de fabricar un líquido viscoso, llamado
plasma seminal, para que los espermatozoides puedan nutrirse, protegerse y
desplazarse con facilidad.
Producen una densa secreción que contribuye de manera muy importante al
volumen del eyaculado, que oscila entre el 46% y el 80%, siendo la última parte
del semen en salir en una eyaculación. Esta secreción es rica en fructuosa o
levulosa, que es el azúcar principal del semen y proporciona los hidratos de
carbono utilizados como fuente de energía de los espermatozoides móviles, y
relacionada con la motricidad de los mismos. Es la productora de colina, una
base orgánica constitutiva de la lecitina, que interviene en el metabolismo y
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
transporte de los lípidos. También contiene pequeñas cantidades de un
pigmento amarillo, flavonas en su mayor parte, que aportan al semen una
fuerte fluorescencia a la luz ultravioleta, que tiene mucho interés en medicina
legal para la detección de manchas de semen en una violación.
La próstata
Es una glándula masculina que se encuentra situada entre la vejiga, la uretra y
el recto. En la próstata confluyen la vía seminal y la urinaria. A partir del punto
de confluencia, la trayectoria del semen y la de la orina por la uretra es la
misma. Recordemos que nunca llegan a juntarse ambos líquidos, ya que
existen unas válvulas que abren o cierran el paso, según convenga.
La próstata segrega un fluido viscoso y blanquecino muy parecido al líquido
seminal. Ambos líquidos, junto con los espermatozoides forman el semen. El
semen es el líquido blanco y denso que se expulsa a través de la uretra cuando
se produce la eyaculación.
La próstata fabrica un líquido llamado porción prostática que protege, alienta y
facilita la movilidad de los espermatozoides, que constituye entre el 13 y 33%
del volumen eyaculado. El líquido prostático es muy rico en enzimas fosfatasas
y ácido cítrico. La próstata produce también el fosfato de espermita, un
compuesto nitrogenado presente en cantidad abundante en el semen humano.
Cuando el semen se enfría y comienza a secarse, esta sustancia forma los
cristales de Böttcher. Otra sustancia de importancia es una proteína específica
del semen, la proteína P30 o E1, de PM 30000 y también denominada antígeno
prostático específico.
Las glándulas de Cowper
Debajo de la próstata hay dos pequeños órganos que reciben el nombre de
glándulas de Cowper. Su función es la de segregar un líquido que se vierte en
la uretra con el fin de lubricar al semen, poco abundante pero rico en
mucoproteínas, galactosa, galactosamina y ácido galacturónico, siendo la
primera parte del eyaculado y que facilitan la lubricación de la uretra que
recorre el pene para el paso del semen a gran velocidad hacia el exterior,
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gracias a la contracción de los músculos bulbo-uretrales, cuando se produce la
excitación sexual. Esta secreción limpia la uretra y la lubrica, dejándola
preparada para la eyaculación. Hay que tener en cuenta que esta secreción
puede contener espermatozoides, por tanto, si hay penetración, puede haber
embarazo aunque la eyaculación se produzca fuera de la vagina.
La uretra
Es un conducto que atraviesa la próstata hasta llegar al final del glande, donde
se ensancha formando el meato urinario, que es por donde sale la orina o el
semen. La uretra conduce el semen o la orina hacia el meato urinario para
expulsarlos hacia el exterior.
Los espermatozoides
Los espermatozoides son las células reproductoras masculinas. Los que ya
han madurado se componen de cabeza, cuerpo y cola.
La cabeza es oval vista de frente y aguzada vista de perfil. Se distinguen en
ella el acrosoma y el núcleo, recubierta por la galea capitis. Siendo el acrosoma
quien tiene la función de la penetración en el óvulo. El segmento intermedio es
cilíndrico y contiene la mayor parte del citoplasma el cual recubre dos
filamentos, uno axial y otro espiral como una vaina formada especialmente por
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mitocondrias. La cola constituye el aparato locomotor quien le provee de
movimientos traslativos rápidos que constituyen el índice de viabilidad de los
mismos, alrededor de 50 micrones/seg.
Por lo general, los espermatozoides pueden mantenerse activos unos tres días
dentro del aparato genital femenino. No obstante, se han encontrado algunos
vivos en el cuello del útero ocho días después de la eyaculación. Tardan más
de setenta días en madurar. En este momento inician el ascenso desde los
testículos para juntarse con las porciones seminales. Se calcula que en cada
centímetro cúbico de semen hay un mínimo de unos veinte millones de
espermatozoides.
El semen o esperma es un líquido libre de bacterias. Está compuesto por los
espermatozoides,
la
porción
seminal
y
la
porción
prostática.
Los
espermatozoides inician una veloz carrera que va de los testículos a la ampolla
seminal, desde donde pasan al pene a través de la próstata.
Semen
El semen o esperma, proviene del griego sperma (que significa semilla), es un
líquido viscoso y blanquecino, que es expulsado a través del pene durante la
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eyaculación. Está compuesto por espermatozoides (de los testículos) y plasma
seminal (de glándulas vesicales, próstata y glándulas bulbo-uretrales).
Espermograma
Se denomina así al estudio clínico que se efectúa parea apreciar las
características físicas y químicas del semen.
Los parámetros que se evalúan en un espermograma son: el volumen de la
muestra, el número de espermatozoides que contiene cada mililitro, el
porcentaje de ellos que presentan movilidad, buena, muy buena o nula;
también el porcentaje de espermatozoides cuya anatomía es anormal
(morfología) y el número total de espermatozoides móviles útiles.
Características del semen

El volumen medio de semen de una eyaculación es de 3 a 5 mililitros, con
máximo de 15 ml.

El cuerpo humano elimina periódicamente el semen almacenado.

El color del semen es normalmente blancuzco o blanco lechoso. Si el líquido
eyaculado presenta un color anaranjado o rojizo puede que contenga sangre,
signo que se conoce como hematospermia, que puede indicar un trastorno
urológico.

El semen tener una consistencia de coágulo, debido a la facilidad de
solidificación que posee gracias al fosfato de espermita.

El olor y el sabor del semen es peculiar y variable en cada individuo
dependiendo de múltiples factores. El aroma puede ser muy intenso.

El pH del semen es de 7,8 a 8,2.

Menos del 10% del volumen del semen de una eyaculación corresponde a los
espermatozoides.
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
Más del 90% del volumen del semen de una eyaculación corresponde al líquido
seminal.

La concentración normal de los espermatozoides en el semen varía de 50 a
150 millones por mililitro.

El semen contiene algunas otras células, desprendidas del epitelio de los
conductos excretores y de la uretra, a veces también puede contener
leucocitos.

En caso de infección del organismo, el semen puede llegar a contener altas
concentraciones de gérmenes o virus, como por ejemplo el VIH (responsable
de la infección en humanos, mal denominada SIDA).
Debido a la composición del semen, en condiciones adecuadas, los
espermatozoides pueden permanecer vivos fuera del organismo durante varios
días. También sobreviven durante cierto tiempo en los conductos excretores
después de la muerte del varón. Se han llegado a encontrar gametos
masculinos vivos en la trompa de Falopio y en el útero de la mujer varios días
después del coito. Pueden almacenarse en estado congelado con nitrógeno
líquido durante meses o años ya que mantienen su capacidad fertilizante tras la
conservación o criopreservación. Debido a esta última característica es posible
la inseminación artificial y la fecundación in Vitro con semen congelado o
criopreservado.
Composición del semen
Entre las sustancias que componen al semen se encuentran además de lo ya
mencionado, fructosa, aminoácidos, fósforo, potasio y hormonas, aportadas por
las vesículas seminales.
La próstata aporta de 15 a 30% del plasma seminal y su secreción contiene,
ácido cítrico, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, calcio, sodio, zinc, potasio,
enzimas proteolíticas y fibrolíticas.
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El último elemento que se agrega al semen es un fluido que secretan las
glándulas uretrales y bulbouretrales, una proteína espesa, clara y lubricante
conocida como moco.
Edad de producción de semen
El semen comienza a producirse a partir de la pubertad y tiene las
características del adulto a partir de los 11-14 años en la mayoría de los
adolescentes. La cantidad producida aumenta con la edad hasta un nivel
máximo que depende de cada individuo, luego disminuye a medida que el
varón envejece, no obstante, se produce semen durante toda la vida adulta del
varón.
Análisis pericial de manchas seminales
El material bajo pericia suele ser de lo más variado, es habitual trabajar con
ropa interior de la víctima y sospechado, ropas de cama, toallas, alfombras y
material de tapicería en general, etc. En ocasiones debe efectuarse con
exudados vaginales o rectales, o hisopos obtenidos luego del levantamiento de
dichos rastros. Otras veces es necesario trasladarse al lugar del hecho para
realizar la observación sobre pisos, escaleras, interior de vehículos, etc.
En función de la porosidad del soporte podemos encontrar distintas
características, en materiales absorbentes las manchas presentan un color
grisáceo que se amarillenta con el tiempo, con bordes irregulares. Si el soporte
es flexible, caso de las telas, estas adquieren una consistencia apergaminada
al tacto, por el gran tenor de hidratos de carbono presentes en el semen.
Si el soporte no es absorbente, el semen al secarse deja un residuo constituido
por una película o escamas brillantes que se pueden retirar por raspados con
elementos adecuados.
Cuando deben revisarse grandes superficies sospechadas es conveniente la
utilización de una lámpara UV, las manchas de semen suelen presentar una
fluorescencia amarillenta, debido a que tal característica no es exclusiva, el
análisis químico posterior será el que determinará su naturaleza. En numerosos
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casos las fluorescencias típicas de los soportes enmascaran esa característica
y en esos casos se verán manchas opacas sobre fondo con fluorescencia.
La fluorescencia es independiente de la presencia o no de espermatozoides.
Una vez localizadas las manchas debe efectuarse el estudio pericial
propiamente dicho, nuevamente vamos a tener reacciones de orientación y de
certeza.
Por supuesto que la presencia de espermatozoides en la misma será
concluyente, pero la ausencia de los mismos en el semen de muchos
individuos
(azoospermia
enfermedades
u
congénitas
oligozoospermia
o
adquiridas,
la
grave)
por
posibilidad
razones
de
de
sujetos
vasectomizados, por excusión parcial de los conductos deferentes y las
alteraciones que el material pericial pueda sufrir por exposición a los factores
actínicos que afecten su morfología. Es muy común el desprendimiento del
filamento denominado cola del espermatozoide, lo que hace en numerosas
ocasiones tal identificación imposible, o al menos, insegura. También es muy
común que la víctima luego de un ataque de este tipo proceda a higienizarse
cuidadosamente antes de proceder a la denuncia del hecho, de manera que
esa operación arrastra la presencia de los espermatozoides.
Por lo tanto la Criminalística ha adoptado el criterio de aceptar otras pruebas
químicas con valor concluyente, como veremos más adelante aunque tal
situación es cuestionada por algunos Criminalistas.
Pasamos a continuación a describir las técnicas propuestas:
1. Métodos cristalográficos
Reacción de Florence
Se basa en la formación de cristales de Yoduro de colina, como ya se ha
mencionado la colina se encuentra en la composición normal del esperma en
forma de fosforil colina y de lecitina.
El reactivo de Florence está constituido por una solución de Yodo metálico y
yoduro de potasio en agua destilada, el agregado de IK es con la finalidad de
facilitar la disolución del Yodo. El material a analizar, obtenido por raspado o
por disolución según la naturaleza del soporte, se coloca sobre un portaobjetos,
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
en el segundo caso se deposita una gota de la solución y se deja secar sobre
el mismo, a continuación se cubre con un cubreobjetos, y finalmente por
capilaridad se agrega entre porta y cubre una gota del reactivo, se deja en
reposo, no más de 20 minutos, pues los cristales pueden redisolverse y se
observa al miscroscopio. La presencia de unos cristales laminares de color
pardo indican la formación de yoduro de colina.
Este ensayo requiere la presencia de colina libre, que normalmente está en el
semen como fosforicolina, por lo tanto es necesaria la actividad de la enzima
fosfatasa, también presente en el semen para liberarla.
Reacción de Barberio
Se basa en la formación de cristales de picrato de espermita, hemos
mencionado que la misma se encuentra en el semen como fosfato de
espermita en cantidades importantes aunque no es exclusiva del semen.
El reactivo de Barberio está constituido por una solución saturada de ácido
pícrico. La técnica de la reacción es similar a la anterior y se obtienen cristales
fusiformes refringentes de color amarillo.
De la misma manera que el anterior, este ensayo requiere la desfosforilación
de la base nitrogenada.
2. Observación microscópica de espermatozoides
Observación microscópica directa
El reconocimiento de un espermatozoide en una mancha es una prueba
irrefutable de la presencia de semen, esa visualización es fácil en manchas
frescas especialmente si dicho líquido aun no se ha secado totalmente.
Ayudado por la morfología característica del espermatozoide y aun por el
movimiento típico.
Por el contrario en manchas secas y eventualmente contaminado por
partículas, la observación del espermatozoide íntegro es muy dificultosa, ya
hemos mencionado la posibilidad de la “pérdida de la cola” que es muy común
y por lo tanto, distinguir los fragmentos entre otro tipo de material celular, fibras,
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
bacterias, etc. es muy complicado y normalmente el estudio finaliza con un
informe negativo. Si sumamos a ello la posibilidad de azoospermia u
oligozoospermia del sospechoso podemos concluir en la dificultad de obtener
resultados positivos.
No obstante se debe efectuar el intento, macerando el soporte con la muestra
sospechada en unas gotas de solución fisiológica durante varias horas y luego
transfiriendo el líquido resultante a una portaobjetos de vidrio, cubrir con
cubreobjetos y mirar con medio aumento. Algunos autores ponen a centrifugar
el macerado para decantar el material celular y luego de eliminar el
sobrenadante transferir el semen al cubreobjeto. Esta técnica está cuestionada
por la posibilidad de alteración de la morfología celular por el efecto de
centrifugación.
Observación microscópica previa coloración
Los preparados mencionados más arriba pueden colorearse previa fijación de
manera que aprovechando la coloración celular, sea más sencillo detectar los
espermatozoides. El secado se hace a temperatura ambiente cuidando que el
preparado no se contamine, luego se fija para lo cual es suficiente el rápido
pasaje sobre la llama del portaobjetos o de lo contrario sumergirlo en alcohol
70º durante 5 minutos.
Se proponen varios métodos de coloración, con eritrosina, con hematoxilinaeosina, con azul de anilina-eosina, con anaranjado de acridina.
Mencionaremos con más detalle la técnica de May Grunwald-Giemsa que es la
más común y además con la ventaja que los colorantes ya preparados por su
gran difusión se comercializan ya preparados en el mercado. El colorante de
May Grunwald es eosinato de azul de metileno y el colorante de Giemsa es una
mezcla de Azur II y eosina.
La técnica de coloración es simple, inicialmente 3 minutos con el colorante de
May Grunwald en su concentración original, etapa de fijado, luego se diluye al
50% por el agregado de gotas de agua, etapa de coloreado de contraste
durante otros 3 minutos y finalmente la coloración propiamente dicha con una
dilución al 10-15% del colorante de Giemsa, se deja secar y luego se observa
microscópicamente.
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Con esta coloración la cabeza del espermatozoide aparece con una coloración
azul intensa en la parte más próxima al segmento intermedio, mientras que la
parte anterior, el acrosoma de un color lila, el cuello y la cola de un gris oscuro,
negro. Estas características tintoriales permiten facilitar la diferenciación de
filamentos varios, esporas y partículas inespecíficas.
3. Métodos cromatográficos
Los ensayos cromatográficos ya sea sobre papel o placa fina, constituyen una
buena técnica para poner en evidencia la presencia de algunas sustancias que
se encuentran presentes en el semen. Dichos ensayos se realizan con líquidos
resolutivos adecuados, simultáneamente con testigo de esperma humano
indubitable o de sustancias puras componentes normales del semen, como
tales habitualmente se utilizan las bases nitrogenadas, colina y espermina y
una enzima, la fosfatasa ácida.
Si bien es cierto que ninguna de tales sustancias son específicas y por lo tanto
concluyentes, su ausencia nos permitirá descartar la presencia de semen y la
presencia de ellas simultáneamente se convierten en resultados hartamente
sugestivos.
Así Yano y cols. realizan la determinación de colina y espermita por
cromatografía en placa fina.
Dzhalalov y cols. mediante cromatografía en papel investiga la presencia de
fosfatasa ácida utilizando un sustrato de fosfato de fenolftaleína que por acción
de la enzima liberan la fenolftaleína la que se pone en evidencia mediante un
revelador alcalino que producirá máculas rojas.
Hessel y Medgalin investigan las bases nitrogenadas con ClH 1 N como líquido
resolutivo y posterior revelado secuencial con Reactivo de Draggendorf para la
colina y Sol. de yodoplatinato de potasio para la espermita. El revelado se
realizará de manera secuencial, inicialmente protegiendo el tercio superior de la
placa se revela el resto con Draggendorf, en caso positivo para colina
aparecerán manchas rojizas de Rf 0,5, y luego protegiendo los dos tercios
inferiores de la placa, con el yodoplatinato apareciendo manchas violáceas de
Rf 0,85 en caso positivo para espermina.
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4. Métodos electroforéticos
a) Villanueva, Castilla y Gilbert Calbuig proponen un método mixto por
electroforesis y cromatografía bidimensional por el cual se pueden poner en
evidencia las bases nitrogenadas ya mencionadas y además alrededor de una
decena de aminoácidos presentes en el semen, entre ellos ornitina que
proviene de la arginina, pues la ornitina no es proteino-genética.
Inicialmente se practica la separación electroforética mediante una solución de
piridina, ácido acético, agua: de pH 3,9, separándose las bases nitrogenadas
de los aminoácidos.
A continuación, previo secado del papel, se gira el mismo 90º y se practica
mediante cromatografía ascendente con un líquido resolutivo compuesto con n
butanol-ácido acético-agua, revelando con Ninhidrina en solución acetonita con
calentamiento a 80º luego de la aspersión.
Una vez eliminada la piridina por el calentamiento, se revela con el reactivo de
Draggendorf y el de yodoplatinato de potasio ya mencionados para las bases
nitrogenadas, por la electroforesis se obtiene un desplazamiento 10% mayor
para la espermina que para la colina dependiendo del tiempo de corrimiento.
Por ejemplo a 350 volts y 1 hora y 50 minutos se obtiene un desplazamiento de
19,5 cm para la espermina y 17 cm para la colina.
b) Método electroforético de la Metropolitan Police Forensic Sciencies
(Londres).
El método consiste en la identificación de la banda de fosfatasa ácida luego de
la corrida electroforética, en este caso se aplica sobre la placa un papel
impregnado con un reactivo a base de fosfato de umbeliferona en solución de
un buffer de pH 3.
La fosfatasa ácida actúa liberando la umbeliferona por ruptura del enlace
fosfato. Esta última es fluorescente azul pálido al UV largo, mientras que el
sustrato no lo es.
La fosfatasa ácida prostática se diferencia de otras fosfatasas por su mayor
movilidad y la mayor actividad, revelada por la alta fluorescencia obtenida, muy
superior a la de las demás fosfatasas. La fosfatasa ácida sanguínea no es
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
detectada por lo cual no interfiere. Esta característica se debe a la
poliacrilamida utilizada para el corrimiento electroforético, (arcrilamida al 8%
con 8% de almidón insertado) que inhibe la acción de la fosfatasa ácida
eritrocitaria.
La inserción del almidón en la zona de siembra, reemplazando al gel de
poliacrilamida se debe a que permite que el desplazamiento se efectúe en el
seno del soporte y no en su superficie., como el gel de poliacrilamida se
fractura al intentar esa siembra en profundidad se reemplaza por el almidón.
5. Métodos enzimáticos
Una enzima es una proteína que tiene la propiedad de magnificar la velocidad
de una reacción, existen numerosas enzimas que contribuyen a acelerar las
reacciones químicas en los organismos vivos, a semejanza de un catalizador
químico.
Las enzimas tienen dos características importantes, no se consumen durante
su acción y mientras tengan las condiciones adecuadas de temperatura, pH y
sustrato, denominando así a la sustancia sobre la cual actúan, lo seguirán
haciendo. La segunda característica es la de especificidad sobre el enlace
químico o función química sobre la que actúan, de ello habitualmente deriva su
nombre.
En el caso de la fosfatasa que nos ocupa se debe a que actúa específicamente
sobre la unión fosfato provocando su ruptura, la denominación de fosfatasa
ácida, aclara que esta acción se realiza óptimamente a pH ácido. En el caso de
la fosfatasa ácida prostática se la denomina así a la que se origina en la
próstata y que tiene en el plasma seminal la función de desdoblar la fosforil
colina en radicales fosfatos y la base orgánica colina. Esta enzima actúa sobre
variadas sustancias que tienen el grupo fosfato como se verá y a las que se
denomina genéricamente sustratos.
Determinación cualitativa de fosfatasa ácida
La acción hidrolítica de la fosfatasa ácida se puede llevar a cabo detectando el
ácido fosfórico liberado o de la sustancia orgánica base del sustrato utilizado,
como se ha visto fosfato de umbeliferona, fosfato de fenolftaleína, fosforil
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colina, fenilfosfato de sodio, alfa naftilfosfato, fosfato de nitrofenol, todos ellos
por la hidrólisis enzimática generan productos coloreados, fluorescentes o que
pueden producir color con algún reactivo cromogénico proporcionales a la
concentración y que por lo tanto son cuantificables por espectrofotometría.
Sustrato
Producto de hidrólisis
Reactivo cromogénico
Fosfato de umbeliferona
Umbeliferona
Fosfato
Fluorescencia azul UV
Fosfato de fenolftaleína
Fenolftaleína
Fosfato
Rojo en medio alcalino
Fenil fosfato de sodio
Fenol
Fosfato
Folin Cicolteau (azul)
Alfa naftil fosfato
Alfa naftol
Fosfato
Diazotación y copulación
Nitrofenilfosfato
Nitrofenol
Fosfato
Amarillo en medio alcalino
Habitualmente se efectúan reacciones cromáticas de dichas sustancias.
Así por ej. el fenol puede identificarse cualicuantitativamente mediante el
reactivo de Folin Cicolteau con quien produce coloración azul en medio
alcalino.
El p nitrofenol tiene coloración propia y en medio alcalino produce una
coloración amarilla proporcional a la concentración.
Determinación cuantitativa de fosfatasa ácida
Ya se ha mencionado que la fosfatasa ácida no es una enzima específica del
esperma, se encuentra presente en numerosos humores y tejidos de origen
animal y vegetal, sin embargo no se conoce otro material que contenga tan
elevada cantidad de esta enzima. En función de esto es necesario establecer
cuantitativamente la presencia de la enzima y encontrar forma de diferenciarla
de las restantes fosfatasas ácidas de otros orígenes.
Para poder efectuar la cuantificación se requiere definir una unidad que se
relacione con la actividad de la misma. Generalmente se aplica la definición de
King Amstrong modificada por Gutman y Gutman y que dice que una unidad de
fosfatasa ácida es la cantidad de la enzima que actuando sobre el sustrato de
fenilfosfatasa disódico a 37ºC y pH 4,9 libera 1mg fenol en 1 hora. Nótese que
si el sustrato es otro habrá que hacer los cálculos que permitan la equivalencia
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en cuanto a la actividad enzimática. El suero humano contiene de 0,5 a 4
U/100ml, mientras que el semen contiene de 400 a 8000 U/100ml.
Cuando se cuantifica la fosfatasa ácida en una mancha se acostumbra a
expresarla en unidades/cm2 de mancha debido a que en general se trabaja con
materiales laminares, debe fijarse un valor umbral experimental que para Kaye
es de 30 UI/cm2 de muestra.
Otros autores prefieren expresar el resultado practicando el agotamiento de
una porción de mancha por maceración, pesando la muestra seca antes y
luego de la extracción, la diferencia entre ambas pesadas corresponde al peso
de la muestra y se expresa el resultado en UI/mg de la diferencia, tomando en
ese caso el valor de 2UI/mg como umbral.
Las investigaciones de varios autores determinaron que en ningún caso en
diversos materiales la concentración supera las 20UI/ml, recordando el hecho
de que el semen supera holgadamente las 400UI/ml podemos verificar que el
hallazgo de cantidades altas es altamente sugestivo de su origen.
Este hecho puede ser mucho más definitorio en función de un descubrimiento
de Sivaram y Barni, en 1971 que fue confirmada por otros autores de que la
actividad de la fosfatasa ácida prostática es inhibida por el ácido L(+) tartárico
en tanto que las restantes no lo son.
Es en función de esto que los diversos métodos propuestos para cuantificar la
fosfatasa se basan en la incubación con exceso de sustrato, en condiciones de
temperatura, pH y en un estricto tiempo de incubación. Se mide el producto
producido y en función de eso se calcula la concentración de enzima en UI,
referidas al área o al peso de la muestra.
Esta determinación debe hacerse con un blanco de reactivos, la muestra y una
muestra en presencia de ácido tartárico, un ensayo positivo daría color sólo con
la muestra. Un ensayo negativo daría todo incoloro y en el caso de que los
tubos de muestra y muestra + tartárico dieran semejantes indicaría que
estamos en presencia de una fosfatasa ácida no prostática.
A continuación se propone un esquema básico para cuantificar FAP.
Inicialmente hay que obtener una solución de la muestra obtenida a partir de un
volumen conocido de solvente y un peso o área conocida de mancha para
finalmente hacer los cálculos necesarios.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Reactivo
Blanco
Muestra
Muestra + L(+) tartárico
Buffer
1ml
1ml
1ml
Solución de L(+) tartrato
----
----
5ml
Agua destilada
5ml
----
----
Extracto de tela manchada
----
5ml
5ml
Sustrato
1ml
1ml
1ml
c. A 37ºC
1 hora
1 hora
1 hora
Inhibidor CO3Na2
1ml
1ml
1ml
Rvo. Cromógeno
1ml
1ml
1ml
Agua destilada
5ml
5ml
5ml
Finalmente se debe interpolar el valor de DO (densidad óptica) obtenida en el
espectrofotómetro de la muestra a la cual se le restó el blanco y ese dato se
interpola en una curva de calibración efectuada graficando las absorbancias
obtenidas con concentraciones conocidas de fenol, haciendo los cálculos
correspondientes y expresando el resultado en UI.
Métodos basados en la identificación de una proteína específica del
semen
Hasta el momento los métodos descriptos con excepción de la visualización de
un espermatozoide humano se basa en la presencia de compuestos que no
son específicos del semen, ya hemos visto en qué condiciones la FAP adquiere
trascendencia definitoria. Actualmente se ha propuesto la búsqueda de una
proteína específica que podría utilizarse como marcador.
G. F. Sensabaugh descubrió en el plasma seminal, mediante estudios
electroforéticos que una de las proteínas que se aislaban no se encontraba en
otros tipos de humores o líquidos biológicos. En función de esos estudios logró
separar numerosas fracciones proteicas y polipeptídicas.
Es de sumo interés, por no haberse encontrado en otros humores biológicos y
vegetales la fracción denominada P30 por su PM 30000 a la cual se la
denomina PSA o Antígeno Prostático Específico. Con esta fracción,
convenientemente purificada, se procedió a obtener con animales de
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
experimentación anticuerpos específicos y la detección de la P30 se efectúa
con reacciones antígeno anticuerpos con los distintos métodos propuestos para
inmunoensayos.
El inmunoensayo ofrece un método alternativo rápido y fiable de detección de
PSA. Tiene una sensibilidad de 99.4%, y a las 48h su sensibilidad disminuye a
96%, puesto que a partir de las 27 horas desaparece progresivamente. Es una
prueba confirmatoria.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Saliva
La saliva es una sustancia involucrada en parte de la digestión, se encuentra
en la cavidad bucal, producido por las glándulas salivales, compuesto por agua,
sales minerales y algunas proteínas que tienen funciones enzimáticas.
La detección y análisis de saliva puede resultar de suma importancia en
diferentes tipos de casos criminales incluyendo, por ejemplo:

Cuando se utilizo una máscara o pasamontaña como disfraz;

En casos de ataque sexual cuando han ocurrido besos/lamidas/mordeduras;

Casos que involucran ítems tales como estampillas/sobres, boquillas de
cigarrillos y botellas de bebidas.
La saliva puede contener un alto nivel de actividad de la enzima a-amilasa. La
a-amilasa, llamada también ptialina o tialina, es una enzima que tiene la función
de catalizar la reacción de hidrolisis al digerir el glucógeno y el almidón para
formas azucares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares
y en el páncreas. Tiene un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama
aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre.
La a-amilasa sigue presente aún en las manchas secas y ha probado ser un
indicador claro de saliva. Sin embargo, la misma sustancia puede estar
presente, pero en niveles mucho más bajos, en otros fluidos como semen y
material vaginal. También pueden detectarse niveles altos de amilasa en las
heces. Por supuesto, la saliva contiene ADN y cualquier trazo de saliva puede
ser sometida a perfilación genética.
Para
medir
la
actividad
enzimática
de
la
a-amilasa,
se
utilizará
un test colorimétrico que detecta el almidón. Para ello se contará con una
solución de iodo/ioduro de potasio (I2/IK), ya que el almidón en presencia de
esta solución adquiere una coloración azulada característica. Esto tiene una
explicación física: el iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la
amilosa (en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo de color azul.
Cuando la a-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por
tanto en presencia de I2/IK ya no dará una coloración azul.
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Capilares pilosos
En todo hecho criminal la pericia en pelos y cabellos reviste suma importancia.
Tanto pleos como cabellos pueden encontrarse en las manos de la víctima o
adheridas al arma homicida, como así también al agresor. La adherencia de los
pelos sobre distintas superficies, se ve facilitada por la rugosidad que
presentan los pelos en su superficie (cutícula). Este tipo de pericias reviste
también cierta importancia en aquellas investigaciones relacionadas con actos
de violación o atentados al pudor. Otra propiedad de este material es su
resistencia a la putrefacción siendo este hecho de gran importancia cuando se
realizan pericias muy posteriormente a la fecha del hecho investigado, en
algunos casos a pesar de inadecuadas condiciones de conservación.
Constitución del pelo
Los pelos son filamentos conificados que se desarrollan en la epidermis. Su
longitud varía entre varios milímetros hasta más de un metro y el diámetro de
su sección transversal varía entre 0,08 y 0,8 mm. Se distribuyen con densidad
variable por toda la piel con excepción de las palmas de las manos y plantas de
los pies, las caras inferiores y laterales de los dedos de la mano y del pie, la
cara superior de la 3ª falange, los labios, el glande del pene, el prepucio y la
superficie interna de los labios mayores.
Cada pelo se forma por una invaginación tubular d el apiel, el folículo piloso,
cuyas paredes están formadas por epidermis y dermis. En el extremo profundo
del folículo piloso hay una saliente de tejido conectivo que constituye la papila
pilosa. La raíz se continúa con el tallo piloso cuyo extremo sale a la piel.
Conectado a cada folículo piloso hay una o más glándulas sebáceas, estas
están situadas en ángulo obtuso y se abren en el cuello del folículo. En la parte
media de la vaina se inserta un haz de fibras musculares lisas, las cuales por el
otro extremo terminan en la capa papilar de la dermis.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
La mayoría de los bulbos pilosos producen al renovar el brote capilar, pelos en
la longitud y espesor crecientes.
El pelo de la cabeza solo alcanza su pleno desarrollo en el momento de la
pubertad, este pelo puede ser rígido, alisado, ondulado, erizado o crespo.
El crecimiento del pelo se efectua a un promedio diario de 0,3 a 0,4mm, lo que
da un crecimiento promedio de 1 cm. al mes, se encuentra condicionado por
glándulas endócrinas tales como hipófisis, suprarrenales, gonadas y tiroides.
La formacion de rizos en el pelo, se debe a la rotación del folículo sobre su eje.
En el orden cronológico, el primer pelo en aparecer en el ser humano es el
lanugo, este posee una longitud de 10 a 15 mm. Y un grosor de 0,014 a 0,027
mm. Presenta una diferenciación cromática en su tallo, la punta es blanca y el
resto presenta variedades en lo que hace a su pigmentación, puede ser
amarillento, pardo o rojizo. El lanugo se pierde en el séptimo u octavo mes de
vida intrauterina y puede encontrárselo flotando en el líquido amniótico.
En el recién nacido, el pelo de la cabeza carece de médula y su longitud
habitualmente es de 20 a 25 mm. este pelo se pierde dentro de los seis meses
iniciales, siendo reemplazado por el pelo infantil. El pelo del recién nacido tiene
su origen en el 4to. mes de embarazo y perfora el cuero cabelludo en el 6to.
mes.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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El pelo infantil, si no es cortado, conserva su punta original, llegando a una
longitud de 144 mm.
con un diámetro de 0,08 mm. va adquiriendo
gradualmente un aspecto mas recio al 3er. o 4to. mes de vida, alcanzando su
máximo desarrollo y características particulares, en la pubertad, pudiendo
llegar a un diametro de 0,14 mm.
En el nacimiento puede existir aún lanugo, especialmente en el tronco, región
de los hombros y en partes posteriores de los brazos.
En la pubertad, aparece el denominado pelo puberal, formado por el vello
pubiano, axilar y mentoniano, que por lo general, son crespos. El vello del
pubis, puede alcanzar diámetros considerables, de hasta 0,30 mm.,los pelos
mentonianos se caracterizan por su secredad, siendo el diámetro del orden de
0,20 mm. El vello axilar, es mas delgado que los anteriores, de longitud variable
pudiendo llegar a varios centímetros. En las fosas nasales y conductos
auditivos pueden encontrarse pelos no muy largos pero tan recios como los de
la barba.
Las pestañas, tardan alredededor de 5 años en llegar a la longitud del adulto,
las cejas demoran mucho mas.
Tecnología para el estudio de pelos
a)
Limpieza y eliminación de partículas extrañas
Se emplea solución jabonosa, eter, o solución de carbonato al 10%, luego se
deshidratan unos minutos en alcohol absoluto, finalmente se los pasa por xilol y
se observan en un medio acuoso glicerinado, puede emplearse también el
Bálsamo de Canadá.
Si el pelo fuese muy oscuro es recomendable decolorarlo para una mejor
observación, para ello se emplean soluciones de agua oxigenada, ácido
acético, solución de hipoclorito de sodio, solución alcohólica de cloro, ácido
nítrico, se obtiene buen resulatado con agua oxigenda de 100 volumenes y
solución OHNa combinadas, la decoloración se obtiene en 15 minutos, no
modificándose ni la estructura ni el diámetro.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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b)
Tinción
El examen microscópico se puede efectuar directamente o previa tinción,
las células cuticulares se pueden teñir con el Gram o sumergirlas en ácido
ósmico (5 minutos), lavar y luego se colorea la cepa medular (10 minutos) con
soluciones de eosina y eritrosina.
Otra técnica recomendada es desengrasar el cabello con sol CO3K2 10% u
OHNa 1%, luego alcohol y eter y finalmente agua, luego sumergirlo en una
solución de violeta de genciana o violeta de metilo durante unos minutos, se
montan con Bálsamo del Canadá. Mediante esta tinción se colorean las
escamas cuticulares, quedando el resto incoloro.
c)
Diámetro del pelo
La observacion del diámetro del pelo se efectúa realizando cortes transversales
con un micrótomo, previa inclusión del pelo en parafina celoidina. Las
mediciones se efectúan con la combinación de micrómetros objetivos y
oculares.
d)
Observación de la forma de la cutícula
Se efectúa un molde sobre un lecho plástico de portaobjetos. Las sustancias
que se utilizan pueden ser: Cefeloidina (30 g.) en acetona (170g.), Acetato de
celulosa, Solución clorofórmica al 10% de plexiglás. La técnica consiste en
generar un lecho de cualquiera de estas soluciones, no endurecida aun, se
coloca suavemente el cabello y se lo deja durante unas horas, luego se lo retira
y se lo observa microscópicamente. Una práctica solución es la utilización de
esmalte de uñas incoloro.
Estructura del pelo
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Bajo el punto de vista legal no es de interés un profundo estudio histológico
del pelo, si es de interés algunos caracteres generales que sirven para su
estudio, en un pelo podemos distinguir: la punta, el cuerpo o tallo y el bulbo.
El cuerpo o tallo presenta un aspecto fusiforme, tiene un estrechamiento en la
raíz, luego se ensancha progresivamente y vuelve finalmente a adelgazarse en
la punta.
En el tallo se distinguen:
a)
La cutícula, que está formada por células imbricadas o empizarradas a
la manera de tejas, con las puntas de estas escamas dirigidas hacia la
extremidad libre del pelo. El tipo y aspecto de las escamas del pelo es de
capital importancia en la discriminación de especies e identificación de pelo
humano.
Tipos de cutícula: simple, Conífera, Serrado, Alargado, Dentado, Ovalado,
Achatado y Acuminado.
Visto de perfil un pelo tiene el aspecto superficial escamoso, con las escamas
dirigidas hacia la punta. Se describe como punta al tramo que comprende entre
su extremidad y su diámetro mayor o máximo. La punta puede perder su
agudeza por corte, por fricción o por desilachado en forma de pincel.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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b)
La Sustancia cortical. Constituida por células unidas por finas fibrillas
de una proteína pseudo cristalina que lleva inclusiones de material pigmentario.
El mayor interés de esta zona lo presenta el pigmento y disposición, cuya
naturaleza bastan para diferenciar gran número de pelos, en función de su
cantidad o su pérdida.
c)
La médula, que no siempre existe (falta en el lanugo y pelos fetales, y
aun frecuentemente en pelos femeninos), constituye el cilindro eje del pelo y
sus células están separadas por una red aérea de aspecto variable según las
especies animales, continua, fragmentada, ausente, etc. Ofrece una serie de
datos de interés, por ejemplo interesan la medidas del diámetro total y el
diámetro medular.
Fotomicrografías de aspecto de pigmentación en pelos, el de la izuiqerda es
pelo animal.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Un diámetro superior a los 160 a 170 micrones permite afirmar su no
procedencia humana.
Pueden encontrarse valores ligeramente inferiores a eso en pelos de barba o
de pubis. El cabello masculino tiene valores entre 80 y 130 micrones, el
femenino es menor, del orden de 90 micrones.
Algunos autores han basado esta situación para diferenciar pelos masculinos y
femeninos, aunque realmente la amplia diversidad de diámetros entre pelos de
uno y otro sexo no permite esta conclusión con certeza.
En cuanto a establecer la edad, solo puedo diferenciarse si se trata de un pelo
fetal, de niño o adulto.
Un dato significativo es establecer el índice medular, el cual se obtiene por el
cociente entre el diámetro de la médula y el diámetro total del pelo. En la
especie humana los índices oscilan entre 0.25 y 0.35 para pelos de pubis,
barba, bigote y pestañas, para el resto es un poco menor 0.25 para hombre y
0.20 para mujer, cuando se encuentra.
Las médulas se clasifican en: continuas, intermitentes y fragmentadas, la
mayoría de las médulas de animales son continuas o intermitentes, la lana de
la oveja recuerda más el cabello humano que el pelo de la mayoría de los
animales.
La disposición de las médulas intermitentes, es a menudo muy llamativa y
característica. El cabello humano posee normalmente una médula de tipo
fragmentario, aunque en muchos casos puede estar ausente, y en otros casos,
la médula es prácticamente contínua, pero raramente se encuentra una médula
de tipo intermitente.
Los pelos humanos a-medulares son más comunes que los de médula
continua. Existe alguna evidencia de que solamente los pelos que sobrepasan
cierto diámetro contienen médula, y cuando mayor es su diámetro más tiende
la médula a ser contínua.
Identificación de la naturaleza del material hallado
En muchas ocasiones distintos tipos de fibras pueden confundirse con pelos.
Una prueba de orientación consiste en quemar una pequeña porción. Las fibras
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
vegetales arden rápidamente, y dando aroma a pan quemado, en el caso de
fibras de origen animal, queman mas dificultosamente y produciendo el típico
olor a cuerno quemado. En el caso de fibras de origen sintético se aprecia en
ocasiones un proceso de fusión sin arder y con la emisión de gases de olor
picante.
Puede intentarse, cuando la cantidad de material disponible es adecuada,
algunos ensayos con reactivos líquidos, así las fibras vegetales son
relativamente disueltas en ácido sulfúrico al 50 %, dicha solución mediante el
agregado de unas gotas de solución alcohólica de naftol arrojando un color
violeta oscuro. En el caso de fibrasde origen animal su disolución es más fácil
con hidróxido de sodio al 10 %.
Cuando la cantidad de muestra es escasa conviene efectuar observaciones
microscópicas luego de exponer el material, entre porta y cubre, a la acción de
un reactivo complejo, inicialmente unos segundos con un reactivo A, solución
acuosa de yodo y IK, y luego con un reactivo B, a base de glicerina, agua y
ácido sulfúrico.
La técnica es la siguiente: se separan las fibras sobre un portaobjeto, se le
adiciona durante unos segundos una gota del reactivo A, se absorbe el exceso
con papel de filtro, y luego una gota de reactivo B. La celulosa se tiñe de azul y
los elementos lignificados de amarillo.
Otra reacción propuesta es con un reactivo A, a base de Cloruro de Zinc en
agua y un reactivo B, a base de Lugol como el ya mencionado, con este
tratamiento la celulosa se colorea en rosa o rosa violáceo y los elementos
lignificados en amarillo.
Coloración de fibras de hilados y tejidos (Norma Iram 7510)
Fibras
Solución de
Solución
Solución de
C12Zn
de Millon
Floroglucina
Yodo/yodurano
Animales: lana y seda
Amarillo oscuro
Vegetales: algodón, lino,
Rojo violáceo
cáñamo y otras fibras pecto
(distintas
celulosas
tonalidades)
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Rosado
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Vegetales: yute cáñamo de
Amarillo (distintas
Manila y otras fibras
tonalidades)
Rosado
celulósicas
Artificiales: proteicas
Amarillo oscuro
Artificiales: rayón viscoso y
Azul más o menos
cuproamoniacal
intenso
Artificiales: rayón al acetato
Amarillo
rosado
de celulosa
Objetos de pericia relacionados con el estudio de pelos
1) Diagnóstico específico
2) Sexo y lugar del cuerpo de dónde proceden
3) Edad del sujeto de quién proceden
4) Pelos arrancados, rotos, cortados, caídos
5) Procedente de un sujeto vivo o muerto
6) Determinar si son pelos teñidos
7) Determinar si el pelo está decolorado
8) Determinación de raza
9) Individualidad de los pelos
10) Traumatólogía del pelo
11) Grupo sanguíneo Sistema ABO en pelo
12) Enfermedades del pelo
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
13) Análisis del cabello por reacción neutrónica
14) Investigación de drogas de abuso en pelos
1) Diagnóstico específico
Debe determinarse si el pelo es humano o no. Del estudio en detalle de las
características diferenciales de las partes constitutivas del pelo humano y de
los animales.
Canal medular
Pelos humanos
Red aérea granulosa
Pelos animales
Contenido aéreo más o menos
voluminoso
Células medulares indivisibles sin
Células medulares aparentes
disociación
Índice medular ≤ 0.30
Índice medular ≥ 0.50
Pelos del vello. Sin médula
Médula en escalones o moniliforme en
los de vello
Sustancia cortical
Pelos humanos
Forma un grueso manguito
Pelos animales
Constituye un cilindro hueco bastante
delgado
Pigmento en granulaciones
Pigmento en granulaciones irregulares
homogéneas muy pequeñas
gruesas, mayores que en el humano
Cutícula
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Pelos humanos
Pelos animales
Escamas delgadas poco salientes y
Escamas gruesas, salientes y menos
muy imbricadas
imbricadas que en los humanos
Se acepta que un diámetro total de pelo, superior a 160 micrones, es indicio
significativo de pelo animal. Por las características histológicas y por estudios
comparativos con pelos de colección podrá establecerse la especie animal a la
que pertenece.
2) Sexo y lugar del cuerpo de dónde proceden
Este tema puede resolverse favorablemente cuando se dispone de abundante
cantidad de muestra, de lo contrario prácticamnete sería imposible. El estudio
microscópico se basa en tres elementos: longitud, diámetro y forma de la
punta.
El vello se caracteriza por su escasa longitud menor a 1 cm, por su delgadez
de 25 a 40 micrones y por la falta de pigmento y canal medular. No presenta
ninguna diferencia regional.
Se ha sugerido la diferenciación de sexo, en función del tenor de azufre del
pelo, mediante reacciones químicas, aprovechando un supuesto mayor tenor
en varones , sin embargo la superposición de valores del tenor de azufre
hallada en ambos sexos genera un serio cuestionamiento a esta propuesta.
El cuadro a continuación constituye una ligera aproximación como para tener
en cuenta, pero no debe tomarse como concluyente.
Pelos cortados
Diámetro medio < a 80 micrones
Cabellos
Ausencia frecuente de médula
Diámetro medio > a 100 micrones
Pelos de barba
Pelos no cortados
Long. > 8 cm
Lic. Lucas Bravo Berruezo
Cabellos
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femeninos
Long. entre 3
Pelos
Raíz nudosa
Pubis
y 8 cm
crespos
Long. entre 3
Pelos
y 8 cm
crespos
Long. entre 3
Pelos lisos
Grosor > 100µ
Pelos lisos
Grosor < 100µ
Cutícula intacta
Escroto
Pelos lisos
Grosor < 100µ
Cutícula
Labios
irregular
mayores
masculino
Raiz delgada
Pubis
femenino
Bigote
y 8 cm
Long. entre 3
y 8 cm
Long. entre 3
y 8 cm
Long. ≤ a 3
Extremidad Diámetro >
Pelos del
cm
gastada o
tronco
60µ
en pincel
Long. ≤ a 3
Extremidad Diámetro <
Pelos
cm
gastada o
extremidades
60µ
en pincel
Long. ≤ a 3
Extremidad Forma
cm
afilada o
Diámetro > 80µ
arqueada
Pestaña
femenina
aguda
Long. ≤ a 3
Extremidad Forma
cm
afilada o
Diámetro > 80µ
arqueada
Pestaña
masculina
aguda
Long. ≤ a 3
Extremidad Forma
Cejas. Pelos
cm
afilada o
nasales
sinuosa
aguda
Long.≤ a 1
Ausencia
Diámetro de 5 a Pelos de vello
cm
de
40 µ
conducto
medular y
pigmento
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Una técnica más segura para establecer el sexo del cual proviene el pelo se basa en
la tinción diferencial de los cromosomas sexuales y su observación microscópica, para
lo cual es necesario disponer de células nucleadas las cuales en el pelo son las
provenientes de la raíz del mismo. Las células queratinizadas provenientes del tallo no
poseen núcleo y solamente podría trabajarse con el ADN mitocondrial.
En la mujer normal los cromosomas sexuales aparecen como un par homólogo de
cromosomas X, uno aparece condensado y puede ser teñido con orceína en medio
acético apareciendo como manchas castaño oscuro sobre el color rosado pálido del
citoplasma, conociéndoselo como corpúsculo de Barr, el número de estos corpúsculos
es menor al número de cromosomas X.
La interpretación del resultado es que, si al menos, el 30 % de las células observadas
presentan corpúsculos de Barr, se considera un pelo de origen femenino, por el
contrario si es menor, se supone masculino, debiéndose confirmar mediante la
detección del cromosoma Y. en todos los casos esta interpretación no es sencilla y se
aconseja que la realice personal experimentado en el tema.
El hombre normal tiene un cromosoma X y otro Y, estos últimos tienen gran afinidad
para fluorescer con clorhidrato de quinacrina, cosa que no ocurre en los cromosomas
X, lo que permite la diferenciación, pudiendo observarse los cromosomas Y como
manchas fluorescentes brillantes amarillo verdosas en la interfase del núcleo sobre un
fondo verde pálido.
3) Edad del sujeto de quién proceden
En general las especulaciones sobre este tema se hacen en función del
diámetro del pelo, en pelos fetales son menores a 50 micrones, sin médula y
carentes de pigmentos. En los recién nacidos ya puede comenzarse a apreciar
canal medular, el desarrollo del mismo es más precoz en pestañas que en los
restantes pelos. Se sugiere un diámetro mínimo creciente según la edad
cronológica la cuál también debe tomarse como referencia.
12 días
24 micrones
6 meses
37 micrones
18 meses
38 micrones
15 años
55 micrones
adultos
70 micrones
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
En sujetos ancianos los pelos tienden a disminuir en cantidad y grosor, el
diámetro medio desciende a 55-60 micrones. Otro detalle es la aparición de
pigmentógrafos, células destinadas a la reabsorción del pigmento que aparece
en la zona cortical , lo cual nos demuestra que los pelos proceden de un sujeto
que comienza a encanecer lo cual, como se sabe, es sumamente variable.
4) Pelos arrancados, rotos, cortados, caídos
Los pelos que no han sido cortados terminan en su punta gradual y
regularmente que presenta una formación redondeada por los rozamientos y
frotes repetidos, por ej. el peinado. En algunos casos en cabellos descuidados
pueden presentar una extremidad libre hendida, en forma de escobilla.
Los pelos recientemente cortados siempre terminan en una superficie plana,
perpendicular u oblicua al eje del pelo, de ángulos limpios y vértices agudos.
En poco tiempo, 48 hs, dichos ángulos comienzan a redondearse y esa
apariencia roma se incrementa con el tiempo.
El cabello crece 0.3 a 0.5 mm por día, por lo tanto, puede calcularse por
ejemplo el tiempo transcurrido desde su última afeitada. Erróneamente se ha
hablado de un crecimiento post morten, lo que realmente ocurre es una mayor
apariencia de los pelos debido a la rigidez cadavérica de los músculos
erectores y la deshidratación del cadáver.
El diagnóstico diferencial entre el pelo caído espontáneo y el arrancado
violentamente se hace por el estudio de la extremidad proximal del pleo o raíz.
El pelo se halla implantado en una papilla dérmica que lo nutre, cuando el pelo
termina su evolución, la papilla se deseca y muere,cayendo junto con el folículo
piloso ya seco. En el caso del pelo arrancado es frecuente que por la violencia
del acto la papila puede no desprenderse y aparece el bulbo vacío, sin
embargo puede acompañar y el pelo arrancado puede llevar parte de la vaina.
5) Procedente de un sujeto vivo o muerto
Si han sido recientemente desprendidos del cuerpo o si por el contrario se trata
de pelos procedentes de una peluca. La presencia de bulbos no desecados
indica que los pelos estaban adheridos a la piel pocas horas antes.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Los pelos postizos son siempre más sucios que los cabellos, incluso de los de
las personas poco aseadas, en general fácilmente cubiertos de polvo y otras
impurezas, son quebradizos, frágiles, presentan resquebrajaduras y tienden a
decolorarse por la luz.
6) Determinar si son pelos teñidos
Los pelos teñidos tienen un color más uniforme que los de color natural, esta
afirmación no es absoluta y solo puede apreciarse con seguridad si se pueden
hacer estudios comparativos, un segundo detalle quizá más significativo es que
a raíz del crecimiento ya mencionado estos cabellos pueden no estar teñidos
en la parte próxima a la raíz.
El número de tintes empleado es ilimitado. Entre las sustancias más empleadas
tenemos: decolorantes, tintas vegetales, tintas de base metálica y tintas
orgánicas sintéticas. El H2O2 es el decolorante más empleado. Entre las tintas
orgánicas, a la fenilendiamina se le atribuye propiedades tóxicas causantes de
graves dermatitis.
La luz U.V. es un auxiliar de valor para la identificación de cabellos decolorados
y teñidos, es de interés examinar la diferente fluorescencia entre el tallo del
pelo y la región próxima a la raíz. Generalmente el pelo teñido aparece opaco y
los cambios cromáticos apreciables pueden ayudar para el aspecto pericial.
7) Determinar si el pelo está decolorado
Se somete al pelo a la prueba de infiltración o impregnación con ciertos
colorantes, el más utilizado es un reactivo constituido por una solución de NH3
en alcohol etílico y una solución de azul de metileno al 1 %.
Se lava el pelo con alcohol, eter y agua, para eliminar grasas y suciedades,
sumergir el pleo en la solución alcalina durante 10 minutos, luego pasarlo por
alcohol y previo secado sumergirlo en la solución de azul de metileno hasta la
evaporación de este, se lava y se observa en el microscopio.
Los pelos sometidos en alguna ocasión al teñido han perdido impermeabilidad
y, por lo tanto, la zona tratada absorberá el azul de metileno.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
8) Determinación de raza
Mediante el estudio de la sección trnasversal del pelo, montándolo
adecuadamente sobre parafina o plexiglás y obtenidas por cortes con
micrótomo se puede verificar la goemetría transversal del pleo y en función de
eso puede estimarse la raza, así la raza caucásica es más o menos circular, la
raza amarilla (mongoloide) es triangular y la raza negra es ovoidea con canal
medular excéntrico.
9) Individualidad de los pelos
Establecer si un determinado pelo pertenece a un individuo es un problema de
difícil resolución, con más frecuencia puede lograrse el diagnóstico de no
identidad, lo cual en muchos casos puede ser suficiente.
Para efectuar este estudio deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos:
 Estudiar las sustancias adheridas
 Medir el diámetro del pelo
 Hallar el índice medular
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
 Estudiar la cutícula
 Establecer la comparación colorimétrica
 Observar alteraciones patológicas
La comparación colorimétrica se realiza previa decoloración del mechón de
cabello con OHK al 5 % sin pasar los 60° C
10)Traumatología del pelo
Los traumatismos y los agentes físicos y químicos producen alteraciones de
valor forense. La tracción produce la ruptura total o parcial del pelo. Los golpes
con elementos contundentes dejan secuelas, cuya magnitud depende de las
condiciones en la cual fue realizado y especialmente si fue contundido sobre un
objeto duro.
El corte con instrumentos filosos o cortantes efectúa un corte en bisel típico, el
cual se va redondeando con el tiempo y tal redondez ofrece datos de interés
cronológico.
El calor produce alteraciones micro anatómicas del pelo, marcando estas si el
cabello fue sometido a la llama o al calor radiante. Los pelos comienzan a sufrir
alteraciones en su microestructura hasta los 140° C, a esta temperatura las
burbujas aéreas, en la sustancia medular aumentan de tamaño y estallan,
venciendo la resistencia de la cutícula, para otros autores este fenómeno se
produce a mayor temperatura 200° C. A los 260° C comienza la carbonización,
la que finaliza a 300-400° C.
Los reconocimientos histológicos se pueden efectuar en cabellos calentados
hasta 200-250° C, pasado lo cual las alteraciones de la carbonización impiden
la determinación de la estructura del tallo piloso. Los agentes químicos (ácidos
y álcalis) son bien resistidos por la estructura del pelo si dicha acción no se
prolonga demasiado
11) Grupo sanguíneo Sistema ABO en pelo
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
En 1966, Yada, determinó el sistema ABO en una muestra de pelo utilizando la
técnica de absorción-elución. Una año más tarde Wynbrandt y Chisum, repiten
el intento presentando su trabajo a la Asociación Criminalística de California,
aunque con resultados no muy satisfactorios. En 1971 los mismos autores
mejoran los resultados trabajando ahora con la técnica de absorción-inhibición.
A partir de 1974 Yada nuevamente presenta con modificaciones su
metodología con mejores resultados. En España, Ruiz de la Cuesta (1980),
Romero Polanco (1981) y Rojo y Ruiz de la Cuesta en 1983 proponen la
siguiente técnica:
1) Limpieza del pelo: se lava el pelo agitando durante una hora con
detergente enzimático (Ter A Zyme) a pH 9.5
2) Desengrasado: con eter de petróleo a 60° C durante 30 minutos
3) Fijado: con etanol a 60° C durante 30 minutos
4) Aplastado: con laminador de metales consiguieron una anchura superior
a 3 veces su diámetro inicial como indica Yada. Hasta ahora se había
realizado con mortero de ágata. Con el nuevo método se ahorra tiempo
y se evita el deterioro de la muestra. Los pelos así preparados se
adhieren a la placa de policarbonato mediante la disolución del mismo
con acetato de celulosa y la inserción de los pelos mientras el material
está fundido.
5) Incubación: con antisueros A y B, título 1/256 a 4° C, durante 12 a 18 hs.
6) Lavado: con 6 cm3 de solución fisiológica a 4 ° C y agitación mediante 5
cm3 de aire
7) Elución: a 56° C durante 12 minutos
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
8) Lectura: con suspensión de hematíes lavados al 1/500 en suero
albuminado 1/200 tras 15 minutos a 4° C y centrifugación
Con esta técnica se obtuvo un error en el resultado del orden del 8 %
12) Enfermedades del pelo
Tricorrexis nudosa (trichorrehexis nodosa)
Esta enfermedad se traduce en al aparición de hinchazones nodulares a lo
largo del tallo, de lo que resulta que éste tiene tendencia a romperse, en
especial, en el lugar de la hinchazón. En este caso se encuentran varios
nódulos blancos grisáceos, en particular, sobre el tercio final del pelo. Este se
vuelve muy seco y frágil y se rompe al nivel del nódulo. Si la rotura no atraviesa
completamente el nódulo, es como si 2 pinceles estuvieran en contacto.
Algunos autores han atribuido esta enfermedad a un defecto bioquímico del
metabolismo del ácido arginiosuccinico y adoptado la idea de que un trauma
puede contribuir a la formación de una Tricorrexis nudosa.
Tricoptilosis
Un cabello afectado por esta enfermedad presenta una hinchazón longitudinal
debido a una sequedad anormal que lo hace ramificar en su extremidad distal,
o bastante avanzado el tallo. Puede haber ramificaciones múltiples en la
extremidad del cabello o puede haber una ramificación simple o bifurcación en
varios lugares a lo largo del tallo.
Triconudosis
Los cabellos afectados por esta enfermedad se enriedan y hacen nudos. Este
género de enfermedad se debe a fuerzas físicas y mecánicas, producidas por
la reacción del peine, del cepillo o de los dedos que algunas personas tienen la
costumbre de pasarse por el cabello. Para McCarthy, las quemaduras y los
lavados efectuados con jabones demasiado detergentes, contribuyen también a
provocar esta enfermedad.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Cabellos de Baynet
Esta enfermedad se caracteriza por un ensanchamiento del pelo en forma de
huso de 2 a 3 mm de largo, muy cerca de la extremidad. La parte afectada es
más oscura que el resto de la cabellera.
Monilethrix
Los pelos enfermos presentan nudos elípticos separados por espacios breves y
apretados. Se ve afectado el pelo entero desde la raíz hasta la punta. Los
nudos en general son el doble de largo que los espacios internodales. Los
nudos están constituídos de una envoltura de cutícula espesa y un núcleo
cortical delgado. El Monilethrix es siempre hereditario.
Anomalías en casos de alopecia
En este caso se produce caída parcial, o generalizada de pelos. Cabe distinguir
3 formas de cabellos atrofiados o muertos:

Cabellos caducos
La raíz de un cabello que padece esta afección está intacta cuando es
arrancado y el cabello tiene siempre una longitud normal. La raíz y la parte del
tallo situada inmediatamente a continuación están netamente atrofiadas.

Cabellos con signos de admiración
En un punto del cabello afectado por este tipo de atrofia, se forma un nudo o
ensanchamiento debido a la disociación de las células corticales en este lugar.
De ahí se sigue una pérdida de la cohesión celular y el cabello se raja
longitudinal y transversalmente, termina por romperse en los lugares que ha
perdido fuerza. Así el cabello afectado por este tipo de anomalías tiene
características que indican una perturbación de la función pigmentaria, una
tendencia a hincharse, a disociarse y por último a quebrarse en uno o varios
puntos.

Cabellos cadáveres
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
En este caso, las raíces y los bulbos de los cabellos se hacen delgados como
hilos y suelen curvarse en su extremidad inferior. Algunos pueden padecer
Tricorrexis en su parte superior.
Anomalías que toman la forma de una distrofia generalizada que afceta a
todas las pigmentaciones del cuerpo:
Cabellos en torsión
La torsión tiene lugar en el sentido del eje longitudinal del cabello y se observa
a intervalos regulares, lo que produce una alternancia de partes ahusadas
oscuras y de partes ahusadas claras, que presenta alguna analogía con lo que
se ve en el Monilethrix.
Cabellos anillados
El cabello que padece esta afección presenta zonas claras y oscuras. Parece
entonces formado de bandas estrechas alternadas, casi anillos, unas
pigmentadas y otras blancas. La anchura de estas bandas varía según los
casos. Las partes anilladas deben su origen a una modificación del envoltorio
cortical y no a una modificación o a una hinchazón de la médula.
La piedra
Osorio fue el primero en descubrir esta enfermedad, que bautizó así a causa de
las concresiones parasitarias que tiene el aspecto de una piedra. Esta
enfermedad consiste en la formación en el pelo de nódulos minúsculos, negros
o castaño claros, con la dureza de una piedra. Pueden encontrarse todo a lo
largo del cabello y se sitúan a menudo a un centímetro del folículo. La raíz no
se ve nunca afectada.
Triconudosis
Esta enfermedad se encuentra a menudo en los individuos que sudan mucho
padeciéndola más a menudo los rubios que los morenos. Al examinar los pelos,
en particular de las axilas, se ve que son más gruesos que los normales. Se
citan casos en los que los pelos de las axilas se han vuelto negros. Afeitados
estos pelos, pueden verse las concresiones de parásitos en torno a la tonalidad
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
o a una parte del tallo, incluso hasta la abertura del folículo. En los otros pelos
solo el último tercio está cubierto de varios nódulos bien separados uno del
otro. Las concreciones se adhieren fuertemente al pelo, en particular cuando
están secas. Llegan a dar al pelo 2 o 3 veces su grosor normal. El tercio central
del pelo es la parte más afectada.
Tricofitosis
Es una enfermedad polimorfa, causada por una serie de parásitos
criptogámicos de la misma familia, llamados los tricoptitos. Estos parásitos, se
componen de elementos cortos, de forma casi cúbica y unidos en micelios.
Según el aspecto de los parásitos en los pelos y alrededor, se distinguen los
siguientes grupos importantes:

Tricofito endotrix
Constituye un grupo que comprende los parásitos que se encuentran
únicamnete en las sustancias de los pelos a saber:
Tricofito acuminado: en los casos de infecciones muy avanzadas los pelos
parecen estar llenos por completo de una masa de esporas unidas en cadenas
y paralelas al eje longitudinal. En ciertos lugares hay tal cantidad de esporas
acumuladas en el pelo que la cutícula se levanta y el pelo está literalmente a
punto de estallar.
Tricofito neo-endotrix: se encuentra en este grupo de parásitos algunos
micelios en la superficie del pelo pero el grupo más importante se halla en el
interior del propio pelo.
Tricofito ectotrix: este grupo comprende los parásitos que proliferan en la
superficie del pelo, así como los que alcanzan su sustancia. El grupo se sub
divide en microsporones y megalosporones.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”

Achorion (favo)
Es el último grupo de parásitos de la familia de los criptogámicos que invaden
los pelos. El pelo está afectado por favus, presenta las características
siguientes: burbujas de aire de dimensiones variables en la superficie del pelo
que contiene los micelios; surcos longitudinales en la sustancia del pelo, en
particular en la parte aérea y escasez de los elementos miceliales y de las
esporas. Unos y otras sond e dimensiones muy variables en un mismo pelo.
Los pelos afectados son un poco más frágiles que los pelos normales. Los
pelos enfermos de favo contienen sino relativamente pocos micelios. En la
parte aérea del pelo se encuentran a veces surcos huecos y ligeramente
ondulados. Estos surcos se llenan de micelios y de esporas muertas.
Pediculosis capitis
Se trata de una enfermedad contagiosa de los cabellos, que consiste en una
infección debida al incesto denominado Pediculosis capitis. Este pone gran
cantidad de huevos de forma ovalada que se adhiere fuertemente a los
cabellos por medio de secresiones quitinosas.
El estrechamiento repentino
Según Niyogí esta anomalía puede deberse a alguna enfermedad desconocida.
En este caso el diámetro del pelo disminuye bruscamente.
Otras anomalías
Existen otras anomalías del tallo: la médula doble, índices medulares
anormalmente elevados, raíces deformadas y escamas salientes en el margen
cuticular.
13) Análisis del cabello por reactivación neutrónica
Este tipo de análisis se basa en el principio por el cual, en los materiales que
son irradiados en un reactor nuclear u otra fuente de neutrones, algunos de los
átomos de la sustancia son convertidos en isotopos radioactivos:
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
La reacción proveniente
por estos elementos deriva de su energía, y su
decaimiento típico es específico y característico permitiendo identificarlos y
cuantificarlos.
Las principales ventajas de dichos análisis son: su especificidad; su
sensibilidad y su capacidad no destructiva para con el espécimen.
La posibilidad de establecer con cierto grado de certeza la identidad o no de 2
muestras, se basa en consideraciones puramente estadísticas que según A.
Travesi depende de los siguientes factores:
1. Nº de elementos en razón de trazas, que sea posible analizar
2. Precisión de análisis para cada uno de dichos elementos
3. La magnitud de la variación de la concentración de dichos elementos
entre individuos diferentes
4. La reproducibilidad de la concentración de estos elementos en diferentes
muestras de la misma naturaleza tomadas de un mismo individuo
14) Investigación de drogas de abuso en pelos
En la actualidad se ha propuesto una metodología por la cual puede
investigarse en el cabello la presencia de numerosas drogas de abuso, la
ventaja fundamental de la metodología es que, sumada a su especifidad y no
invasividad, el hecho del crecimiento prácticamente constante del pelo permite
establecer con alta aproximación la fecha de utilización de dichas drogas,
sumado al hecho de que abarca un período prolongado de evaluación
solamente limitado por el eventual corte del cabello.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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ADN
La genética clásica se dedicaba al mecanismo de la herencia: como las
unidades hereditarias se transmiten de una generación a la siguiente y como
los cambios de material hereditario se expresan a los organismos individuales.
En la década de 1930 se plantearon interrogantes nuevos y los genetistas
empezaron a explorar la índole del gen: su estructura, su composición, sus
propiedades y su papel en la química interna de los organismos vivos.
En la década de 1940 muchos investigadores creían que los genes eran
proteínas, pero otros estaban convencidos de que el material hereditario era el
ácido desoxirribonucleico (ADN). Lo importante, aunque no halló amplia
aceptación fue que Avery, en sus experimentos sobre el factor transformador
de los neumococos, había presentado evidencias del papel genético del ADN.
La confirmación de la hipótesis de Avery vino con los estudios sobre
bacteriófagos (virus bacterianos) que demostraron que el material genético del
virases ADN y no proteína.
Otro respaldo adicional del papel genético del ADN provino de otros dos
conjuntos de datos 1) Casi todas las células somáticas de una especie dada
contienen cantidades iguales de ADN y 2) Las proporciones de bases
nitrogenadas son las mismas en el ADN de todas las células de una especie
dada, pero varían en las distintas especies.
En 1953 Watson y Crick propusieron una estructura para el ADN. Según un
modelo, la molécula de ADN es una hélice de dos cadenas que tiene la forma
de una escalera retorcida. Los dos lados de la escalera consisten en grupos
repetidos de un fosfato y un azúcar de cinco carbonos (d-oxiribosa). Los
“escalones” son bases nitrogenadas apareadas con enlaces de puente de
hidrógeno, una base púrica (dos anillos) apareada con una base pirimídica (un
anillo). Existen cuatro bases: adenina (A), guanina (G), ambas bases púricas, y
timina (T) y citosina (C), bases pirimídicas. (A) sólo puede aparearse con (T) y
(C) solo lo puede hacer con (G). Las cuatro bases con las cuatro “letras” que se
emplean para deletrear el mensaje genético. Las bases apareadas se hallan
unidas como ya se ha dicho por enlaces de hidrógeno, lo que permite la
reversibilidad del proceso de apareamiento y desapareamiento según las
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circunstancias. De acuerdo con esta estructura propuesta por Watson y Crack,
el papel del ADN como portador y transmisor de la información genética halló
amplia aceptación.
Cuando la molécula de ADN se replica, las dos cadenas se separan al
romperse los enlaces de hidrógeno y cada cadena forma una nueva cadena
complementaria con los nucleótidos disponibles en las células (como
trifosfatos). La índole semiconservadora (se conserva en cadena) de este
proceso se confirmó en estudios de isótopos radiactivos.
La replicación del ADN es mediada por enzimas, ADN polimerasas, tal
replicación no sucedería si experimentalmente colocásemos ADN y los
precursores suficientes, es decir, los nucleótidos correspondientes y la energía
es aportada por los enlaces fosfato, pues los nucleótidos son trifosfatos y en la
cadena solo queda uno de los mismos.
El código y su traducción
La información genética está codificada en la secuencia de nucleótidos de las
moléculas de ADN y éstas, a su vez, determinan la secuencia de aminoácidos
en las moléculas de proteínas.
La forma en que el ADN se traduce en proteínas se elucidó con considerable
detalle en las células bacterianas. Cada serie de tres nucleótidos a lo largo de
una cadena de ADN es el código del ADN para un aminoácido en particular. La
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información se transcribe del ADN a una sola cadena larga de ARN (ácido
ribonucleico). Este tipo de molécula de ARN se conoce como ARN mensajero o
ARNm. El ARNm se forma a lo largo de la cadena 3´ a 5´ del ADN siguiendo el
principio de apareamiento de las bases que sugirieran Watson y Crack. En
consecuencia el ARNm es complementario de la cadena transcripta de ADN.
En las bacterias, incluso mientras se está transcribiendo la cadena de ARNm,
su extremo 5´ se inserta en un ribosoma, estructura compleja que consiste en
dos subunidades, cada una de ellas constituida por ARN específico y
moléculas de proteína. En el sitio donde el ARNm está en contacto con el
ribosoma, unas pequeñas moléculas de otro tipo de ARN, conocidas como
ARN de transferencia (ARNt), que sirven de adaptadores entre el ARNm y los
aminoácidos, se fijan temporariamente a la cadena del ARNm. Cada molécula
de ARNt trae el aminoácido específico que solicita el codón de ARNm al cual
se inserta el ARNt. Así siguiendo la secuencia dictada originariamente por el
ADN, las unidades de aminoácidos se alinean una tras otra y forman una
cadena polipeptídica.
Ya se ha “descifrado” el código genético; es decir, se sabe que el aminoácido
es requerido por un codón de ARNm en particular. De las 64 combinaciones de
tripletes posibles del código de nucleótidos de 4 letras, se identificaron 61
combinaciones con uno de los 20 aminoácidos que constituyen moléculas
proteicas. Los otros tres tripletes sirven de señales de “detención”, que
terminan la síntesis proteica.
En la actualidad a las mutaciones se las define como cambios en la secuencia
o cantidad de nucleótidos del ácido nucleico de una célula u organismo. La
mayoría adoptan la forma de sustituciones de un nucleótido por otro, lo cual
puede acarrear el cambio de un aminoácido como sucede en la hemoglobina
de la anemia drepanocítica.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
El cromosoma eucariótico
En los eucariotas, el material genético está empaquetado en cromosomas, los
cuales se tornan visibles al condensarse en la mitosis o meiosis. En los
cromosomas condensados la cromatina adopta la forma de eucromatina, que
se halla almacenada en forma laxa, o de heterocromatina, que está
densamente empaquetada. El nucleolo, visible en el núcleo durante la
interfase, consiste en asas de cromatina de cromosomas distintos y en él
ocurre la síntesis de los ribosomas.
El cromosoma eucariótico difiere en muchos sentidos del cromosoma de los
procariotas. Su ADN siempre se asocia con proteínas que representan más de l
amitad, en peso, del cromosoma. La mayoría de estas proteínas son histonas,
moléculas relativamente pequeñas que poseen carga positiva. La molécula de
ADN envuelve a los centros de histonas para formar nucleosomas, unidades de
empaquetado básicas del ADN eucariótico. Existen muchas evidencias que
vinculan a la transcripción del ADN con el grado de condensación de la
cromatina.
Los eucariotas tienen mucho más ADN que los procariotas. La cantidad de
ADN es constante en todas las células de una especie dada, pero no
concuerda con el tamaño, complejidad ni posición del organismo en la escala
evolutiva. La replicación del ADN es bidireccional, como en los procariotas,
pero con la diferencia de que en cada cromosoma hay millones de sitios de
iniciación de la replicación.
Los estudios de hibridación y secuenciado del ADN revelaron 3 clases de ADN
eucariótico: repeticiones múltiples cortas, dispuestas de manera característica
en tandem; repeticiones más largas, por lo general dispersas por los
cromosomas, y ADN de una sola copia (este último representa el 70% de todo
el ADN cromosómico en el ser humano). Solo un 10% del ADN en realidad
codifica proteínas.
Genética humana
El número diploide de cromosomas humanos es 46, de los cuales 44 son
autosomas y 2 cromosomas sexuales. El sexo heterogamético es el masculino.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Cariotipo es la representación gráfica de un juego de cromosomas. Para
preparar el cariotipo se aparean los cromosomas metafísicos homólogos y
estos, a su vez, se agrupan de acuerdo con su tamaño. Los cromosomas no
homólogos de tamaño y forma similares pueden distinguirse con técnicas de
coloración que revelan el bandeado cromosómico. Se hicieron mapas
cromosómicos recurriendo a técnicas de hibridación celular y también con
sondas de ácidos nucleicos radiactivos.
Las anormalidades cromosómicas visibles comprenden cromosomas extras
(por lo general originados en la disyunción, es decir, falta de separación de dos
homólogos en el momento de la meiosis), translocaciones y delecciones. El
síndrome de Down figura entre los trastornos asociados con un cromosoma
extra, puede deberse a la no-disyunción o, con menos frecuencia a
translocación. También pueden ocurrir cromosomas sexuales extras por no
disyunción: a menudo, aunque no siempre, esto se asocia con esterilidad y
retardo mental.
La aniridia y el tumor de Wilms son defectos asociados con la delección de una
pequeña región del cromosoma 11. En la actualidad se detectan muchos
defectos genéticos en el feto haciendo amniocentesis, que es la recolección de
células fetales del líquido amniótico.
Los defectos genéticos expresados en los varones pero transmitidos por las
mujeres se deben a alelos recesivos mutantes situados en el cromosoma X. En
los seres humanos tales características ligadas al sexo comprenden ceguera
para los colores y hemofilia.
Muchas enfermedades genéticas obedecen a deficiencias o defectos en
enzimas y otras proteínas críticas. A su vez, estas deficiencias y defectos se
deben a mutaciones en los alelos que codifican a las proteínas. Tales
enfermedades por lo general solo se manifiestan en el homocigoto y
comprenden fenilcetonuria, enfermedad de Tay Sachs, anemia drepanocítica y
varias más vinculadas con variaciones en las moléculas de hemoglobina.
Las técnicas de ADN recombinante ofrecen medios nuevos para hacer el
diagnóstico precoz en las enfermedades hereditarias y también se emplean
para tratar de producir proteínas biológicamente importantes. Es probable que
en el futuro sean importantes para tratar enfermedades hereditarias humanas.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
Introducción al ADN y su utilización en el ámbito forense
En 1985, Jeffreys y cols, describían un método de identificación individual que
denominaron ADN fingerprinting o huella genética que prometía ser la solución
definitiva al análisis de la diversidad humana desde la Medicina Legal, tanto en
investigación biológica de la paternidad como en Criminalística.
En 1992, el US National Research Council (NRC) confirmaba con rotundidad la
validez de las técnicas de identificación individual basadas en la prueba del
ADN y establecía unas guías de actuación.
Análisis de polimorfismos de ADN en Medicina Legal y Forense
Los fundamentos de las técnicas de análisis de polimorfismos ADN en
Medicina Forense se basan en dos hechos trascendentales y elementales que
se deducen del modelo de doble hélice, propuesto ya en 1953 por Watson y
Crick. Estos son:
1. Principio de complementariedad entre bases
2. Desnaturalización y renaturalización del ADN
El ADN es un polímero constituido por un limitado número de monómeros. Los
monómeros son nucleótidos que consisten en una base nitrogenada, un azúcar
(desoxiribosa) y un grupo fosfato.
Las bases nitrogenadas son las purinas: adenina (A) y guanina (G) y las
pirimidinas: timina (T) y citosina (C). Los nucleótidos están ligados por medio
de enlaces fosfodiester formando una cadena de la que protruyen las bases
que se emparejan con las bases de otra cadena nucleotídica por medio de
puentes de hidrógeno. El proceso de emparejamiento entre bases no es al
azar. La adenina y la timina siempre se reconocen y se unen en forma
específica, lo mismo que ocurre entre la guanina y la citosina. De tal manera
que la secuencia de bases de una cadena de ADN determina siempre la de su
cadena complementaria.
Por otro lado, la exposición a determinadas temperaturas o a un ambiente
alcalino provoca la abolición de los puentes de hidrógeno entre las bases y la
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separación de las dos hebras del ADN. Esta situación es reversible, y cuando
cesan esas condiciones, se vuelve a establecer de nuevo la asociación entre
las cadenas que se unen otra vez según el principio de complementariedad
entre sus bases.
En una hebra de ADN puede existir una enorme cantidad de secuencias
nucleotídicas diferentes. Por ej. si se consideran únicamente 10 posiciones en
la cadena, cada una de las cuales pudiera ser ocupada por cualquiera de los 4
nucleótidos, el número de combinaciones posibles sería 410, o sea 1.048.576.
La cantidad total de material genético del ser humano consiste en 3 billones de
nucleótidos, aproximadamente. En este ADN existe información para un total
estimado de unos 100.000 genes, que constituyen sólo entre un 5 y un 10% del
genoma.
El ADN expresivo o codificante, a pesar de ser el más interesante desde el
punto de vista médico, posee poca variabilidad entre las personas, con la
excepción de ciertas regiones, como la que informa para el sistema HLA. El
resto del ADN, hasta el 80-95%, se ha denominado “basura” (“junk”), porque no
es transcripto a ARN y no codifica para ningún gen en particular, aunque
parece poseer otras funciones biológicas muy importantes. Curiosamente, este
ADN no expresivo, e injustamente denominado “basura”, es tremendamente
polimórfico y variable entre los individuos, por lo que posee una utilidad
extraordinaria en Medicina Legal. Además tiene la ventaja de representar,
como se ha visto, la mayor parte del genoma humano, por lo que se ha
convertido en una gran fuente de marcadores genéticos.
Se estima que aproximadamente la mitad del ADN no codificante es ADN
repetitivo y, aunque gran parte del mismo es extremadamente polimórfico por
diversos motivos, el ADN más utilizado con fines forenses hasta la fecha es el
ADN repetido en tándem y, dentro de él el ADN minisatélite y microsatélite.
La variabilidad genética observable en el ADN de los distintos individuos se
puede investigar experimentalmente por diversos procedimientos. En Genética
Forense los más habituales pueden clasificarse en dos grandes grupos desde
una perspectiva histórica. Estos son: procedimientos clásicos o de análisis por
sondas multilocus (MLP) y unilocus (SLP) (DNA fingerprinting y DNA profiling
respectivamente) y procedimientos basados en el uso de la reacción en cadena
de la polimerasa o PCR.
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Las sondas son polinucleótidos de longitud variable que de acuerdo a su propia
secuencia buscaran sectores en el ADN a analizar de modo de hibridizarse en
función de la complementariedad respectiva. Cuando se habla de sondas
multilocus significa que la hibridización puede realizarse en cualquier
cromosoma, en el caso de unilocus la hibridación se producirá en un
cromosoma específico. En función de lo cual el perfil obtenido con sondas
multilocus es realmente complejo, mientras en el obtenido con sondas unilocus
es mucho más sencillo.
Esa variabilidad o polimorfismos, que estas técnicas detectan en el ADN
presente en las células de una persona puede residir:
 En la secuencia de bases específica de una determinada región de ADN
que muestra diferencias o variaciones de una persona a otras. Este es
el caso de la región control del ADN (ADNmit) y la que codifica para el
sistema HLA en ADN nuclear.
Los polimorfismos de este tipo se denominan polimorfismos de secuencia.
 En la longitud de los fragmentos de ADN que aparecen tras someter éste
a la acción de una enzima de restricción que corta las cadenas de ese
ácido nucleico en puntos concretos, sitios de restricción, originando
trozos o fragmentos de ADN de distinto tamaño. La longitud de esos
fragmentos varía entre las personas y el patrón de fragmentos es
característico para cada individuo, porque también lo es la localización
de los sitios de restricción.
Los polimorfismos de este tipos e denominan polimorfismos de longitud
de los fragmentos de restricción (RFLP, restriction fragment length
polymorphisms).
Este tipo de polimorfismos es el que más se utilizó inicialmente con fines
forenses, analizando ADN repetitivo y concretamente ADN minisatélite.
Posteriormente, el polimorfismo del ADN repetitivo minisatélite se analizaría
con más éxito por medio de la técnica de PCR.
Los loci mini y microsatélite pertenecen a la categoría de los números variables
de repeticiones en tándem (VNTR, variable number of tándem repeats), que
consisten en repeticiones en tándem de una secuencia específica, siendo el
número de esas repeticiones diferente de unos individuos a otros.
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Precisamente de esas “diferencias” interindividuales deriva su interés y utilidad
en Medicina Legal. Las unidades de repetición de los microsatélites son muy
pequeñas (2-5pb), por lo que se denominan también secuencias cortas
repetidas en tándem (STR, Short Tandem Repeats), mientras que en los casos
de minisatélites la unidad de repetición es mayor (10-80pb).
Procedimientos clásicos
Análisis por MLP (sondas multilocus), DNA fingerprinting y análisis por
SLP (sonda unilocus) DNA profiling
Estos procedimientos responden a un conjunto de técnicas, ya clásicas, de
estudio de RFLP con las que se obtiene el patrón de fragmentos de ADN
característico de cada individuo gracias al uso de enzimas de restricción y de
sondas marcadas. Las sondas son pequeños segmentos de ADN de cadena
simple que se marcan radioactivamente por ej. con P32 o por procedimientos no
isotópicos y que se utilizan para la identificación de fragmentos de ADN.
Se inician con el aislamiento o extracción del ADN del fluido (sangre, semen,
etc) o tejido que se haya enviado para análisis. Una vez obtenido el ácido
nucleico, este es clivado o sometido a la acción de una enzima de restricción
que lo fragmentará en pequeños trozos. Los fragmentos de ADN producidos se
someten a electroforesis sobre gel de agarosa para conseguir una separación
de los mismos de acuerdo con su tamaño y su PM. Lógicamente los que sean
más pequeños se moverán más deprisa que los más grandes dentro del campo
eléctrico, facilitando así la identificación de los mismos.
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Cuando la separación electroforética concluye, los fragmentos del gel se
transfieren e inmovilizan en una membrana de nailon por un proceso conocido
como Southern Blotting. En este punto se suele realizar la separación de la
doble cadena de ADN (de la que se componen los distintos fragmentos) en dos
hebras simples por un procedimiento de desnaturalización. Con ello se
pretende conseguir cadenas simples de ácido nucleico que puedan unirse total
o parcialmente a cualquier pieza de ADN unicatenario que presente una
secuencia complementaria (sonda). En definitiva, el objetivo que se persigue es
que se unan a una sonda específica, proceso que se denomina hibridación.
Sea cual sea el tipo de sonda con la que se trabaje, ésta siempre se acoplará
con determinados fragmentos de ADN, de los separados por electroforesis,
siguiendo el principio de complementariedad de bases. En esto se basan los
distintos métodos que existen para la detección de fragmentos; es decir, en la
aplicación de sondas marcadas que permitan la visualización del patrón o perfil
de fragmentos del ADN característico de un individuo.
Para conseguir ese resultado, la membrana de nailon, que contenía los
fragmentos de ADN separados por electroforesis, se sumerge en una solución
en la que está la sonda, de tal manera que los fragmentos de secuencia
complementaria se unirán a ella. La visualización de estos fragmentos se
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“Curso de rastros y huellas indiciarias en casos criminales”
puede realizar por medio de una autorradiografía y el patrón resultante puede
ser evaluado de visu o por un analizador de imágenes.
Este método de diagnóstico de la individualidad biológica consiste básicamente
en una técnica comparativa, al igual que ocurre con cualquier otro en Genética
Forense. El perfil de ADN que se ha obtenido de una muestra biológica,
recogida en el lugar del crimen, se compara con el que muestra el sospechoso.
Ese perfil es característico de cada individuo, y no varía aunque provenga de
vestigios biológicos de distinta naturaleza, como sangre, semen, pelo, tejidos,
etc. Por lo tanto, si dos perfiles o patrones son coincidentes es tremendamente
probable que provenga del mismo individuo, y si no es así se puede establecer,
con toda seguridad, que no procedan del mismo sujeto.
El análisis por sondas multilocus fu el que Jeffreys y cols. describieron en 1985
y denominaron DNA Fingerprinting o “huella genética” por su capacidad de
individualizar. Sin embargo este análisis que abrió tantas expectativas
inicialmente, ha tenido una utilización escasa en la práctica porque era muy
difícil su estandarización, así como la creación de bancos de datos, y también a
serios problemas de interpretación bioestadística de los resultados.
Posteriormente se han desarrollado sistemas de RFLP que producen patrones
mucho más sencillos y fáciles de interpretar. Las sondas que utilizan reconocen
secuencias repetitivas o VNTR ubicadas en un locus único dentro de
cromosomas homólogos, por lo que se les denominó sondas unilocus. El
sondaje unilocus requiere condiciones de hibridación especiales (muy
rigurosas).
Cuando un ADN genómico cortado con enzimas de restricción se analiza con
una sonda unilocus se detectarán hasta un máximo de dos alelos por individuo,
uno procedente del cromosoma materno y otro procedente del cromosoma
paterno. Si un individuo hereda fragmentos de igual longitud de sus padres
entonces sólo será visible una banda (homocigoto).
Es estudio con una única sonda unilocus no permite la individualización de un
sujeto a partir de un espécimen de ADN. Se necesitan varias sondas para
conseguir el mismo poder de individualización que proporcionaba un único
análisis multilocus. De esta forma resulta un procedimiento que reúne las
ventajas de ambos sistemas: simplicidad de patrones y gran poder
discriminativo.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Marcadores moleculares
Considerando la gran cantidad de información que contiene el genoma,
podemos visualizar su potencial para identificación humana. En particular la
prueba de ADN se realiza analizando secuencias del genoma muy variables, es
decir, que entre los individuos de una población puede tener diferentes formas
alternas denominadas alelos.
Estas secuencias permiten diferenciar a un individuo de otro y, al heredarse de
padres a hijos, también permite establecer relaciones biológicas de parentesco,
por lo que se les conoce como marcadores genéticos o marcadores
moleculares (por estar en la molécula de ADN). Cabe señalar que para cada
marcador una persona tendrá dos alelos, uno materno y otro paterno, y a dicha
combinación de alelos que recibimos de nuestros padres se le denomina
genotipo.
Específicamente las secuencias o marcadores para realizar una prueba de
ADN se caracteriza por tener repeticiones cortas en tándem, y son
ampliamente conocidos por sus siglas en inglés STRs (short tándem repeats) o
microsatélites. A lo largo del genoma se encuentran miles de STRs que pueden
ser usados como marcadores moleculares.
Como su nombre lo dice, los STRs se componen de secuencias cortas
repetidas, por ejemplo GATA, formando diversos alelos que se nombran por el
número de veces que se encuentre la secuencia repetida; por ejemplo, el alelo
6
presentará
seis
veces
la
secuencia
(por
ej.
GATA,GATA,GATA,GATA,GATA,GATA), y en una población podrían existir los
alelos 6,7,8,9,10,11,12,13,14, etc.
El par de alelos o genotipo para cada marcador STR (por ej. 6/9), permite
diferenciarlo o relacionarlo con otras personas. Cuando la persona dos alelos
diferentes (uno materno y uno paterno), se dice que su genotipo es
heterocigoto; mientras que, cuando tiene un solo alelo se asume que recibió el
mismo alelo de ambos padres, y se dice que su genotipo es homocigoto para el
SRTs en cuestión.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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En una pareja de heterocigotos para alelos diferentes se pueden generar
cuatro genotipos distintos en sus hijos, lo que permite diferenciar individuos
estrechamente relacionados como los hermanos.
Un perfil de ADN, que también suele llamarse huella genética, se genera
obteniendo los genotipos de varios STRs, formando un código que
presumiblemente puede llegar a ser único e irrepetible (6/9, 12/16, 17/21,
22/23, etc.).
Uso de los marcadores STRs para identificación humana. Los genotipos
permiten establecer las relaciones de parentesco y diferenciar a un individuo de
otro. De una pareja de heterocigotos se generan múltiples genotipos en sus
hijos.
Técnica para obtener perfil de ADN
La forma de obtener perfil de ADN se basa en generar millones de copias o
amplificar las secuencias del genoma que permiten diferenciar individuos, en
este caso los marcadores STRs. Esta técnica permite replicar al ADN in vitro, y
se conoce ampliamente por sus siglas en inglés como PCR (polymerase chain
reaction).
La PCR se realiza por ciclos de temperatura en los que básicamente suceden
los siguientes tres pasos en cada ciclo:
1) Desnaturalización, por calor se abren las cadenas de ADN
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2) Alineamiento de secuencias cortas conocidas como primers, que
delimitan las regiones que se van a replicar, y
3) Extensión, formándose cadenas nuevas de ADN por acción de la Taq
polimerasa, una enzima termoestable capaz de añadir nucleótidos a los
extremos de los primers.
En cada ciclo de PCR se duplica la secuencia de interés (STRs), por lo que en
solo 25 ciclos teóricamente habrá millones de copias, a lo que se conoce como
“amplificado”, lo que facilitará enormemente su análisis posterior.
Para el análisis post-PCR hay que recordar que los alelos STRs se diferencian
por el número de veces que se repite una secuencia, esto significa que el
tamaño o longitud va a ser diferente de un alelo de otro.
Para ver estas diferencias se emplea la electroforesis, técnica para separar
moléculas en una superficie de soporte (gel) por acción de un campo eléctrico
en base a la carga y tamaño de la molécula; las más pequeñas corren más
rápido mientras las grandes se van retrasando.
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Amplificación exponencial de una secuencia de ADN por ciclos de temperatura
por la técnica PCR.
Amplificación de STRs y detección por electroforesis en geles verticales de
poliacrilamida en un caso forense. Nótese que el perfil de ADN de la mancha
de sangre en ropa del sospechoso es igual al de la víctima.
Para ello simultáneamente se someten a electroforesis muestras con
fragmentos de tamaño conocido, también llamados marcadores de peso
molecular o estándar de tamaño, y/o una mezcla de los diferentes alelos
posibles para los STRs que se están analizando, y que se conoce como
escalera alélica o ladder; con lo que resulta relativamente sencillo definir los
alelos/genotipos y posteriormente el perfil genético de una persona.
La electroforesis en una prueba de ADN se realiza de dos formas:
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1) Por geles verticales de poliacrilamida, técnica que ha caído francamente
en desuso, y
2) Electroforesis capilar (EC), cuyo proceso es más preciso y automatizado,
por lo que constituye el método de elección en los laboratorios de
genética forense en el mundo.
3)
Finalmente, para observar el ADN amplificado (STRs) y sometido a
electroforesis es necesario teñirlo; existen métodos tradicionales como la
tinción con nitrato de plata de los geles de poliacrilamida, o más sofisticados
que involucran la detección de fluorescencia añadida durante la PCR y que se
detecta en sistemas automatizados de electroforesis capilar.
Los amplificadores deben someterse a electroforesis capilar, es decir, este
proceso se hace a través de un tubo dl tamaño de un capilar relleno de un
polímero, donde bajo el mismo principio de separación por la carga y tamaño
de la molécula, los amplificados se van separando al aplicar corriente eléctrica.
Para este fin se usan analizadores genéticos, que de forma automatizada carga
la muestra en el capilar para luego aplicar voltaje. De esta forma se separan los
STRs hasta llegar a una ventana donde pasa un rayo laser que convierte esa
luz en impulsos eléctricos que, con ayuda de un software, se representan
gráficamente en un electroferograma.
Lic. Lucas Bravo Berruezo
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Representación de los pasos que involucra el análisis de fragmentos de
ADN por electroforesis capilar (EC).
Cabe señalar que la longitud de onda de las diferentes fluorescencias puede
superponerse y su registro se logra mediante el hecho de cuánto se
superpongan cada uno de los colores, a lo que se denomina matriz. Durante el
análisis del electroferograma para definir el perfil de ADN es muy importante
que simultáneamente se corra en la EC una escalera alélica (ladder) con todos
los alelos STRs, lo que por comparación directa se facilita enormemente la
asignación correcta de los alelos, genotipos, y finalmente perfil de ADN del
individuo.
Cabe señalar que todo este proceso dura alrededor de 30 minutos por muestra,
facilitando enormemente esta labor. Una vez realizada la electroforesis capilar
se observa el perfil de ADN de un individuo en un electroferograma, donde los
picos de acuerdo a su color y posición nos indican los alelos (genotipo) que
tiene la persona para cada STR. Si un individuo presenta uno o dos picos
(alelos), indica que su genotipo es homocigoto o heterocigoto, respectivamente,
para el STR en cuestión.
Electroferograma del perfil genético de un individuo. El tamaño en nucleótidos
(pb) y nombre del STR se muestra en la parte superior de cada carril. Debajo
de cada pico se indican los alelos del individuo. Para amelogenina (A) se
observa solo un pico y una X (mujer, XX).
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El cromosoma Y en las identificaciones de rastros de interés forense y en
el rastreo de línea paterna
El complemento cromosómico humano está compuesto por 46 elementos
organizados en 23 pares. De estos, 22 son semejantes en hombres y mujeres,
y
cada
par
presenta
igual
morfología
denominándose
“cromosomas
autosómicos” o “autosomas”. El par restante, llamado “par sexual”, tiene
características diferenciales dependiendo del sexo considerado.
Los individuos de sexo femenino normales presentan el par sexual constituido
por dos elementos homólogos con morfología semejante. En cambio en los
hombres, el par correspondiente posee elementos disímiles, formado por un
cromosoma metacéntrico mediano y un pequeño cromosoma acrocéntrico. El
primero denominado cromosoma X es el elemento presente en doble dosis en
las mujeres, en tanto que el segundo, sólo presente en los varones, es el
denominado cromosoma Y.
En el proceso de formación de células germinales femeninas sólo podrás
generarse gametos que contengan el cromosoma X como elemento sexual, por
tanto la mujer cederá a su descendencia obligatoriamente un cromosoma X. El
varón, en cambio, podrá generar dos tipos de espermatozoides que diferirían
en cuanto a la presencia de un cromosoma X o un cromosoma Y además de
los 22 elementos autosómicos. Será, por tanto, el hombre, quién determine el
sexo en su descendencia, dependiendo de si el espermatozoide aporta un
cromosoma X (descendencia femenina) o cromosoma Y (descendencia
masculina).
Debido a que en la mujer el par sexual está formado por dos elementos de
morfología semejante, todos los genes y secuencias presentes estarán en
condición diploide y, por tanto, si los dos alelos de un locus determinado son
idénticos, la portadora será homocigota, si los alelos difieren su condición será
heterocigota, al menos en el locus referido. En el hombre, tanto el cromosoma
X como el Y se encuentran como elementos únicos, siendo su condición
hemicigótica.
En el cromosoma Y existen secuencias polimórficas cuya variabilidad se refleja
en variantes de longitud, como es el caso de los microsatélites y los
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minisatélites, en lo que las unidades de repetición pueden variar tanto en
número como en secuencia. Además de estas, existen otras variantes como las
de inserción/delección y también simples sustituciones nucleotídicas.
Los
polimorfismos
presentes
en
este
cromosoma
proporcionan
una
herramienta adicional en las metodologías de la identificación humana. En
particular, los microsatélites híper variables han contribuido en gran medida en
este campo debido al gran número de tales marcadores disponibles, los que
han sido validados en el ámbito forense internacional.
La posibilidad de determinar vínculos de filiación en ausencia del progenitor, la
investigación de identidad y sexo en desastres en masa y la identificación de
responsables de violación tanto hétero como homosexual constituyen algunos
de los campos de aplicación forense de los marcadores de microsatélites del
cromosoma Y.
Los marcadores posibles de trabajar con cromosomas Y tienen gran capacidad
discriminativa, pero presentan la limitación de que todos los individuos de la
misma línea paterna compartirán idéntica información de estos haptotipos, por
lo cual no será posible desvincular individuos vinculados por vía paterna de la
posible existencia de vínculo de parentesco o filiación, ni tampoco descartar al
hermano de un sospechoso si sólo se analizan marcadores presentes en este
cromosoma. Puede por lo tanto concluirse que estos marcadores son de
enorme utilidad en la investigación de identidad, pero deberán ser, en todos los
casos, evaluados juntamente con marcadores autosómicos.
ADN Mitocondrial en Genética Forense
En las células de los organismos superiores, existen unas formaciones
denominadas mitocondrias que son auténticas generadoras de energía
necesaria para el buen funcionamiento de la célula, pero además dichas
formaciones están provistas de un patrimonio genético propio, el ADN
mitocondrial. A diferencia del ADN nuclear que forma largas fibras, constituidas
cada una de ellas por una doble hélice, y que codifican aproximadamente
100.000 genes, el ADNmt que representa el 1 al 2% del ADN celular, se
presenta en pequeños anillos de doble filamento, codificando 37 genes. El
ADNmt codifica aproximadamente el 10% de las proteínas constitutivas de las
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mitocondrias, por consiguiente, para un buen funcionamiento de estas se
necesita una buena cooperación entre el ADN nuclear y el ADNmt.
El ADNmt no tiene nada en especial que lo diferencie en cuanto a su
composición química con el nuclear, sin embargo posee un código genético
propio, su organización es diferente pues solo el 10% de su totalidad es no
codificante. Su genoma es haploide debido a que su herencia es estrictamente
materna, por lo que no está sometido a procesos de recombinación,
característica muy importante desde el punto de vista de los estudios
filogenéticos. Al mismo tiempo, la herencia uniparental imposibilita su utilización
para realizar estudios de investigación biológica de paternidad.
Este ADN que se encuentra entre las moléculas de ADN más pequeñas, con
una longitud de 16.569pb ha sido completamente secuenciado por Anderson y
cols. en 1981. Así mismo, se han asignado a todos los genes mitocondriales
sus funciones y sus productos génicos, incluyendo 13 proteínas.
Las dos hebras de ADNmt tienen una distribución asimétrica de guanina y
citosina, lo que genera una hebra pesada (H) y una ligera (L). Cada hebra es
transcripta por un promotor localizado en la región control, la región más
interesante desde el punto de vista forense, es la de replicación de la cadena
H, dado que es una región hipervariable y lo suficientemente pequeña para
poder ser utilizada en PCR.
Debido a su alta variabilidad, la región control es la que normalmente se
analiza, tanto para estudios antropológicos como para genética forense. Mide
aproximadamente 1.100pb y forma parte del 10% del ADNmt no expresivo. Es
una región no codificante y se subdivide en dos regiones de aproximadamente
el mismo tamaño (400pb), la región HVI y HVII.
El ADN nuclear puede proporcionar mucha más información que el ADNmt
debido a la cantidad de sistemas polimórficos que se pueden estudiar, como
por ejemplo los microsatélites (STR). Sin embargo en muchas ocasiones, su
estudio se hace totalmente imposible debido a la cantidad insuficiente de
material para analizar o al grado de degradación de este.
La utilización del ADNmt se debe restringir a aquellos casos donde no se
pueda realizar un estudio a través del ADN nuclear o en aquellos casos en que
el ADNmt pudiera proporcionar información adicional.
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En algunos casos como muestras de pelos sin bulbos, un vestigio bastante
común en la pericia forense, tan sólo se puede llevar a cabo el análisis del
ADNmt. El abordaje estadístico de los resultados del ADNmt es complejo y las
estimas de frecuencias tan sólo se podrán llevar a cabo en el futuro con
obtención de amplias bases de datos.
En genética forense el ADNmt ofrece importantes ventajas. Por un lado, la
amplificación es mucho más fácil debido a que existe un gran número de
moléculas de ADNmt por célula, por lo que podemos obtener mayor cantidad
de producto de PCR de muestras muy pequeñas. Además, debido a que es
menos propenso a la degradación que el ADN nuclear, se evitan errores de la
polimerasa durante la amplificación provocados por la degradación del ADN
original.
Así pues, las muestras más idóneas para el abordaje a través del ADNmt son
aquellas muestras biológicas que, debido a su pequeño tamaño o posible
degradación, no puedan ser analizados por medio de polimorfismos de ADN
nuclear. La identificación de restos antiguos o restos cadavéricos procedente
de grandes catástrofes, como los accidentes aéreos (normalmente piezas
dentarias o huesos), y la identificación de vestigios de Criminalística, como
pelos sin bulbo o manchas biológicas de escaso tamaño parcialmente
degradadas, son las aplicaciones más importantes que este tipo de ADN tiene
en el campo de la genética forense.
Extracción de ADN en muestras forenses
Es fundamental tener en cuenta el criterio de elección de un método de
extracción u otro, no es solamente su rendimiento en cuanto a cantidad de
ADN sino su éxito en la amplificación, dos funciones que no siempre se
correlacionan.
El método más simple es añadir las células sustrato de la amplificación
directamente a la mezcla de reacción, la lisis celular se produce en el primer
paso del calentamiento para la desnaturalización, quedando así el ADN libre y
accesible a la polimerasa. Sin embargo cuando se sobrepasa un cierto número
de células, el rendimiento del producto amplificado empieza a declinar debido a
la acumulación de restos celulares y de inhibidores. Esto hace necesario
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establecer ciertas condiciones que permitan extraer el ADN a partir de un
número elevado de células, preservando con ellos la actividad de la taqpolimerasa.
En general, los métodos de digestión de muestras biológicas suelen hacer uso
de detergentes para solubilizar componentes celulares, y de enzimas
proteolíticas, para digerir proteínas, principalmente histonas, que de otra forma
permanecerían fuertemente ligadas al ADN, dificultando su extracción.
La enzima proteolítica de uso más extendido es la proteinasa K, que se inactiva
por calor, con lo cual luego de su acción el calentamiento necesario en la
primera etapa de la PCR será suficiente para inactivar la enzima y evitar su
acción sobre la taq-polimerasa.
El proceso de digestión de la muestra suele ir seguido de otros pasos de
purificación para retirar del extracto proteínas residuales, componentes de
membrana y sobre todo posibles inhibidores de la PCR.
Muestras de Sangre
Aunque la hemoglobina es un conocido inhibidor de la taq-polimerasa no son
requeridos protocolos especiales. Bastan 3-5ul de sangre fresca o manchas de
unos 3mm2, de donde se pueden obtener cómodamente 200ng de ADN. Las
muestras de sangre líquidas procedentes de cadáveres, degradada o
contaminada, pueden ocasionar problemas si el secado es lento pues los
fenómenos de putrefacción han avanzado. Es por ello que se prefiere la
utilización de pequeñas manchas las cuales por su diminuto tamaño han
secado rápidamente evitándose el fenómeno putrefactivo.
Muestras de Semen
El estudio de restos de semen como evidencia en casos de agresión sexual es,
junto con el de vestigios sanguíneos, el tipo de análisis más solicitados en
laboratorios de biología forense. Antes de la aplicación de las técnicas con
ADN, los estudios con este material tenían grandes limitaciones, incluso con la
posibilidad de mezclado con fluidos de la víctima que podrían enmascarar
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resultados en la identificación de proteínas como enzimas e incluso del
agrupamiento ABO.
Actualmente muchas de esas limitaciones se han superado aunque por
supuesto que la tecnología tiene sus propias limitaciones. Una de sus mayores
ventajas es que ofrece la posibilidad de resolver las mezclas de semen aun en
presencia de otros fluidos biológicos procedentes de la víctima (fluidos
vaginales, sangre o saliva), gracias a un método de extracción conocido como
“lisis diferencial”, se basa en la resistencia de los espermatozoides a la lisis con
detergente y proteínasa K en ausencia de un agente reductor. En un primer
paso se produce la ruptura de las células epiteliales, pero no de los
espermatozoides,
que
pueden
recuperarse
por
centrifugación.
En
el
sobrenadante de esa primera digestión queda el ADN procedente de la víctima.
El precipitado conteniendo los espermatozoides íntegros convenientemente
tratado aportaría el ADN del agresor.
Esta técnica no resuelve el problema cuando el agresor es un sujeto
azoospérmico pues en este caso la cantidad de ADN que puede recuperarse
es mucho menor y proveniente solo de las células y leucocitos presentes en el
semen del agresor, aproximadamente la cantidad recuperable será del orden
del 6% de la posible en un sujeto espérmico.
Recientemente el estudio de evidencias en casos de agresión sexual, en
partículas aquellas que se presentan en cantidades trazas, se ha beneficiado
mucho de la incorporación en las baterías de tipificación de microsatélites
específicos del cromosoma Y. estos Y-STR incrementan notablemente el índice
de éxitos en la identificación del componente masculino en mezcla de fluidos
biológicos hombre/mujer en lo que la lisis diferencial es inútil o en aquellas en
las que sea de alto riesgo su aplicación.
Muestras de Saliva
En los últimos años, debido al notable incremento de las técnicas utilizadas,
con el consiguiente requerimiento de contar con menor cantidad de ADN,
aumentando el éxito en muestras con cantidades trazas de material biológico,
tales como sellos, sobres, colillas, mordazas, huellas de mordeduras, manchas
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en ropa, etc. Cada vez se extiende más su utilización en casos de
Criminalística o de estudios de paternidad.
Si se compara con la venopuntura, la toma de saliva con la ayuda de un hisopo
resulta un método no invasivo, ni doloroso, ni traumático, de fácil recogida en
recién nacidos y no implica el riesgo de vertido o rotura de los tubos
conteniendo la sangre. Si bien en ensayos realizados con hisopos bucales con
muestras de saliva, se obtuvo un promedio de 9ug de ADN, utilizando
extracción orgánica y precipitación con etanol, esta recuperación queda
bastante lejos de a obtenida en casos reales con muestras como las
mencionadas arriba.
En general se trabaja con muestras tan exiguas, en las que a menudo solo
pueden obtenerse unos pocos nanogramos de ADN, es aconsejable el uso de
sistemas “multiplex”, en los que se obtendrá información simultánea de varios
marcadores con una sola amplificación.
Muestra de Pelos
En ocasiones, unos pelos son la única evidencia que permite establecer una
conexión entre un agresor y la víctima o al menos con el lugar de los hechos.
Cabellos o vellos de cualquier origen corporal son recogidos en la escena del
delito, sobre la víctima, en las prendas, etc. Pero como también es una muestra
ubicua y, en el caso de los cabellos, el ritmo normal de caída en un sujeto
normal es de 80 a 100 diarios y, aunque la decisión de la importancia de una
evidencia, habitualmente no es incumbencia del laboratorio, sería muy
importante no considerar en los estudios nada más que aquellos pelos que
estén incuestionablemente relacionados con el delito.
El pelo es una muestra delicada, posiblemente la que presenta mayor índice de
fracasos; una de las razones puede encontrarse en el elevado contenido en
melaninas solubles, potentes inhibidores de las ADN polimerasas y que se
forman espontáneamente por contacto con el aire, en los pelos oscuros y se ve
favorecida de más, por los tratamientos de decoloración con agua. Su análisis
es laborioso ya que se requiere un exhaustivo análisis morfológico, sobre todo
si se trata de una muestra abundante, para hacer un cribado previo que los
clasifique y ordene por su semejanza o sus diferencias.
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Sólo los pelos provistos de raíz y vaina son útiles para el análisis de ADN
nuclear, si no la presentan, deberá estudiarse ADN mitocondrial. No hay que
olvidar que analizados uno a uno, o agrupados si es posible, los pelos son
siempre muestra única que se destruye en el proceso de extracción. Sólo se
dispone de los nanogramos de ADN que se hayan obtenido del primer y
definitivo análisis. Los primeros en realizar la individualización de un único pelo
humano, fueron Higuchi y cols. las raíces de los pelos arrancados, sobre todo
si son recientes no ofrecen demasiados problemas y pueden ser extraídos con
una técnica especial con fenol cloroformo o con un buffer especifico para pelos,
adicionado de un detergente no iónico como el Laureth-10.
Aunque un pelo con raíz puede contener teóricamente 5ug de ADN, no suelen
extraerse más de 200ng. No ocurre lo mismo con los pelos caídos,
normalmente en fase telogénica, carente de raíz o con muy escaso resto, de
los que pueden extraerse como máximo alrededor de 10ng de ADN y de los
que es frecuente no obtener resultados.
Es difícil establecer una correlación entre la técnica de extracción, su eficiencia
y el éxito de tipificación.
Otros tipos de muestras
Otros tipos de muestras, menos habituales, pero que también se contemplan
desde la óptica del
diagnóstico de individualización son: orina, heces,
secreciones nasales, uñas y, en general, cualquier vestigio que pueda contener
células de las que podría extraer el ADN.
La identificación de muestras de orina suele estar relacionada con el control de
consumo de drogas en determinados trabajos o como dopaje en el deporte,
que puede conllevar un intento fraudulento de sustitución de muestras. El
rendimiento del ADN en orina depende de su procedencia y de la demora entre
su recogida y el análisis. La orina de mujer es habitualmente más rica en
material celular porque se contamina con células del epitelio vaginal,
obteniéndose habitualmente un rendimiento 5 veces superior al de la orina del
hombre. En cuanto al tiempo transcurrido se ha determinado caídas de hasta 3
veces entre orinas recientemente obtenidas y conservadas en freezer durante
una semana. En 20ml de orina fresca pueden obtenerse 800ng de ADN, sin
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embargo en una mantenida 24 horas a 4 grados y partiendo de 50ml el valor
obtenido fue de 230ng.
En la individualización de muestras de heces, su escasísimo rendimiento en la
extracción de ADN hace infructuoso el análisis de STR, pero puede abordarse
el problema por estudio del ADN mitocondrial. Se ha conseguido amplificar con
éxito la región HVI partiendo de 10mg de heces frescas, usando bolas
magnetizadas para aislar y purificar el ADN.
En uñas, es posible obtener información directamente de un fragmento de
estas, para lo que es necesario digerir un mínimo de 9mg de uña para poder
llevar a cabo la amplificación. Habitualmente el interés de estas muestras se
centra en los restos que pudieran permanecer adheridos a las uñas si se
produjeron arañazos o heridas en el transcurso del ataque violento. En este
caso la recuperación de las partículas de piel o células sanguíneas será función
directa de la profundidad de la herida producida, por lo que no puede
generalizarse nada sobre el rendimiento en la extracción del ADN.
Consideraciones sobre el valor probatorio de los estudios de ADN
El ADN, ácido desoxirribonucleico, encierra en su molécula de doble hélice la
información genética de cada individuo. La policía recoge en el lugar del crimen
las huellas biológicas, como partículas de piel, pelos, semen o sangre, y
analiza su ADN. Después compara el análisis con el ADN del presunto criminal.
Si coinciden, es una prueba de su culpabilidad.
La probabilidad de que dos personas tengan idéntico perfil genético es de 1 por
3 billones. Al respecto representan al respecto un problema tan solo los
gemelos procedentes del mismo óvulo cuyo perfil genético coincide.
A excepción de los gemelos, no existen dos personas con un ADN idéntico y
así podría darse por descartada la eventualidad de que a raíz de un análisis del
ADN pueda ser inculpada una persona inocente.
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