תקציר
תקציר מיני Pseudomonasפלואורסנטים ריזוספרים אשר מייצרים אנטיביוטיקות בעלות טווח רחב, ביניהן ) 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4-DAPGופירולניטרין ) (Prnהם כרגע נושא חם בחקר הדברה ביולוגית .אופרון ה prnABCD -בגודל 5,8-Kbהמקודד לפירולניטרין נלקח מהתבדיד P. fluorescens Pf-5ושובט תחת בקרת הפרומוטור החזק tacליצירת שתי קסטות הנבדלות זו מזו בסמיכות קודון תחילת השעתוק לפרומוטור .קסטות אלה הוחדרו לתוך הוקטור האינטגרטיבי pBK-miniTn7-ΩGmוהתקבלו קונסטרוקטים . miniTn7-Ptac-prnנעשתה טרנספורמציה עם קונסטרוקטים אינטגרטיבים אלה לחיידקים Q8r1-96 P. fluorescensו Q2-87 -המייצרים ) (2,4-DAPGוידועים כיעילים כנגד הפטריה ,Gaeumannomyces graminis var. triticiאך יחסית לא יעילים כנגד פתוגנים פטריתיים אחרים ,ביניהם Rhizoctonia solaniאשר גורמת לנזקים נרחבים בגידולים רבים ברחבי העולם .המטרה הייתה להגביר את הפעילות האנטי- פטרייתית ולהרחיב את טווח הפעילות של תבדידים אלה .בנוסף קונסטרקטים אלה הוחדרו גם למוטנט 4C5של Q8r1-96החסר ביכולת ייצור .DAPGהתקבלו הוכחות כי הקסטות Ptac-prn נכנסו לגנום החיידקים באתר החדרה ספציפי לטרנספוזון Tn7קרוב לגן הכרומוזומלי .glmS הוכח ע"י TLCו HPLC -כי החיידקים הטרנספורמנטים המכילים את הקסטה tac-prnABCD בכרומוזום מייצרים פירולניטרין בנוסף ל . 2,4-DAPG -בניסויי חממה כנגד R. solaniהגורמת למחלת החולי נופל בצמחי שעועית נמצא כי החיידקים הרקומביננטים הורידו את חומרת המחלה ב 52.6%-90.9% -בעוד שתבדידי המקור הורידו את חומרת המחלה ב 2.8%-12.4% -בלבד. בניסויי שרידות שנערכו לאורך ניסויי החממה נמצא כי הטרנספורמנטים הראו יציבות דומה לזו של חיידקי המקור ושמרו על יציבות לאורך הניסויי .בנוסף נמצא כי החיידקים הרקומביננטים כנראה לא משפיעים על אוכלוסיית החיידקים הטבעית בקרקע .הקונסטרקטים שהתקבלו בעבודה זו יכולים לשמש ככלי יעיל להנדסה גנטית בחיידקים גראם שלילים ריזוספרים לשיפור תכונותיהם כמדבירים ביולוגים כנגד R. solaniופטריות קרקע אחרות. .1מבוא פתוגנים צמחיים התוקפים גידולים חקלאיים בכל העולם ,מהווים מכשול בייצור מזון ,צמחי נוי וסיבים .האמצעי הנפוץ ביותר כנגד מחלות צמחים הוא ההדברה הכימית ,אולם החברה האנושית מודעת כיום לסכנות הטמונות בשימוש רב בכימיקלים הפוגעים באורגניזמים שאינם יעד המטרה, מזהמים את סביבתנו והופכים עם הזמן פחות ופחות יעילים עקב התפתחותן של עמידויות בקרב הפתוגנים .אחת הדרכים המבטיחות והעונות על הדרישות היא ההדברה הביולוגית ,המבוססת על אינטראקציות אנטגוניסטיות טבעיות בין מיקרואורגניזמים ומציעה אמצעים ליישום ההדברה של מחלות צמחים בהימנע מבעיות הנובעות משימוש לא הולם במדבירים סינתטיים .מדביר ביולוגי הנו אורגניזם המקיים אינטראקציות אנטגוניסטיות עם אורגניזם אחר הגורם נזק כלכלי בגידול חקלאי .אורגניזמים אלה מצויים בדרך כלל בסביבתו הטבעי של הגידול החקלאי ,אף כי אפשר גם לייבאם מסביבה אחרת ולבססם בסביבה החדשה .לפיתוח מדביר ביולוגי דרוש מחקר מקיף in vitroו in vivo -לבירור מנגנוני ההדברה ,תרומתם היחסית ,דרכי פעולתם ובקרתם .כמו כן ,כדי להבטיח שאותו מדביר פוטנציאלי אכן יהיה ידידותי לסביבה יש להעריך את סך האינטראקציות הביולוגיות של אותו מדביר עם אורגניזמים אחרים בסביבתו .חיידקי סביבת השורש מעודדי צמיחה (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) PGPR -מהווים את המאגר העיקרי של מדבירם פיטופתוגנים ונציגים של מינים שונים משמשים להדברת מחלות צמחים. מדבירים ביולוגיים מוצלחים מאכלסים את השורש ומדכאים פתוגנים ע"י תפיסת נישות ותחרות ,אנטגוניזם ישיר נגד פתוגנים ע"י הפרשת אנטיביוטיקות ,טפילות וטריפה וכמו כן, הפעלת מנגנונים של עמידות מושרית בצמח. מטרת עבודה זו היא שיפור המדביר הביולוגי Pseudomonas fluorescensתבדידים Q8rl-96ו- Q2-87המייצרים 2, 4-diacetylphloroglucinolבאופן טבעי ע"י החדרת וביטוי אופרון הפירולניטרין ובכך הגדלת טווח הדברתם כנגד הפטרייה Rhizoctonia solaniהגורמת למחלת החולי נופל. על מנת להשיג מטרה זו אופרון הפירולניטרין בודד מגנום החיידק הריזוספרי P. flourescense תבדיד Pf-5והוחדר לגנום החיידק הריזוספרי P. flourescenseתבדידים Q8rl-96ו,Q2-87 - אשר ידועים כמדבירים ביולוגים טובים כנגד )Gaeumannomyces graminis var. tritici (Ggt עקב יכולתם לייצר את האנטיביוטיקה (Weller at al., (DAPG) 2,-4-diacetylphloroglucinol ) .2007חיידקים אלה שימשו כחיידקי מודל בהדברה כנגד הפטריה Rhizoctonia solaniהגורמת למחלת החולי נופל בצמחי שעועית .בעבודה זו נבנתה קסטה המכילה את אופרון הפירולניטרין תחת בקרת הפרומוטור החזק tacבוקטור האינטגרטיבי miniTn7והוחדרה לגנום חיידקי המטרה .החיידקים שהתקבלו בעבודה זו מפרישים בנוסף את האנטיביוטיקה פירולניטרין ובעלי יכולת הדברה טובה יותר משמעותית כנגד הפטריה R. solaniבתנאי חממה מתבדידי המקור. 2 .2סקירת ספרות פתוגנים צמחיים משפיעים על גידולים בכל העולם ומהווים מכשול רציני לאספקת מזון ברחבי העולם .הפסדים כתוצאה ממחלות צמחים יכולים להגיע ל 30 -עד 50ביליון דולר לשנה בגידול גידולים ואחסונם ) ,(Chet and Chernin, 2002אשר יכולים להאכיל מיליוני בני אדם .פתוגנים צמחיים משפיעים על חלקים שונים של הצמח ,מתחת ומעל פני הקרקע .פתוגנים ריזוספריים הגורמים לריקבונות שורש ,רקבונות כתר ,נבילה וחולי נופל הם גורמים מאוד מגבילים בתוצרי יבול ויצרנותו .רוב פתוגנים אלה קשים לריסון ע"י אמצעים קונבנציונלים כמו השימוש בזנים עמידים ופונגיצידים סינתטים ) .(Weller et al., 2002כיום יש מחסור בהדברה כימית אמינה, עלייה בעמידות הפתוגנים לפונגיצידים ושבירה של עמידות הפונדקאי .כל זאת הם בין הגורמים העיקריים התווים את הדרך למאמצי פיתוח אסטרטגיות אלטרנטיביות להדברת פתוגנים צמחיים .דאגת הציבור בנוגע להשפעות סביבתיות של כימיקלים )כמו מתיל ברומיד( ,לבריאות יונקים גם היא מעודדת חיפוש אפשרויות שונות להדברה .שיטה אלטרנטיבית בטוחה וידידותית להדברת פתוגנים צמחיים היא שימוש בשיטות ביולוגיות להדברת מחלות )Whipps et al., 1997 ( .בנוסף ,מדבירים ביולוגים יכולים לספק הדברה של מחלות אשר מודברות חלקית בלבד באמצעים כימיים .הדברה ביולוגית היא מצב בו שרידות או פעילות הפתוגן מוקטנת ע"י אורגניזם נטרלי או מהונדס ,הגורם לירידה בחומרת המחלה הנגרמת ע"י הפתוגן ).(Cook, 1993 האורגניזמים בהם משתמשים להגנת צמחים מפני פתוגנים נקראים Biological Control ) ,Agents (BCAאלו הם מיקרואורגניזמים ,הנמצאים בדרך כלל בקרקע ,בעלי תכונות הפוגעות בגדילה ,שרידות או הדבקת הצמח ע"י הפתוגן BCA .הם ברך כלל בעלי השפעה קטנה על מיקרואורגניזמים אחרים הנמצאים בקרקע ,כך האקוסיסטמה נשארת מאוזנת ,לעומת שימוש בחומרי הדברה כימיים הקוטלים מגוון רחב של מיקרואורגניזמים ,ביניהם מיקרואורגניזמים מועילים ) .(Chet and Chernin, 2002תפקיד המיקרואורגניזמים הריזוספריים בהגנה על צמחים מפני פתוגנים הנמצאים בקרקע ,מודגם בצורה הטובה ביותר בקרקעות המדכאות באופן טבעי התפתחות מחלות .קרקעות שכאלה נצפו בתחילה ע"י דרגות מחלה נמוכות בתנאים מעודדי מחלה ,או בהשוואה לקרקעות בסביבה ) .(Cook and Baker, 1983קרקעות שכאלה נצפו עבור מספר פתוגנים הנמצאים בקרקע ,ביניהם Gaeumannomyces graminis var tritci (Ggt), Fusarium oxysporum, Pythium ultimumוLucas et al., 1993; ) Rhizoctonia solani - .(Weller, 1988דיכוי המחלות ע"י מיקרואורגניזמים הוכח ע"י פיסטור הקרקעות ,חשיפה לטיפולים אנטי מיקרוביאלים שונים ובכך איבוד יכולת דיכוי המחלות .בנוסף נמצא כי הוספת קרקע מדכאת מחלות לקרקע הנגועה במחלה גרמה לדיכוי המחלה ונמצא כי שנים של מונוקולטורה ,הביאו גם הן לדיכוי מחלות מסוימות. .2.1חיידקים כמדבירים ביולוגיים ישנו עניין גובר והולך בשימוש במיקרואורגניזמים להדברה ביולוגית של מזיקי צמחים .אולם אכלוס לא יעיל של השורש ופעילות אנטגוניסטית לא עקבית מעכבים את היישום המסחרי של הטכנולוגיה .הרבה חיידקים הנמצאים בקרקע וחיידקים ריזוספריים שימשו להדברה ביולוגית 3 של פתוגנים צמחיים .חיידקים מתאימים להיות BCAמכיוון שהם נוחים לגידול ,אפשר להשתמש בהם לטיפול בזרעים או בקרקע ומנגנוני הפעולה שלהם נלמדו .רוב הBCA - החיידקיים הם גרם שליליים ביניהם Agrobacterium radiobacter, P. fluorescens, P. putida, Bukholderia spp., Serratia plymuticaוהרבה אחרים ) Whipps, 1997; Chet and .(Chernin, 2002ידע על מנגנונים ומטבוליזם המעורבים בהדברה ביולוגית מבוסס בעיקר על מחקרים עם Pseudomonas spp.פלורוסנטים אשר נמצאים בקרקע ,מים ועל צמחים ,חיידקים מעודדי צמיחה אלה ) (Plant Growth Promoting Rhizobacteria- PGPRהשייכים לתת מחלקה גמא של פרוטאובקטריה ,בעלי השפעה גדולה על צמחים ע"י דיכוי פתוגנים ,הגברת גישה לנוטריאנטים ושינוי תהליכים פיזיולוגיים ) .(Paulsen et al., 2005נוכחותם נקשרת לעיתים קרובות עם דיכוי מחלות ) (Raaijmakers and Weller, 1998והם מתאימים להיות BCAמכיוון שהם יכולים להשתמש בהסתעפויות שורשים כמקור לנוטריאנטים ),(Lugtenberg et al., 1999 הם נמצאים בשפע בריזוספרה ,בעלי קצב גידול גבוה יחסית לחיידקים ריזוספרים אחרים, משתמשים במגוון מנגנונים לעיכוב פיטופתוגנים והם קלים לגידול Lugtenberg et al., ) in-vitro .(2001 למרבית המדבירים הביולוגיים ,הנמצאים בשימוש ,יש יותר ממנגנון אנטגוניסטי אחד .ריבוי מנגנוני הדברה מהווה יתרון ,כיוון שבכך גדל טווח פעילותו של המדביר הביולוגי הן במגוון הפתוגנים היכולים להיות מעוכבים על ידו והן במגוון הסביבות בהן ניתן ליישמו. הכנסת גנים מובחרים עם פעילויות שונות נגד פיטופתוגנים לאורגניזם אחד יכולה לשפר את יעילות ההדברה הביולוגית וכמו כן לייעל את אכלוס השורש .שיטה זו מונעת את התהליך היקר של סריקת תבדידים חדשים בעלי ערך לא ידוע ,מונעת תחרות בין התבדידים המוכנסים למערכת ומאפשרת לאלו שכבר הסתגלו לסביבה מסוימת לקבל תכונות מטבוליות חדשות עם פעילות מוגדרת כנגד פתוגן המטרה .את מגוון הדרכים בהן יכול מדביר ביולוגי לפעול ,ניתן לחלק לדרכים ישירות כגון אנטיביוזיס ,הפרשת אנזימים ליטיים וטפילות ,ולדרכים עקיפות כגון השראת עמידות בצמח ,עידוד גדילה ותחרות ).(Whipps, 1997, 2001; Massart and Jijakli, 2007 .2.1.1הפרשת אנזימים ליטיים :מנגנון בו מופרשים ע"י המדביר הביולוגי אנזימים המשפיעים על הפתוגן באופן ישיר ,כגון פירוק דפנות התאים ,או פגיעה בפעילות המטבולית הנגזרת מאנזימים אלה .מבין האנזימים הליטיים ניתן למנות כיטינאזות ,גלוקאנאזות ופרוטאזות ) Chet .(and Chernin, 2002 .2.1.2טפילות :יכולתו של מיקרואורגניזם להיזון בצורה ישירה מאורגניזם אחר ,תוך חדירה אל גוף הפונדקאי או ע"י הצמדות אליו .כדי ליצור קשר פיזי עם הפונדקאי ,מפריש הטפיל חומרים אשר מאפשרים הצמדות או חדירה ,כגון אנזימים הידרוליטיים ,תופעה נפוצה בעיקר באקטנומיצטים ובפטריות ).(Whipps, 1997 4 .2.1.3השראת עמידות :Induced resistance -במנגנון זה משרה המדביר הביולוגי או תוצריו תגובה טבעית של הפעלת מנגנוני הגנה בצמח וכתוצאה מכך הופך הצמח עמיד יותר כלפי מגוון פתוגנים .למשל אילוח מוקדם של הצמח בתבדיד לא אלים יכול להביא להשראת עמידות ) van .(Loon et al., 1998; Bakker et al., 2007 .2.1.4תחרות :מיקרואורגניזמים החולקים את אותה מיקרו-סביבה מתחרים ביניהם על המשאבים הקיימים :מקום )נישה אקולוגית מתאימה( ומזון )נוטריאנטים ,חמצן ,פחמן ,חנקן, ברזל ,ויטמינים וכו'( .במהלך האבולוציה התפתחו מנגנונים המאפשרים תחרות על משאבים אלו, כגון כמוטקסיס המאפשר תנועה לאתר הזנה טוב יותר ,או הפרשת סידרופורים כאמצעי ספיגה יעילה של ברזל ).(Whipps, 2001 הריזוספרה היא אזור בקרקע המקיף את שורשי הצמח ,בו מתרחשות אינטראקציות מורכבות בין הצמח ,הקרקע ומיקרואורגניזמים .צמחים מפרישים תרכובות שונות כמו סוכרים ,חומצות אורגניות וחומצות אמינו ,אשר משחקות תפקיד חשוב באינטראקציות בריזוספרה ע"י דחיית מיקרואורגניזם אחד לעומת משיכת אחר ) .(Bais et al., 2006אכלוס הריזוספרה הוא קריטי להדברה ביולוגית מוצלחת ,מכיוון ש BCA -צריכים לבסס ולשמור על אוכלוסיית סף בכדי להגן על הצמח הפונדקאי מפתוגנים הנמצאים בקרקע .תחרות בריזוספרה מאפשרת אכלוס שורש יעיל, יכולת להתפזר לאורך שורשי צמח גדלים ושרידות לאורך תקופת זמן בהימצא מיקרופלורה מקומית ) .(Lugtenberg and Dakkers, 1999; Weller, 1988בוססו יחסים ברורים בין צפיפות זנים שונים של פסאודומנדים פלורוסנטים לבין דיכוי של מחלת ה take all -ונבילה הנובעת מ- Fusariumבחיטה ושורשי צנונית בהתאמה ).(Bull et al., 1991; Raaijmakers et al., 1995 למרות הנאמר במחקרים רבים BCA ,מהווים רק חלק קטן של תכשירי ההדברה המצויים בשוק ולא נמצאים בשימוש מלא בחקלאות .זאת עקב פעילותם הבלתי הדירה הנובעת ממספר גורמים ביניהם ,יכולת התבססות נמוכה בריזוספרה ).(Raaijmakers and Weller, 2001 .2.1.5עידוד צמיחה PGPR :הינם חיידקי סביבת השורש ,החיים בחופשיות בקרקע ומביאים תועלת לגידולים חקלאיים ,אך אינם בהכרח מדבירים ביולוגים .חיידקים אלה נחשבים למעודדי צמיחה ומהווים את המאגר העיקרי של מדבירי פיטופתוגנים כאשר נציגים של מינים שונים ,כמו ,Azotobacter, Azospirilium, Acetobacter, Burkholderiaפסאודומונדים ובאצילים ,מנוצלים להדברת מחלות צמחים .חלק מחיידקי ה PGPR-מעודדים צמיחה ע"י סינטזת הורמונים צמחיים וסידרופורים ,קשירת חנקן או מינרלים מומסים .אחרים משבשים את הביוסינתזה של חומרים מעכבי גדילה ,כמו אתילן .לעידוד צמיחה תפקיד מכריע במצבים בהם החלה כבר להתפתח אוכלוסיית פתוגן ,כיוון שקצב גדילה גבוה יותר עשוי להביא להתחמקות הצמח ממחלות רבות ).(Glick et al., 1998 .2.1.6אנטיביוזיס :הפרשת מטבוליטים משניים ,בדרך כלל בעלי משקל מולקולרי נמוך ,ע"י אוכלוסיית מיקרואורגניזמים אחת המעכבת באופן ישיר את התפתחותה של אוכלוסיית 5 מיקרואורגניזמים אחרת .ייצורם של חומרים אלו מתרחש לרוב בשלב הגידול הסטציונרי ונתון תחת בקרת מנגנונים שונים .כמו כן ,תלוי ייצורן של התרכובות האנטיביוטיות באיכות ובכמות הנוטריאנטים בסביבת הגידול ,וביכולתו של המדביר להתחרות עליהם עם מיקרואורגניזמים אחרים בסביבתו ).(Raaijmakers et al., 2002; Weller et al., 2007 .2.1.6.1האנטיביוטיקה פירולניטרין פירולניטרין ] (Prn) [3-chloro-4-nitro-chloro-phenyl) pyrroleהיא אנטיביוטיקה אנטי- פטרייתית רחבת טווח המיוצרת ע"י מספר מינים חיידקיים )איור מס' .(1מאז הגילוי הראשון של Prnב ,(Arima et al., 1964) Pseudomonas pyrrocinia -האנטיביוטיקה זוהתה במספר מינים וזנים ביניהם P. fluorescens, Burkholderia cepaciaוHill et al., ) S. plymutica - Prn .(1994; Chernin et al., 1996; Kalbe et al., 1996; El-Banna and Winkelmann, 1998 פעילה כנגד מגוון רחב של Deuteromycetes, Ascomycetesו ,Basidiomycetes -ביניהם הפתוגנים החשובים כלכלית R. solani, Botrytis cinerea, Verticillium dahliaeו- .(Ligon et al., 2000) Sclerotinia sclerotiorumלמרות פעילותה ההדברתית כנגד מספר פתוגני קרקע Prn ,נמצאה כלא מתאימה לשימוש כפונגיציד בחקלאות עקב רגישותה הגבוהה לאור שמש ) .(Umio et al., 1987בעיה זו נפתרה בסידור מבני ,ע"י החלפת אטום כלור על טבעת הפירול בקבוצת ציאנו .סידור זה הגדיל את היציבות של האנטיביוטיקה באור ואת פעילותה האנטי -פטרייתית הכללית ) .(van Pee, 1980למרות זאת ,האנטיביוטיקה שימשה כמבנה מוביל בפיתוח הפונגצידים היציבים fenpiclonilו.fludiioxonil - prnA prnB prnC prnD איור מס' :1ביוסינתזה של פירולניטרין )(Kirner al., 1998 6 הלוקוס הביוסינתטי של Prnרוצף ב P. fluorescens -בזנים BL917וHammer et al., ) Pf- 5 - (1997; Paulsen et al., 2005ומכיל בין היתר את ארבעת הגנים,prnA, prnB, prnC, prnD : אשר מתפקדים כיחידת שעתוק יחידה )אופרון( ושמורים בזנים שונים המייצרים אנטיביוטיקה זו ) .(Hammer et al., 1999מסלולים ביוסינתטים של prnהוצעו כבר בHamill et al., ) 1967 - .(1967הפרוקורסור ליצירת Prnהוא טריפטופן .תוצר הגן prnAגורם להוספת הכלור לטריפטופן ,ליצירת .7-chloro-tryptophanתוצר הגן prnBגורם לסידור מחדש ודקרבוקסילציה של הטבעת ,ליצירת .(MCAP) monodechloroaminopyrrolnitrinתוצר הגן prnCגורם להוספת כלור בפחמן 3ל MCAP -ליצירת ,aminopyrrolnitrinולבסוף תוצר הגן ,prnDגורם לחמצון קבוצת האמינו של aminopyrrolnitrinלקבוצת ניטרו ליצירת Kirner et ) pyrrolnitrin ,(al., 1998המסלול הביוסינטטי של Prnמתואר באיור מס' .1 מנגנון הפעולה של Prnנלמד ב ,Neurospora crassa -התוצאות הראו ש Prn -משפיעה על מערכת העברת האלקטרונים ,הוספתה מעכבת את ניצול החמצן ) El-Banna and Winkelmann, .(1998הוספת (TMPD) N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochlorideאשר משמש כהטיה בין החלק הראשוני של שרשרת מעבר האלקטרונים לציטוכרום ,Cהורידה את רמת עיכוב קליטת החמצן ,כלומר Prnחסמה את מעבר האלקטרונים בין הדהידרוגנאז לציטוכרום .(El-Banna and Winkelmann, 1998) Cכמו כן דווח כי Prnמובילה לצבירת גליצרול ומעודדת סינתזה של טריאצילגליצרול הגורם לדליפה ממברנות התא ומשם למסלולים ביוסינתטים המובילים למוות של התא. .2.1.6.2האנטיביוטיקה )2, 4-diacetylphloroglucinol (DAPG ) DAPGאיור מס' (2היא אנטיביוטיקה המהווה מרכיב חשוב בהדברה ביולוגית של מגוון פיטופתוגנים ,מופרשת ע"י מגוון פסאודומונדים פלורסנטים ובעלת פעילות אנטי-פטרייתית, אנטי -חיידקית ,אנטי -ויראלית ופיטוטוקסית ) Keel et al., 1992; Thomashow and Weller, .(1996מיני פסאודומונס פלורסנטים המייצרים DAPGמופיעים הרבה בקרקעות בהן מופיעה תופעת ה ,take all decline (TAD) -ירידה משמעותית באוכלוסיית חיידקים אלה מורידה את יכולת דיכוי המחלה .כאשר מאלחים זרעים בחיידקים אלה וזורעים בקרקע הנגועה ב take all ,diseaseישנה הדברה של המחלה עד לרמת קרקע .(Raaijmakers and Weller, 1998) TAD בדומה ,מוטנטים חסרי יכולת יצור ,DAPGלא הצליחו לעכב פטריות in- vitroולדכא מחלה בהשוואה לתבדיד הבר ) .(Fenton et al., 1992; Keel et al., 1992השלמה ע"י החדרת פלסמיד נושא את הלוקוס הביוסינתטי של ,DAPGהחזירה את יכולת יצור האנטיביוטיקה והתכונות הנלוות .תפקיד DAPGבהדברה ביולוגית של פתוגנים הנמצאים בקרקע הוחלפה ע"י בידוד ישיר של האנטיביוטיקה מריזוספרה של חיטה ).(Bonsal et al., 1997 DAPGמסונתזת ע"י דחיסה של שלוש מולקולות אצטיל CoAעם מולקולה אחת של מלוניל ,CoAליצירת הפרוקורסור ,monoacetylphloroglucinolאשר עובר טרנס-אצטליציה ליצירת 7 .(Bangera and Thomashow, 1999) DAPGמנגנון ההדברה של ,DAPGטרם הובן לחלוטין, אך הוכח כמשחק תפקיד חשוב בהפרעה לממברנת הפטריה וזאוספורות של de ) Pythium spp. .(Souza et al., 2003הלוקוס הביוסינתטי של DAPGמכיל שישה גניםphlA, phlB, phlC, : phlD, phlEו ,phlF -אשר מקודדים לסינתזה ,רגולציה ויצוא של האנטיביוטיקה ) Bangera and (Thomashow, 1999ושמורים בקרב תבדידים המייצרים ,DAPGשנאספו ברחבי העולם ) Keel .(et al., 1996; Raaijmakers et al., 1997; McSpadden Gardener et al., 2000בין תבדידים אלה מצויות שונויות בפעילות ההדברה הביולוגית ואכלוס השורש ,אשר יכולות לתרום לשימוש בזנים המייצרים DAPGלהדברה יעילה של פתוגנים הנמצאים בקרקע ) Raaijmakers and .(Weller, 2001 יצור DAPGמושפע ע"י מספר גורמים ביוטים ,ביניהם מין הצמח ,גיל הצמח ,קוים פונדקאים וגורמים א-ביוטים כמו מקורות פחמן ,מינרלים שונים וטמפרטורה .דווח כי Fe3+וסוכרוז מעלים את רמות DAPGבתבדיד F133של (Shanahan et al., 1992) P. fluoroscensבעוד שבתבדידים Pf-5ו ,CHA0 -ייצור DAPGהוגבר ע"י גלוקוז וירד ע"י סוכרוז ).(Duffy and Defago, 1999 מיקרואלמנטים כמו Zn2+ו Mo2+ -גם כן הוכחו כמגבירי יצור של DAPGבDuffy and ) CHA0 - .(Defago, 1999בנוסף ) ,Bonsal et al., (1997הראו כי טמפרטורה היא בעלת השפעה על יצור DAPGבתבדיד ,Q2-87בכך שהבחינו ביצור מוכפל של האנטיביוטיקה בטמפ' 27°Cלעומת היצור בטמפ' החדר .לעומת זאת תבדיד F113של P. fluoroscensיצר כמות מקסימלית של DAPGבטמפ' של .(Fenton et al., 1992) 12°C איור מס' :2המבנה של האנטיביוטיקה 2, 4-diacetylphloroglucinol .2.2שיפור גנטי של מדבירים ביולוגיים שיפור גנטי של מדבירים ביולוגיים קיימים הינה תפיסה רווחת כיום ,ומטרתה לשפר את היכולת האנטגוניסטית של מיקרואורגניזמים אשר נחקרו ונמצאו בעלי יתרון רלוונטי להדברה .תכונות כגון יכולת התבססות האוכלוסייה באזור השורש ,ייצור מטבוליטים משניים כגון אנטיביוטיקה והפרשת אנזימים ליטיים כגון כיטינאזות ,הן תכונות המשמשות בסיס לשיפור גנטי ) Morrissey .(et al., 2002האסטרטגיות האפשריות לשיפור גנטי כוללות מניפולציה של גנים המעורבים בבקרה כללית )השתקה או הגברה( ,השפעה על תזמון ייצור חומרים אנטי-פטרייתיים והחדרת גנים זרים המקנים למדביר הביולוגי יכולת אנטגוניסטית נוספת ).(Ligon et al., 2000 בשנים האחרונות יצאו לשוק מספר מדבירים ביולוגים אשר חלקם בעלי יכולת עידוד צמיחה ) .(PGPRהשימוש בהם מוגבל יחסית להדברה הכימית ,עקב בעיות של ביצועים לא אחידים והמינון הגבוה הנדרש .לעומת זאת ,מדבירים ביולוגים המהונדסים גנטית ) Genetically 8 ,(Modified Microorganisms- GMMהם מספיק יעילים במינונים נמוכים כנגד מגוון פתוגנים של שורשי צמחים .הם יכולים לסייע בהתגברות על מכושלים בייצור ,פורמולציה ומחיר המגבילים כיום את יישום המדבירים הביולוגים .למרות הפוטנציאל התועלתי העצום ומחקרים רבים התומכים בהתכנות גישה זו )( Fravel, 2005; Walsh, 2001ל GMM-ישנן עדיין מספר בעיות הממסכות על הצלחתם .אחת הבעיות היא העלות הגבוהה של פיתוח המוצר ואישורים הדרושים לשם פיתוחו ,פורמולציות ושימוש .צוואר הבקבוק נובע מפחד הציבור מפני יישום מוצרים ביוטכנולוגים חדשים ,אשר עלולים לפגוע סביבה ) .(Migheli, 2001לפני שהGMM- יוכלו להיות משווקים כמדבירים ביולוגיים צריכים להיות מפורסמים מחקרים מעריכי סיכון, העוזרים לציבור לקבל את המידע של אפשרויות ההשפעה שלהם על אורגניזם שאינם מהווים מטרה .קיימות מספר דוגמאות בספרות המתארות שיפור גנטי של תבדידים ,הידועים כבר כמדבירים ביולוגיים ,ע"י החדרה לתוכם גנים לייצור אנטיביוטיקות וכיטינאזות ) Ligon et al., .(2000; Timms-Wilson et al., 2000; Huang et al., 2004ניתן לשפר גנטית מדבירים ביולוגים ע"י הגדלת מספר העותקים של גנים ביוסינתטים ,שינוי הסיגנלים הביוסינתטיים המבקרים את ביטויים והחדרה של גנים ביוסינתטיים חדשים לזנים בעלי תכונות רצויות אחרות ) .(Chet and Chernin, 2002ביטוי של צבר הגנים prnABCDתחת פרומוטור tacבP. - fluorescensתבדיד ) BL915ממנו הגנים נלקחו( גרם להגדלה פי 4של יצור Prnוהגן על צמחי מלפפון מפני R. solaniפי 10בהשוואה ל BL915-תבדיד הבר .הדברה של R. solaniוP. - ultimumעם זנים משובטים הוכחה כטובה יותר בניסויי שדה ,מאשר ההדברה שהתקבלה ע"י תבדיד הבר ,BL915ולא הייתה בעלת הבדלים מובהקים מהדברה כימית ,או מהבקרה הבריאה ).(Ligon et al., 2000 תוצאות שדווחו ע"י Thomashowושות' בהם הכניסו את המסלול הביוסנתטי של האנטיביוטיקה פנזין לשם הגברת ההדברה הביולוגית כנגד מחלת החולי נופל ,תומכות באסטרטגיה זו .אופרון הפנזין בוטא תחת בקרה של הפרומוטור הקונסטיטוטיבי tacוהוחדר אקראית לגנום של ,P. fluorescensתבדיד .SBW25כתוצאה מכך ,נצפתה ירידה משמעותית בעוצמת מחלת החולי נופל ,בנבטי אפונה לעומת תבדיד הבר .רמת הפנזין שיוצרה התאימה ישירות ליעילות ההדברה ע"י החיידק ,כמו כן קרקע שאולחה עם חיידק ששונה גנטית ) (GMגם כן הורידה את שיעור המחלה ) .(Timms-Wilson et al., 2000קסטה זו שימשה להגברת ההדברה ביולוגית של P. fluorescensתבדיד .Q8rl-96נמצא כי זני GMהנושאים את קסטת הפנזין ייצרו יותר DAPGמאשר תבדיד הבר Q8rl-96ויותר פנזין מאשר תבדיד הבר in 2-79 vitroובריזסופרת חיטה .השיבוטים שהכילו פנזין דיכאו את ריקבון השורש הנגרם ע"י R. ,solaniכאשר אולחו בכמות של ,102 cfu/seedכלומר שני סדרי גודל פחות מאשר נחוץ להדברה דומה ע"י Maurhofer et al., 1995 .(Huang et al., 2004) Q8rl-96הראו ,כי החדרה של קוסמיד רקומביננטי הנושא מחדר של 22kbשל דנ"א השייך ל P. fluorescens -תבדיד CHA0 גורם לייצור מוגבר של DAPGו ,pyoluteorin -המוביל לעלייה בהגנה על צמחי מלפפון מפני Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinumו .Phomopsis sclerotiodes -בנוסף Alsanius et 9 al., 2002הראו כי זני P. fluorescensשייצרו כמויות גבוהות של DAPGע"י ביטוי גנים של DAPGגרמו להדברה משופרת של .P. ultimum למרות יתרונות פוטנציאלים רבים ,הכנסה של מיקרואורגניזמים מהונדסים גנטית ) (GMMכ- BCAבחקלאות עומדת בפני כמה בעיות המעכבות את הצלחתה .אחת המגבלות הגדולות היא עלות יצור ופיתוח גבוהה של המוצר והצורך באישורים מיוחדים לכל תבדיד ,פורמולה ושימוש. הצורך באישורים רבים נובע מפחד כי הכנסה של מוצרי ביוטכנולוגיה חדשים יצרו סיכונים לסביבה .צוואר הבקבוק נובע מפחד הציבור מפני יישום מוצרים ביוטכנולוגים חדשים ,אשר עלולים לפגוע סביבה ) .(Migheli, 2001לפני שה GMM-יוכלו להיות משווקים כמדבירים ביולוגיים צריכים להיות מפורסמים מחקרים מעריכי סיכון ,העוזרים לציבור לקבל את המידע של אפשרויות ההשפעה שלהם על אורגניזם שאינם מהווים מטרה .עד כה ,השפעות אילוח קרקע עם זני בר ו GMM -על האקוסיסטמה ,נחקרו בעיקר במיקרוקוסמוס וברוב ניסויי השדה הדגש הושם על גורל GMMאלה ולא על אוכלוסיות מיקרואורגניזמים אחרות בסביבה. .2.4תיאור החיידקים ששימשו בעבודה זו .2.4.1חיידקים מקבוצת פסאודומונדים פלורוסנטים חיידקים מהסוג Pseudomonasהם גראם שלילים ,מתגים ,המאופיינים ע"י רב-גוניות מטבולית, נשימה אארובית )מלבד מספר תבדידים הנושמים אנאירובית ,כאשר ניטראט ) (NO3משמש להם כקולט אלקטרונים סופי במקום החמצן( ,תנועה בעזרת שוטון קוטבי אחד או יותר וריכוז גבוה של בסיסי GCבגנום .אחת הקבוצות הגדולות וההטרוגניות של סוג חיידקים זה הם הפסאודומונדים הפלורסנטים הכוללת את P. aeruginosa, P. putida, P. syringaeוP. - fluorescensהמאופיין בייצור פיגמנט פלורסנטי ירוק ,Pvd -הידוע גם כפסאודובקטין ) Haas .(and Defago, 2005לחיידקים מקבוצה זו יש דרישות תזונתיות פשוטות והם גדלים ומסתגלים היטב לקרקעות שונות ,אף מליחות ועשירות במינרלים בתוספת של אחד ממקורות הפחמן הרבים .הם בעלי טכניקות גנטיות כגון :קוניוגציה ,טרנספורמציה ומעבר גנים ,לכן הם נוחים לעבודה מולקולרית ויישום מחקרי. מספר נכבד של תבדידים מקבוצה זו הם בעלי יכולת הדברה ביולוגית של מחלות צמחים הנגרמות ע"י פיטופתוגנים שונים .יכולת זו נובעת ממנגנונים שונים המאפשרים את דיכוי הפתוגנים כגון: השראת עמידות ,ייצור מטבוליטים משניים ,כמו סידרופורים ומגוון חומרים אנטיביוטים ,כמו פנזין ,פירולניטרין ,פלורוגליצנול ועוד ) .(Weller et al., 2007כמו כן Pseudomonas spp. נחשבים ל"מתחרים" חזקים ומרחיקים פתוגנים ע"י אכלוס מאוד יעיל של הריזוספרה ,וזה גורם חשוב בהדברה ביולוגית .תבדידי Pseudomonas spp.ידועים כבעלי השפעה בדיכוי מחלת ה- take allבכל העולם ונמצאו כמעורבים בתופעת הקרקע הסופרסיבית .הם מסתגלים בצורה טובה לסביבת הריזוספרה ,משתמשים בהרבה סובסטרטים אורגניים ומסנתזים כאמור מגוון של מטבוליטים אנטי-פטרייתיים ,המעכבים בין היתר את הפטרייה Gaeumannomyces graminis 10 ) .var tritci (Ggtהאוכלוסייה של חיידקים אלה גדלה באופן דרמטי על גבי שורשים הנגועים ב- take allאך תהליך פסטור הקרקע יכול להעלים אותם לחלוטין ).(Weller et al., 2002 Pseudomonas fluorescens .2.4.2תבדיד Pf-5שימש כמקור לגנים prn P. fluorescensתבדיד Pf-5בודד מריזוספרת כותנה ,משמש להדברה ביולוגית ע"י ייצור מספר אנטיביוטיקות ומטבוליטים משניים אחרים ובעל פעילות אנטימיקרוביאלית .חיידק זה מייצר אנטיביוטיקות אנטי -פטרייתיות כמו DAPG ,PrnוHowell and Stipanovic, ) pyoverdine - (1979, 1980; Nowak-Thomson et al., 1994תבדיד זה מייצר גם ,HCNמולקולה נדיפה בעלת פעילות אנטיביוטית ,ואת הסידרופורים pyochelin ,ו,pyoverdine (pseudobactin) - אשר יכולים לדכא פתוגני מטרה בריזוספרה ע"י תחרות על ברזל ) .(Buysens et al., 1996תבדיד Pf-5מעכב את הריזוספרה של צמחים רבים ומדכא מחלות צמחים הנגרמות ע"י מספר פתוגני קרקע ,ביניהן נבילה של נבטים הנגרמת ע"י P. ultimumו R. solani -בכותנה ) Howell and ,(Stipanovic, 1979, 1980יצירה אסקוספורות ע"י ,Pyrenophora tritici repentisאשר גורמת למחלת ה tan spot -בחיטה ) ,Fusarium sambucinum ,(Pfender et al., 1993אשר מדביקה תפו"א וריקבון שורש בעגבנייה הנגרם ע"י Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici ) .(Sharifi-Tehrani et al., 1998מחקרים שנעשו על מנת לסווג אוספים בינלאומיים של מיני Pseudomonasהמייצרים ,DAPGבוססו על McSpadden Gardner et al., ) BOXAIR- PCR ,(2000אנליזות חיתוך והגברה של DNAריבוזומלי ) Keel et al., 1996; Sharifi-Teherani et ,(al., 1998מיקמו את Pf-5בקבוצה Aשל מייצרי .DAPGחברי קבוצה זאת הם פחות תחרותיים בריזוספרה מאשר חברי קבוצות אחרות ,כגון קבוצות Dו ,B -כפי שהודגם ע"י P. fluorescensזנים Q8rl-96ו ,Q2-87 -בהתאמה ) .(Weller et al., 2002תבדיד Pf-5הוא ה- BCAהראשון שכל הגנום שלו רוצף ומכיל כ 7 -מיליון זוגות בסיסים (GenBank accession No. ).(Paulsen et al., 2005) CP00007.1 Q8rl-96 Pseudomonas fluorescens .2.4.3ו Q2-87 -שימשו כמקבלי הגנים prn P. fluorescensתבדיד Q8rl-96ותבדיד Q2-87בודדו מקרקע מדכאת של המחלה take allליד Quincy Washבארה"ב בשנת 1996ו 1987 -בהתאמה .התבדידים ידועים כאנטגוניסטים בעלי טווח פעולה רחב כנגד פתוגנים פטרייתיים וחיידקיים של צמחים .תבדידים אלה מייצרים ,DAPGאנטיביוטיקה פוליקטידית האחראית על הדיכוי הטבעי של מספר קרקעות כנגד מחלת ה take all -בחיטה ,חולי נופל הנגרמת ע"י Pythiumבסלק סוכר וריקבון שורש שחור בטבק ) .(Keel et al., 1992; Shanahan et al., 1992; Thomashow and Weller, 1998מיון זני Pseudomonasהמייצרים DAPGמקרקעות ברחבי העולם ע"ב ייצור אנטיביוטיקות הראה כי תבדידים אלה שייכים למייצרי DAPGו ,HCN -אך לא למייצרי McSpadden ) pyoluteorin .(Gardener et al., 2000יצרני ה pyoluteorin -ידועים כקבוצה יותר מגוונת ומכילה BACיותר 11 יעילים ) .(Sharifi Tehrani et al., 1998בהסתמך על BOXAIR- PCRו RLFP -של הגן ,phlD נמצא כי Q8rl-96שייך לגנוטיפ ,Dאשר ידוע כיותר תחרותי בריזוספרת חיטה מאשר גנוטיפים אחרים המייצרים ,(McSpadden Gardener et al., 2000; Mavrodi et al., 2001) DAPGבעוד שהתבדיד Q2-87משויך לגנוטיפ ,Bהנמנה בין הגנוטיפים הפחות אגרסיביים מבחינת אכלוס השורש ) .(McSpadden Gardener et al., 2000; Mavrodi et al., 2001; Weller et al., 2007זן Q8rl-96מבסס ומתחזק אוכלוסיות גדולות )עד (107 CFU/grבריזוספרת החיטה גם כשניתנות מנות קטנות של החיידק ) ,(Raaijmakers and Weller, 2001דבר האופייני לגנוטיפ Dומבדילו מפסאודומונדים ריזוספרים אחרים כמו Q2-87וRaaijmakers et al., 1997; ) Pf-5 - .(Raaijmakers and Weller, 2001; Landa et al., 2003היברידיזצית הפחתה הראתה כי Q8rl-96מכיל אלמנטים גנטיים שלא נמצאים ביצרני DAPGאחרים )למשל P. fluorescensזן ,(Q2-87אשר כנראה תורמים ליכולתו היוצאת דופן לפוטנציאל האכלוס האגרסיבי שלו ).(Mavrodi et al., 2002 .2.5מחלת המודל בניסויי חממה כמודל נבחרה מחלת החולי נופל ,הנגרמת ע"י הפטרייה R. solani .Rhizoctonia solaniשייכת לסוג פטריות הריזוקטוניה ,שהן שוכנות קרקע טיפוסיות הנפוצות ברוב הקרקעות ,בכל היבשות. בחלקן הגדול הן פתוגניות לצמחים וגורמות לנזקים חמורים בגידולים חקלאיים רבים ,אך הן מתפתחות גם כפטריות ספרופיטיות בקרקע .להפרשות שורשים )העשירות בסוכרים ,ח' אמינו וכו'( יש תפקיד חשוב בפתוגנזה של ריזוקטוניה והתפטיר נמשך אל מקור ההפרשות .בהגיעו אל שורש הפונדקאי מסתעף התפטיר ,ובאתרים המתאימים לחדירה ) ,(infection sitesבהם ישנם מנגנוני הכרה בין הפתוגן לפונדקאי ,מצטרפים תאים צפופים של הפטרייה למבנים הנקראים "כריות הדבקה" ,מפרישים אנזימים מפרקי דופן ותאית עד לפירוקה של למלת הביניים ודופן התא ולחדירה. המחלה הידועה והנפוצה ביותר אותה מחוללת ריזוקטוניה היא מחלת החולי נופל .מחלה זו תוקפת זרעים ונבטים במנבטות ובשדה ,לפני או אחרי הצצה .לפני ההצצה ,ניכרת המחלה בתמות הזרעים .אחר הצצה ,מתבטאת המחלה בהצטמקות אופיינית של אזור צוואר השורש ,עקב התמוססות הרקמה הנגועה ע"י אנזימים פקטוליטיים וצלוליטיים ,כתוצאה מכך נופל הנבט ומת. במקרים רבים ,מקבל האזור הנגוע גוון חום ,ובצמחונים נגועים מופיעים כתמים חומים באזור קו הקרקע ,בגודל ובעומק שונים בהתאם לרמת המחלה ).(Garcia et al., 2006 12 חומרים ושיטות.3 פלסמידים ותנאי גידול, זני חיידקים.3.1 Pf-5 התבדידים.1 הזנים החיידקיים והפלסמידים בהם נעשה שימוש מצוינים בטבלה מספר de ) 4C5 ,(Raaijmakers and Weller, 2001) Q8r1-96 ,(Howell and Stipanovic, 1979) King's B ( גודלו במצע נוזלי או אגר שלPierson et al., 1994) Q2-87 -( וSouza et al., 2003 אשר שימשו,Escherichia coli זני. 28°C ( בטמפ' שלKing et al., 1954) ,2 ' טבלה מס,(KB) .37°C נוזלי ואגר בטמפרטורה שלLuria Bertani גודלו במצע,כמאכסנים לבניית הקסטות נעשה שימוש.Rhizoctonia solani ( שימש לגידול הפטרייהPDA/B) Potato Dextrose (10 µg/ml) גנטמיצין,(15 µg/ml) טטרציקלין,(100 µg/ml) באנטיביוטיקות אמפיצילין . אלא אם צוין אחרת,(20 µg/ml) וריפאמפיצין חיידקים ופלסמידים אשר נחקרו במסגרת העבודה הנוכחית:1 'טבלה מס תכונות רלוונטיות /Reference פלסמיד/חיידק מקור J. Loper Rifr, Prn+, DAPG+ r L. P. fluorescens Pf-5 + P. fluorescens Q8r1-96 Rif , DAPG Thomashow עבודה זוRifr, Gmr,DAPG+, Prn+ P. fluorescens Q8r196#C25 r r + עבודה זוRif , Gm ,DAPG , Prn + P. fluorescens Q8r196#C82 Rifr, DAPG- J. P. fluorescens Q8r1-96 DAPG- mutant#4C5 Raaijmakers עבודה זוRifr, Gmr, Prn+ P. fluorescens 4C5#C62 עבודה זוRifr, Gmr, Prn+ P. fluorescens 4C5#C551 Rifr, Gmr,DAPG+, Prn+ L. P. fluorescens Q2-87 Thomashow עבודה זוRifr, Gmr,DAPG+, Prn+ P. fluorescens Q287#C36 r r + עבודה זוRif , Gm ,DAPG , Prn + P. fluorescens Q287#C222 Stratagene 13 MRF’ D(mrcA) 183 D(mrcCB-hsdSMR- E. coli XLI-Blue mrr)173 supE44 recA1 endA1 gyrA96 thi- 1 relA1 [proAB+lac1q lacZDM15 Tn10 Tcr Promega F’ traD36 proA+ proB+ lacP lacZM15/rec E. coli JM109 Al gyr A96 thi hsdR17 supE44 relAl ∆ (lac-proAB) mcrA O. Højberg Kmr E. coli SM10 O. Højberg Kmr E. coli S17 λpir Stratagene Ampr, E. coli cloning and expression pBluescript vector L. Tcr, T7, SP6 and tac promoters ColE1 Thomashow f1ori עבודה זוTcr, Prn+ O. Højberg pAlter-EX1/prnABCD r Transposon, Gm r pAlter-EX1 + עבודה זוGm , Prn miniTn7ΩGm miniTn7ΩGm/tac- prnABCD O. Højberg Helper plasmid, Ampr pUX-BF13 Rif: rifampicin, Amp: ampicillin, Tc: tetracycline, r: resistant, Km: kanamycin Gm: gentamycin מצעי מזון:2 'טבלה מס /יצרן (g/l dH2O) הרכב Reference Difco Bacto beef extract, 3; Bacto peptone, 5 Difco King et al., 1954 Potato Starch, 4; Dextrose, 20 Proteose Peptone (NO3), 20; K2HPO4, 1.5; MgSO4*H2O, 1.5; Glycerol 10 ml Sambrook et NaCl, 5; Bacto yeast al., 1989 extract, 5; Bacto tryptone, 10 14 פונקציונליות מצעי גידול גידול חיידקים NB (Nutrient Broth) גידול חיידקים ופטריות PDB (Potato Dextrose Broth) מבדיל בין חיידקים המפרישים KB ( או לא מפרישים פיגמנטיםKing’s B) פלורוסנטים )מושבות זוהרות מצע דל בברזל,(בצבע ירוק זוהר גידול חיידקים LB (LuriaBertani) .3.2הפקת DNAגנומי הפקת DNAגנומי מכל סוגי החיידקים בהם נעשה שימוש בעבודה זו נעשתה באופן הבא: החיידק גודל בטלטול במשך לילה בתוספת האנטיביוטיקה מתאימה 1.5 ,מ"ל מהתרבית סורכזו במהירות 8000 rpmבמשך דקה והנוזל העליון נזרק .התאים הורחפו ב 400µl-בופר ,TEלתאים הוספו 10% SDS 50 µlו 50 µl -של פרוטאוקינאז Kוהם הודגרו למשך שעה ב .37ºC -לאחר מכן הנוזל הועבר 3-5פעמים דרך מחט 26Gומוצה פעמיים עם 500 µlשל פנול:כלורופורם ביחס של 1:1וסורכז ב 12000 rpm -למשך 5דקות ,כאשר בכל מיצוי נלקחה הפאזה העליונה בלבד. לאחר מכן בוצעה השקעה אתנולית ע"י הוספת 3M NaAcבנפח של עשירות מהנוזל הכללי ו- 100%אתנול קר בנפח כפול מהנוזל הכללי .הנוזל הודגר למשך 15דקות בטמפ' של -20ºCוסירכוז למשך 10דקות במהירות של .12000 rpmלאחר מכן בוצעה שטיפה עם 1מ"ל של 80%אתנול קר וזריקת כל הנוזל ,המשקע הורחף ב 100µl -של RNAse Aוהודגר למשך 15דקות ב.37ºC - בוצעה הדגרה סופית ב 65ºC -למשך 10דקות. .3.3הפקת DNAפלסמידי DNAפלסמידי הופק ממושבה בודדת שגודלה במשך לילה במצע LBב 37°C -בתוספת האנטיביוטיקה מתאימה עם הקיט Roche Diadnostics ) High Pure Plasmid Isolation Kit (GmbH, Germany .3.4ריאקציות PCR 3.4.1ריאקציות PCRלמושבות בודדות DNA -הופק ע"י הרחפת מושבה מצלחת LAבת יום או יומיים ,ב 50µl -תמיסת ליזיס ) (0.05M NaOH, 0.25% SDSוהרתחה למשך 5דקות ) .(Raaijmakers et al., 1997לשם שימוש ב ,DNA-עבר הליזאט סירכוז ב12,000 rpm - )צנטריפוגת (Biofuge pico Heraeus, Kendroלמשך דקה ולאחר מכן דולל הנוזל העליון פי 50 במים סטריליים ,לכל ריאקצית PCRנלקחו 5µlמהליזאט DNAהמדולל .הריאקציה התרחשה בנפח כולל של ,25µlהמכילה 200 µM ,1.5 mM MgCl2מכל בסיס דאוקסי-נוקלאוטיד טריפוספט ) 10 pmol ,(dATP, dCTP, dGTP, dTTPמכל פריימר(Promega) 1U Taq DNA , ,polymeraseוליזאט .DNA .3.4.2ריאקציות PCRפלסמידי וגנומי -ה DNA-הופק כפי שמתואר בסעיפים 3.2ו 3.3 -לעיל. הדוגמאות הוכנו באופן זהה לליזאט מהמושבה ,אך נלקח 1µlבלבד לריאקציה ושאר הנפח הושלם עם מים .הדוגמאות כוסו בשמן מינרלי והוכנסו למכשיר PTC100 programmable ) .thermal controller (MJ Research Inc., Watertown, MAתוצרי הריאקציה הופרדו ונצבעו בג'ל 1%אגרוז בבופר Tris-acetate-EDTA*0.5המכיל אתידיום ברומיד ) ,(1 mg/mlכאשר להערכת המשקל המולקולרי שימשו .(MBI Fermentas) Ladder Mix 5µl 15 טבלה מס' :3תוכניות הרצה בPCR - פירוט התוכנית תוכנית (1) 94ºC-3 min (2) 60ºC-2 min (3) 72ºC-2 min (4) 94ºC-30 sec (5) 60ºC-30 A sec (6) 72ºC-2 min (7) go to 4X29 (8) 72ºC-10 min (9) hold at 10ºC (1) 94ºC-3 min (2) 55ºC-2 min (3) 72ºC-2 min (4) 94ºC-30 sec (5) 55ºC-30 B sec (6) 72ºC-2 min (7) go to 4X29 (8) 72ºC-10 min (9) hold at 10ºC טבלה מס' :4פריימרים אשר שימשו לריאקציות PCRבעבודה הנוכחית שם הפריימר מקור BamHI-ATG- עבודה זו prnA XbaI-R6164- התוכנית רצף ATG GAT CCA TGA ACA AGC A CAA TCA AGA ATA TCG TCA עבודה זו ATT CTA GAC ACG AGT TGC prnABCD A AAC AGC CAG ATG prnC-F2759 L. Thomashow GCG AAC GAA CAC GAT AGG AA A prnC-R4222 L. Thomashow CGT CAA TGA GGG CGT GAA T A glmS-F1592 עבודה זו CAA GTC CAA CCT GCA GGA A B TnL-R72 עבודה זו TGT AGC GTC GTA AGC TAA A TnR-F88 עבודה זו prnA-R33 עבודה זו TAC GAA GAA ATC AGT CCA GTT ATG A CTG GTG A CAG GAT GAC GAT ATT CTT GAT A TGG prnD-F4721 עבודת הגמר של TGC ATC CAG TGC CCG TTT A, B מוחמד בימורוו prnA-R841 עבודת הגמר של GGC CCA GCA TCG GAA TCT T A, B מוחמד בימורוו .3.5יצירת חיידקי E. coliזן XLI-Blueקומפטנטים החיידקים גודלו בתרבית של 3מ"ל LBעם האנטיביוטיקה המתאימה במשך לילה .לאחר מכן 2 מ"ל מתרבית זו הוספו ל 55 -מ"ל LBוגודלו בטמפ' של 37ºCעד ל OD -של ,0.8מעתה כל המשך העבודה נעשתה בקרח .התרבית הועברה לשתי מבחנות צנטריפוגה בנפח של 25מ"ל וסורכזה במהירות של ,3500 rpmטמפ' ,4ºCלמשך 10דקות .הנוזל העליון נזרק והתאים הורחפו ב50 - מ"ל מים מזוקקים קרים ,סורכזו בשנית ,והורחפו ב 25 -מ"ל של מים מזוקקים קרים ,בשלב זה שתי המבחנות אוחדו לאחת וסורכזו שוב .לאחר זריקת הנוזל העליון הוספו 10מ"ל של 10% גליצרול קר ,התאים הורחפו היטב וסורכזו .לאחר הסירכוז התאים הורחפו שוב באותו הנוזל 16 וחולקו ל 40 -מבחנות בנפח 0.5מ"ל ) 40µlכ"א( והועברו מיד לחנקן נוזלי ומשם הועברו לאחסון ב.-70ºC - .3.6יצירת חיידקי E. coliזן SM10קומפטנטים שיטה זו בוצעה במטרה להפוך את החיידק E. coliזן SM10הנושא את פלסמיד העזר pUX- BF13לקומפטנטי .בתחילה החיידקים גודלו על צלחת LBעם אמפיצילין למשך לילה .לאחר מכן גורדו מן הצלחת למבחנת אפנדורף המכילה 1מ"ל 10%גליצרול קר והורחפו .התאים סורכזו ב- 2ºCלמשך 5דקות במהירות של .14000 rpmשלב זה חזר על עצמו פעמיים נוספות ומייד בסיום התהליך בוצעה אלקטרופורציה. .3.7אלקטרופורציה האלקטרופורציה נעשתה ע"י הפעלת זרם חשמלי בעוצמה של 1.35 Kvבמכשיר מדגם transPorator Plusשל חברת BTXעל 40µlתאים קומפטנטים ,אליהם הוסף הפלסמיד הרצוי. לאחר מכן התאים הורחפו מיידית ב LB 800 µl -נקי והודגרו בטמפרטורה של 37ºCלמשך שעה או יותר. .3.8הכלאה דו-הורית – biparental mating השיטה שנבחרה ליצירת הטרנספורמנטים היא הכלאה דו-הורית – .biparental matingלפי שיטה זו גודלו החיידקים במשך לילה במצע נוזלי עם אנטיביוטיקות מתאימות ונשטפו מהאנטיביוטיקה ע"י סירכוז והוספה של מצע חדש ללא אנטיביוטיקה .לאחר השטיפה הועבר נפח שווה מכל תרבית )חיידק תורם וחיידק מקבל( למבחנת אפנדורף .לאחר ערבוב הועברו התרחיפים להדגרה של שעה ב .28ºC -בשלב הבא התרחיף המעורבב הושם על ממברנת ניטרוצלולוז 0.45µm שהושמה על צלחת LAנטולת אנטיביוטיקה למשך לילה .למחרת גורדה תרבית החיידקים מהממברנה והורחפה ב 100µl -מים סטריליים .לתרחיף שהתקבל בוצעה סדרת מיהולים )כל מיהול פי 10מהקודם( ושלוש טיפות מהמיהולים נזרעו על צלחת LAסלקטיבית ,הכוללת את האנטיביוטיקות ריפאמפיצין וגנטמיצין לבידוד הרקומביננטים .במקרה של תוצאה חיובית, כלומר קבלת גידול על הצלחת הסלקטיבית ,הועברה מושבה בודדת לצלחת זהה על מנת לקבל גידול נקי ככל האפשר והמצאות המחדר אומתה ע"י .PCR .3.9מיצוי מקטע מג'ל לשם מיצוי מקטע PCRמג'ל ,הוכן ג'ל אגרוז 1%עבה מהרגיל ונצפה על שולחן .UVהמקטע נחתך מהג'ל ומוצה בעזרת הקיט .(Promega) Wizard SV Gel and PCR Clean-up System .3.10הורדת זרחן )דפוספרילציה( לאחר חיתוך של וקטור בעזרת אנזימי חיתוך בוצע תהליך של הורדת זרחן מקצוות הוקטור על מנת שלא יסגר על עצמו בחזרה בעזרת האנזים shrimp alkeline phospataseתוצרת MBI (Vilnius, Lithuania) Fermentasבטמפרטורה של 37°Cלמשך חצי שעה. 17 .3.11ליגציה על מנת לחבר בין הוקטור הרצוי למחדר בוצעה ליגציה ביחס של ) 1:3מחדר :וקטור( תוך כדי שימוש באנזים ליגאז תוצרת Fermentasוהדגרה למשך לילה בטמפרטורה של .16ºCבתום ההדגרה בוצעה אינאקטיבציה בטמפ' של 65ºCלמשך 10דקות וסירכוז תערובת הליגציה במשך דקה במהירות .11000 rpmלאחר מכן תוצרי הליגציה הוחדרו לחיידקי המטרה באלקטרופורציה. .3.12שיבוט הגנים prn בידוד דנ"א גנומי ,חיתוך באנזימי חיתוך ,אלקטרופורזה בג'ל ואלקטרופורציה בוצעו בהליכים סטנדרטיים ) .(Sambrook et al., 1989אנזימי החיתוך נרכשו מVilnius, ) MBI Fermentas - (Lithuaniaונעשה בהם שימוש עפ"י המלצת היצרן .על מנת לשבט את אופרון הפירולניטרין לתוך גנום החיידקים Q8rl-96ו ,Q2-87 -נבנו שתי קסטות המכילות את צבר הגנים .prnהקסטות נבדלות ב 186 bp -הנמצאים בין הפרומוטור לקודון התחלת השעתוק בקסטה הראשונה ,לפירוט מלא על אופן השיבוט ,אנזימי החיתוך ,וקטורים ופלסמידים בהם נעשה שימוש ראה פרק תוצאות סעיף .4.1 .3.13פעילות אנטי-פטרייתית in vitro על מנת לבחון יכולת אנטגוניסטית של החיידקים כנגד R. solaniנזרעו החיידקים כפס במרכז צלחת PDAוהודגרו ב 28ºC -למשך לילה .לאחר לילה הושמו דסקיות )קוטר 0.5ס"מ( של פטרייה משני צדדיו )איור מס' .(3הצלחות עברו הדגרה בחושך בטמפרטורת 28oCעד אשר התקבל תפטיר מאוחד של שתי הדסקיות בצלחת ללא החיידק )צלחת הביקורת אשר בה הושם מים במקום תרבית חיידקים( .מרחקי "בלימת" גידול התפטיר נמדד כממוצע שני המרחקים ,מחזית גידול החיידק לחזית גידול התפטיר. גידול החיידק דסקית הפטרייה מרחק 1ס"מ מדופן הצלחת איור מס' :3שירטוט של צלחת פטרי עם תרבית זוגיות. .3.14מיצוי אנטיביוטיקה ,אנליזת TLCוHPLC- .3.14.1הכנת מיצוי כלורופורום הפרוטוקול בוצע לפי ) Chernin et al., (1996עם שינויים מעטים .החיידק עבר הדגרה בצלחות KBב ,28ºC -לאחר חמישה ימים המצע עבר מיצוי כלורופום ושטיפה ב ,0.1M K2HPO4 -בעזרת משפך מפריד )כשנפח השטיפה לפחות פי שלוש מנפח הפזה האורגנית( .לאחר השטיפה ,הפזה האורגנית עברה נידוף ברוטואופורטור ) (RE111 Switzerland Buchiבטמפרטורת אמבט של 18 400Cעד לייבוש מלא והרחפה באצטוניטריל .על מנת לבחון את היכולת האנטגוניסטית של האנטיביוטיקה הגולמית נערך מבחן ביולוגי בצלחת. .3.14.2הכנת מיצוי אתיל אצטט הפרוטוקול בוצע לפי Bonsall et al., 1997עם שינויים מעטים .החיידקים גודלו במצע KBנוזלי מדולל 1:2למשך 48שעות בטמפ' של .28ºCהתרבית מוצתה ע"י אתיל אצטט פעמיים ונוקתה עם מגנזיום אנהידרידי בעזרת משפך מפריד .לאחר השטיפה ,הפזה האורגנית עברה נידוף ברוטואופורטור ) (RE111 Switzerland Buchiבטמפרטורת אמבט של 400Cעד לייבוש מלא והרחפה באצטוניטריל .על מנת לבחון את היכולת האנטגוניסטית של האנטיביוטיקה הגולמית נערך מבחן ביולוגי בצלחת. .3.14.3הפרדה בפלטת TLC דוגמת האנטיביוטיקה הגולמית והאנטיביוטיקה) Pyrrolnitrin -כסמן( הופרדו בממיסים כלורופום:מתנול ) (1:19על גבי פלטת זכוכית המצופה סיליקהMacherey-) 0.25 mm G-25 , (Nagelבטמפרטורת החדר .לאחר ייבוש ,הכרומטוגרפיה נעשתה בעזרת ריאגנט ארליך ) 2% para ,dimethyl aminobenzaldehydeבתוך (5N HClלקבלת ריאקצית צבע כחולה לנוכחות ,Prn וריאקצית צבע ורודה עבור .DAPG .3.14.5אנליזת(High Pressure Liquid Chromatography) HPLC דוגמאות האנטיביוטיקה גולמית והאנטיביוטיקה ,Pyrrolnitrinאשר שימשה כסמן ,הורצו לפי ) Corbell and Loper, (1995איזוקרטית עם בופר שהכיל 45%מים 30% ,אצטוניטריל ו25% - מתנול בקלונה C18מסוג ) ,reverse phase O.D.S (5 µm, 250 x 4.6mmתוצרת ”Luna Phenomenexבמערכת (Spectra) HPLCבקצב זרימה של .1 ml/minהזיהוי נערך באורך גל של .225 nmפרקציות מההרצה נאספו ,יובשו ב speed vac -והומסו באצטוניטריל לשם עריכת Bioassayבצלחת. .3.15מבחן ביולוגי כל אחד ממיצויי האנטיביוטיקה הגולמית נבחן לנוכחות המצאות החומר הפעיל על ידי ערבוב המיצוי הגולמי ) (10µlב PDA 2 ml-עליו נזרעה דיסקית תרבית צעירה בת שלושה ימים של R. ,solaniעיכוב צמיחת התפטיר היווה הוכחה לנוכחות חומר פעיל. .3.16ניסויי חממה כמודל לניסוי שימשה מחלת החולי נופל ) (damping- offבשעועית הנגרמת ע"י הפטרייה R. .solaniהפטרייה גודלה במצע PDBבמשך 5-7ימים ,ב .28ºC -אחר יבוש קל ,נשקל התפטיר לכמות המספיקה ל 0.03 gr -לעציץ ) 0.5 kgחול רחובות( לא כולל טיפולי ביקורת נביטה ,כאשר כמות זו של פטרייה נקבעה בניסויי כיול מקדימים .התפטיר רוסק בבלנדר ) ,(toraxב 30 -מ"ל מי ברז ,ובחממה עורבב תרחיף הפטרייה בכמות חול המתאימה לשליש מכל עציצי הניסוי ,מלבד טיפולי ביקורת נביטה .בכל עציץ נזרעו 10זרעי Phasolus vulgarisצהובה זן "גלוריה" )חברת בן 19 שחר מ .בע"מ( בעומק 3ס"מ ,כשליש עציץ .הזריעה התבצעה ע"י מילוי העציץ החול עד לשני שליש גובה ,הנחת הזרעים ולאחר מכן הוספת שליש החול השלישי ,אשר הוא השליש המאולח. לכל חיידק נעשו 3-5ניסויי חממה ,כאשר בכל ניסוי היו חמש חזרות לכל טיפול. החיידקים גודלו במשך לילה במצע LBבנפח של 3מ"ל ,והועברו למצע NBלמשך לילה נוסף בנפח המתאים )מספר עציצים* 20מ"ל תרחיף חיידקים( .תרבית החיידקים סורכזה והורחפה בנפח זהה של מי ברז .כל עציץ הושקה ב 20 -מ"ל תרחיף ביום הזריעה ושנית ביום השביעי לניסוי. קביעת אחוזי מחלה :נעשתה בסוף כל ניסוי ,לאחר 12-14ימים ,ע"י ספירת הצמחונים החולים בכל עציץ וחושבו אחוזי המחלה בדרך הבאה: ,(Y-X)*100=%Dכאשר =Xממוצע נביטה בטיפול =Y ,מספר נבטים חולים בטיפול. כדי לקבל את השפעת הטיפול על ההפחתה ברמת המחלה )באופן יחסי לביקורת המחלה המחושבת כ ,(100% -כלומר ) ,%Disease reduction ,(%DRחושב כך: =%DRאחוז ההפחתה ברמת המחלה= *100אחוז מחלה בטיפול אחוז מחלה בביקורת מחלה 100- .3.16.1שרידות החיידקים בקרקע בתנאים של ניסויי החממה כדי לעקוב אחר שרידות החיידקים בקרקע בתנאי החממה ,הוקצה עציץ עם חול רחובות לכל תבדיד שהושקה ב 20 -מ"ל של תרחיף התבדיד .נאסף 1גר' חול ,הורחף ב 10 -מ"ל מים סטריליים ועורבב בחוזקה ) 30שניות ורטקס( .אחר ,בוצעה ספירת מיהולים ע"י דילולים וזריעה על מצע סלקטיבי המכיל ריפאמפיצין .דגימות חול נאספו מהעציצים בשש נקודות זמן :ביום הזריעה, ביום השביעי לפני ואחרי ההשקיה עם מנה שנייה של חיידקים ,לאחר שבועיים ,שלושה שבועות וארבעה שבועות. 3.16.2בדיקת השפעת חיידקי המקור והטרנספורמנטים על אוכלוסיית החיידקים הטבעית באדמת חממה על מנת להעריך מהי השפעת החיידקים המהונדסים על אוכלוסיית הקרקע לעומת חיידקי המקור ובכלל ,הוקצה עציץ עם חול רחובות לכל תבדיד שהושקה ב 20 -מ"ל של תרחיף התבדיד .נאסף 1 גר' חול ,הורחף ב 10 -מ"ל מים סטריליים ועורבב בחוזקה ) 30שניות ורטקס( .אחר ,בוצעה ספירת מיהולים ע"י דילולים וזריעה על מצע NAומצע סלקטיבי המכיל ריפאמפיצין .דגימות חול נאספו מהעציצים בשש נקודות זמן :ביום הזריעה ,ביום השביעי לפני ואחרי ההשקיה עם מנה שנייה של חיידקים ,לאחר שבועיים ,שלושה שבועות וארבעה שבועות .מספר המושבות מצלחות הNA+ - Rifהופחתו ממספר המושבות על צלחות ה NA -ונבחנה קינטיקת חיידקי הקרקע בחול רחובות בתוספת חיידקי המקור ובתוספת החיידקים המשובטים. .3.17ניתוח סטטיסטי כל הניתוחים הסטטיסטים נעשו בעזרת תוכנת .(SAS Institute Inc. Cary, NC) JMP8הניתוח הסטטיסטי נעשה ע"י מבחן ,Tukey-Kramerכאשר תבדידי המקור נמדדו יחסית לטרנספורמנטים המתאים להם. 20 .4תוצאות 4.1שיבוט וביטוי הגנים prn אופרון הפירולניטרין נלקח מהחיידק P. flourescensתבדיד .Pf-5תבדיד זה מייצר באופן טבעי פירולניטרין והגנום שלו מרוצף לחלוטין ,דבר המקל על בניית הקסטה הרצויה .על מנת להחדיר את אופרון הפירולניטרין לגנום התבדידים Q8rl-96ו ,Q2-87 -גנום Pf-5נחתך קרוב ככל האפשר לאופרון ,תהליך זה גרם לעודף של upstream 186 bpלקודון תחילת השיעתוק .על מנת לבדוק האם עודף בסיסים זה משפיע באופן כלשהו על ביטוי האנטיביוטיקה נבנתה קסטה נוספת שבה האופרון הוגבר בשלמותו ע"י PCRללא 186 bpהעודפים .כך בעבודה זו נבנו שתי קסטות אוניברסליות כאשר ההבדל ביניהן הוא הסמיכות בין קודון תחילת שעתוק האופרון לפרומוטור. על כן בעבודה זו מוצגות שתי קסטות ,האחת ,קסטה Aבה ישנם 186בסיסים המפרידים בין הפרומוטור לקודון התחלת השעתוק ,בעוד שבקסטה ,Bקודון תחילת השעתוק נמצא בצמוד לפרומוטור. .4.1.1אופן בניית קסטה :(miniTn7-ΩGm/ tac-prnABCD) A אופרון ה Prn -נחתך מהוקטור ) pALTER-EX1/tac-prnABCDעבודת הגמר של מוחמד בימרוו, (2006בעזרת אנזימי החיתוך NotIו .EcoRV -מקטע המחדר באורך ~5.9 Kbנוקה מג'ל אגרוז. הוקטור (Koch et al., 2001) pBK-miniTn7-ΩGmעוכל בעזרת אנזימי החיתוך NotIו,SmaI - עבר דפוספרילציה וליגציה עם המחדר .tac-prnABCDלאחר מכן ,תערובת הליגציה עברה אלקטרופורציה לחיידקי ,E. coliזן ,XLI-Blueעל מנת לקבל יעילות טרנספורמציה גבוהה. הפלסמיד ההיברידי הופק והוחדר ע"י אלקטרופורציה לחיידקי ,E. coliזן SM10המכילים את פלסמיד העזר ,(Koch et al., 2001) pUX-BF13אשר הודגרו למשך לילה בטמפ' של 37°Cעל צלחות LBבתוספת גנטמיצין .המושבות הטרנספורמנטיות מיונו ע"י PCRכפי שמתואר ע"י ) .Raaijmakers et al. (1997לבסוף ,הפלסמיד ההיברידי הוחדר לחיידקי P. fluorescens תבדידים 4C5 ,Q8r1-96ו Q2-87 -ע"י הכלאה דו -הורית ,אשר הפיקו את החיידקים הרקומביננטים ,C36 ,C62 ,C25בהתאמה )איור מספר .(3 pAlter-Ex1/tac-prnABCD pBK-miniTn7ΩGm NotI SmaI NotI tac EcoRV Ligation E. coli SM10/pUX- BF13 mating electroporation pBK-miniTn7ΩGm/tac-prnABCD hybrid plasmid Q8r1-96, 4C5, Q2-87 derivatives containing tac-prn cassette איור מס' :4אופן העברת האופרון tac-prnABCDלחיידקי P. fluorescens 21 לשם הוכחת המצאות אופרון הפירולניטרין בחיידקים המשובטים בוצעו מספר .PCRבחיידקים המכילים את קסטה ) Aבעלת עודף 186bpבין קודון תחילת השעתוק לפרומוטור( בתחילה הוגבר מקטע בגודל 1.5 Kbמהגן prnCע"י שימוש בצמד הפריימרים prnC-F2795וprnC-R4222 - בתוכנית ) Aאיור מס' 6בארות .(2+5בשלב השני ,על מנת להבין את כיווניות הקסטה ושלמות אזור ה '3וה '5 -בוצעו מספר .PCRעל מנת לקבוע את שלמות איזור ה '3 -נעשה שימוש עם צמד הפריימרים TnR-F88ו prnA-R841 -בתוכנית ) Aאיור מס' .(5ניתן לראות בנד ברור בגודל ~1.7Kbבחיידק ) Q8r1-96#C25באר מס' (2המכיל את קסטה Aלעומת חוסר בנד בחיידק המקור ) Q8rl-96באר מס' .(1לקביעת שלמות אזור ה '5 -נעשה שימוש בצמד הפריימרים TnL- R72ו prnDF4721 -בתוכנית ) Aאיור מס' .(5שוב ניתן לראות בנד ברור בגודל ~ 2Kbבחיידק ) Q8r1-96#C25באר מס' (3המכיל את קסטה Aלעומת חוסר של בנד בחיידק המקור Q8rl-96 )באר מס' .(4עם קבלת תוצאות אלה הוסק כי קסטה Aבנויה כמתואר באיור מס' .7 2 Kb 1.7 Kb 1.5 Kb 4 3 M 2 1 איור מס' :5הגברת אזורי ה) 3' -בארות (1+2וה5' - )בארות (3+4של קסטה ,C25 -2 ,Q8r1-96 -1 .A Q8r1-96 -4 ,C25 -3 EcoRV GlmS 6 5 4 3 MCS prnDCBA ~700 bp 1 איור מס' :6הגברת מקטע באורך ~1.5Kbמהגן -1 .prnC ,4C5 -4 ,Q8r1-96#C82 -3 ,Q8r1-96#C25 -2 ,Q8r1-96 4C5#C551 -6 ,4C5#C62 -5 tac promotor TnR 2 M 186 bp Gmr TnL ~5.9 Kb ATG- start codon איור מס' :7סכמה של אופן החדרת וכיווניות קסטה Aבגנום החיידקים הטרנספורמנטים 22 .4.1.2אופן בניית קסטה :(miniTn7-ΩGm-tac-ATG-prnABCD) B מכיוון שישנם 186bpעודפים בין קודון תחילת השעתוק לפרומוטור בקסטה Aנבנתה קסטה חדשה ללא מרווח עודף זה )איור מס' ,(9במטרה לבדוק האם יש שיפור ביכולות ייצור הפירולניטרין וההדברה כאשר מצמידים את קודון תחילת השעתוק לפרומוטור .הקסטה נבנתה ע"י הגברה של המחדר המכיל את צבר הגנים prnהוגבר ב PCR -ע"י KOD hot start DNA Polymeraseוהפריימרים BamHI-ATG-prnAו ,XbaI-R6164-prnABCD -המכילים את אתרי החיתוך של BamHIו XbaI -מקודון ההתחלה ATGמהפלסמיד ההיברידי ) pBluescrtipt/prnABCDעבודת הגמר של מוחמד בימרוו .(2006 ,תוצר ה PCR-נוקה מג'ל אגרוז .1%ליגציה בוצעה עם הוקטור ,(Stratagene) pBluescriptשעוכל עם SmaIועבר דפוספורילציה .תערובת הליגציה עברה אלקטרופורציה לחיידקי E. coliזן .XLI-Blueקלונים משובטים מיונו ע"י PCRכפי שמתואר ע"י ) .Raaijmakers et al., (1997הפלסמיד ההיברידי pBluescript/tac-prnABCDעוכל עם אנזימי החיתוך BamHIו NotI -להמשך שיבוט .הפרגמנט החתוך נוקה מג'ל ועבר ליגציה לוקטור ,pAlter-EX1אשר עבר חיתוך עם אנזימי החיתוך BamHIו ,NotI -על מנת לבטא את אופרון ה prn-תחת בקרת הפרומוטר .tacפלסמיד זה עבר אלקטרופורציה אל חיידקי E. coliזן JM109ומושבות חיוביות מיונו ע"י זריעה על צלחות LB עם טטרציקלין .על מנת לוודא נוכחות prnבוצע PCRעם הפריימרים הסטנדרטיים של prnC )טבלה מס' (4על מושבות חיוביות .בכדי לבנות את הקסטה האינטגרטיביתminiTn7-ΩGm-tac- ,ATG-prnABCDהפלסמיד ההיברידי pAlter-EX1-tac-prnABCDעוכל עם אנזימי החיתוך EcoRVו StuI -והוחדר לטרנספוזון ,(Koch et al., 2001) pBK-miniTn7-ΩGmשעוכל עם ~2Kb ~1.2Kb M 4 3 2 1 איור מס' :8הגברת אזור ה 3' -בארות (3+4וה) 5'-בארות (1+2 בחיידקים המכילים את קסטה 1 -1 .B -4 ,C82 -3 ,C551 -2 , C82 C551 .SmaIלאחר מכן הפלסמיד ההיברידי pBK- miniTn7-ΩGm/tac-prnABCDהופק והוחדר ע"י אלקטרופורציה לחיידקי ,E. coliזן SM10המכילים את פלסמיד העזר Koch et ) pUX-BF13 ,(al., 2001אשר הודגרו למשך לילה בטמפ' של 37°Cעל צלחות LBבתוספת גנטמיצין .המושבות הרקומביננטיות מיונו ע"י PCRכפי שמתואר ע"י ) .Raaijmakers et al. (1997לבסוף ,הפלסמיד ההיברידי הוחדר לחיידקי P. fluorescensתבדידים 4C5 ,Q8r1-96ו Q2-87 -ע"י הכלאה דו- 23 הורית ,אשר הפיקו את החיידקים הרקומביננטים C222 ,C551 ,C82בהתאמה )איור מספר .(4 על מנת לודא כי אכן הקסטה נכנסה בשלמותה לגנום התבדידים נעשו בדיקות PCRלהמצאות הגן המרכזי באופרון ) (prnCבהן הוגבר מקטע בגודל ~1.5Kbמהגן prnCע"י שימוש בצמד הפריימרים prnC-F2795ו prnC-R4222 -בתוכנית ) Aאיור מס' 6בארות .( 3+6בשלב השני על למנת לקבוע את שלמות איזור ה '3 -נעשה שימוש בצמד הפריימרים TnL-R72וprnA-R33 - בתוכנית ) Aאיור מס' .(8ניתן לראות בנד ברור בגודל של ~2Kbבחיידקים ) Q8rl-96#C82באר מס' (3ו) 4C5#C551 -באר מס' (4המכילים את קסטה .Bלשם קביעת שלמות אזור ה'5- XbaI-prnD-3’-primer prnD BamHI –5’-ATG-prnA primer prnB prnC ATG-prnA SmaI prnABCD-PCR product pBlueScript Ligation E. coli strain XLI Blue BamHI XbaI pAlter-Ex1 electroporation BamHI XbaI Ligation tac- prn electroporation E. coli strain JM109 איור מס' :9אופן בניית הקסטה -miniTn7/tac-ATG-prnABCDשלב א' בקסטה Bנעשה שימוש בצמד הפריימרים TnR-F88ו prnD-F4721 -בתוכנית ) Aאיור מס' .(8 ניתן להבחין בבנד ברור בגודל ~1.1Kbבחיידקים ) Q8r1-96#C82באר מס' (1ו4C5#C551 - )באר מס' .(2מתהליך זה הוסק כי קסטה Bבנויה כמתואר באיור מס' .10 MCS tac promotor GlmS TnR prnABCD Gmr TnL ~700 bp ~5.9 Kb ATG- start codon איור מס' :10סכמה ל אופן וכיווניות החדרת קסטה Bבגנום החיידקים הטרנספורמנטים 24 pBK- miniTn7Ω Gm pAlter- Ex1/tac ATG prnABCD StuI EcoRV SmaI Ligation Electroporation E. coli strain SM10/ pUX- BF13 pBK- miniTn7Ω Gm/tac-ATG-prnABCD Biparental mating hybrid plasmid Q8r1-96, 4C5, Q2-87 derivatives containing miniTn7-tac-ATG-prnABCD cassette איור מס' :11אופן בניית הקסטה -miniTn7/tac-ATG-prnABCDשלב ב' ~1.7 Kb 2 Kb 1.5 Kb M 3 2 1 איור מס' :12הגברה של מקטע באורך -2 ,Q8r1-96#C82 -1 ~1.7Kb Q2-87#C222 -3 ,4C5#C551 M 6 5 4 3 2 1 איור מס' :13הגברה של מקטע באורך -1 .2Kb -4 ,4C5#C62 -3 ,Q8r1-96 -2 ,Q8r1-96#C25 Q2-87 -6 ,Q2-87#C36 -5 ,4C5 בספרות מתואר כי הטרנספוזון miniTn7מבצע החדרה באתר החדרה ספציפי attTn7באזור לא מקודד בגנום החיידק downstreamלגן glmSהמקודד לחלבון גלוטאמין סינטאז ) Lambertsen .(et al., 2004על כן בוצעו PCRעל מנת לאשר זאת ולראות כי אכן האופרון נכנס במקום המיועד לו .לשם כך נעשה שימוש בפריימר glmS-F1592ובפריימר prnA-R841בתוכנית Bעם גנום החיידקים ,Q8r1-96#C25, Q8r1-96, 4C5#C62, 4C5, Q2-87#C36, Q2-87חיידקי המקור והטרנספורמנטים המכילים את קסטה .Aניתן לצפות במקטע בגודל 2500 bpבאיור מס' 10 בארות 3 ,1ו 5-המייצגים הגברה של DNAגנומי מהחיידקים ,4C5#C62 ,Q8r1-96#C25ו- Q2-87#C36בהתאמה ובחוסר של בנד זה בבארות 4 ,2ו 6 -שם הוטען תוצר PCRכאשר DNA 25 של תבדידי המקור 4C5 ,Q8r1-96ו Q2-87 -שימש כתבנית .ישנו במקטע נוסף בגודל 1500 bp )איור מס' 10בארות (1+4הנובע מהצמדות לא ספציפית של הפריימרים לדנ"א בתוכנית PCRזו. המקטע בגודל 2.5 Kbנשלח לריצוף ונמצא כמכיל חלק מהגן TnR ,glmSשהוא חלק המשמש כזרוע הימנית של הטרנספוזון ומקטע מהוקטור pAlter-EX1הנובע מהחיתוך באנזים הרסטריקציה EcoRVכ upstream 707 bp -לפרומוטור ) .tacנספח א'( .המקטע בגודל 1.5 Kb כנראה נובע מהצמדות לא ספציפית של הפריימרים לדנ"א בתוכנית PCRזו .תהליך דומה בוצע עבור הטרנספורמנטים המכילים את קסטה ,(C82, C551, C222) Bבעזרת הפריימרים glmS- F1592ו PCR ,prnD-F4721 -זה הניב מקטע בגודל ) ~1.7Kbאיור מס' (12המעיד על כך כי אכן קסטה Bהוחדרה douwnstreamלגן .glmSמעבר לאמור לעיל מקטעי ה '5 -של תחילת האופרון בשתי הקסטות נשלחו לריצוף על מנת לוודא כי בקסטה Bאין רצף נוסף בין קודון ההתחלה לפרומוטור למעט 10בסיסים הנובעים משאריות ה) Multiple Cloning Site (MCS) -נספח ג'(. .4.2בדיקת ביטוי וייצור פירולניטרין .4.2.1בדיקת יכולת הפרשת חומרים אנטיביוטיים לאחר שוידאנו את המצאות האופרון ושלמותו בחיידקים הרקומביננטים ביצענו מיצויי אנטיביוטיקה מהחיידקים על מנת לבדוק האם החיידקים הטרנספורמנטים המכילים את אופרון הפירולניטרין מפרישים פירולניטרין .בוצעו מיצויים גולמיים מחיידקי המקור ומהטרנספורמנטים בשני אופנים המצוינים בפרק שיטות .מיצוי האנטיביוטיקה מהתבדידים נעשה בשני אופנים מפני שעפ"י הספרות מצאנו כי מיצוי אנטיביוטיקה בעזרת אתיל אצטט מתרבית חיידקים נוזלית מתאים יותר להפקת ,(Bangera and Thomashow, 1999) DAPG 1 2 5 איור מס' bioassay :14של מיצויי אתיל אצטט גולמיים כנגד הפטרייה -1 .R. solaniביקורת -3 ,4C5 -2 ,ACN C62 -5 ,C25 -4 ,Q8r1-96 3 4 איור מס' bioassay :15של מיצויי כלורופורם גולמיים כנגד הפטרייה ,C62 -2 ,C25 -1 .R. solani -5 ,4C5 -4 ,Q8r1-96 -3ביקורת ACN בעוד שמיצוי בעזרת כלורופורם מאגר מוצק מתאים יותר להפקת .(Chernin et al., 1996) Prn מיצויים אלה נבחנו במבחן ביולוגי כנגד הפטרייה R. solaniכמצוין בפרק השיטות .ניתן לראות באיור מס' 14כי מיצויי האתיל אצטט מהחיידקים הטרנספורמנטים )צלחות 4ו (5 -גרמו לעיכוב הפטריה בעוד שמבין חיידקי המקור רק Q8r1-96גרם לעיכוב הפטריה )צלחת (3בעוד שהמוטנט 4C5לא עיכב את הפטריה כלל )צלחת (2ודמה לביקורת )צלחת .(1כלומר כצפוי המוטנט 4C5לא 26 מפריש אנטיביוטיקה כלל ומיצוי אנטיביוטיקה בעזרת אתיל אצטט הוא מוצלח מאוד למיצוי DAPGכנאמר בספרות ואין להסיק מצלחות אלה האם החיידקים הטרנספורמנטים מייצרים .Prnממיצויי הכלורופורם ניתן לראות באיור מס' 15כי חיידקי המקור Q8r1-96ו 4C5 -לא גרמו כלל לעיכוב הפטריה ) R. solaniצלחות (3+4ודמו לחלוטין לביקורת ,לעומת החיידקים הטרנספורמנטים Q8r1-96#C25ו) 4C5#C62 -איור מס' 12צלחות (1+2שעיכבו אותה לחלוטין .כלומר בעזרת כלורופורם לא ניתן למצות DAPGמאגר מוצק וכנראה שתוצאות אלה מרמזות כי הטרנספורמנטים מייצרים Prnבניגוד לתבדידי המקור. .4.2.2אנליזת TLC לאחר שקיבלנו רמיזה על הפרשת Prnע"י החיידקים הטרנספורמנטים ממבחני הbiassay - ניגשנו לבדוק מהו החומר המופרש ע"י החיידקים הטרנספורמנטים ומעכב את הפטריה R. ,solaniבהנחה כי הם מייצרים Prnעקב ביטוי האופרון המוחדר .על כן מיצויי האנטיביוטיקה הגולמיים שהופקו מתבדידי הבר והחיידקים הטרנספורמנטים נבדקו ב .TLC -ניתן להבחין בנקודות כחולות ברורות של פירולניטרין שמקורן במיצויי אתיל אצטט מהחיידקים הטרנספורמנטים באיור מס' 16במסלולים 3ו .5 -בנוסף ניתן לראות נקודות ורודות המייצגות את DAPGמחיידק המקור Q8r1-96והטרנספורמנט Q8r1-96#C25באיור מס' 16מסלולים 2 ו 3-בהתאמה .אפשר לראות כי חיידק המקור Q8rl-96מכיל DAPGבלבד בעוד הטרנספורמנטים שלו) C25 ,איור מס' ,16מסלול (3ו) C82 -איור מס' ,17מסלול (3מכילים DAPGופירולניטרין. המוטנט 4C5לא מייצר אף אחת מהאנטיביוטיקות )איורים ,16+17מסלול (4בעוד הטרנספורמנטים שלו) C62 ,איור מס' ,16מסלול (5ו) C551 -איור מס' ,17מסלול (5מייצרים פירולניטרין .איורים 16ו X 17-מעידים כי החדרת אופרון ה Prn -לא פגעה ביכולת ייצור ה- DAPGהמקורית ,מכיוון שניתן לראות כי החיידקים הטרנספורמנטים מייצרים DAPG בכמויות הדומות לאלה של חיידק המקור. איור מס' TLC :16של מיצויי אתיל אצטטQ8r1- -1 . .C62 -4 ,4C5 -3 ,C25 -2 ,96 איור מס' TLC :17של מיצויי אתיל אצטט-1 . .551 -4 ,4C5 -3 ,82 -2 ,Q8r1-96 27 .4.2.3אנליזת HPLC לאחר שהתקבלו הוכחות לייצור פירולניטרין ב TLC -המשכנו עם HPLCעל מנת לאפיין את מיצויי הכלורופורם הגולמיים ,כלומר נבדקו המיצויים בהם יש Prnבלבד ללא .DAPGניתן להבחין בפיקים ברורים של Prnבחיידקים הטרנספורמנטים )איור מס' ,18חלקים C, D, Fו(G - לעומת חיידקי המקור )איור מס' ,18חלקים Bו .(E -מכיוון שמיצויי האנטיביוטיקה מהחיידקים השונים נעשו באותה צורה והוטענו כמויות זהות של מיצוי גולמי ב ,HPLC -ניתן לחשב את ריכוז האנטיביוטיקה בכל מיצוי ע"י השוואת הפיקים שהתקבלו ב HPLC -לפיק הסטנדרט ,ע"י חישוב של שטחי הפיקים .נמצא כי מיצוי כלורופורם מהטרנספורמנט Q8r1-96#C25מכיל 1.2 איור מס' HPLC :18שבוצע למיצויי כלורופורם גולמיים מהחיידקים 4C5 ,Q8r1-96ונגזרותיהם. -Aביקורת ,C82 -D ,C25 -C ,Q8r1-96 -B ,prn .C551 -G ,C62 -F ,4C5 -E )µg/µlאיור ,18חלק Q8r1-96#C82 ,(Cמכיל ) 0.36 µg/µlאיור ,18חלק 4C5#C62 ,(Dמכיל ) 0.48 µg/µlאיור ,18חלק (Fו 4C5#C551 -מכיל ) 0.86 µg/µlאיור ,18חלק .(Gניתן לראות 28 באיור ,18חלקים Bו ,E -כי חיידקי המקור Q8r1-96ו 4C5 -לא הראו פיק של פירולניטרין כלל. הפרקציות שנצפו ב HPLC -נאספו ,יובשו ב speedvac -והורחפו באצטוניטריל .דוגמאות אלה נבחנו ב -מבחן ביולוגי )איור מספר (19ונמצא כי הפרקציות אשר הראו פיק ב HPLC-מעכבות את הפטריה ) R. solaniאיור מס' ,19צלחות 3,5,6ו ,(8 -לעומת הביקורת השלילית שהכילה רק אצטוניטריל )איור ,19צלחת מס' .(2בהרצות בהן לא נצפה פיק ,בהן נבחנו מיצויים מחיידקי המקור Q8rl-96ו ,4C5 -נאסף החומר שיצא בסביבות הדקה ה 20 -ונבחן גם הוא ב.biassay - חומר זה לאחר שיובש והורחף מחדש באצטוניטריל לא עיכב את הפטריה R. solaniכלל כפי שניתן לראות באיור ,19צלחות 4ו 7 -בהתאמה. איור מס' bioassay :19כנגד הפטריה R. solani לפרקציות שנאספו מה-2 ,prn st. -1 .HPLC - אצטוניטריל-6 ,4C5#C62 -5 ,4C5 -4 ,4C5#C551 -3 , Q8r1-96#C82 -8 ,Q8r1-96 -7 ,Q8r1-96#C25 .4.2.4פעילות אנטי-פטרייתית in vitro לאחר שוידאנו את שלמות אופרון הפירולניטרין בחיידקים השונים ומצאנו כי הם מבטאים אותו, ביצענו בדיקה של עיכוב הפטריה R. solaniע"י חיידקי המקור והטרנספורמנטים in vitroעל צלחות .PDAלהלן טבלת ממוצע של ארבע חזרות של דיכוי גדילה )במ"מ( של R. solaniלכל תבדיד .לפי החישוב הנמצא בפרק השיטות. טבלה מס' :5עיכוב הפטריה ) R. solaniבמ"מ( ע"י החיידקים השונים M±SE התבדיד M±SE התבדיד 1.75± 0.14 Q8r1-96#C25 1.73± 0.13 Q8r1-96 1.71± 0.08 Q8r1-96#C82 1.21± 0.2 4C5#C62 1.95± 0.23 4C5#C551 1.75± 0.26 Q2-87#C36 1.76±0 .23 Q2-87#C222 0± 0 1.51± 0.46 4C5 Q2-87 29 ניתן לראות כי אין הבדל משמעותי בעיכוב הפטרייה in vitro R. solaniבין תבדיד הבר Q8r1-96 )איור מס' ,20צלחת (2לטרנספורמנטים ) Q8r1-96#C25איור מס' ,20צלחת (3וQ8r1- - ) 96#C82איור מס' ,20צלחת , (4ובין תבדיד הבר Q2-87לטנספורמנטים Q2-87#C36וQ2- - ) 87#C222טבלה מס' (5ההבדל היחיד שניתן להבחין בו הוא בין המוטנט 4C5שלא מייצר הרקומביננטים 4C5#C62ו ,4C5#C551 -המייצרים אנטיביוטקה כלל לבין החיידקים פירולניטרין .אך גם במקרה זה אין הבדל בעיכוב בינהם לבין חיידקי המקור Q8r1-96ו.Q2-87 - איור מס' :20עיכוב הפטריה .in vitro R.solani -1ביקורת Q8r1-96# -3 ,Q8r1-96 -2 ,H2O 4C5#C62 -6 ,4C5 -5 ,Q8r1-96#C82 -4 ,C25 .4.3השוואת גדילה בין תבדיד המקור לטרנספורמנטים מטרת ניסוי זה הייתה לבחון האם חל שינוי בקצב גידול החיידקים הטרנספורמנטים ,עקב הכנסת אופרון ה ,prn-לעומת חיידקי המקור .in vitroניסוי זה בוצע ע"י גידול החיידקים בתרבית נוזלית במשך 24שעות ובחינת ה OD -כל שעתיים .מאיור מס' 21ניתן להבחין כי אין השפעה יוצאת דופן על קצב גידול החיידקים המכילים את אופרון ה prn -ביחס לחיידקי המקור. הטרנספורמנטים המכילים את קסטה Bהראהו קצב גידול זהה לאלה המכילים את קסטה A 26 22 24 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 OD 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 )time (h C36 Q2 C62 4C5 C25 Q8 איור מס' :21עקומות גידול של החיידקים השונים בתרבית נוזלית לאורך 24שעות 30 )נתונים לא מוצגים(. .4.4ניסויי חממה השפעת האופרון prnעל כושרם האנטי-פטרייתי של שלושת החיידקים הנבדקיםQ8r1-96,4C5 , ו Q2-87 -נבדקה ,in vivoכנגד מחלת המודל ,חולי נופל בשעועית ,הנגרמת ע"י .R. solani בניסויי הדברת R. solaniהוערך כושרו של החיידק להביא לירידת ברמת המחלה )יחסית לביקורת מחלה המהווה ,(100%כלומר (%DR) % Disease reductionבלבד .התוצאות מוצגות באיור מס' .22התוצאות המופיעות בגרף הן ממוצע של ארבעה עד שישה ניסויים נפרדים ,כאשר לכל טיפול נעשו 5חזרות .לכל קבוצה של חיידק מקור ושני הטרנספורמנטים שלו נערך מבחן .Tukey-Kramerכלומר התבדיד Q8r1-96נבחן אל מול הטרנספורמנטים Q8r1-96#C25ו- ,Q8r1-96#C82התבדיד 4C5נבחן אל מול הטרנספורמנטים 4C5#C62ו ,4C5#C551 -התבדיד Q2-87נבחן אל מול הטרנספורמנטים Q2-87#C36ו .Q2-87#C222 -ניתן לראות כי כל החיידקים הטרנספורמנטים המכילים את אופרון ה ,prn -מראים הדברה טובה יותר משמעותית של מחלת החולי נופל בשעועית לעומת חיידקי הבר .מהתוצאות עולה כי הוספת אופרון זה בנוסף לאופרון ה DAPG-בחיידק Q8rl-96ו Q2-87 -הביאה ליצירת טרנספורמנטים בעלי יעילות הדברה גבוהה יותר בתנאי הניסוי הזה .בנוסף ניתן להבחין כי הטרנספורמנט 4C5#C551החסר ביכולת ייצור DAPGומכיל את קסטה ,Bהוא בעל ההדברה טובה יותר משמעותית מהחיידק 4C5#C62הדומה לו אך מכיל את קסטה .Aתוצאה זו רומזת על התכנות הפרעה של ביטוי אופרון ה DAPG -על יצור פירולניטרין ,ובהעדרו השפעת הפירולניטרין חזקה יותר .מעבר לכך ניתן לראות כי אין הבדל משמעותי ביכולת ההדברה של הטרנספורמנטים הנבדלים בקסטות. כלומר כנראה ואין השפעה ממשית לסמיכות קודון תחילת השעתוק לפרומוטור במקרה זה, כנראה שניתן לראות את השפעת סמיכות תחילת האופרון לפרומוטור כאשר החיידק מייצר אנטיביוטיקה אחת בלבד ולא נוצר מיסוך ע"י DAPGשככל הנראה מפריע באופן כלשהו לייצור .Prn A A A B B C B DR% A A 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 8 87 7 #C Q 236 87 #C 22 2 Q 2- Q 2- 4C 5 4C 5# C 62 4C 5# C 55 1 196 196 #C Q 8r 25 196 #C 82 Q 8r Q 8r איור מס' :22תיאור אחוזי הפחתת מחלת החולי נופל בשעועית ע"י החיידקים השונים 31 4.4.1שרידות החיידקים בקרקע בתנאי חממה 14 10 12 8 4 6 0 2 bacteria concentration in )gr of soil (log of 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 time in days C62 4C5 C82 C25 Q8 C222 C36 Q2 C551 איור מס' :23ריכוזי החיידקים השונים בקרקע לאורך שבועיים בתנאי חממה מטרת הניסוי הייתה לבדוק את שרידות החיידק בתנאים המדמים את ניסויי החממה .כל עציץ הושקה ב 20 -מ"ל תרחיף חיידקים ,ריכוז החיידקים בכל עציץ היה כ 2.5*107 -לגרם קרקע. באיור מס' ,23המספרים בציר ה X-מציינים את הימים במהלך הניסוי בהם נלקחו דגימות קרקע מן העציצים .ניתן לראות באיור מס' ,23שלקראת ההשקיה השנייה ,ביום השביעי ,חלה ירידה קטנה בכמות החיידקים ,שאותה בדקנו ע"י גידול החיידקים על מצע עם ריפאמפיצין ,ולמרות זאת התקבלה ההחלטה להשקות במנת חיידקים נוספת ביום השביעי ,על מנת לתגבר את כמות החיידקים באמצע הניסוי .לאחר הוספת החיידקים ביום השביעי שוב חלה ירידה בכמות החיידקים אשר מגיעה למצב של שיווי משקל בתום הניסוי ,לאחר 14יום ,הדומה לכמותם בתחילת הניסוי .כלומר לא היה הבדל בגדילת ושרידות החיידקים הטרנספורמנטים לחיידקי הבר בתנאי ניסוי זה. .4.4.2השפעת חיידקי המקור והטרנספורמנטים על כמות החיידקים באדמת חממה מטרת הניסוי הייתה לבדוק את השפעת המדבירים הביולוגים על אוכלוסיית החיידקים הטבעית באדמת ,sandy-loamרחובות ,בתנאים המדמים את ניסויי החממה .ניסוי זה נעשה ע"י לקיחת דגימות קרקע בחמש נקודות זמן )לפני ההשקיה הראשונה ,לאחר ההשקיה הראשונה ,לאחר שבוע ימים ,לאחר השקיה שנייה ביום השביעי ,לאחר שבועיים ולאחר שלושה שבועות( ,החיידקים גודלו על מצע NAומצע NAעם ריפאמפיצין ,כאשר מספר החיידקים במצע הסלקטיבי הופחת ממספר החיידקים במצע העשיר ,זאת מנקודת הנחה כי במצע הסלקטיבי גדלים רק החיידקים שהוספו באופן מלאכותי .באיור מס' ,24העקומה התחתונה מייצגת את אוכלוסיית החיידקים הכללית בקרקע והעקומה העליונה מייצגת את החיידק המוסף בהשקייה פעמיים במהלך הניסוי. 32 כל החיידקים נבדקו בנפרד הן תבדיד המקור והן החיידקים הטרנספורמנטים ,כל החיידקים הראו דינמיקה דומה .בגרף Aשל איור מס' 24מוצגת השפעת תבדיד הבר Q8r1-96על אוכלוסיית החיידקים הטבעית בקרקע ובגרף Bמוצגת השפעת החיידק הרקומביננטי Q8r1- 96#C82על אוכלוסיית החיידקים הטבעית בקרקע .איור זה הוא איור מייצג לכל התבדידים המוזכרים בעבודה זו שכן כולם הראו עקומות דומות לאלה המוצגות באיור זה .כמו כן הטרנספורמנטים המכילים את קסטה Aהראו עקומות דומות לאלה גם כן. ניתן לראות באיור מס' ,24בעקומה התחתונה כי כמות החיידקים הכללית בקרקע נשארת יציבה ונמוכה ,אף כמעט אפסית לאורך כל הניסוי,בעוד שרמת החיידק המוסף גבוהה משמעותית .בנוסף ניתן לראות עליה בכמות החיידק המוסף ביום השביעי ,מפני שזהו היום בו השקנו פעם שנייה עם החיידק .מממצאים אלה אפשר לומר כי הקרקע בה נעשה שימוש בניסוי יחסית נקייה וכי אין השפעה מהותית על כמות החיידקים בקרקע עקב הוספת חיידקי המקור או החיידקים המהונדסים. A 21 28 14 7 bacteria concentration in )gr of soil (log of 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 time in days 7 5 3 1 28 21 14 7 -1 0 bacteria concentration )in gr of soil (log of 10 B 9 time in days Na+Rif )Na-(Na+Rif איור מס' :24השפעת התבדיד (A) Q8r1-96והטרנספורמנט (B) Q8r1#C82על אוכלוסיית החיידקים הטבעית בקרקע 33 .5דיון ומסקנות עמידות גנטית למחלות שורש בצמחים היא תופעה לא נפוצה ומחלות אלה מודברות בעיקר ע"י שימוש בשיטות גידול שונות ופונגיצידים סינטתיים .צמחים גם מגינים על עצמם ע"י תמיכה במיקרואורגניזמים ריזוספריים אנטגוניסטים לפתוגנים אשר בקרקע .ייצור אנטיביוטיקה הוא מנגנון חשוב של הגנת הצמח ע"י הרבה חיידקים ריזוספרים שכאלה .כיום יודעים הרבה על הגנטיקה ,הביוכימיה והרגולציה של יצירת האנטיביוטיקות השכיחות .בדומה ,זוהו הרבה גנים אשר תורמים ליכולת החיידקים הריזוספריים לאכלוס השורשים ).(Thomashow et al., 2007 מדבירים ביולוגים הם ידידותיים לסביבה ומהווים אלטרנטיבה אפשרית לכימיקלים בהדברת פתוגנים צמחיים ,הם בעלי מגבלות בשימוש בחקלאות .זה יכול לנבוע מפעילות בלתי הדירה, אכלוס שורש נמוך ,ועד לכך שתבדיד מסוים לא פעיל כנגד מגוון רחב של פתוגנים ) Weller et al, (Lugtenberg and Kamilova , 2009; 2002 מחקרים על דיכוי טבעי של מחלות קרקע המספקים עדות על אינטראקציות המתקיימות בין צמחים פונדקאים ואוכלוסיות ,Pseudonomas fluorescensמגלים כי יש מגוון רחב של תבדידים בריזוספרה אשר מייצרים DAPGוניתן להבדיל ביניהם על סמך "טביעת אצבע" גנטית ) .(Weller et al., 2007הוצע בעבר כי מתאים יותר לסנן חיידקים מעודדי צמיחה שהם גם מאכלסי שורש טובים ולשפר אותם גנטית כך שיבטאו תכונות חדשות לשיפור ההדברה הביולוגית מאשר לבודד מספר חיידקים בעלי יכולת הדברתית לא ידועה ).(Timms- Wilson et al., 2000 הבסיס לאנטיביוזה כמנגנון הדברה ביולוגית של PGPRהובן יותר טוב בשני העשורים האחרונים .זוהו מגוון של אנטיביוטיקות ,ביניהן התרכובות ,HCN ,DAPGפנזין ,פיולוטאורין ופירולניטרין המיוצרים ע"י מיני .Pseudomonas גידולים רבים יכולים להנזק ממחלת שורש אחת או יותר כמו take allבחיטה וחולי נופל הנגרם ע"י פיתיום וריזוקטוניה .מחלות אלה נפוצות כאשר הגידול נזרע ישירות בקרקע ללא עיבוד, שיטה התופסת תאוצה עקב הפחתה בשחיקת הקרקע וחסכון במים .זנים מסוימים של פסאודומונדים פלורסנטים יכולים לדכא מחלות אלה ,אך רב הזנים לא מתפקדים באופן אחיד וברוב המקרים אין תבדיד אחד יעיל כנגד שלושת הפתוגנים הנ"ל ).(Raajmakers et al., 2001 ככל שחיידק מסויים מייצר יותר תרכובות שונות ,כך טווח הפעילות שלו גדל ומתרחב ,תחת מגוון תנאים סביבתיים שונים .למשל סינתזה של DAPGב P. flourescens -תבדיד CHA0מעודדת בנוכחות גלוקוז כמקור פחמן בעוד שבתנאים אלה ייצור פיולוטאורין מדוכא .כאשר מקורות הגלוקוז מדלדלים ,פיולוטאורין הופכת להיות האנטיביוטיקה המיוצרת בשפע בתבדיד זה .מנגנון זה מבטיח דרגת גמישות לאנטגוניסט כאשר הוא נתקל בתנאי סביבה משתנים .תנאים ביוטים גם הם יכולים להשפיע על ייצור אנטיביוטיקה .למשל ,פיולוטאורין יכולה להשפיע על ייצור DAPG ע"י P. flourescensתבדיד .CHA0מעבר לכך ,גדילת הצמח והתפתחותו גם כן משפיעים על ייצור אנטיביוטיקה ,מכיוון שהפעילות הביולוגית של יצרני DAPGלא מושרית ע"י הפרשות של צמחים בוגרים ,נוצר לחץ סלקטיבי כנגד מיקרואורגניזמים ריזוספריים .בנוסף ידוע כי סוג הצמח הפונדקאי משפיע גם הוא על אינטראקציות של דיכוי מחלות בין הצמח למדביר הביולוגי ,כגון איכלוס ריזוספרי ,הרכב אוכלוסיית החיידקים בקרקע והרכב הפתוגנים הנמצאים בריזוספרה 34 ) .(Girlanda et al., 2001קביעת תפקיד הפרמטרים הקרקעיים המועדפים לדיכוי מחלות ,בעיקר אלה המעודדים ייצור חומרים אנטיביוטים ,יכולה להיות מנוצלת ע"י בחירת תבדידים המתאימים לקרקע מסוימת ובכך הסבירות כי יהיו בעלי פעילות הדברתית טובה יותר ) Compant .(et al., 2005 במחקר זה ניסינו לשפר את הפעילות ההדברתית של P. flourescensתבדידים Q8r1-96וQ2- - 87ע"י החדרת אופרון המקודד לאנטיביוטיקה פירולניטרין מהתבדיד הקרוב אליו טקסונומית .Pf-5יצור פירולניטרין אפשר לתבדידי P. flourescensכמו Pf-5ו BL915 -להיות מדבירים יעילים כנגד פתוגנים כמו .(Howell and Stipanovic, 1979; Hill et al., 1994) R. solani התבדידים Q8r1-96ו ,Q2-87 -השייך לגנוטיפים Dו B-בהתאמה ,הם פונדקאים מתאימים למניפולציה שכזו מפני שהם מאכלסים אגרסיבים ושומרים על אוכלוסייה גבוהה בשורשים של צמחים פונדקאים בהשוואה למייצרי DAPGאחרים Pf-5השייך לגנוטיפ Aונמצא בריכוזים נמוכים בריזוספרה ) .(McSpadden Gardner et al., 2000ידוע כי התבדידים P. fluorescens Q8r1-96ו Q2-87 -מספקים הדברה מצויינת כנגד ,Gaeumannomyces graminis var. tritici אשר רגישה במיוחד ל ,DAPG-אך פחות יעילים כנגד ,R. solaniאשר באופן יחסי אינה רגישה ל- .(Thomashow et al., 2007) .DAPGעל כן ,בעצם החדרת אופרון הפירולניטרין לתבדידים אלה שריכוזם בריזוספרה גבוה מעלה משמעותית את טווח הפעילות שלהם ואת יעילות ההדברה הביולוגית. החיידקים הרקומביננטים של Q8r1-96ו Q2-87 -הונדסו ע"י הכנסת אופרון הפירולניטרין מP. - flourescensתבדיד Pf-5באמצעות הטרנספוזון ,miniTn7המקודד לייצור האנטיביוטיקה פירולניטרין .נבחרה דרך זו לקבלת חיידקים טרנספורמנטים מכיוון שצורה זו של טרנספורמציה מבטיחה קבלת טרנספורמנטים יציבים בקרקע ובאוכלוסיה ,בגלל שהאופרון הוחדר ישירות לגנום .מעבר לכך האופרון מוחדר באזור לא מקודד כך שאין השפעות לוואי על המטבוליזם ושאר תכונות החיידק ומתקבל רקומביננט יציב המבטא את צבר הגנים ,prnאשר הוביל לייצור פירולניטרין ולעיכוב .(Lambertsen et al., 2004) R. solaniהתוצאות המוצגות בעבודה זו ע"י PCRוריצוף מאשרות כי אופרון הפירולניטרין שהוחדר הוא שלם ולא ניזוק בתהליך ומקודד לאנטיביוטיקה פעילה ,כפי שנצפה ע"י TLCו .HPLC -החדרת צבר הגנים prnלתבדידים Q8r1- 96ו Q-87 -הוסיפה ליכולת יצור ה DAPG-גם את היכולת לייצר ) Prnאיורים 16ו .(17 -ביטוי האופרון באופן קונסטיטוטיבי לאחר שהוחדר לכרומוזום החיידק לא הראה שינוי כלשהו ביכולותיו המטאבוליות של החיידק שכן החיידק המשובט וחיידק המקור הראו קינטיקת גדילה כמעט זהה )איור מס' ,(21בנוסף נמצא כי Q8r1-96ו Q2-87 -והנגזרות המייצרות Prnשלהם, שומרים על כמות חיידקים יחסית יציבה ודומה בקרקע תחת תנאי חממה )איור מס' .(23למרות שבניסויי in vitroלא נמצא הבדל בהפרשת האנטיביוטיקות בין חיידקי המקור לטרנספורמנטים ובין הטרנספורמנטים הנבדלים בקסטות וזאת עקב מגבלות השיטה וחוסר אפשרות לכמת באופן מדוייק את כמות האנטיביוטיקות המפורשות בשיטות בהן השתמשנו ,יתכן שאם תמצא שיטה להפקה מדוייקת של האנטיביוטיקות מחיידקים אלה ימצא הבדל בכמות האנטיביוטיקה 35 המופרשת בין החיידקים המכילים את קסטה Aלעומת אלה המכילים את קסטה .Bבהמשך מניסויי החממה עולה כי החיידקים הטרנספורמנטים המכילים את אופרון הפירולניטרין ,יעילים יותר בהדברת R. solaniומעבר לכך נמצא כי הטרנספורמנט 4C5#C551המכיל את קסטה B ומייצר פירולניטרין בלבד הוא בעל יכולת הדברתית גבוהה משמעותית משאר החיידקים )איור מס' ,(22כלומר כנראה שיש אינטראקציה שלילית בין ייצור DAPGל Prn -המפריע באופן כלשהו ליצור מקסימלי של פירולניטרין ,כמו שצויין בעבר בספרות בנוגע לשילובי DAPGופיולאוטרין ) .(Baehler et al.,2005בנוסף עולה כי הצמדת קודון התחלת השעתוק לפרומוטר בטרנספורמנטים Q2-87#C222ו 4C5#C551 -תורמת להדברה יעילה יותר של R. solaniלמרות שלא נצפה הבדל בכמויות הפירולניטרין שמוצו מהחיידקים השונים וזאת מכיוון שלא ניתן היה לכמת את כמויות האנטיביוטיקות שהופרשו עקב מגבלות השיטה הנפוצה ברחבי העולם. למרות עשורים של שימוש יעיל ב ,BCA -ישנה דאגה בקשר לשחרור אורגניזמים המהונדסים גנטית לסביבה וההשפעה של חיידקים טרנסגנים על המגוון והפונקציונאליות של האקוסיסטמה הקרקעית .דאגה ראשונית בנוגע להעברת גנים מ GMM -לחיידקים הנמצאים באופן טבעי בקרקע היא ברובה לא מבוססת .הפוטנציאל להעברת גנים בין אורגניזמים יכולה להצטמצם ע"י החדרת הגנים הרצויים לכרומוזום החיידק ) .(Timms-Wilson et al., 2000בעבודה זו ננקטו מירב המאמצים על מנת למנוע בריחת גנים ,כגון החדרת האופרון לגנום החיידקים ואי שימוש בפלסמידים בעלי נטייה למעבר בין חיידקים ,כמו כן אופרון הפירולניטרין נלקח מ Pf-5 -שהוא תבדיד הקרוב מאוד טקסונומית לתבדידים שהונדסו Q8rl-96ו ,Q2-87 -כלומר נעשתה העברה באופן מאוזן מאותו המין ולא בצורה אנכית ממין שונה ,כך שההשפעה הסביבתית קטנה יותר והסבירות כי תהליך שכזה יעשה באופן טבעי גבוהה יותר .טכניקה זו מהווה יתרון בהערכת סיכונים מפני שהסבירות כי גנים אלה יזלגו שוב החוצה אל אורגניזמים אחרים נמוכה .בעבודה זו נעשתה הערכת סיכונים מצומצמת לבדיקת שינויים בכמות החיידקים הטבעית הנמצאת בקרקע ברגע החיידקים המוהנדסים מוספים אליה ,נמצא כי ההשפעה על כמות החיידקים הטבעית בקרקע נמוכה מאוד באם בנמצא בכלל ,זאת כמובן במגבלות אורך הניסוי ,בקרקע בה השתמשנו בניסויי החממה שנמצאה כדלה במיקרואורניזמים באופן כללי ,ובמגבלות השיטה המאפשרת בחינה של חיידקים הניתנים לגידול in vitroבלבד .שימוש בזנים טרנסגנים יכול להציע יתרונות מסוימים בהרכב האוכלוסייה בקרקע ,מכיוון שזהו תבדיד המוכר כבר בקרב האוכלוסייה ולא יתחרה עם חיידקים אחרים על נישות חדשות ,עקב כך ניתן להשתמש במנות קטנות יותר של החיידק הטרנסגני .עפ"י ממצאי הערכת הסיכונים שביצענו כאן ניתן לראות כי אין כל השפעה מהותית על הרכב אוכלוסיית החיידקים הטבעית בקרקע עם הוספת הנגזרות המהונדסות .על מנת שנוכל להשתמש בזנים טרנסגנים אלה לשם הדברה ביולוגית מוצלחת ונכונה ,יש לבצע מבחני הערכת סיכונים נרחבים על מנת לאמוד את היקף מעבר הגנים בין זנים אלה לאוכלוסייה הריזוספרית ואת השפעתם על אוכלוסיות חיידקים שלא ניתן לגדלן in vitroע"י שימוש בשיטות מולקולריות הכוללת את מאגר הגנים בריזוספרה גם באם לא ניתן לגדל את החייידקים הללו. כמו כן ,יש להמשיך ולבחון את השפעת ייצור האנטיביוטיקה המוגבר הן על אוכלוסיית החיידקים הריזוספרית והן על הצמחים הפונדקאים. 36 ביבליוגרפיה.6 Alsanius, B.W., M. Hultberg, and J.E. Englund. 2002. Effect of lacZY-marking of the 2,4-diacetylphloroglucinol producing Pseudomonas fluorescens strain 5-2/4 on its physiological performance and root colonization ability. Microbiol. Res. 157: 39-45 Arima, K.H. Imanaka, M. Kausaka, A. Fukuda, and C. Tumura. 1964. Pyrrolnitrin, a new antibiotic substance, produced by Pseudomonas. Agric. Biol. Chem. 28: 575-576 Baehler, E., M. Bottiglieri, M. Pe´chy-Tarr1, M. Maurhofer and C. Keel. 2005. Use of green fluorescent protein-based reporters to monitor balanced production of antifungal compounds in the biocontrol agent Pseudomonas fluorescens CHA0. J. Appl. Microbiol. 99: 24–38 Bais, H.P., T.L. Weir, L.G. Perry, S. Gilory, and J.M. Vivanco. 2006. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Ann. Rev. Plant Biol. 57: 233-266 Bakker, P.A.H.M., C.M.J. Pieterse and L.C. van Loon. 2007. Induced systemic resistance by fluorescent Pseudomonas spp.. Phytopathology. 97:239-243 Bangera, M.G., and L.S. Thomashow. 1999. Identification and characterization of a gene cluster for synthesis of the polyketide antibiotic 2,4diacetylphloroglucinol from Pseudomonas fluorescens Q2-87. J. Bacteriol. 181: 3155-3163. Bonsal, R.F., D.M. Weller, and L.S. Thomashow. 1997. Quantification of 2,4diacetylphloroglucinol produced by fluorescent Pseudomonas spp. in vitro and in the rhizosphere of wheat. Appl. Environ. Microbiol. 63: 951-955. Bull, C.T., D.M. Weller, and L.S. Thomashow. 1991. Relationship between root colonization and suppression of Gaeumannomyces graminis var. tritici by Pseudomonas fluorescens strain 2-79. Phytopathology 81: 954–959 Buysens, S., K. Huengens, J. Poppe, and M. Hofte. 1996. Involvement of pyochelin and pyoverdin in suppression of Pythium-induced damping-off of tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2. Appl. Environ. Microbiol. 62: 865-871. Chernin, L., A. Brandis, Z. Ismailov, and I. Chet. 1996. Pyrrolnitrin production by an Enetrrobacter agglomerans strain with a broad spectrum of antagonistic 37 activity towards fungal and BCAterial phytopathogens. Curr. Microbiol. 32: 208-212. Chet, I., and L. Chernin. 2002. Biocontrol, Microbial agents in soil. Encyc. Environ. Microbiol. John Willey and Sons Inc., New York. Compant, S., B. Duffy, J. Nowak, C. Clement, and E.A. Barka. 2005. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: Principles, mechanisms of action, and future prospects. Appl. Enviro. Microbiol. 71: 4951-4959. Cook, R. J. and K. F. Baker. 1983. The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens. Amer. Phytopathol. Soc. (St. Paul, MN). Cook. R.J. 1993. Making greater use of introduced microorganisms for biological control of plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 31: 53-80 Corbell, N.A., and J.E. Loper. 1995. A global regulator of second metabolite production in Pseudomonas fluorescens Pf-5. J. Bacteriol. 177: 6230-6236 de Souza, J.T., C. Arnould, C. Deulvot, P. Lemanceam, V.G. Pearson, and J.M. Raaijmakers. 2003. Effect of 2,4-diacetylphloroglucinol on Pythium: Cellular responses and variation in sensitivity among propagules and species. Phytopathology 93: 966-975 Duffy, B.K. and G. Defago. 1999. Environmental factors modulating antibiotic and siderophores biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2429-2438 El-Banna, N., and G. Winkelmann. 1998. Pyrrolnitrin from Burkholderia cepacia: antibiotic activity against fungi and novel activities against streptomycetes. J. Appl. Microbiol. 85: 69-78 Fenton, A.M., P.M. Stephens, J. Crowley, M. Ocallaghan, and F. Ogara. 1992. Exploitation of gene(s) involved in 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthesis to transfer a new biocontrol capability to a Pseudomonas strain. Appl. Environ. Microbiol. 58: 3873-3878. Fravel, D.R. 2005. Commercialization and implementation of biocontrol. Annu. Rev. Phytopathol. 43: 309-315 Garcia, V.G., M.A.P. Onco, and V.R. Susan. 2006. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia. Spanish J. Agr. Res. 4:55-79 Girlanda, M., S. Perotto, Y. Moenne-Loccoz, R. Bergero, A. Lazzari, G. Defago, P. Bonfante and A.M. Luppi. 2001. Impact of biocontrol 38 Pseudomonas fluorescens CHA0 and a genetically modified derivative on the diversity of culturable fungi in the cucumber rhizosphere. Appl. Environ. Microbiol. 67: 1851-1864 Glick, B.R., D.M. Penrose, and J. Li. 1998. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant growth-promoting bacteria. J. Theor. Biol. 190:63-68 Haas, D., and G. Defago. 2005. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. Nature Rev. Microbiol. 3:307-319 Hamill, R., R. Elander, M. Mabe, and M, Gorman. 1967. Metabolism of tryptophan by Pseudomonas aureofaciens. V. Conversion of tryptophan to pyrrolnitrin. Antimicrob. Agents Chemother. 1967:388-396 Hammer, P.E., W. Burd, D.S. Hill, J.M. Ligon, and K.H. van Pee. 1999. Conservation of the pyrrolnitrin biosynthetic gene cluster among six pyrrolnitrin producing strains. FEMS Microbiol. Lett. 180: 39-44 Hill, D.S., J.I. Stein, N.R. Torkewitz, A.M. Morse, C.R. Howell, J.P. Pachlatko, J.O. Becker and J.M. Ligon. 1994. Cloning of genes involved in the synthesis of pyrrolnitrin form Pseudomonas fluorescens and role of pyrrolnitrin synthesis in biological control of plant disease. Appl. Environ. Microbiol. 60: 78-85 Howell, C.R., and R.D. Stipanovic. 1979. Control of Rhizoctonia solani in cotton seedlings with Pseudomonas fluorescens and with an antibiotic produced by the bacterium. Phytopathology 69: 480-482. Huang, Z., R.F. Bonsal, D.V. Mavrodi, D.M. Weller, and L.S. Thomashow. 2004. Transformation of Pseudomonas fluorescens with genes for biosynthesis of phenazine-1-carboxilic acid improves biocontrol of Rhizoctonia root rot and in situ antibiotic production. FEMS Microbiol. Lett. 49: 243-251 Kalbe, C., P. Marten, and G. Berg. 1996. Strains of the genus Serratia as beneficial rhizobacteria of oilseed rape. Microbiol. Res. 151: 4400-4433. Keel, C., D.M. Weller, A. Natsch, G. Defago, R.J. Cook, and L.S. Thomashow. 1996. Conservation of the 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthesis locus among fluorescent Pseudomonas strains from diverse geographic locations. Appl. Environ. Microbiol. 62: 552-563 Keel, C., U. Schnider, M. Maurhofer, C. Voisard, J. Laville, U. Burger, P. Wirthner, D. Haas, and G. Defago. 1992. Suppression of root diseases by 39 Pseudomonas fluorescens CHA0: Importance of the secondary metabolite 2,4- diacetylphloroglucinol. Mol. Plant-Microbe Interact. 5: 4-13. King, E.O., M.K. Ward, and D.E. Rainey. 1954. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescein. J. Lab. Clin. Med. 44: 301-307. Kirner, S., P.E. Hammer, D.S. Hill, A. Altmann, L. Fischer, L.J. Weislo, M. Lanahan, K.H. van Pee, and J.M. Ligon. 1998. Functions encoded by pyrrolnitrin biosynthetic genes from Pseudomonas fluorescense. J. Bacteriol. 180: 1939-1943 Koch, B., L.E. Jensen, and O. Nybroe. 2001. A panel of Tn7-based vectors for insertion of the gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a neutral chromosomal site. J. Microbiol. Meth. 45: 187-195. Landa, B.B., D.M. Mavrodi, L.S. Thomashow, and D.W. Weller. 2003. Interactions between strains of 2,4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas fluorescens in the rhizosphere of wheat. Phytopathology 93: 982-994 Ligon, J.M., D.S. Hill, P.E. Hammer, N.R. Torkewitz, D. Hofmann, H.J. Kempf and K.H. van Pee. 2000. Natural products with antifungal activity from Pseudomonas biocontrol Bacteria. Pest Manag. Sci. 56: 688-695 Lambertsen, L., C. Sternberg, and S. Molin. 2004. Mini-Tn7 transposons for site tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environ. Microbiol. 6: 726-732 Lucas P.S.R., and H.P. Collins. 1993. Decline of Rhizoctonia root rot on wheat infected with Rhizoctonia solani AG-8. Phytopathology 83: 260-265. Lugtenberg, B. J. J., and L. C. Dekkers. 1999. What make Pseudomonas Bacteria rhizosphere competent? Environ. Microbiol. 1: 9–13. Lugtenberg, B.J.J., L. Dekkers, and G.V. Bloemberg. 2001. Molecular determinants of rhizosphere colonization by Pseudomonas. Annu. Rev. Phytopathol. 39: 461–490. Lugtenberg, B.J.J., and F. Kamilova. 2009. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu. Rev. Microbiol. 63:541-56. MacsPaden-Gardener, B.B., K.L. Schroeder, S.E. Kalloger, J.M. Raaijmakers, L.S. Thomashow, and D.M. Weller. 2000. Genotypic and phenotypic diversity of phlD-containing Pseudomonas strains isolated from the rhizosphere of wheat. Appl Environ Microbiol. 66: 1939-1946 40 Massarat, S., and M.H. Jijakli. 2007. Use of molecular techniques to elucidate the mechanisms of action of fungal biocontrol agents: a review. J. Microbiol. Meth. 69:229-241 Maurhofer, M., C. Keel, D. Haas and G. Defago. 1995. Influence of plant species on disease suppression by Pseudomonas fluorescens strain CHAO with enhanced antibiotic production. Plant Pathol. 44: 40-50 Mavrodi, D.V., O.V. Mavrodi, B. B. McSpadden-Gardener, B.B. Landa, D.M. Weller, and L.S. Thomashow. 2002. Identification of differences in genome content among phlD-positive Pseudomonas fluorescens strains by using PCR-Based Subtractive Hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 68: 5170-5176 Migheli, Q. 2001. The deliberate release of genetically modified biocontrol agents. I. Is it possible to harmonise safety, emotion and rationality? Agro Food Industry Hi-Tech 12: 41-42 Morrisey, J.P., U.F. Walsh, A. O’Donnell, Y. Moënne-Loccoz, and F. O’Gara. 2002. Explotitaion of genetically modified inoculants for inductrial ecology applications. Antonie Leeuwnhoek 81:559-606 Nowak-Thompson, B., S.J. Gould, J. Kraus, and J.E. Loper. 1994. Production of 2,4-diacetylphloroglucinol by the biocontrol agent Pseudomonas fluorescens Pf-5. Can. J. Microbiol. 40: 1064-1066. Paulsen, I.T., C.M. Press, J. Ravel, D.Y. Kobayashi, G.S.A. Myers, D.V. Mavrodi, R.T. DeBoy. R. Seshadri, Q. Ren, R. Madupu, R.J. Dodson, A.S. Durkin, L.M. Brinkac, S.C. Daugherty, S.A. Sullivan, M.J. Rosovitz, M.L. Gwinn, L. Zhou, D.J. Schneider, S.W. Cartinhour, W.C. Nelson, J. Weidman, K. Watkins, K. Tran, H. Khouri, E.A. Pierson, L.S. Pierson III, L.S. Thomashow, and J.E. Loper, 2005. Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescense Pf-5. Nature Biotechnol. 23: 873-878 Pfender, W.F., J. Kraus, and J.E. Loper. 1993. A genomic region from Pseudomonas fluorescens Pf-5 required for pyrrolnitrin production and inhibition of Pyrenophora tritici-repentis in wheat straw. Phytopathology 83: 1223-1228. 41 Pierson, E.A., and D.M. Weller. 1994. Use of mixture of fluorescent pseudomonas to suppres take-all and improve the growth of wheat. Phytopatology. 84: 940-947 Pierson, L.S., D.W. Wood, and E.A. Pierson. 1998. Homoserine lactonemediated gene regulation in plant-associated BCAteria. Ann. Rev. Phytopathol. 36: 207-225 Pierson, L.S., V.D. Keppenne, and D.W. Wood. 1994. Phenazine antibiotic biosynthesis in Pseudomonas aureofaciens 30-84 is regulated by PhzR in response to cell-density. J. Bacteriol. 176: 3966-3974 Raaijmakers, J.M., M. Vlami, and J.T. de Souza. 2002. Antibiotic production by bacterial biocontrol agents. Antonie Leeuwenhoek 81:537-547 Raaijmakers, J.M., and D.M. Weller. 1998. Natural plant protection by 2,4diacetylphloroglucinol producing Pseudomonas spp. in take-all decline soils. Mol. Plant-Microbe Interact. 11: 144-152. Raaijmakers, J.M., and D.M. Weller. 2001. Exploiting genotypic diversity of 2,4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas spp.: Characterization of superior root-colonizing P. fluorescens strain Q8r1-96. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2545-2554 Raaijmakers, J.M., D.M. Weller, and L.S. Thomashow. 1997. Frequency of antibiotic producing Pseudomonas spp. in natural environments. Appl. Environ. Microbiol. 63: 881-887 Raaijmakers, J.M., M. Leeman., M.M.P. Van Oorschot, L. Van der Sluis, B. Schippers and P.A.H.M. Bakker. 1995. Dose-response relationships in biological control of Fusarium wilt of radish by Pseudomonas spp., Phytopathology 85: 1075–1081. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY Shanahan, P., D.J. Osullivan, P. Simpson, J.D. Glennon, and F. Ogara. 1992. Isolation of 2,4-diacetylphloroglucinol from fluorescent pseudomonad and investigation of physiological parameters influencing its production. Appl. Environ. Microbiol. 58: 353-358. Sharifi-Tehrani, A., M. Zala, A. Natsch, Y. Moenne-Loccoz, and G. Defago. 1998. 42 Biocontrol of soil-borne fungal plant diseases by 2,4- diacetylphloroglucinol producing fluorescent pseudomonads with different restriction profiles of amplified 16S rDNA. Eur. J. Plant Pathol. 104: 631-643. Thomashow, L.S. and D.M. Weller. 1996. Current concepts in the use of introduced BCAteria for biological disease control: mechanisms and antifungal metabolites. In: Stacey G & Keen NT (Eds), Plant-Microbe Interactions 1: 187–236 Thomashow, L.S., and D.M. Weller. 1998. Role of a phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gaeumannomyces graminis var. tritici. J. Bacteriol. 170: 3499-3508. Thomashow, L.S., D.M. Weller, O. Mavrodi, and D. Mavrodi. 2007. Selection, monitoring, and enhancement of bacterial biocontrol agents.XIII Int. Cong. MPMI, Sorrento, Italy. 1-4 Timms-Wilson, T.M., R.J. Ellis, A. Renwick, D.J. Rhodes, D.V. Mavrodi, D.M. Weller, L.S. Thomashow, and M.J. Bailey. 2000. Chromosomal insertion of phenazine-1-carboxylic acid biosynthetic pathway enhances efficacy of damping-off disease control by Pseudomonas fluorescens. Mol. Plant-Microbe Interact.13: 1293-1300 Umio, S., T. Kamimura, T. Kamishita, and Y. Mine. 1987. Antifungal composition employing pyrrolnitrin in combination with an imidazole compound. US patent 4, 636,520 van Loon L.C., P.A.H.M. Bakker, and C.M.J. Pieterse. 1998. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 36: 453483. van Pee, K.H, O. Salcher, and J.F. Ligon 1980. Formation of pyrrolnitrin and 3(2-amino-3-chlorophenyl) pyrrole from 7-chlorotryptophan. Angew Chem Int Ed. Engl. 19: 828 Walsh, U.F., J.P. Morrissey, and F. O’Gara. 2001. Pseudomonas for biocontrol of phytopathogenes: from functional genomics to commercial exploitation. Curr. Opin. Biotechnol. 12:289-295 Weller, D.M. 1988. Biological control of soilborne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria. Annu. Rev. Phytopathol. 26: 379–407. Weller, D.M., B.B. Landa, O.V. Mavrodi, K.L. Schroeder, L. De La Fuente, S. Blouin Bankhead, R. Allende Molar, R.F. Bonsal, D.V. Mavrodi, and 43 L.S. Tomashow. 2007. Role of 2,4-Diacetylphloroglucinol- producing fluorescent Pseudomonas spp. In the defense of plant roots. Plant Biol. 9: 4-20 Weller, D.M., J.M. Raaijmakers, B.B McSpadden Gardener, and L.S. Thomashow. 2002. Microbial populations responsible for suppressiveness to plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol 15: 1-17 Whipps, J. M. 1997. Developments in the biological control of soil-borne plant pathogens. Adv. Bot. Res. 26:1–133 Whipps, J.M. 2001. Microbial interaction and biocontrol in the rhizosphere. J. Exp. Bot. 52: 487-511 44 נספחים.7 Q8r1- בחיידקminiTn7-ΩGm/ tac-prnABCD ריצוף אזור ההחדרה של הקסטה:'נספח א 96#C25 glmS GTGCGCGCCC GTGGCGGCCA GTTGATTGTC TTTGCCGACG AAAAGGCTGG CATGACCAAT GGCGAAGGCA CCCACGTGGT GCACATGCCA CACATCCACG ACATCCTGTC GCCGATTCTC TACACCATCC CGCTGCAACT GCTGTCGTAC TACGTCGCGG TGCTCAAGGG GACTGATGTG GACCAGCCGC GTAACCTGGC GAAATCTGTG ACGGTGGAGT GAGTCGCCCA CCAGAAGCCT TnR- pUC18T-mini-Tn7T-Gm GGCTCTCTGT GGGCGGACAA TAAAGTCTTA AACTGAACAA AATAGATCTA AACTATGACA ATAAAGTCTT AAACTAGACA GAATAGTTGT AAACTGAAAT CAGTCCAGTT ATGCTGTGAA AAAGCATACT GGACTTTTGT TATGGCTAAA GCAAACTCTT CATTTTCTGA AGTGCAAATT pAlter-EX1 GCCCGTCGTA TTAAAGAGGG GCGTGGGGTC GAAATTCCCA TCCCGCAAGA GGCCCGGCAG TACCGGCATA ACCAAGCCTA TGCCTACAGC ATCCAGGGTG ACGGTGCCGA GGATGACGAT GAGCGCATTG TTAGATTTCA TACACGGTGC CTGACTGCGT TAGCAATTTA ACTGTGATAA ACTACCGCAT TAAAGCTAAT CGAAGATAAG CTGTCAAACA TGAGAACAAA AAACCCCTCA AGACCCGTTT AGAGGCCCCA AGGGGTTATC CGATGATAAG CTGTCAAACA TGAGAATTAA TTCATGTTCT TTCCTGCGTT ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA CCGCTCGCCG CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA GCGGAAGANC GCCCAATACG CAAACCGCCT CTNCCCGCGC GTTGGCCGAT TCATTAATGC AGCTGGCACG ACAG 45 Q8r1-96#C25 ' של אופרון הפירולניטרין בחיידק5 - ריצוף אזור ה:'נספח ב prnA Uncoding region TTGTTCAT1AA CACTCCCTGT TTCGAGGCGG GCTGTCTGTG AGGAGGGGAA GGCCGCCAGT CTCTGTGCAT CCGTGCAAGA GGCACATCAA TGTGCTTGTC GGATTTAGAC TCTAGCCTGC CGGAAAAGCG ATGCACCTTC CGTTTCCGAA TTAGCATTCA AAAAAGCAAA GGCATTTGGT CTAAAGGAAA ATTGGATCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC tac promoter AATTCCACAC ATTATACGAG CCGATGATTA ATTGTCAACA GGG2GGATGGG GAGTAAGCTT GAGTATTCTA TAGTGTCACC TAAATAGCTT GGCGTAATCA pAlterTGGTCATAGC TGTTTCCTGT GTGAAATTGT TATCCGCTCA CAATTCCACA CAACATACGA GCCGGAAGCA TAAAGTGTAA AGCCTGGGGT GCCTAATGAG TGAGCTAACT CACATTAATT GCGTTGCGCT CACTGCCCGC TTTCCAGTCG GGAAACCTGT CGTGCCAGCT GCATTAATGA ATCGGCCAAC GCGCGGGGAG AGGCGGTTTG CGTATTGGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGAA TTAATTCTCA TGTTTGACAG CTTATCATCG GATAACCCCT TGGGGCCTCT AAACGGGTCT TGAGGGGTTT TTTGTTCTCA TGTTTGACAG CTTATCTTCG ATTAGCTTTA ATGCGGTAGT TTATCACAGT TAAATTGCTA ACGCAGTCAG GCACCGTGTA TGAAATCTAA CAATGCGCTC ATCGTCATCC TCGGCACCGT CACCCTGGAT GCTGTAGGCA TAGG אותיות מודגשות עם קו תחתון מסמלות את קודון התחלת השעתוק של אופרון הפירולניטרין1 tac אותיות מודגשות מסמלות את פרומוטור2 46 Q8r1-96#C82 ' של אופרון הפירולניטרין בחיידק5 - ריצוף אזור ה:'נספח ג CCGCCCACGA TGACGATATT CTTGATTGGC TTGTTCATAA CACTCCCTGT TTCGAGGCGG prnA CCGTGCAAGA GGCACAT3CAA GCTGTCTGTG AGGAGGGGAA GGCCGCCAGT CTCTGTGCAT GGATCCTGTT TCCTGTGTGA AATTGTTATC CGCTCACAAT TCCACACATT ATACGAGCCG Tac promotor pAlter-EX1 ATGATTAATT GTCAACAGG4G GGATGGGGAG TAAGCTTGAG TATTCTATAG TGTCACCTAA ATAGCTTGGC GTAATCATGG TCATAGCTGT TTCCTGTGTG AAATTGTTAT CCGCTCACAA TTCCACACAA CATACGAGCC GGAAGCATAA AGTGTAAAGC CTGGGGTGCC TAATGAGTGA GCTAACTCAC ATTAATTGCG TTGCGCTCAC TGCCCGCTTT CCAGTCGGGA AACCTGTCGT GCCAGCTGCA TTAATGAATC GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT CTTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA ACATGAATTA ATTCTCATGT TTGACAGCTT ATCATCGGAT AACCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT TGTTCTCATG TTTGACAGCT TATCTTCGAT TAGCTTTAAT GCGGTAGTTT ATCACAGTTA AATTGCTAAC GCAGTCAGGC ACCGTGTATG AAATCTAACA ATGCGCTCAT CGTCATCCTC GGCACCGTCA CCCTGGATGC TGTAGGCATA GGCTTGGTTA TGCCGGTACT GCCGGGCCTC TTGCGGGATG GGGATCCACG CGTCTTAAGG CGGCCGCGGT ACCGGGCCCG TCGGGATCCG GTGATTGATT GAGCAAGCTT TATGCTTG התחלת השעתוק של אופרון הפירולניטריןi אותיות מודגשות עם קו תחתון מסמלות את קודו3 tac אותיות מודגשות מסמלות את פרומוטור4 47 :תוצאות עבודה זו הניבו את הפרסומים הבאים 1. Moseri, I., Bimerew, M., Ovadis, M., Thomashow, L., and Chernin, L. (2009) Combining 2,-4-diacetylphloroglucinol and pyrrolnitrin activities in Pseudomonas fluorescens Q8r1-96 increases its ability to suppress Rhizoctonia solani, pp. 159- 162. In: IOBC/wprs Bulletin, Vol. 43, 2009 Working Group "Integrated Control of Plant Pathogens, Proceedings of the meeting "Molecular Tools for Understanding and Improving Biocontrol" at Interlaken (Switzerland) September 9-12, 2008. Edited by: Yigal Elad, Monika Maurhofer, Christoph Keel, Cesare Gessler, Brion Duffy, 390 pp. 2. Moseri, I., M. Ovadis, D. Mavrodi, D. Weller, L. Thomashow, and L. Chernin (2008) Cloning and expression of antibiotic pyrrolnitrin genes in 2,4-DAPGproducing strain Pseudomonas fluorescens Q8r1-96 for improvement of its biocontrol activity, p. 84. In: Abstracts of Annual Meeting of Israeli Society of Microbiology (ISM-2008, Rehovot, Israel). 3. Moseri, I., M. Ovadis, D. Mavrodi, D. Weller, L. Thomashow, and L. Chernin (2008) Introduction of pyrrolnitrin operon into 2,-4-diacetylphloroglucinolproducer Pseudomonas fluorescens Q8r1-96 increases its ability to suppress Rhizoctonia solani, p. 69. In: Abstracts of 4th Int. Symp. on Rhizoctonia (20-22 August, Berlin, Germany). 4. Moseri, I., M. Ovadis, L. Thomashow, D. Weller, D. Mavrodi, and L. Chernin (2008) Combining 2,-4-diacetylphloroglucinol and pyrrolnitrin activities in Pseudomonas fluorescens Q8r1-96 increases its ability to suppress Rhizoctonia solani , p. 15. In: 10th Meeting of the Working Group “Biological control of fungal and bacterial plant pathogens. Molecular Tools for Understanding and Improving Biocontrol” (9-12 September, Interlaken, Switzerland). 5. Moseri, I., Gazit-Fatal, I., Ovadis, M., Thomashow, L., and L.Chernin (2009) Engineered derivatives of 2,4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas fluorescens expressing foreign genes encoding chitinase or pyrrolnitrin provide superior control of Rhizoctonia solani disease, p. 23. In IOBC/WPRC the 5th meeting on “Multitrophic interactions in soil” (June 11-13, 2009, UppsalaSweden). This research was supported by the US-Israel Bi national Agricultural Research and Develop-ment, Fund (BARD),Grant No.US-3789-05. 48
© Copyright 2024