1. No category

‫כתמים כהים בתפוחי אדמה לאחר אסיף כתוצאה‬
‫מהשתעמות יתר בתגובה ל‪Rhizoctonia solani -‬‬
‫עבודת גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות‪ ,‬מזון וסביבה על שם‬
‫רוברט ה‪ .‬סמית של האוניברסיטה העברית בירושלים לשם‬
‫קבלת תואר 'מוסמך למדעי החקלאות'‬
‫מאת‬
‫יוסי בוסקילה‬
‫אייר תש"ע‬
‫רחובות‬
‫מאי ‪2010‬‬
‫עבודה זו נעשתה בהדרכתם של‪:‬‬
‫ד"ר דני אשל‪ -‬המחלקה לחקר תוצרת חקלאית לאחר קטיף‪ ,‬המכון‬
‫לחקר אחסון ואיכות תוצרת חקלאית ומזון‬
‫‪ ,‬מינהל המחקר החקלאי‪ ,‬מרכז‬
‫וולקני‪ ,‬בית דגן‪.‬‬
‫ד"ר לאה צרור‪ -‬המחלקה למחלות צמחים וחקר עשבים‪ ,‬מינהל המחקר‬
‫חקלאי‪ ,‬ממ"ח גילת‪.‬‬
‫ד"ר שאול בורדמן ‪ -‬המחלקה למחלות צמחים ומיקרוביולוגיה ‪ ,‬הפקולטה‬
‫לחקלאות‪ ,‬מזון וסביבה על שם רוברט ה‪ .‬סמית של האוניברסיטה העברית‬
‫בירושלים‪.‬‬
‫‪2‬‬
‫תודות‬
‫לד"ר דני אשל אלפי תודות על ההדרכה‪ ,‬החברות‪ ,‬הליווי‪ ,‬העצה‪ ,‬התמיכה‪,‬‬
‫שתמיד היו ברוח טובה ובסבלנות אין קץ‪.‬‬
‫לד"ר לאה צרור על שיתוף הפעולה והסיוע לאורך כל הדרך‪ ,‬שתמיד הייתה‬
‫נכונה לענות על השאלות והעזרה לפתרון בעיות שהתעוררו‪.‬‬
‫לד"ר שאול בורדמן על העצה בתחום הפיטופתולוגי והזמינות לכל בעיה‬
‫שהתעוררה‪.‬‬
‫לצוות הניסויים בחבל מעון ובעיקר למר שמעון וורשבסקי על הסיוע‪ ,‬אספקת‬
‫תפו"א בשמחה וברצון ועל חלקכם בניסויי השטח‪.‬‬
‫דר' פינחס פיין וחברי מעבדתו מהמחלקה לחקר קרקע ומים מכון וולקני על‬
‫העזרה בתכנון וביצוע ניסוי החממה ‪.‬‬
‫לחברי למעבדה דר' פאולה טפר‪-‬במנולקר‪ ,‬טלי מונוסוב‪ ,‬אבישי שניידר וענבל‬
‫סעד על הסובלנות ‪ ,‬העבודה המשותפת וחברתכם הנעימה והתומכת‪.‬‬
‫לחברי המחלקה לחקר תוצרת לאחר קטיף‪ ,‬מכון וולקני ‪ .‬על סביבת העבודה‬
‫הנעימה והנכונות לעזור בכל שאלה ובעיה‪.‬‬
‫למרכז למחקר ויישום חקלאי בנגב ע"ש חיים מולכו ז"ל על המלגה והתמיכה‬
‫הכלכלית‪.‬‬
‫למדען הראשי של משרד החקלאות על מימון המחקר‪.‬‬
‫ותודה מיוחדת מעומק לבי לאשתי היקרה לירון על התמיכה‪ ,‬ההבנה והעידוד‪.‬‬
‫‪3‬‬
‫תקציר‬
‫ענף תפוחי האדמה (תפו"א; ‪ (Solanum tuberosum L.‬בישראל מייצא כ‪250,000 -‬‬
‫טון בשנה כאשר כ‪ 40,000 -‬טון נאספים טרם התייצבות הקליפה ונארזים בצוברים עם כבול‬
‫השומר על הלחות במארז‪ .‬בשנים האחרונות חלה עלייה בהופעת כתמי שעם נקרוטיים על‬
‫גבי הקליפה (בזן ניקולה)‪ ,‬המתפתחים במהלך האחסון וההובלה ומכונים "כתמים כהים"‪.‬‬
‫הפטרייה ‪ Rhizoctonia solani‬בודדה מכתמים אלה ‪ ,‬אולם בשלבי העבודה המוקדמים לא‬
‫ניתן היה להשלים את מבחן קוך‬
‫באופן הדיר ‪ .‬נמצא שפקעות המאוחסנות בצובר מסחרי‬
‫מגיעות לטמפרטורת האחסון הרצויה (‪ ,)8°C‬רק לאחר ‪ 25‬ימים מהאסיף‪ .‬במהלך השבוע‬
‫הראשון לאחסון נצפתה עליה של טמפרטורת הפקעות ו‬
‫הצטברות של פחמן דו חמצני‬
‫כתוצאה מנשימה מוגברת והגלדה של פצעי האסיף ‪ .‬הכבול‪ ,‬העוטף את הפקעות בצוברים‪,‬‬
‫איבד כ‪ 30% -‬מתכולת נוזליו ויצר אוירה לחה סביב הפקעות‪ .‬אילוח מלאכותי של הפקעות‬
‫במערכת מודל המדמה את תנאי האחסון בצובר ‪ ,‬אפשרה להשלים את מבחן קוך ולקבוע‬
‫שאכן מקור מחלת האחסון באילוח בפטרייה ‪ ,R. solani‬שבודדה מ"הכתמים הכהים"‪.‬‬
‫מאנליזת רצף ה‪ )ITS( internal transcribed spacer -‬של ה‪ DNA -‬הריבוזומאלי של התבדיד‪,‬‬
‫שהתקבל מהפקעות הנגועות‪ ,‬נמצא דמיון בשיעור של ‪ 98.3-99.4%‬ל‪ R. solani -‬מקבוצת‬
‫אנסטומוזיס ‪ ,(AG3) 3‬שהיא הקבוצה השכיחה ביותר בתפו"א‪ .‬בשנים האחרונות נצפו‬
‫שינויים בחומרת המחלה בקורלציה עם שינויים במשטרי הזנה‪ ,‬בעיקר בריכוזי חנקן וסידן‪.‬‬
‫בחינה של יחסי הגומלין בין אילוח בפטרייה לרמות שונות של הזנה בסידן וחנקן לא הצביעה‬
‫על קורלציה כלשהי בין הגורמים שנבחנו‬
‫‪ .‬אילוח מלאכותי בפתוגן ‪ ,‬בתנאי חממה ‪ ,‬יצר‬
‫קשיונות אופייניים שהתפתחו לכתמים נקרוטיים באחסון במופע מעט שונה מ "כתמים כהים"‬
‫המתקבלים בשדה באופן ספונטני‬
‫‪ .‬בחינה מיקרוסקופית של רקמה פצועה‪ ,‬מאולחת‬
‫מלאכותית בפטרייה‪ ,‬הראתה תגובה ייחודית של הצטברות מי חמצן ברקמת הפרידרם‬
‫המלווה ביצירה מוגברת של שכבות תאי שעם‪ .‬תגובה זו מוגברת גם בתאי פרנכימה‬
‫ממרכז הפקעת בדסקיות שאולחו בפטרייה‪ .‬בנוסף נמצא ביטוי מוגבר של הגנים ‪ StKCS6‬ו‪-‬‬
‫‪ CYP86A33‬המעורבים בביוסינתזה של סוברין בקליפת תפו"א‪ ,‬בשיעור של פי ‪ 6.4‬ו‪,3.4 -‬‬
‫בהתאמה‪ ,‬כבר לאחר ‪ 24‬שעות‪ ,‬וכן עליה בביטוי הגן ‪ POP_A‬בשיעור של פי ‪ 48 ,1.5‬שעות‬
‫לאחר ההדבקה‪ .‬נראה כי איסוף הפקעות בשלב מוקדם לפני התייצבות הקליפה‪ ,‬מוביל‬
‫לפציעה מוגברת‪ ,‬אילוח בפטרייה ותגובת השתעמות יתר של הקליפה במהלך האחסון‬
‫וההובלה‪.‬‬
‫‪4‬‬
‫תוכן עניינים‬
‫תקציר ‪4......................................... ........................................................................‬‬
‫רשימת קיצורים ‪7............................................................................................ ........‬‬
‫‪ 1‬מבוא ‪8................................... .............................................................................‬‬
‫‪ 1.1‬גידול תפוחי אדמה ‪8...................................................................................‬‬
‫‪ 2.1‬פיסיולוגיה ופתולוגיה פקעות תפו "א ‪8............................................................‬‬
‫‪9‬‬
‫‪ 1.2.1‬קליפת הפקעת ‪................................................................ ................‬‬
‫‪ 1.2.2‬ביוסינתזת סוברין ‪10.............................................................................‬‬
‫‪ 1.3‬אחסון והובלת פקעות בישראל ‪13...................................................................‬‬
‫‪13............................................................‬‬
‫‪.‬‬
‫‪ 1.3.1‬מחלות אחסון בתפו"א ‪..........‬‬
‫‪ 1.3.2‬השפעת דישון על מחלות תפו"א ‪14..........................................................‬‬
‫‪ 1.4‬הפטרייה הפתוגנית ‪15.......................................................... Rhizoctonia spp‬‬
‫‪ 1.4.1‬שימוש במקטעי ‪ ITS-rDNA‬לסיווג ריזוקטוניה ‪16............... ............................‬‬
‫‪ 1.4.2‬תהליך האילוח של צמחים\פקעות ב‪17........................................ R. solani -‬‬
‫‪ R. solani 1.4.3‬בצמחי תפו"א ‪17................................................................... ....‬‬
‫‪ 1.5‬הכתמים הכהים בתפו"א מהזן ניקולה ‪ :‬תאור תופעה‪18.................. ............... ......‬‬
‫מטרות העבודה ‪19..................... ................................................................................‬‬
‫‪2‬‬
‫שיטות וחומרים ‪20............................ ..................................................................‬‬
‫‪ 1.2‬החומר הצמחי ‪20.......................... ..............................................................‬‬
‫‪ 2.2‬בידוד הפתוגן והשלמת מבחן קוך ‪20.. .............................................................‬‬
‫‪ 3.2‬ניסוי צוברים ‪21...................... ....................................................................‬‬
‫‪1.3.2‬‬
‫מדידת הרכב הגזים בצובר ‪21..................... .....................................‬‬
‫‪ 2.4‬ניסוי חממה לבחינת השפעת גורמי ההזנה סידן וחנקן על יצירת התסמינים‪22.........‬‬
‫‪ 2.4.1‬מבנה הניסוי ‪22.................................................................................‬‬
‫‪23...............................................................................‬‬
‫‪.‬‬
‫‪ 2.4.2‬מהלך הגידול‬
‫‪ 2.4.3‬אחסון ומדידת הפקעות ‪24..................................................................‬‬
‫‪24..............................................................‬‬
‫‪.‬‬
‫‪ 2.4.4‬הכנת אינוקולום הפטרייה‬
‫‪ 2.5‬בחינה היסטולוגית של תגובת האפידרמיס לאילוח ב‪25........................ R. solani -‬‬
‫‪ 2.5.1‬קיבוע הרקמה ‪25............................................... ................................‬‬
‫‪25..................................................‬‬
‫‪.‬‬
‫‪ 2.5.2‬ביצוע חתכים היסטולוגיים ‪............‬‬
‫‪5‬‬
‫‪ 2.5.3‬צביעת סוברין בצבע סודן (‪26.................................................. )Sudan IV‬‬
‫‪ 2.5.4‬צביעות לזיהוי ‪26................................... )Reactive oxygen species) ROS‬‬
‫‪ 2.6‬זיהוי גנומי של תבדיד הפטרייה ‪26...................................................................‬‬
‫‪27...................................................................‬‬
‫‪.‬‬
‫‪ 2.6.1‬הפקת ‪ DNA‬מהפטרייה‬
‫‪ 2.6.2‬ריצוף של מקטעי ה‪27......................................................... ITS-rDNA -‬‬
‫‪ 2.7‬רמת שעתוק גנים המעורבים בתהליכי השתעמות (ביוסינתזת סוברין ) ‪29................‬‬
‫‪ 2.7.1‬הפקת ‪ RNA‬מרקמה צמחית ‪29...............................................................‬‬
‫‪ 2.7.2‬סינתזת ‪30............................................... .................................. cDNA‬‬
‫‪ 2.7.3‬קביעת רצף ואנליזה של תוצרי ‪30.................................................. ...PCR‬‬
‫‪31..…….………...…………………..….Quantitative Real Time RT-PCR.2.7.4‬‬
‫‪33....................... ..‬‬
‫‪ 3‬תוצאות ‪.......................................................................................‬‬
‫‪ 3.1‬בידוד פתוגנים מהכתמים הכהים ‪33..................................................................‬‬
‫‪ 3.2‬ניסוי צוברים ‪ -‬אפיון התנאים בהם נוצרים הכתמים הכהים ‪33.................................‬‬
‫‪ 3.3‬השלמת מבחן קוך ובידוד הפתוגן ‪35.................................................................‬‬
‫‪ 3.4‬השפעת גורמי ההזנה סידן וחנקן על התפתחות "הכתמים הכהים" ‪36.....................‬‬
‫‪ 3.4.1‬מדדים פיטופתולוגיים ‪36.......................................................................‬‬
‫‪ 3.4.2‬השפעה על מדדי גידול ‪36.....................................................................‬‬
‫‪ 3.5‬אפיון תבדיד ‪ R. solani‬מכתמים כהים בעזרת ‪40................................... rDNA-ITS‬‬
‫‪ 3.6‬הצטברות ‪ ROS‬ויצירת פרידרם מוגברת בתגובה לאילוח ב‪42.................. R. solani -‬‬
‫‪ 3.7‬ביטוי מוגבר של גנים המעורבים בביוסינתזה של סוברין בתגובה לאילוח‬
‫ב‪44..................................................................................................... R. solani -‬‬
‫‪45.........‬‬
‫‪ 4‬דיון ומסקנות ‪................................................................................................‬‬
‫‪ 4.1‬אפיון התנאים המובילים ליצירת "כתמים כהים" ‪45...............................................‬‬
‫‪ 4.2‬בידוד הפתוגן והשלמת מבחן קוך ‪46..................................................................‬‬
‫‪ 4.3‬מעורבות גורמי הזנה סידן וחנקן ביצירת הסימפטומים ‪46......................................‬‬
‫‪ 4.4‬אפיון תבדיד הריזוקטוניה שבודד מ"כתמים כהים"‪47......................................... ...‬‬
‫‪ 4.5‬תגובת רקמת הפקעת‪ -‬השתעמות וגורמי חמצון ‪48..............................................‬‬
‫‪ 4.6‬סיכום ‪49......................................................................................................‬‬
‫‪ 5‬רשימת ספרות ‪51......................................................................................................‬‬
‫‪63................................................................................................................. Abstract‬‬
‫‪6‬‬
‫רשימת קיצורים‬
‫ מיליגרם‬-‫מ"ג‬
‫ מיליליטר‬-‫מ"ל‬
‫ מילימטר‬-‫מ"מ‬
‫ מיקרוגרם‬-‫מק"ג‬
‫ סיבובים לדקה‬-‫סל"ד‬
‫ סנטימטר‬-‫ס"מ‬
‫ מנטימטר מעוקב‬-‫סמ"ק‬
‫ מנטימטר רבוע‬-‫סמ"ר‬
‫חמצני‬-‫ פחמן דו‬-‫פד"ח‬
AG – Anastomosis group
CYP - Cytochrome P450 monooxygenase
ITS - Internal transcribed spacer
KCS - 3-ketoacyl-CoA synthase
mM – Millimolar
POP_A - Suberization-associated anionic peroxidase
PPM - Parts per million
RH - Relative humidity
ROS - Reactive oxygen species
SPAD -Suberin poly aliphatic domain
SPPD - Suberin poly phenolic domain
VLCFAs - Very long chain fatty acids
µL – Microlitre
m – Micrometer
7
‫‪ .1‬מבוא‬
‫‪ 1.1‬גידול תפוחי אדמה‬
‫גידול תפוחי אדמה (תפו"א; ‪ )Solanum tuberosum L.‬למאכל הינו הרביעי‬
‫בחשיבותו בעולם לאחר החיטה‪ ,‬אורז והתירס ( ‪Harlan, 1975; Van der Zaag and Horton,‬‬
‫‪ .)1983‬אזורי הגידול המסורתיים מזוהים עם אקלים ממוזג המאופיין בטמפרטורות ועוצמות‬
‫קרינה בינוניות (‪ .)Gregory, 1965‬תפו"א במקורו מוגדר כצמח יום קצר‪ ,‬חד שנתי ומתאים‬
‫לגידול בעונות קרירות‪ .‬צמח תפו"א עבר תהליך ארוך של אקלום וטיפוח וגדל כיום באזורים‬
‫רבים בעולם ומניב תוצרת גם בתנאי יום ארוך ובטמפרטורות גבוהות יחסית‪ .‬עיקר הריבוי‬
‫נעשה בדרך וגטטיבית על ידי שימוש בפקעות זריעה אשר מבטיחות אחידות בגידול ועמידות‬
‫למחלות ווירוסים‪.‬‬
‫על פי נתוני משרד החקלאות בישראל‪ ,‬שטחי הגידול בשנת ‪ 2008‬הגיעו ל‪180 -‬‬
‫אלף דונם אשר נאמדים ביבול של כ‪ 550-‬אלף טון‪ ,‬כשמחציתו מיועדת לייצוא‬
‫(‪ .)http://www.cbs.gov.il/shnaton60/st19_17.pdf‬בשנים האחרונות חלה עלייה חדה‬
‫בייצוא תפו"א טריים בעיקר למדינות אירופה‪ .‬כ‪ 50% -‬מהתפו"א המיוצרים בישראל מיועדים‬
‫לייצוא אשר צמח בהדרגה מ‪ 85 -‬אלף טון בשנת ‪ 1999‬ל‪ 335 -‬אלף טון בשנת ‪ .2007‬מתוך‬
‫כלל‬
‫תפו"א‬
‫לייצוא‬
‫כ‪-‬‬
‫‪15%‬‬
‫מיוצרים‬
‫בשיטה‬
‫האורגנית‬
‫(‪.)http://www.cbs.gov.il/www/publications09/haklaut08/excel/t07.xls‬‬
‫בישראל גידול תפו"א מתבצע בשתי עונות עיקריות‪ ,‬אביב וסתיו‪ .‬באביב‪ ,‬מקור‬
‫פקעות הזריעה הוא מארצות צפון אירופה ואילו בעונת הסתיו נעשה שימוש בפקעות לזריעה‬
‫הנאספות במועד מוקדם במהלך הגידול האביבי (‪ .)Tsror et al, 1999a‬ייבוא חומר ריבוי רב‬
‫כל כך מהווה גורם משמעותי בהחדרת מחלות הנישאות על גבי הפקעות המאלחות את‬
‫הקרקע בפתוגנים שונים‪ ,‬ולעיתים מוחדרים גם פתוגנים חדשים לארץ בדרך זו‪.‬‬
‫‪ 1.2‬פיסיולוגיה ופתולוגיה של פקעות תפו"א‬
‫צמח תפו"א הינו עשבוני‪ ,‬חד עונתי הנמנה על משפחת הסולניים‪ .‬מוצאו של הצמח‬
‫בהרי האנדים באמריקה הדרומית (‪ .)Hawkes, 1978‬האיבר הנאכל הוא הפקעת בה נאגרות‬
‫פחמימות מורכבות (עמילן) בשיעורים שנעים בין ‪ 15-22%‬על פי תנאי הגידול והזן‬
‫(‪ .)Woolfe, 1987‬הפקעת הינה גבעול תת אדמתי מעובה המורכב ממספר פרקים בעלי‬
‫עלים גלדנים ובלתי מפותחים‪ ,‬אשר בחיקם קיימים ניצנים רדומים ("עיניים") ובקודקודה‬
‫הניצן הקודקודי‪ .‬קליפת הפקעת מכילה עדשתיות רבות המשמשות למעבר מים וגזים (כגון‬
‫חמצן ופחמן דו‪ -‬חמצני ‪ -‬פד"ח) בין פנים הפקעת והסביבה (שהם‪ .)1992 ,‬בחתך אורך של‬
‫‪8‬‬
‫הפקעת מבחינים בארבעה חלקים עיקריים (איור ‪ :)1‬פרידרם‪ ,‬קורטקס‪ ,‬צרורות ההובלה‬
‫ורקמת הפרנכימה הפנימית (‪.)Woolfe, 1987‬‬
‫איור ‪ : 1‬ציור פקעת תפו"א בחתך‬
‫אורך ומרכיביה העיקריים‬
‫‪(www.geochembio.com/IMG/potato‬‬‫)‪anatomy.png‬‬
‫‪ 1.2.1‬קליפת הפקעת‪ :‬קליפת פקעות תפו"א נוצרת במהלך הגידול על ידי חלוקות‬
‫תאים אולם היא מתייצבת‪ ,‬כלומר אינה ניתנת לקילוף ידני‪ ,‬רק עם ההאטה או הפסקה של‬
‫גידול הפקעות‪ .‬לקליפה יציבה ואיכותית חשיבות רבה בשמירת איכות הפקעת לאחר האסיף‬
‫במניעת הורקה וצבירת אלקלואידים‪ ,‬בהפחתת איבוד מים‪ ,‬והגדלת העמידות לפציעות‬
‫ומחלות במהלך האחסון (‪ .(Lulai and Orr, 1995; Lulai and Corsini, 1998‬קליפת הפקעת‬
‫היא רקמת הפרידרם‪ ,‬המחליפה את שכבת האפידרמיס בשלבים מוקדמים של התפתחות‬
‫הפקעת (‪ .)Yamaguchi et al, 1964‬פרידרם הפקעת מורכב משלושה סוגי תאים‪ :‬פלם‬
‫(‪ ,)phellem‬פלוגן (‪ )phellogen‬ופלודרם (‪( (Reeve et al, 1969) )phelloderm‬איור ‪.)2‬‬
‫הפלם מרכיב את השכבה החיצונית של הפרידרם והוא מאופיין במבנה של עמודי תאים‬
‫שטוחים המכילים חומר דמוי שעם הנקרא סוברין‪ .‬תאים אלה צוברים סוברין בדופן התא‬
‫הראשוני בכמות גבוהה (שיעום) ומתים ובכך יוצרים את הקליפה )‪ .(Esau, 1965‬הפלוגן‬
‫(קרוי גם קמביום השעם) מורכב מתאים מריסטמטיים היוצרים את תאי הפלם המשועמים‬
‫שמעליהם‪ ,‬ואת תאי הפלודרם כלפי פנים הפקעת (איור ‪ .)2‬כל עוד הפקעת גדלה‪ ,‬תאי‬
‫הפלוגן מתחלקים כדי ליצור תאי פלם נוספים‪ .‬בשלב זה דפנות תאי הפלוגן דקים‪ ,‬נקרעים‬
‫בקלות וגורמים להפרדת הקליפה מהפקעת (‪ .)Lulai and Freeman, 2001‬כאשר הפקעת‬
‫מפסיקה לגדול‪ ,‬אם בשל הזדקנות הצמח או בשל קטילת הנוף‪ ,‬תאי הפלוגן מפסיקים‬
‫להתחלק‪ ,‬דפנותיהם מתעבות‪ ,‬נוצרים קשרים בין מולקולות פקטין בדפנות תאים שכנים‪,‬‬
‫והקליפה "נדבקת" לפקעת‪ .‬תהליך זה נקרא התייצבות הקליפה (‪Braue et al, ( )skin-set‬‬
‫‪ .)1983; Haderlie et al, 1989; Sabba and Lulai, 2002‬התייצבות הקליפה הינה תהליך‬
‫איטי‪ ,‬הנמשך ממועד קטילת הנוף ועד לאסיף הפקעות‪ .‬בתהליך זה הפקעות טמונות בקרקע‬
‫‪9‬‬
‫למשך כשלושה עד חמישה שבועות בהתאם לסוג הקרקע‪ ,‬טמפרטורת הסביבה‪ ,‬לחות‬
‫הקרקע והזן‪ .‬במצב בו נחשפים תאי קורטקס (דמויי פרנכימה) לפציעה‪ ,‬מושרית יצירה של‬
‫שכבת סגירה (‪ ,)closing layer‬תאי פרנכימה האוגרים בדופן חומרים‬
‫וקאלוז‪ ,‬ורק לאחר מכן נוצרת רקמת פרידרם מתחתיה‬
‫כגון ליגנין ‪,‬סוברין‬
‫( ‪Thomson et al, 1995; Lulai,‬‬
‫‪)2001‬‬
‫‪:2‬‬
‫איור‬
‫מבנה הפרידרם של‬
‫פקעת תפו"א ( ‪Lulai,‬‬
‫‪ .)2002‬התיאור מציג‬
‫את תאי הפלם‪ ,‬הפלוגן‬
‫והפלודרם מתוך פקעת‬
‫שקליפתה לא התייצבה‬
‫ועל כן הקריעה היא‬
‫באזור הפלוגן ‪.‬‬
‫‪Phellogen‬‬
‫‪Shear‬‬
‫‪Component‬‬
‫‪Phellem‬‬
‫‪Phellogen‬‬
‫‪Phelloderm‬‬
‫‪Cortical‬‬
‫‪Cells‬‬
‫‪ 1.2.2‬ביוסינתזת סוברין‪ :‬סוברין הוא תרכובת של פולימרים ארומאטיים (פנולים)‬
‫ופולימרים אליפטיים (‪ ,)Kolattukudy et al, 1980‬אשר נמצאת באזורים רבים בצמח בעיקר‬
‫כשיש צורך למנוע אובדן או חדירה של נוזלים‪ .‬שני מרכיבים אלו קרויים ‪suberin ( SPAD‬‬
‫‪ )poly aliphatic domain‬ו‪ .)suberin poly phenolic domain( SPPD -‬למרות מחקרים רבים‬
‫שנעשו להבנת תהליך הביוסינתזה של מרכיבי הסוברין‪ ,‬התהליך אינו פתור לחלוטין אך נוצר‬
‫בסיס מידע רחב באשר למסלולים הביוכימיים המעורבים בו‪.‬‬
‫‪ 1.2.2.1‬המרכיב הפנולי בסוברין‪ :‬המרכיב הפנולי דומה יותר לליגנין‪ ,‬כלומר‬
‫תרכובת של מונוליגנולים (‪ ;monolignols‬כגון ‪)coumaryl, coniferyl and sinapyl alcohols‬‬
‫שהם תוצרי מעגל הפנילפרופנואידים‪ .‬מרכיב עיקרי נוסף הוא נגזרות של חומצה‬
‫הידרוקסיצינמית (‪Kolattukudy, 1980, 1984; Neto et al, 1996; ( )hydroxycinnamic acid‬‬
‫‪ .)Conde et al, 1998; Graça and Pereira, 2000a, 2000b‬אין מידע רב על הפולימריזציה‬
‫של המרכיב הפנולי בסוברין‪ ,‬אולם ישנה הצטברות של ראיות הקושרות פראוקסידאז אניוני‬
‫אשר על ידי הפיכת מי חמצן (‪ )H2O2‬למים מעורב ביצירת המרכיב הפנולי ‪(Kolattukudy,‬‬
‫)‪ .1980; Bernards and Razem, 2001‬מקור מי החמצן עדיין לא הוכח אך הוצע על ידי‬
‫)‪ Bernards (2002‬כי המקור בתפו"א הוא ‪ NADPH-dependent oxidase‬כפי שהוכח לפני כן‬
‫בסולניים שונים‪ .‬כפי שיפורט בהמשך‪ ,‬מעורבותו של פראוקסידאז אניוני ספציפי הוכחה‬
‫בתהליכי סובריזציה בתפו"א ועל כן שינוי בביטוי הגן המקודד לאנזים זה ברקמה מצביע על‬
‫שינוי בביוסינתזה של סוברין‪ .‬באנלוגיה לתהליכי חמצון המתרחשים בתהליך הליגניפיקציה‬
‫(הרבצת ליגנין) הוצע כי המרכיב הפנולי בסוברין מפולמר בתיווך פראוקסידאז ומי חמצן‬
‫‪10‬‬
‫(‪ )H2O2‬ומכאן שמו ‪(Kolattukudy, )suberization-associated anionic peroxidase( POP_A‬‬
‫)‪ .1980‬מאוחר יותר מעורבותו של פראוקסידאז אניוני )‪ )anionic peroxidase‬נצפתה‬
‫בסובריזציה כתוצאה מתהליך החלמה מפציעה בקליפת תפו"א ‪(Borchert, 1978; Borchert‬‬
‫‪ .)and Decedue, 1978; Espelie and Kolattukudy, 1985; Espelie et al, 1986‬בהתאם לכך‬
‫הוגדרה פעילותו הביוכימית ורצף ‪ cDNA‬של הגן רוצף ;‪Roberts and) Kolattukudy, 1989‬‬
‫‪ .)Roberts et al, 1988‬בעבודה נוספת הוכח כי לתהליך הפולימריזציה של המרכיב הפנולי‬
‫יש צורך ב‪ H2O2 -‬בעזרת פעילותו של פראוקסידאז אניוני‪.Bernards) (and Razem, 2001‬‬
‫לאחרונה הצטברו עדויות נוספות לביטוי מוגבר של הגן ‪ POP_A‬ולנוכחות התוצר החלבוני‬
‫בקליפה‪ ,‬לעומת העדרותו בתאי בפרנכימה ונראה שהדבר כרוך במעורבות בתהליך סינתזת‬
‫הסוברין (‪.)Barel and Ginzberg, 2008‬‬
‫‪ 1.2.2.2‬המרכיב האליפתי בסוברין‪ :‬הגורם האליפטי תואר כפוליאסטר תלת מימדי‬
‫המורכב מ‪ α,ω-dioic acids -‬ו‪ , ω-hydroxy acids -‬חומצות שומן ארוכות ( ‪very long chain‬‬
‫‪ ,)fatty acids- VLCFAs‬חלקן מחומצנות‪ ,‬חומצות הידרוקסי‪-‬צינאמאט אסטריות )‪esterified‬‬
‫‪ )hydroxycinnamic acids‬ופוליאסטרים של גליצרול‪Kolattukudy 1980, 1984; Cottle and ( .‬‬
‫‪ .)Kolattukudy, 1982; Holloway, 1983; Graça and Pereira, 1997‬חומצות שומן ארוכות‬
‫(‪ )VLCFs –C20-C32‬ונגזרותיהן מרכיבות את הגורם האליפאטי בסוברין‪ .‬תחילת תהליך‬
‫ההתארכות של ‪ VLCFs‬מקוטלז על ידי האנזים ‪ )KCS( 3-ketoacyl-CoA synthase‬וריאקציה זו‬
‫היא המגיב המגביל של התהליך כולו (‪ .)Suneja et al, 1991; Cassagne et al, 1994‬אנזים זה‬
‫לוקח ‪( Malonyl-CoA‬תוצר מטבוליזם הסוכרים) וחומצת שומן באורך של ‪( 18:0‬ממעגל‬
‫חומצות השומן) תוך שחרור מולקולת פד"ח ויוצר ‪(Schreiber et al, 2000( β-ketoacyl-CoA‬‬
‫(מסלול מספר ‪ ,2‬איור ‪.)3‬‬
‫אנזים נוסף בעל חשיבות בתהליך זה הוא ‪ cytochrome P450 monooxygenase‬אשר‬
‫משתמש במולקולת חמצן ו‪ ,NADPH -‬ליצירת אומגה הידרוקסילציה של חומצות שומן‪,‬‬
‫שבצורות שונות יחד עם גליצרול‪ ,‬מהוות אבן בסיס למרכיב האליפאטי של סוברין (מסלול‬
‫מספר ‪ ,6‬איור ‪ .)3‬עלייה בביטוי המקודד לאנזים זה יכולה להצביע על יצירת סוברין‪.‬‬
‫המרכיב העיקרי בגורם האליפטי של הסוברין הוא תערובת של ‪ ω-hydroxyacids‬ו‪-‬‬
‫‪ α,ω-diacids‬באורך של ‪( C16-C28‬בעיקר ‪ )C18‬יחד עם גליצרול (‪.(Schreiber et al, 2005‬‬
‫אומגה הידרוקסילציה של חומצות שומן היא ריאקציה אשר מקוטלזת על ידי ציטוכרום ‪P450‬‬
‫מונואוקסיגנאז (‪ .)cytochrome P450 monooxygenases- CYP‬תפקיד הגן ‪CYP86A1‬‬
‫בביוסינתיזה של סוברין תואר בשורש צמח ארבידופסיס (‪.(Li et al, 2007; Hofer et al, 2008‬‬
‫לאחרונה ‪ Serra‬וחובריו (‪ )2009b‬הראו כי השתקה של הגן ‪ CYP86A33‬בפרידרם פקעת‬
‫‪11‬‬
‫ מעוותת את למלת הביניים בתאים ופוגמת‬,‫ משנה את הרכב הסוברין‬,RNAi ‫תפו"א בעזרת‬
.‫ביכולת הפרידרם לתפקד כמחסום מים‬
‫) בצמח המודל‬multigene( ‫ גנים‬21 ‫ מקודדים על ידי משפחת גנים המונה‬KCS ‫חלבוני‬
‫) ולאחרונה מספר מחקרים הראו את מעורבות‬Joube`s et al, 2008( Arabidopsis thaliana
,)Todd et al, 1999, Franke et al, 2008( ‫ בביוסינתזה של סוברין בשורש ארבידופסיס‬KCS ‫של‬
Serra .(Vogg et al, 2004; Leide et al, 2007( ‫כמו גם בשעוות קוטיקולה של פירות העגבנייה‬
‫ בפרידרם‬StKCS6 (Solanum tuberosum KCS6) ‫) הראו כי השתקה של הגן‬2009a( ‫וחובריו‬
‫ מורידה את אורך חומצות השומן וכתוצאה מכך‬RNAi ‫פקעת תפו"א מהזן דזירה בעזרת‬
.‫פקעות אלה איבדו יותר נוזלים‬
Carbohydrate
Metabolism
Fatty Acid
Biosynthesis
O2
NADPH
16:0
18:0
2
NADPH
3
β-Ketoacyl-CoA CO
2
9
9-OH-FA
NAD(P)H
5
O2
NAD(P)+
?
7
NADH
8
NADP+
9,10-epoxy- ω-oxo-FA
NADPH
NADPH
NADP+
9,10-diOH- α,ω-dioic acids
(predominantly 18:0)
9,10-epoxy- α,ω-dioic acids
(predominantly 18:0)
Poly(Aliphatic)
Domain,
Waxes
VLCFA
Ferulates
Feruloyltyramine
Poly(Phenolic)
Domain
21?
21?
Benzoates
H2 O
Monolignols
AcetylCoA
21
24
CoASH
NADH
23
O2
16
α,ω-dioic acids
18 CoASH
Phenylpropanoid
Metabolism
NADP+
NADP+
2
NADP+
1o Alcohols
12
ω-oxo-9,10-diOH-FA
NADPH O 2
13
NADP+
ω-oxo-FA O
15
NADPH
18:1-ω-OH-FA
NADPH
9,10-epoxy-ω-OH-FA
NADPH
14
ω-OH-FA
6
NAD+
Ammonia
Recovery
9,10,ω-triOH-FA
NADPH NADP+
17
Glycerol-P
10
Lipid Modification
NADP+
NADPH NADP+
9,ω-diOH-FA
20:0
22:0
24:0
28:0
30:0
32:0
β-Hydroxyacyl-CoA
4
Chain
H 2O
Elongation
2
trans-∆ Enoyl-CoA
O2
NADP+
18:1
NADP+
9,10-diOH-FA
O2
11 NADPH
1
11
NADPH
NAD+
NADP+
NADPH
O2
NADH
1
O2
NADP+
CoASH
22 Hydroxycinnamoyl-
NAD+
H 2O
CoA’s
H2 O2
₋
2
O2
NADP+ NADPH
19
O2
Hydrogen Peroxide
Generation
‫ הסכימה נבנתה על‬.Bernards (2002) ‫ ביוסינטזה של סוברין כפי שהוצעה על ידי‬: 3 ‫איור‬
‫ חצים מלאים מורים‬. ‫מידע שהתקבל ממחקרים שבוצעו על מגוון צמחים אך בעיקר על תפו"א ותירס‬
‫ תיבות‬.‫ ריאקציות שסומנו בחצים מקוטעים משוערות וטעונות הוכחה‬,‫על ריאקציות ידועות ונחקרות‬
‫ האנזימים‬.)‫ (שסומנו בהצללה כהה יותר‬SPPD ‫ או‬SPAD ‫מוצללות מסמנות מרכיבים ידועים של‬
-‫ ו‬6 ,2( ‫ נבדקו בעבודה זו ומסומנים בצהוב‬, POP_A-‫ ו‬CYP86A33 , StKCS6 ‫המקודדים על ידי הגנים‬
.)‫ בהתאמה‬,21
12
‫‪ 1.3‬אחסון והובלת פקעות בישראל‬
‫הבעיות העיקריות המתעוררות במהלך אחסון והובלת הפקעות הן איבוד משקל‪,‬‬
‫נביטה‪ ,‬רקבונות והמתקה‪ .‬חדרים לאחסון פקעות תפו"א מאווררים היטב וזאת על מנת‬
‫לאפשר סילוק פד"ח וחום‪ ,‬הנובעים מנשימת הפקעות‪ ,‬וכן לשם החדרת חמצן ולחות למצבור‬
‫הפקעות (‪ .)Rostovski, 1987‬הטמפרטורה המקובלת לאחסון תפו"א בארץ היא ‪3-8°C‬‬
‫לפקעות המיועדות למאכל ו‪ 8-12°C -‬לפקעות המיועדות לתעשייה (אפק וורשבסקי‪.)1998 ,‬‬
‫ללחות האוויר יש חשיבות רבה‪ ,‬ככל שהלחות היחסית גבוהה יותר‪ ,‬אך בלא שיתהוו על גבי‬
‫הפקעות מים חופשיים הגורמים לרקבונות‪ ,‬הן תשמרנה באיכות טובה יותר‪ .‬הלחות היחסית‬
‫המקובלת היא כ‪ 92-94% -‬ואחסון ברמות לחות נמוכות יותר גורם לאובדן של משקל‬
‫הפקעות ומוצקותן (‪.(Meijers, 1987‬‬
‫בארץ לא נהוג לשטוף או לחטא פקעות לאחר האסיף ובמהלך האחסון והמעבר‬
‫מהשדה אל חדרי האחסון הוא ישיר בין אם האסון הוא בתפזורת ובין אם באריזה ‪ .‬השיטות‬
‫המקובלות לאחסון תפו"א בישראל הן במיכלי עץ או שקי צובר ולעיתים אף בערימות ענק‬
‫שבתחתיתן צינורות אוורור‪ .‬שקי הצובר מכילים ‪ 1.25‬טון פקעות והם עשויים מניילון ארוג‬
‫המאפשר את מעבר הגזים והלחות‪ .‬הצוברים מונחים בכלובי מתכת המאפשרים אחסון‬
‫לגובה ומרווח מספיק למעבר האוויר בין הצוברים (אפק וורשבסקי‪ .)1998 ,‬העבודה‬
‫הנוכחית מתמקדת בפקעות מהזן ניקולה הנאספות לפני התייצבות קליפתן ומיועדות לייצוא‬
‫ללא אחסון או לאחר אחסון קצר בשקי צובר המכילים כבול ‪ .‬על מנת להתגבר על בעיית‬
‫איבוד הנוזלים בפקעות אלו‪ ,‬מוסף כבול רטוב (‪ 60%‬רטיבות)‪ ,‬שעבר פסטור בקיטור‪ ,‬ביחס‬
‫של ‪ 150-200‬ליטר ל‪ 1.25 -‬טון פקעות‪ .‬בעת יובש בתוך הצובר הכבול פולט נוזלים לסביבה‬
‫וכשהלחות עולה הכבול קולט‬
‫נוזלים‪ .‬נוכחות הכבול מונעת היווצרות מים חופשיים או‬
‫התייבשות הצובר ובכך מונעת איבוד נוזלים והתרככות הפקעות‪.‬‬
‫לקצב ולעוצמת הנשימה בפקעות מאוחסנות יש השפעה ניכרת על איכות הפקעות‬
‫ורמת החומר היבש בהן‪ ,‬זאת מאחר ובתהליך הנשימה נצרך גלוקוז שמקורו בעמילן ( ‪Es‬‬
‫‪ .)and Hartmans, 1987‬קצב הנשימה של פקעות בתרדמה הוא כמחצית מהקצב של פקעות‬
‫בשלב הנביטה (‪ .)Burton, 1974‬עוצמת הנשימה תלויה בגורמים רבים כגון גיל פיסיולוגי‪,‬‬
‫הזן‪ ,‬שלמות הקליפה‪ ,‬מחלות‪ ,‬תהליך ההגלדה וטמפרטורת האחסון‪ .‬פקעות צעירות‬
‫מבחינה פיסיולוגית‪ ,‬כאלה שטרם הגיעו לבשלות‪ ,‬עשויות לנשום בעוצמה של עד פי עשר‬
‫מפקעות בשלות (‪.)Es and Hartmans, 1987‬‬
‫‪ 1.3.1‬מחלות אחסון בתפו"א‪ :‬אחסנה נאותה מאפשרת לתוצרת הקטופה להגיע לידי‬
‫הצרכן טרייה ופטורה ממחלות‪ .‬הבשלת פירות וירקות והפציעה הכרוכה באיסופם מהשדה‬
‫‪13‬‬
‫מגבירים את רגישותם לפתוגנים‪ .‬התארכות שלב האחסון מובילה להתעצמות תהליכים‬
‫פיסיולוגיים הקשורים בהזדקנות הרקמה הצמחית‪ ,‬ובמקביל להגברת רגישות לפתוגנים‬
‫מסוימים (ברקאי‪-‬גולן‪ .)1997 ,‬רוב האילוח בפתוגנים מתרחש בשדה‪ ,‬ומהווה מקור מדבק‬
‫למחלות האחסון‪ .‬נביטת גופי קיימא של פתוגנים באחסון מושפעת מתנאי הסביבה אליהם‬
‫נחשפת התוצרת כגון טמפ'‪ ,‬לחות יחסית‪ ,‬מים חופשיים‪ ,‬ריכוז פד"ח‪ ,‬קרבה של רקמה‬
‫פצועה ועוד‪ .‬מחלות אחסון בירקות ופירות בכלל‪ ,‬ובתפו"א בפרט‪ ,‬מושפעים ישירות מאיכות‬
‫ומהירות הגלדת פצעי האסיף‪ .‬פתוגנים יכולים לחדור לפקעת דרך צינורות ההובלה‪,‬‬
‫עדשתיות פצועות ופצעים בקליפה‪ .‬חדירת הפתוגן לפרנכימת הפקעת תלויה במידה רבה‬
‫בכושרו להפריש אנזימים המסוגלים לפרק את התרכובות הפקטיות הבלתי מסיסות ובכך‬
‫לגרום להיפרדות תאים והתפרקות הרקמה‪ .‬תהליך ההתפרקות מוביל להגברת חדירותן של‬
‫דפנות התאים‪ ,‬מות התאים ודיפוזיה של חומרי מזון התורמים להתפתחות הפתוגן )‪Mount,‬‬
‫‪ .)1980‬פקעות מאוחסנות עלולות להירקב כתוצאה מהתקפה‬
‫על‪ -‬ידי מספר סוגים של‬
‫פטריות וחיידקים‪ .‬הפטרייה פוזריום (‪ )Fusarium spp.‬חודרת בעיקר דרך פצעים וגורמת‬
‫לריקבון יבש עמוק; הפטרייה אלטרנריה (‪ )Alternaria spp.‬גורמת לכתמים כהים ומשוקעים‬
‫בגדלים שונים; פיטופטורה (‪ )Phytophthora infestans‬גורמת לכתמים חומים אדמדמים‬
‫ויבשים החודרים לפקעת ללא גבול ברור ואלה הופכים בהמשך לרקבונות רכים עקב אכלוס‬
‫על ידי חיידקים סאפרופיטיים; הלמינתוספוריום (‪ )Helminthosporium spp.‬היא פטרייה‬
‫המתרבה באחסון וגורמת למחלת "כתמי כסף" ואיבוד משקל בגלל פגיעה בקליפה‬
‫;קולטוטריכום (‪ )Colletotrichum coccodes‬גורמת כתמים דמויי "כתמי כסף" ועליהם קשיונות‬
‫בגודל של כ‪ 0.1 -‬ס"מ; סטריפטומיצס (‪ )Streptomyces scabies‬הוא חיידק ה גורם לכתמי‬
‫גרב הנראים כשקעים דמויי מכתש; ואילו החיידק פקטובקטריום ( ‪Pectobacterium‬‬
‫‪ ,carotovorum‬לשעבר ‪ )Erwinia carotovora‬גורם ריקבון רך ולח עם ריח רע‬
‫אופייני )‪.(Meijers, 1987; Rich, 1968; Snowdon, 1992‬‬
‫‪ 1.3.2‬השפעת משטרי דישון על מחלות תפו"א‪ :‬לשינויים ועקות במשטרי ההזנה‬
‫בשלב הגידול ישנן השפעות על איכות וכמות היבול‪ .‬בתפו"א ישנה חלוקת משאבים בין איברי‬
‫אגירה‪ ,‬תשמורת וריבוי לבין ביומאסת הנוף‪ .‬שינויים במינראלים שונים עשויים להטות חלוקה‬
‫זו לכיוון מסוים )‪ .(Taiz and Zeiger, 1998‬כמו כן משטרי הזנה שונים מעודדים או מעכבים‬
‫מחלות בכל שלבי הגידול והאחסון זאת בשל השפעה על הפיסיולוגיה של הפרי הנאסף‬
‫ויכולתו להתגונן בפני פתוגנים )‪ .(Lisinska and Leszczynski, 1987‬יישום חנקן וסידן בריכוזים‬
‫אופטימאליים נתגלה כמעורב בתהליכים חיוניים רבים בהגנת הפקעת כגון חיזוק דופן התא‪,‬‬
‫העלאת ייצור חומצות אמינו ויצירת מהירה של קליפה יציבה )‪ .(Lambert et al, 2005‬בדישון‬
‫אופטימאלי של חנקן וסידן‪ ,‬התקבלו שינויים בהתפתחות מספר מחלות תפו"א בשדה כגון‬
‫‪14‬‬
‫מחלת הנבילה‪ ,‬הגרב שחור‪ ,‬ריקבון רך ועוד ( ‪Tawfik et al, 1996; McGuire and Kelman,‬‬
‫‪ .1986; (Bain and Perombelon, 1996; Honeycutt et al, 1996‬עבודות מעטות בוצעו על‬
‫השפעת דישון על מחלת הריזוקטוניה למרות היותה מחלה המסבה נזק רב לגידול‪.‬‬
‫)‪ McGregor and Wilson (1966‬הראו כי מתן ריכוז אופטימאלי של מנגן הוריד נגיעות‬
‫בקשיונות בפקעות תפו"א מ‪ 25% -‬ל‪ ;11%-‬ואילו ‪ Honeycutt‬וחובריו )‪ (1996‬לא הצליח‬
‫להראות הבדל מובהק בנגיעות ריקבון הגבעול הנגרם על ידי ‪ R. solani‬במשטרי חנקן שונים‪.‬‬
‫ניסוי ההזנה במחקר זה יבחן את השפעת רמות גורמי ההזנה חנקן וסידן על התפתחות‬
‫כתמים כהים בפרט ו‪ R. solani -‬בכלל‪.‬‬
‫‪ 1.4‬הפטרייה הפתוגנית ‪Rhizoctonia spp.‬‬
‫הסוג ‪ Rhizoctonia‬תואר לראשונה על‪-‬ידי ‪ De candolle‬בשנת ‪ 1815‬שציין את המין‬
‫‪ R. crocorum‬כמין המייצג (‪ .)type species‬המין )‪Rhizoctonia Solani Kϋhn (Anamorph‬‬
‫שהוא המין בעל החשיבות הפיטופתולוגית הגדולה ביותר בסוג ריזוקטוניה‪ ,‬תואר על ידי‬
‫‪ Kϋhn‬בשנת ‪ .)Sneh et al, 1991; Ogoshi, 1996( 1858‬השלב המיני של הפטרייה הוא נדיר‬
‫]‪ [Teleomorph: Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk‬ועל כן השם הא‪ -‬מיני נותר נפוץ‬
‫בספרות‪ .‬תפטיר הפטרייה ריזוקטוניה בעל צורה אופיינית‪ ,‬כל תא מסתעף‪ ,‬כאשר מחיצת‬
‫התא נמצאת במרחק קטן ממקום ההסתעפות והתפטיר באזור ההסתעפות מעט יותר צר‬
‫)‪ (Parmeter and Whitney, 1970; Sneh et al, 1991‬ההסתעפויות הראשונות מופיעות בזוית‬
‫של ‪ 45°‬מהקור המרכזי והסעיפים המשניים בזוית של ‪ 90°‬מהסעיף הראשוני‪.‬‬
‫‪ Rhizoctonia‬היא למעשה על‪-‬סוג (‪ )Form Genus‬הכולל מספר סוגים של פטריות‬
‫ביניהם יש פטריות פתוגניות לצמחים‪ ,‬פטריות ספרופיטיות ופטריות מיקוריטיות‪ .‬בעל‪-‬סוג‬
‫ריזוקטוניה ידועות שלוש קבוצות עיקריות בהתאם למספר הגרעינים לתא בתפטיר הצעיר –‬
‫קבוצה רב גרעינית‪ ,‬דו גרעינית וחד גרעינית‪ .‬הצורה האל‪-‬מינית ( ‪anamorph- asexsual‬‬
‫‪ )stage‬של פטריות אלה שייכת ל‪syn: Deuteromycotina, ( Mitosporic Fungi -‬‬
‫‪ .)Hawksworth et al, 1995 ( )Deuteromycetes, Fungi Imperfecti, Asexual Fungi‬היא‬
‫אינה יוצרת נבגים אל‪-‬מיניים ולכן היא שייכת לקבוצת ה‪Ulloa and ( Mycelia Sterilia -‬‬
‫‪ .)Hanlin, 2000‬לפי השלב המיני (‪ )teleomorph- sexual stage‬פטריות השייכות לעל‪-‬הסוג‬
‫ריזוקטוניה שייכות למשפחת ה‪ ,Ceratobasidiaceae -‬סדרת ה‪ ,Ceatobasidiales -‬מחלקת‬
‫ה‪ ,Hymenomycetes -‬מערכת ה‪ ,Basidiomycota -‬ולתת‪-‬ממלכת ה‪ . Basidiomycetia -‬מיון‬
‫זה נקבע בין השאר לפי מאפיינים שונים ב‪ Dolipore Septa -‬בדופן המחיצה בין תאי‬
‫התפטיר‪.‬‬
‫‪15‬‬
‫כל אחת מהקבוצות (הרב והדו גרעיניות) של ‪ Rhizoctonia spp.‬מתחלקות לקבוצות‬
‫התאם (‪ .)AG, Anastomosis Groups‬תבדידי הריזוקטוניה שקצות התפטיר שלהם מתאחים‬
‫עם קצות תפטיר של נציגי קבוצת התאם מסוימת משתייכים לאותה קבוצת התאם‪ .‬באופן זה‬
‫נעשה האפיון הטקסונומי של התבדידים (‪ .)Sneh et al, 1991; Carling et al, 2002b‬קביעת‬
‫ההשתייכות לקבוצות אנסטומוזיס נחשבת כיום למהימנה ביותר‪ ,‬והשיטות המולקולריות‬
‫המבוססות על קרבה או ריחוק גנטיים מאמתות ששיטת האנסטומוזיס אומנם מצביעה על‬
‫קרבה גנטית בין פרטים השייכים לאותה קבוצה וריחוק מפרטים השייכים לקבוצות אחרות‬
‫(‪ .)Carling et al, 2002b‬לעיתים‪ ,‬קורי תבדידים מסוימים מתאחים פחות טוב עם נציגי קבוצת‬
‫אנסטומוזיס אליה משתייך התבדיד הנבדק (‪ .)Martin, 2000‬במקרים כאלה האפיון יכול‬
‫להיות לא מדויק‪ ,‬לעומת זאת יש תבדידים שאינם מתאחים אפילו עם עצמם ( ‪Carling et al,‬‬
‫‪ .)1996‬בהתאם לכך‪ ,‬המין ‪ R. solani‬חולק ל‪ 13 -‬קבוצות התאם לפי היכולת לעבור איחוי‬
‫ציטופלסמטי‪ .‬קבוצת ההתאם ‪ AG3‬נחשבה כהומוגנית הידועה ביצירת קשיונות שחורים‬
‫בגודל ‪ 1-20‬מ"מ על גבי קליפת תפו "א‪ ,‬אולם לאחרונה התרבו העדויות על פונדקאים‬
‫וסימפטומים נוספים כגון‪ :‬כתמים חומים בחצילים הנגרמים על ידי תבדיד מקבוצה זו‬
‫) ‪ ,(Kodama et al, 1982‬וכתמי עלים בצמחי עגבנייה וטבק ( ‪Data et al, 1984; Shew and‬‬
‫‪ .)Main, 1985; Shew and Main, 1990‬תבדידי ‪ AG3‬המוכרים כפתוגנים של תפו"א סווגו‬
‫כתת‪-‬קבוצה של ‪ ,PT‬והפתוגנים של צמחי הטבק סווגו כתת‪-‬קבוצה ‪Stevens Johnk .TB‬‬
‫וחובריו (‪ )1993‬הראו כי תבדידי ‪ AG3‬מצמחי עגבנייה שונים בהופעתם בתרבית‪ ,‬פרופיל‬
‫חומצות שומן וטווח פונדקאים שונים בין שתי תתי הקבוצות‪ Kuninaga .‬וחובריו (‪ )2000‬הראו‬
‫הבדל מולקולרי בריצפי ‪ rDNA-ITS‬של שני תבדידים אלו‪.‬‬
‫‪ 1.4.1‬שימוש במקטעי ‪ ITS-rDNA‬לסיווג ריזוקטוניה‪ :‬מקטעי ‪internal transcribed‬‬
‫‪ )ITS( spacer‬הם רצפים לא מקודדים שמורים יחסית הנמצאים בין רצפים המקודדים ל‪-‬‬
‫‪( rDNA‬איור מס' ‪.)4‬‬
‫איור ‪ : 4‬אזורי‬
‫ומיקום‬
‫‪ITS-rDNA‬‬
‫תחלים נפוצים עליהם‪.‬‬
‫האזורים הכהים הינם‬
‫רצפי ‪ DNA‬המקודדים‬
‫היחידות‬
‫לתת‬
‫המרכיבות את ה‪-‬‬
‫‪ ,rDNA‬החצים מראים‬
‫את מיקום התחלים‬
‫בהם משתמשים להגברת להגברת רצפי ה‪ ITS-rDNA -‬בריאקציית ‪ , PCR‬כיוון הפריימר ככיוון החץ‬
‫(‪.)Boysen et al, 1996‬‬
‫‪16‬‬
‫במחקרים קודמים הגבירו מקטעי ‪ ITS-rDNA‬בתבדידי ריזוקטוניה על מנת לבדוק את‬
‫השתייכותם לקבוצת אנסטומוזיס‪ .‬קביעת הקבוצות בשיטה זו נעשתה על ידי הערכת השוני‬
‫בין מקטעי ‪ ITS-rDNA‬בין אם בחיתוך בעזרת אנזימי רסטריקציה והשוואת מספר וגודל‬
‫המקטעים שהתקבלו (‪ )Botha, 2003; Martin, 2000; Toda et al, 1999 ( )RFLP‬או על ידי‬
‫ריצוף אזורי ‪ ITS-rDNA‬והשוואה בין הרצפים שהתקבלו ( ‪Boysen et al, 1996; Kuninaga et‬‬
‫‪ .)al, 1996; Sharon et al, 2007‬בהשוואה בין שיטת איחוי קצות התפטיר לשימוש ברצף‬
‫מקטעי‬
‫‪ ITS-rDNA‬במספר תבדידי ריזוקטוניה נמצא כי קבוצות התבדידים על העץ‬
‫הפילוגנטי שנבנה מריצוף מקטעי ‪ ITS-rDNA‬תואם את קבוצות ההתאם שנקבעו על ידי‬
‫בדיקות האנסטומוזיס‪ .‬על פי העץ הפילוגנטי ניתן היה להבחין גם בתת קבוצות שלא נראו‬
‫בבדיקות אנסטומוזיס קלאסיות ( ‪Carling et al, 2002b; Gonzalez et al, 2001; Kuninaga et‬‬
‫‪.)al, 1997‬‬
‫‪ 1.4.2‬תהליך האילוח של צמחים\פקעות ב‪ :R. solani -‬בשל מחסור בנבגים מיניים או‬
‫קונידיות ‪ R. solani‬שורדת בקרקע ועל חומר אורגני כתפטיר ובעיקר כק ישיונות‪ .‬קשיונות הן‬
‫תפטיר דחוס אשר מסייע לפטרייה לשרוד מצבים לא אופטימאליים ‪ .‬הפטרייה נפוצה בעיקר‬
‫בקישיונות בעזרת רוח‪ ,‬מים ומעבר בידי מגדלים על זרעים או שתילים‪Winhold and Motta .‬‬
‫(‪ )1973‬ומאוחר יותר ‪ )1981( Armentrout and Downer‬מצאו שבאילוח נבטי כותנה‬
‫ב‪ R. solani -‬תפטיר הפטרייה נפגש עם היפוקוטיל הנבט‪ ,‬גדל לאורכו ומסתעף‪ .‬גרדיאנט‬
‫כימי של חומצות אמינו ‪,‬סוכרים‪ ,‬חומצות אורגאניות ועוד מובילים לנביטת קשיונות וצמיחת‬
‫התפטיר לכיוון המקור‬
‫)‪ .(Lehtonen et al, 2008‬הצטברות של קורים והפרשת מוצילג‬
‫(‪ )mucilage‬אפשרה לקורי הפטרייה להיצמד לשטח פני הצמח וזה לזה‪ ,‬תוך יצירת תאים‬
‫קצרים וכרית הדבקה ממנה יצאו ‪ Infected pegs‬רבים שחדרו דרך האפידרמיס‪ .‬תהליך‬
‫החדירה אף מלווה בהפרשת אנזימים כגון קוטינאזות ופקטינאזות‬
‫‪(Baker and Bateman‬‬
‫‪ .(1978‬תחת כרית ההדבקה הופיעו הסימפטומים הראשוניים של שינוי בצבע ההיפוקוטיל‪.‬‬
‫באזור התפתחה נקרוזה והרס הרקמה‪ .‬הזמן שעבר מרגע ההדבקה ועד ליצירת הנקרוזה‬
‫(ב‪ )28°C -‬היה כ‪ 30 -‬שעות‪.‬‬
‫‪ R. solani 1.4.3‬בצמחי תפו"א‪ :‬אילוח פקעות תפו"א ב‪ R. solani -‬מקורו בקרקע או‬
‫זרעים מאולחים (‪ .)Powelson et al, 1993; Jeger et al, 1996‬בשנים האחרונות הפכה‬
‫מחלה זו לחשובה ביותר בגידול תפו"א בישראל‪ ,‬המסבה הפסדים קשים לענף ( ‪Tsror et al,‬‬
‫‪ .)1993‬נזקי המחלה הם‬
‫כמותיים על ידי כיבים בצווא ר הגבעול (‪ ,)cankers‬בשורשים‬
‫ובסטולון‪ ,‬תמותת נבטים לפני ההצצה וכן בהפחתת מספר הפקעות וגודלן ‪(Carling et al,‬‬
‫)‪ .1989; Platt, 1989‬איכותיים בשל צמצום מערכת השורשים‪ ,‬קשיונות על פקעות בת‬
‫‪17‬‬
‫(‪ )black scurf‬וירידה באיכות הקליפה (‪ .)Jeger et al, 1996‬מתוך ‪ 13‬קבוצות האנסטומוזיס‬
‫הקיימות‪ AG3 ,‬היא הקבוצה הגורמת לתופעות האופייניות לריזוקטוניה בתפו"א ‪(Bandy et‬‬
‫)‪ .al, 1988‬אולם‪ ,‬גם קבוצות נוספות מאכלסות פקעות ו שורשים של צמחי תפו"א כגון ‪AG5‬‬
‫)‪ AG4 ,AG1-2 )Jager and Velvis, 1989‬ו‪.(Hide and Firmager, 1990) AG8 -‬‬
‫‪ 1.5‬הכתמים הכהים בתפו"א מהזן ניקולה‪ :‬תאור התופעה‬
‫בעשר השנים האחרונות חלה עלייה בביקוש בשווקים באירופה לתפו"א צעירים‬
‫הנאספים לפני התייצבות קליפתם‪ .‬הפקעות נאספות מיד לאחר קטילת הנוף בעודן קליפות‬
‫דבר המוביל לפגיעות הפקעות וחשיפתן לנזקים מכאניים‪ .‬אחד הגורמים העיקריים לפחת‬
‫בזן ניקולה בשנים האחרונות מקורו בתופעה הקרויה "כתמים כהים" המתבטאת בכתמים‬
‫נקרוטים‪ ,‬משועמים ולא רגולאריים על גבי הקליפה‪ .‬נראה שפקעות הנאספות מן הקרקע‬
‫אינן פגועות‪ ,‬והסימפטומים מופיעים בשלב האחסון וההובלה‪ .‬מלבד הנזק האיכותי ישנם‬
‫מיקרים בהם התופעה מלווה ברקבונות הנגרמים על ידי פתוגנים סאפרופיטיים החודרים‬
‫דרך הפציעה באזור הכתם‪.‬‬
‫בעבודה מוקדמת בודדה מהכתמים הכהים פטרייה מהסוג ריזוקטוניה‪ .‬ההנחה היא‬
‫כי תבדיד זה גורם ל"כתמים הכהים" באופן ישיר או משני‪ ,‬יתכן בשילוב עם מחסור או עודף‬
‫של מרכיב הזנה‪ .‬רגישות זו מתקיימת בפקעות במצבן הקליף לפני היווצרות הפרידרם‪.‬‬
‫בעבודה הנוכחית מודגם כי רקמת הפקעת מגיבה בהשתעמות יתר בעקבות האילוח ב‪R. -‬‬
‫‪ solani‬ובכך יוצרת את "הכתמים הכהים" האופייניים‪.‬‬
‫‪18‬‬
‫מטרות העבודה‬
‫‪.1‬‬
‫אפיון תנאי האחסון הייחודיים בהם נוצרים "הכתמים הכהים"‪ ,‬זאת במטרה‬
‫לבנות מערכת מודל שתדמה את התנאים המסחריים ותשמש ככלי מחקרי‪.‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.3‬‬
‫זיהוי ואפיון גורם המחלה והוכחת הקשר שלו לתופעת הכתמים הכהים‪.‬‬
‫חקר השפעת הגומלין של מחסורים או עודפים של חנקן וסידן‪ ,‬שנמצאו‬
‫במתאם להופעת הסימפטומים‪.‬‬
‫‪.4‬‬
‫אפיון תגובת רקמת פקעת תפו"א לאילוח בגורם התופעה‪.‬‬
‫‪19‬‬
‫‪ .2‬שיטות וחומרים‬
‫‪ 2.1‬החומר הצמחי‬
‫פקעות תפוחי‪-‬אדמה מהזן ניקולה )‪ (Solanum tuberosum L. cv. Nicola‬נאספו‬
‫בחורפי ‪ 2007-2009‬בנגב במערבי‪ ,‬תחת תנאי גידול מסחריים סטנדרטים‪ .‬האסיף בוצע‬
‫‪ 90-100‬ימים לאחר הזריעה‪ ,‬לפני התייצבות הקליפה‪ .‬הפקעות אוחסנו בחדרי קירור‬
‫בטמפרטורה של ‪ 8°C‬ו‪ 95% -‬לחות יחסית (‪ )RH‬המיוצרת באמצעות מחולל לחות‬
‫אולטרסוני (‪ S.M.D.‬טכנולוגיות ריסוס נוזלים‪ ,‬רחובות)‪.‬‬
‫‪ 2.2‬בידוד הפתוגן והשלמת מבחן קוך‬
‫מפקעות נגועות ב"כתמים כהים" בודדו פתוגנים אפשריים שגודלו על גבי מצע מזון‬
‫המכיל ‪ 39‬גרם לליטר ‪ )PDA Difco, MO, USA) Potato Dextrose Agar‬ו‪ 25 -‬מ"ג לליטר‬
‫‪ .)Sigma, Rehovot, Israel) chloramphenicol‬קוביות רקמה‪ ,‬מאזור הקליפה‪ ,‬בגודל של ‪1‬‬
‫סמ"ר חוטאו ב‪ 80% -‬אתנול למשך ‪ 30‬שניות ולאחר מכן ב‪ 3% -‬אקונומיקה (‪sodium‬‬
‫‪ (hypochlorite‬לשתי דקות‪ ,‬נשטפו שלוש פעמים במים מזוקקים פעמיים (‪ )DDW‬סטריליים‬
‫למשך ‪ 30‬שניות ויובשו תחת מנדף ביולוגי למשך ‪ 10‬דקות‪ .‬החתכים נפרסו לשתי חתיכות‬
‫שוות והונחו בצלחת פטרי סטרילית המכילה את מצע המזון‪ .‬הצלחות הודגרו בטמפרטורה של‬
‫‪ 20°C‬למשך שלושה ימים ולאחריהם נלקח קצה תפטיר בודד (‪ )Single tip‬שהועבר לצלחת‬
‫‪ PDA‬סטרילית חדשה‪.‬‬
‫אילוח פקעות בריאות‪ ,‬לצורך השלמת מבחן קוך‪ ,‬בוצע עם וללא פציעה‪ .‬הפקעות‬
‫נשטפו במי ברז‪ ,‬חוטאו ב‪ 70% -‬אתנול ויובשו במינדף‪ .‬הפציעה בוצעה ע"י הסרת הקליפה‬
‫בעזרת סקלפל סטרילי עד לעומק של ‪ 1‬מ"מ בקוטר של ‪ 5-6‬מ"מ‪ .‬על אזור הפציעה או על‬
‫הקליפה הונחה דסקית ‪ PDA‬עם הפטרייה לאחר שגודלה ‪ 3-5‬ימים ב‪ .20°C -‬בקבוצת‬
‫הביקורת הונחה דסקית ‪ PDA‬סטרילית‪ .‬לאחר ‪ 3-5‬ימי הדגרה נבחנו והושוו הסימפטומים‬
‫ל"כתמים כהים" שנוצרו באופן ספונטני‪ .‬בהמשך העבודה הפטרייה נשמרה ב‪ 4°C -‬תוך אילוח‬
‫מחודש של פקעות מידי חודשיים לשימור הפתוגניות‪.‬‬
‫לאילוח דסקיות תפו "א נפרס ו פקעות על ידי פורס ביתי אשר חותך דסקיות בעובי‬
‫קבוע של כ‪ 1 -‬ס"מ‪ .‬הדסקיות הונחו בתוך צלחת פטרי על נייר וואטמן מספר‬
‫מזוקקים סטריליים ‪ .‬לשם אילוח הונחה במרכז דסקית תפו‬
‫‪ 1‬ספוג במים‬
‫"א דסקית ‪ PDA‬עם תפטיר‬
‫הפטרייה‪ .‬בטיפול הביקורת הונחה דסקית ‪ PDA‬בלבד‪ .‬הצלחות כוסו והודגרו ב‪ 20°C -‬ל‪3-5 -‬‬
‫ימים לשם הכנת החתכים ההיסטולוגיים ובחינת תגובת הפרנכימה לאילוח‪.‬‬
‫‪20‬‬
‫‪ 2.3‬ניסוי צוברים‬
‫על מנת לדמות אחסון והובלה בזמן אמת וכן בכדי ללמוד על התנאים המובילים‬
‫להתפתחות הכתמים הכהים‪ ,‬פקעות תפו"א נאספו בפברואר ‪ 2008‬באזור חלוצה בנגב‬
‫המערבי היישר לתוך צוברים מסחריים העשויים מפוליפרופילן ארוג המכיל ‪ 1.25‬טון תפו"א‬
‫(איור ‪ .)7A‬על מנת למנוע אובדן מים של הפקעות לכל צובר הוספו ‪ 5‬ק"ג כבול לח (‪60%‬‬
‫‪ )RH‬שעבר חיטוי בקיטור‪ .‬במרכז כל צובר‪ ,‬בארבעה גבהים (כל ‪ 50‬ס"מ)‪ ,‬הוחדרו חיישנים‬
‫למדידת טמפרטורה שחוברו לאוגר נתונים ( ‪Campbell Scientific Ltd., Logan, UT, ,CR10‬‬
‫‪ )USA‬אשר צבר נתונים כל ‪ 20‬דקות‪ .‬בנוסף‪ ,‬בכדי למדוד את הצטברות פד"ח ואתילן בכל‬
‫צובר הוחדרו צינורות סיליקון בקוטר ‪ 1‬ס"מ בכל מפלס בצמוד לחיישני הטמפרטורה‪ .‬רטיבות‬
‫הכבול שימשה כמדד לרטיבות בצוברים‪ ,‬ונקבעה על פי איבוד המשקל במהלך ייבוש הכבול‬
‫בתנור ב‪ 70°C -‬למשך ‪ 48h‬בתחילת הניסוי לעומת סופו‪ .‬טמפרטורת זו שימשה לייבוש על‬
‫מנת שלא לשרוף את החומר האורגני הרב המצוי בכבול‪ .‬ניסוי זה כלל ארבעה צוברים כשכל‬
‫צובר היווה חזרה‪ .‬הצוברים אוחסנו בחדר קירור מסחרי בקיבוץ מגן‪ ,‬שביישובי חבל מעון‬
‫(יח"מ) בטמפרטורה של ‪ 8°C‬ו‪ 85-90% -‬לחות יחסית (‪.)RH‬‬
‫‪ 2.3.1‬מדידת הרכבי הגזים בצובר‪ :‬הכרומטוגרפיה כוללת את כל שיטות ההפרדה‬
‫המבוססות על אינטראקציה בין החומר הנבדק לשתי פאזות‪ ,‬האחת קבועה ( ‪stationary‬‬
‫‪ )phase‬והשנייה הנעה (‪ .)mobile phase‬במחקר זה נעשה שימוש בכרומטוגרפיית גז (‪)GC‬‬
‫הכוללת קולונה שבה חומר סופח בעל נקודת רתיחה גבוהה ולמעשה בלתי נדיף בתנאי‬
‫הניסוי‪ ,‬אותו החומר מהווה את הפאזה הקבועה ובעזרתו מתבצעת ההפרדה‪ .‬על מנת‬
‫לאפשר את התקדמותם של התרכובות דרך הקולונה‪ ,‬מעבירים דרכה במהירות קבועה גז‬
‫אינרטי‪ .‬במחקר זה נעשה שימוש בגז הליום‪ .‬מאחר ולמרכיבי הדוגמה מקדמי חלוקה שונים‬
‫הם עוברים דרך הקולונה במהירויות שונות ומגיעים לקצה בנפרד‪ .‬הגז הנושא מזרים את‬
‫מרכיבי הדוגמה אל תוך גלאי בעל רגישות גבוהה אשר בעזרת דוגמת סטנדרט מסוגל‬
‫להבחין החומר אות אנו מחפשים‪ .‬במחקר זה נעשה שימוש בגלאי להבה‪ .‬הגלאי מעביר את‬
‫האותות המתקבלים לרשם אשר משרטט את העקומה המאפשרת לקבוע איכותית וכמותית‬
‫את מרכיבי הדוגמה‪ .‬דגימת הגזים נעשתה על ידי מזרק בנפח של ‪ 10‬סמ"ק‪ .‬לפני לקיחת‬
‫הדוגמה רוקן האוויר מצינורית הסיליקון ממנה נלקחה הדוגמה על ידי מזרק בנפח של ‪100‬‬
‫סמ"ק‪ ,‬נעשתה חזרה על פעולה זו שלוש פעמים לפני לקיחת הדוגמה‪.‬‬
‫לצורך מדידת נוכחות וריכוז פד"ח נעשה שימוש במכשיר גז כרומטוגרף מדגם‬
‫)‪ Fisher-Hamilton (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA. USA‬המצויד בגלאי הולכת חום‬
‫[(‪(series 580; GOW-MAC Instruments co., Bethlehem, PA, )thermal conductivity‬‬
‫‪21‬‬
‫‪ .]USA‬תנאי הכרומטוגרפיה כללו הפרדת תערובת הגזים על‪-‬ידי קולונה כפולה בטמפרטורת‬
‫החדר (מסוג ‪ ,CTR1‬באורך ‪ .)6 feet‬הגז הנושא היה הליום בזרימה של ‪ 30‬סמ"ק לדקה‪.‬‬
‫ריכוז הפד"ח חושב על‪-‬ידי האינטגרטור בהשוואה לסטנדרט ידוע בריכוז של ‪.16.8%‬‬
‫לצורך מדידת הצטברות האתילן בצוברים נעשה שימוש במכשיר גז כרומטוגרף‬
‫מדגם ‪ )Walnut Creek, CA, USA) Varian 3300‬המצויד בגלאי להבה‪ .‬תנאי הכרומטוגרפיה‪:‬‬
‫קולונת ‪ .Stainless steel, HayeSepR, ALTECH 100-120 mesh‬הגז הנושא היה הליום‬
‫בזרימה של ‪ 30‬סמ"ק לדקה‪ .‬ריכוז האתילן חושב על‪-‬ידי האינטגרטור בהשוואה לסטנדרט‬
‫ידוע בריכוז של ‪ 1ppm‬אתילן‪.‬‬
‫‪ 2.4‬ניסוי חממה לבחינת השפעת גורמי ההזנה סידן וחנקן על יצירת התסמינים‬
‫לצורך בחינת השפעת גורמי ההזנה סידן וחנקן על יצירת הכתמים או על אילוח‬
‫הפטרייה בפקעות ניקולה בוצע ניסוי בתנאי חממה‪ .‬הניסוי נערך בחממה סגורה בבית דגן‬
‫בחורף ‪ 2008‬בין החודשים נובמבר‪ -‬פברואר‪ .‬מבנה הניסוי היה תלת גורמי‪ ,‬שני טיפולי‬
‫דישון ואילוח בפטרייה‪ ,‬כפי שמפורט מטה‪.‬‬
‫‪ 2.4.1‬מבנה הניסוי‪ :‬הגידול בוצע במיכלים בנפח ‪ 50‬ליטר המכיל פרלייט סטרילי כדי לנטרל‬
‫השפעות קרקע‪ .‬שלוש פקעות נזרעו בעומק של ‪ 10‬ס"מ‪ ,‬במרחק של ‪ 20‬ס"מ בין פקעת‬
‫לפקעת‪ .‬בין הפקעות הונחו ‪ 0.15‬ג' קשיונות שהם ‪ 50-60‬קשיונות בממוצע‪ .‬חמישים יום‬
‫לאחר הזריעה יושמה כמות זהה נוספת של קשיונות בעומק של ‪ 10‬ס"מ בשלוש נקודות‬
‫שונות‪ .‬כל טיפול דישון בוצע בשש חזרות‪ ,‬שלוש מאולחות בפטרייה ושלוש ללא אילוח כלומר‬
‫שלוש חזרות לכל טיפול (שלושה דליים)‪ ,‬הטיפולים מוצגים בטבלה ‪.1‬‬
‫‪22‬‬
‫טבלה ‪ : 1‬מרכיבי הדשן לכל אחד מהטיפולים ‪ .‬עמודות ‪ 2-3‬מימין מציינות את הריכוז המתוכנן של‬
‫סידן וחנקן‪ .‬שאר העמודות מציינות את המרכיבי ם שנמהלו ב‪ 20 -‬ליטר מים מזוקקים‪.‬‬
‫מספר‬
‫הטיפול‬
‫טיפול‬
‫סידן ‪Ca‬‬
‫)‪(mM‬‬
‫טיפול‬
‫חנקה‬
‫‪NO3‬‬
‫(‪)mM‬‬
‫‪NaNO3‬‬
‫(גרם)‬
‫‪MgSO47H2O‬‬
‫(גרם)‬
‫‪H3PO4‬‬
‫(מ"ל)‬
‫‪KCl‬‬
‫(גרם)‬
‫‪CaCl2.2H2O‬‬
‫(גרם)‬
‫‪1‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪29.4‬‬
‫‪202‬‬
‫‪-‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪596‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪118‬‬
‫‪202‬‬
‫‪-‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪596‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2.0‬‬
‫‪1‬‬
‫‪588‬‬
‫‪202‬‬
‫‪-‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪596‬‬
‫‪4‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪5‬‬
‫‪29.4‬‬
‫‪1010‬‬
‫‪-‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪-‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪5‬‬
‫‪118‬‬
‫‪1010‬‬
‫‪-‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪-‬‬
‫‪6‬‬
‫‪2.0‬‬
‫‪5‬‬
‫‪588‬‬
‫‪1010‬‬
‫‪-‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪-‬‬
‫‪7‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪10‬‬
‫‪29.4‬‬
‫‪1010‬‬
‫‪850‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪-‬‬
‫‪8‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪10‬‬
‫‪118‬‬
‫‪1010‬‬
‫‪850‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪-‬‬
‫‪9‬‬
‫‪2.0‬‬
‫‪10‬‬
‫‪588‬‬
‫‪1010‬‬
‫‪850‬‬
‫‪246.5‬‬
‫‪34.6‬‬
‫‪-‬‬
‫‪KNO3‬‬
‫(גרם)‬
‫‪ 2.4.2‬מהלך הגידול‪ :‬בחודש הראשון לניסוי כל הצמחים דושנו בעודף בדשן שפר‬
‫בתוספת ‪ 0.002‬מ"ל לליטר תמיסת מיקורואלמנטים כדי לעודד התפתחות הצמחים בצורה‬
‫שווה‪ .‬הדישון בוצע על ידי משאבות תפן פרופורציונאליות דגם ‪Tefen, ,Israel( 12502‬‬
‫‪ )Kibbutz Nahsholim‬בספיקה של ‪ 2‬ליטרים לשעה‪ .‬ארבעים יום לאחר הזריעה נשטף מצע‬
‫הגידול במים מזוקקים ובוצע מעבר לתמיסות המתוארות בטבלה ‪ .1‬למדידת ריכוזי‬
‫התמיסות‪ ,‬אחת לשבוע נאספו דגימות תמיסה מהטפטפות ונקז הדליים‪ .‬בכדי למדוד את‬
‫קליטת הדשן על ידי הצמחים נאספו פטוטרות עלים מייצגים בגובה זהה (פטוטרת שלישית‬
‫מאמיר הצמיחה)‪ .‬הפטוטרות הופרדו מהעלעלים בשדה‬
‫‪ ,‬נשמרו בקירור עד להגעתן‬
‫למעבדה‪ ,‬והוקפאו עם הבאתן למעבד ה‪ .‬מוהל הפטוטרות נסחט מהן לאחר הפשרתן ‪ ,‬נמהל‬
‫במים מזוקקים בהתאם לצורך ‪ ,‬ונבדק לקביעת ריכוזי החנקה באוטואנלייזר (‪Quik- Lachat‬‬
‫)‪ .Chem Systems, Mequon, WI, USA‬הבדיקות הכימיות בתמיסות הנדגמות מהנקז‬
‫ומפטוטרות כללו קביעה נפרדת של חנקן כללי מחוזר וסריקת יסודות כללית (לבד מחנקן )‪.‬‬
‫לבדיקת חנקן כללי מחוזר‪ ,‬מדגמים (במשקל ‪ 0.2‬גרם או ‪ 10‬מ"ל תמיסת נקז) עוכלו בחומצה‬
‫גופרתית מרוכזת רותחת ‪ ,‬עם הוספות עתיות של מי‪-‬‬
‫חמצן לחומצה ‪ ,‬לאחר הבאתה‬
‫לטמפרטורת החדר ‪ .‬ריכוזי החנקן נבדקו בריאקצית צבע באוטואנלייזר (‪ .(Lachat‬נעשתה ע ל‬
‫ידי עיכול מדגמים צמחיים במשקל‬
‫‪ 5-1‬גרם או ‪ 10‬מ"ל תמיסת נקז בחומצה חנקתית‬
‫מרוכזת רותחת ‪ ,‬בתוספת חומצה פרכלורית לסיום ‪ .‬המדידה נעשתה באמצעות‬
‫‪(Spectro‬‬
‫‪Spectroscopy‬‬
‫‪Emission‬‬
‫‪Atomic‬‬
‫‪23‬‬
‫‪plasma‬‬
‫‪Coupled‬‬
‫‪ICP-AES‬‬
‫‪[Inductively‬‬
‫]‪ .analyticastruments, Germany‬אחת לשבועיים ניתנו ריסוסי נוף של בראבו ומנצידן‬
‫למניעת כימשון‪ ,‬סקור נגד חלפת וקוצייד למניעת מחלות בקטריאליות‪.‬‬
‫‪ 2.4.3‬אחסון ומדידת הפקעות‪ :‬מאה ועשרה ימים לאחר הזריעה בוצעה הערכה של‬
‫העלווה והפקעות‪ .‬נבחנה הנגיעות במחלות נוף‪ ,‬באורך והסתעפות שורשי הצמחים‪ ,‬גודל‬
‫הפקעות‪ ,‬מספרן‪ ,‬משקלן ונגיעות הפקעות בכתמים כהים וקישיונות‪ .‬לשם בניית אינדקס‬
‫גודל‪ ,‬הפקעות הוגדרו בסולם של שלוש דרגות‪ :‬גדול‪ ,10 -‬בינוני‪ 5 -‬וקטן‪( 1 -‬איור ‪ .)5‬אינדקס‬
‫הפקעות חושב על ידי הנוסחה הבאה‪ ( :‬מספר הפקעות הקטנות ‪ + 1 X‬מספר הפקעות‬
‫בינוניות ‪ + 5 X‬מספר הפקעות הגדולות ‪ 10 X‬חלקי סך כל הפקעות בטיפול) (בר‪-‬יוסף ופליק‪,‬‬
‫‪.)2008‬‬
‫‪1:4‬‬
‫איור ‪ : 5‬שלוש דרגות גודל הפקעות‬
‫שהתקבלו בניסוי ההזנה‪ .‬קנה המידה מציין‬
‫ארבעה ס"מ‪ .‬בתחתית האיור ערכים שרירותיים‬
‫המייצגים את גודל הפקעות ‪.‬‬
‫‪Small=1‬‬
‫‪Medium=5‬‬
‫‪Big=10‬‬
‫בכדי לבחון התפתחות כתמים כהים או תופעות נוספות באחסון‪ ,‬הפקעות אוחסנו למשך ‪40‬‬
‫יום בתנאים המדמים את התנאים שנמצאו בשבוע הראשון בניסוי צוברים‪ ,‬כבול בתכולת‬
‫רטיבות של ‪ ,60%‬ב‪ 14°C-‬ובלחות יחסית של ‪ .98%‬בשלב האחסון הערכת נגיעות ואומדן‬
‫כללי של הפקעות בוצע אחת לשבוע‪ .‬ניתוח השונות בוצע בעזרת תוכנת (‪JMP8‬‬
‫‪SAS‬‬
‫‪ )Institute Inc, Cary, NC‬במבחן תלת גורמי ברמת מובהקות של ‪ .α=0.05‬נתוני גודל‬
‫הפקעות ומספר הפקעות לא התפלגו נורמאלית כאחת ההנחות של ניתוח ‪ ANOVA‬ועל כן‬
‫בוצעה לנתונים טרנספורמציית לוג‪ .‬כמו כן הנתונים נבחנו במבחן ‪ Bartlet‬לבחינת הומוגניות‬
‫השונויות‪ .‬ההבדלים בין הריכוזים נבחנו במבחן ‪ HSD Tukey‬ברמת מובהקות של ‪.α=0.05‬‬
‫‪ 2.4.4‬הכנת מידבק הפטרייה‪ :‬הפטרייה גודלה בתנאים שנזכרו בסעיף ‪ 2.2‬למשך ‪ 14‬יום‪.‬‬
‫קשיונות נאספו ונשמרו בתנאים סטריליים ויבשים‪ .‬חיוניות הקשיונות נבחנה על ידי הערכת‬
‫אחוז הנביטה על צלחת ‪ PDA‬ב‪ .25C -‬תשעים אחוז מהקשיונות נבטו תוך ‪ 3-5‬ימים‪ .‬על מנת‬
‫לבדוק פתוגניות של התבדיד אולחו פקעות על ידי הקשיונות שהתעוררו‪ .‬תשעים אחוז‬
‫מהאילוחים יצרו כתמים‪.‬‬
‫‪24‬‬
‫‪ 2.5‬בחינה היסטולוגית של תגובת האפידרמיס לאילוח ב‪R. solani -‬‬
‫לצורך בחינה היסטולוגית של תגובת הפרנכימה‪ ,‬נלקחו דסקיות מאולחות ודסקיות‬
‫ביקורת שלושה ימים לאחר האילוח‪ .‬הרקמה שנדגמה היא ממרכז הדסקית ‪ ,‬מאזור האילוח‪.‬‬
‫העבודה על הדסקיות נועדה לבחון את תגובת הפרנכימה לעומת תגובת קורטקס בפקעות‬
‫שלמות‪ .‬לצורך בחינת תגובת הקורטקס נלקחו פקעות שלמות שלושה ימים לאחר פציעה‬
‫ואילוח ופקעות ביקורת שעברו פציעה בלבד‬
‫‪ .‬החיתוך בפקעות שלמות התמקד באזור‬
‫האפידרמיס והפרידרם ‪ ,‬זאת כיוון שאופי הסימפטומים שטחי‬
‫‪ ,‬ללא חדירה לרקמת‬
‫הפרנכימה‪.‬‬
‫‪ 2.5.1‬קיבוע הרקמה ‪ :‬הקיבוע התבצע לפי פרוטוקול‬
‫שתואר בספרות ( ‪Ruzin,‬‬
‫‪ .)1999‬בקצרה‪ ,‬הרקמה שנלקחה מדיסקיות כמתואר לעיל הודגרה בתמיסת ‪50%( FAA‬‬
‫אתנול‪ 5% ,‬חומצה אצטית ‪10% ,‬‬
‫פורמאלדהיד‪ 35% ,‬מים מזוקקים סטריליים )‪ .‬לשם‬
‫החדרה טובה יותר של התמיסה לרקמה הופעל וואקום באמצעות משאבת וואקום‬
‫(‪ ,)Biometra, 3257-BM‬שישה מחזורים למשך ‪ 15‬דקות כל מחזור ‪ .‬לאחר מכן הודגרו‬
‫הדוגמאות למשך לילה בתמיסה בטמפרטורת החדר‬
‫החלפת תמיסת הקיבוע ב‪-‬‬
‫‪ .‬למחרת יו בשו הדוגמאות על ידי‬
‫‪ 50%‬אתנול‪ ,‬למשך שעה ‪ ,‬בטמפרטורת החדר וחזרה על‬
‫התהליך בריכוזי אתנול עולים של ‪ ,95% ,90% ,70% :‬למשך חצי שעה ו‪ 100% -‬הדגרה‬
‫למשך לילה‪ .‬בהמשך התבצעה החלפה של נוזל ההדגרה בריכוזים יורדים של אתנול ועולים‬
‫של היסטוקליר )‪ ,3:1 ,1:1 ,1:3 (Finkelman, Petah Tikva, Israel‬בהתאמה תוך הדגרה של‬
‫שעה בין ההחלפות‪ .‬ההחלפה ל‪ 100% -‬היסטוקליר בוצעה פעמיים למשך שעה‪ .‬לכל דוגמה‬
‫הוספו כ‪ 25 -‬פתיתי פראפלסט (‪ )Paraplast Plus,Oxford Labware, MO, USA‬והרקמה‬
‫הודגרה בטמפרטורת החדר ללילה ‪ .‬למחרת‪ ,‬הועברו הדגימות לתנור בטמפרטורה של‬
‫‪ .42ºC‬הוספו בהדרגה ‪ 2-3‬פתיתי פראפלסט עד לרוויה והדוגמאות הועברו ל הדגרה ב‪-‬‬
‫‪ 62ºC‬עד להמסה ‪ .‬לשם החלפת הפראפלסט המומס בה יסטוקליר הוסף פראפלסט נקי‬
‫מותך שהוכן מראש ‪ .‬בוצעו ארבע החלפות במרווחים של כשעתיים בין כל החלפה ‪ .‬לאחר‬
‫מכן הועברו הדוגמאות עם הפרפין לצלוחיות חרס להתקרשות בטמפ' החדר‪.‬‬
‫‪ 2.5.2‬ביצוע חתכים היסטולוגיים ‪ :‬החתכים בוצעו על‪-‬ידי מיקרוטום ‪Buffalo ( 820‬‬
‫‪ )NY, USA, American Optical Co.‬בעובי של ‪ 20‬מיקרומטר והונחו על זכוכית נושאת ללילה‬
‫ב‪ .42ºC -‬צביעת הרקמה‪ -‬לשם המסת הפראפלסט‬
‫הזכוכיות נטבלו בשני כלים של‬
‫היסטוקליר לחמש דקות בכל כלי ‪ .‬לאחר מכן סדרת טבילות בכלים של אתנול ‪ 95%‬לשטיפת‬
‫ההיסטוקליר‪ .‬לאחר מכן ‪ ,‬טבילה בודדת בכלים של אתנול ‪ ,70%‬ו‪ 50% -‬לקבלת פאזה‬
‫מימית‪ .‬החתכים הודבקו על הזכוכית הנושאת בעזרת דבק‬
‫)‪.Germany‬‬
‫‪25‬‬
‫‪Entellan® new (Merck,‬‬
‫המבנה כללי של הרקמה והיווצרות הפרידרם צולמו במיקרוסקופ אור בעל אפשרות‬
‫תאורת ‪ .(Leica DMLB, Germany) UV‬הצילום בוצע בעזרת מצלמת ‪(Leica, DC2000 CCD‬‬
‫)‪ Germany‬ותצוגת התמונות בעזרת תוכנת ‪ .Leica IM1000‬הארת ‪ UV‬בוצעה בעזרת מנורת‬
‫כספית ‪ HBO103W/2‬ובעזרת פילטרים מה סוגים הבאים‪ :‬פילטר אקסיטציה ( ‪BP 340–380‬‬
‫‪,(Excitation‬מפצל כרומטי ‪ LP 425‬ומחסום פילטר )‪.) FT 400Leitz, Wetzlar, Germany‬‬
‫‪ 2.5.3‬צביעת סוברין בצבע סודן (‪ :)Sudan IV‬החתכים בוצעו על רקמת פרידרם חיה‬
‫שנלקחה מפקעות שלמות קובעה לתוך ‪ 6%‬אגארוז זאת כדי לאפשר אחיזה‬
‫נוחה בעת‬
‫החיתוך בעזרת ויברוטום )‪ .(VT 1000, Leica, Germany‬חתכים בעובי של ‪ 20m‬הונחו על‬
‫זכוכית נושאת ונצבעו בסודן (‪ )Sudan IV, Sigma Chemicals, Rehovot, Israel‬בטמפרטורת‬
‫חדר למשך ‪ 20‬דקות (‪ .(Gerlach 1984‬צבען זה נקשר לחומצות שומן אשר מצויות במרכיב‬
‫האליפטי בסוברין (‪.)Bernards, 2002‬‬
‫‪ 2.5.4‬צביעות לזיהוי ‪ :)Reactive oxygen species) ROS‬לצורך צביעת ‪ ROS‬נדגמו‬
‫פקעות לאחר האילוח ב‪ R. solani -‬ופקעות ביקורת לאחר הסרת קליפה בלבד (כמתואר‬
‫בפרק ‪ .)2.2‬צביעה זו בוצעה על רקמת פרידרם לא מקובעת‪ .‬צביעות לצורך זיהוי ‪ROS‬‬
‫ברקמת הפרידרם החומר נעשה שימוש בצבען ‪)DCF( diacetate 2'-7' dichlorofluorescin‬‬
‫אשר הופך לתוצר פלואורוצנטי בנוכחות ‪ .(Zhu et al, 1994) ROS‬הוכנה תמיסת אם של‬
‫החומר בריכוז ‪ 20mM‬ב‪(Dimethyl sulfoxide, Sigma Chemicals, Rehovot, DMSO -‬‬
‫)‪ Israel‬שנשמרה בחושך ב‪ .-20°C -‬חתכי יד מאזור האילוח בוצעו בעזרת סכין גילוח‪ ,‬נשטפו‬
‫בבופר ‪[(2-N-[Morpholino ethanesulfonic acid sodium salt), 50 mM; pH 6.2 MES‬‬
‫)‪ (Sigma‬בסמוך למועד הצביעה הוכנה תמיסת בופר ‪ MES‬המכילה ‪ 10mM H2DCF‬והרקמות‬
‫הודגרו למשך ‪ 10‬דקות בתמיסה בטמפרטורת החדר בחושך‪ .‬לאחר מכן הרקמה נשטפה‬
‫פעמיים בבופר ‪ MES‬למשך דקה )‪ .(Rosenvasser et al, 2006‬זיהוי צביעה פלואורוצנטית‬
‫בוצע תוך שימוש באקסיטציה באורך גל של ‪ 485nm‬ופליטה (‪ )emission‬באורך גל של‬
‫‪ .530nm‬הצפייה בחתכים נעשתה בעזרת תוכנת )‪LSM-510 laser scanning confocal‬‬
‫‪ )microscope system‬תוך שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ‪Zeiss Axiovert-100M inverted‬‬
‫)‪.microscope (Carl Zeiss Microscopy, Germany‬‬
‫‪ 2.6‬זיהוי גנומי של תבדיד הפטרייה‬
‫לצורך זיהוי גנומי של תבדיד הפטרייה הגורמת ל"כתמים הכהים"‪ ,‬נעשה שימוש‬
‫בטכניקת ‪ .ITS-rDNA‬שיטה זו משווה רצפים אשר מאגפים את הרצפים המקודדים לתת‬
‫היחידות הריבוזומאליות‪ .‬רצפי ‪ ITS‬שמורים יחסית וניתן להבחין בעזרתם בין תבדידים שונים‬
‫‪26‬‬
‫מאותו המין‪ .‬הניסוי בוצע על שלושה תבדידים שבודדו מכתמים ספונטניים‬
‫(חזרות‬
‫ביולוגיות)‪.‬‬
‫‪ 2.6.1‬הפקת ‪ DNA‬מהפטרייה‪ :‬בוצע על‪-‬פי הפרוטוקול שתואר על ידי ‪Freeman‬‬
‫וחובריו (‪ .)1993‬בקצרה‪ ,‬לאחר גידול תבדיד הפטרייה בארלמייר שהכיל ‪ 100‬מ"ל של מצע‬
‫‪ )PDB( Potato Dextrose Broth‬ו‪ 25 -‬מ"ג לליטר ‪ .chloramphenicol‬הגידול נמשך ‪ 10‬ימים‬
‫בטלטול במהירות של ‪ 150‬סל"ד ובטמפרטורה של ‪ .25°C‬התפטיר נאסף תוך שימוש‬
‫במשפך ביכנר ובנייר סינון וואטמן מס' ‪ ,1‬יובש בליאופילייזר למשך ‪ 48‬שעות ונישמר ב‪-‬‬
‫‪ -20°C‬עד לשימוש‪.‬‬
‫לצורך הפקת ‪ DNA‬התפטיר נכתש במכתש ועלי באווירה של חנקן נוזלי‪ ,‬והוספו לו ‪4‬‬
‫מ"ל בופר המסה (‪ 0.05M Tris pH 8, 0.15M EDTA pH 8, 2% Sarkosyl‬והשלמה ל‪ 10-‬מ"ל‬
‫על‪-‬ידי ‪ .)DDW‬בוצע טלטול במכשיר וורטקס למשך דקה והדוגמה הודגרה בטמפרטורה של‬
‫‪ 65°C‬למשך ‪ 25‬דקות עד להמסה מלאה שבמהלכה המבחנות טולטלו בעדינות‪ .‬לאחר מכן‬
‫בוצע סרכוז משך ‪ 20‬דקות ב‪ 10,000 -‬סל"ד‪ ,‬והנוזל העליון הועבר למבחנה חדשה‪.‬‬
‫למבחנה הוספה תמיסת ‪ 20% PEG/2.5M NaCl‬לשיקוע בכמות של ‪ 70%‬מנפח הדוגמה‪,‬‬
‫שטולטלה בוורטקס וקוררה בקרח למשך ‪ 20‬דקות‪ .‬הדוגמה סורכזה למשך ‪ 5‬דקות‬
‫במהירות‪ 7,000 -‬סל"ד‪ ,‬הנוזל העליון הורחק והמשקע יובש בטמפרטורת החדר‪ .‬ה‪DNA -‬‬
‫הורחף מחדש ב‪ 2 -‬מ"ל בופר ‪(Trishydrochloride buffer, pH 8.0, containing 1.0 mM ( TE‬‬
‫‪ .EDTA‬לדוגמה הוסף חצי נפח של ‪ NH4OAc‬על קרח למשך ‪ 20‬דקות תוך ערבוב קל והיא‬
‫סורכזה במהירות ‪ 10,000‬סל"ד למשך ‪ 20‬דקות‪ .‬הנוזל העליון נשפה למבחנה חדשה‬
‫והוספה של ‪ 60%‬מנפח הדוגמה איזופרופאנול (‪ )IPA- Isopropanol‬על קרח תוך ערבוב קל‬
‫למשך ‪ 25‬דקות‪ .‬הדוגמה סורכזה במהירות ‪ 5,000‬סל"ד למשך ‪ 5‬דקות ויובשה‬
‫בטמפרטורת החדר‪ .‬הרחפת המשקע ב‪ 0.5 -‬מ"ל בופר ‪ TE‬בתוספת ערבוב עדין עד להמסה‬
‫מלאה‪ .‬לצורך ניקוי נוסף‪ ,‬למבחנה הוספה תמיסה של ‪ NaCl 1.0M‬עד לריכוז סופי של ‪0.1M‬‬
‫ושני נפחי אתנול ‪ 100%‬שקורר ל‪ .-20C -‬המבחנה הודגרו בקרח למשך ‪ 20‬דקות‪.‬‬
‫הדגימות סורכזו ב‪ 5,000 -‬סל"ד למשך ‪ 5‬דקות‪ ,‬הנוזל העליון הורחק‪ ,‬המשקע יובש והומס‬
‫בבופר ‪ .TE‬ה‪ DNA -‬נשמר בטמפרטורה של ‪.-20°C‬‬
‫‪ 2.6.2‬ריצוף של מקטעי ה‪ :ITS-rDNA -‬התחלים שנבחרו לריאקציית ‪ ,PCR‬היו ‪ITS4‬‬
‫ו‪ ,ITS5 -‬תוצר ההגברה של ריאקציה זו כולל את אזורי ‪ ITS1, 2‬וכן את תת‪-‬היחידות‬
‫הריבוזומליות ‪ 18S‬ו‪( 28S -‬איור ‪ )4‬בריזוקטוניה לפי פרוטוקול עבודה של ‪ Sharon‬וחובריה‬
‫)‪ .(2007‬רצפי התחלים בעזרתם הוגברו המקטעים ושימשו לזיהוי ואפיון התבדידים הם‪:‬‬
‫‪27‬‬
‫)'‪ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'); ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‬‬
‫)‪ .(White et al, 1990‬תנאי ה‪ PCR -‬להגברת המקטע היו‪ :‬דנטורציה ב‪ 95°C -‬למשך ‪5‬‬
‫דקות‪ .‬ארבעים מחזורים של הפרדת זוג הגדילים בטמפרטורה של ‪ 95°C‬למשך ‪ 30‬שניות‪,‬‬
‫צימוד התחלים לגדילי ה‪ DNA -‬המתאימים בטמפרטורה של ‪ 50°C‬למשך ‪ 30‬שניות‪ ,‬הארכת‬
‫תוצרי הצימוד בטמפרטורה של ‪ 72°C‬למשך ‪ 90‬שניות ושלב סיום הארכה ‪ 72°C‬למשך ‪10‬‬
‫דקות‪ .‬תוצר ה‪ PCR -‬הופרד על ג'ל ‪ 1%‬אגרוז ונצפה בעזרת אתידיום ברומיד‪ .‬מקטע ה‪ITS -‬‬
‫(כ‪ )600bp -‬הופק מהג'ל בעזרת הקיט‪DNA Isolation kit (Biological Industries, Beit :‬‬
‫)‪ ,Ha’emek, Israel‬בהתאם להוראות היצרן‪.‬‬
‫ליגציה וטרנספורמציה בוצעו באמצעות קיט ‪pGEM-T Easy Vector systems (Promega‬‬
‫)‪USA‬‬
‫‪Corp.,‬‬
‫‪WI,‬‬
‫על‪-‬פי‬
‫פרוטוקול‬
‫היצרן‬
‫הוראות‬
‫בהבדלים‬
‫הבאים‪:‬‬
‫בליגציה‪ ,‬כל ריאקציה בנפח של ‪ 10µl‬הכילה‪1µl vector pGEM 50 ng/µl, 1µl T4 DNA :‬‬
‫‪DDW‬‬
‫‪2.35‬‬
‫‪Buffer,‬‬
‫‪Ligation‬‬
‫‪5µl‬‬
‫‪Product,‬‬
‫‪PCR‬‬
‫‪0.65µl‬‬
‫‪.Ligase,‬‬
‫בטרנספורמציה‪ ,‬לכל מבחנת חיידקי ‪ Escherichia coli‬מהזן ‪ DH5α‬קומפטנטים של ‪125µl‬‬
‫הוספו ‪ 10µl‬מתוצר הליגציה להדגרה של ‪ 30‬דקות על קרח‪ .‬לאחריה התאים חוממו ( ‪Heat‬‬
‫‪ )shock‬לטמפרטורה של ‪ 42°C‬במשך דקה והוחזרו לקרח‪ .‬לכל מבחנה הוספו ‪ 750µl‬מצע‬
‫נוזלי ‪ LB‬לפני הדגרה בטלטול למשך שעה ב‪ .37°C-‬בתום ההדגרה נזרעו ‪ 200µl‬מהתוצר על‬
‫צלחות ‪ LB‬המכילות אמפיצילין‪ X-gal ,‬ו‪ IPAG-‬למשך ‪ 24‬שעות ב‪.37°C -‬‬
‫האתר בפלסמיד אליו מקטע ‪ ITS-rDNA‬אמור לחדור נמצא בתוך הגן ‪ ,lacZ‬לכן מושבות‬
‫שנכנס אליהן פלסמיד עם מקטע ה‪ ITS-rDNA -‬לא יבטאו את הגן‪ ,‬ויראו לבנות‪ .‬פלסמיד שחדר‬
‫למושבות שנראות כחולות לא אמור להכיל את המקטע ולכן הוא קטן בכ‪ 600 -‬בסיסים‬
‫מהפלסמיד שהכיל את המחדר‪ .‬מושבות בעלות מופע לבן נאספו לצלחת ‪ LB‬המכילה‬
‫אמפיצילין והודגרו למשך ‪ 24‬שעות ב‪ .37°C -‬המושבות הורחפו עם ‪ 10µl‬ונסרקו באמצעות‬
‫‪ PCR‬ישיר מהחיידקים על מנת לוודא כי המחדר מצוי בתוכן‪ .‬בנוסף הורחפו באותה צורה‬
‫מושבות כחולות שנבדקו כהיקש‪ .‬הפקת פלסמידים מהחיידקים בוצעה באמצעות קיט ‪Plasmid‬‬
‫)‪ Mini HiYieldTM (Real Genomics, Taipei, Taiwan‬לפי פרוטוקול היצרן‪ .‬ריצוף המקטע בוצע‬
‫על‪-‬ידי מעבדות חי‪ ,‬רחובות )‪.(Molecular Biotechnology Center- MBC-hylabs, Israel‬‬
‫הרצף שהתקבל עובד בתוכנת ‪( Chromas‬מחיקת רצפי הפלסמיד בו שובוטו מקטעי ה‪ITS- -‬‬
‫‪BCM‬‬
‫באתר‬
‫‪ http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html‬לביצוע‬
‫‪multiple‬‬
‫‪(rDNA‬‬
‫והועבר‬
‫לתוכנת‬
‫‪launcher‬‬
‫‪search‬‬
‫‪ alignment‬מול רצפים ידועים של ריזוקטוניה מתת הקבוצות ‪)Accessions # AB000042, PT‬‬
‫‪28‬‬
‫‪ ,(AB019023, AB019017‬ל‪ )Accessions # AB000001, AY154319, AB000004( TB -‬ול‪out -‬‬
‫‪ ,)Accessions # AY684917 ( group‬שנלקחו מעץ פילוגנטי קיים מעבודה קודמת של‬
‫)‪ .Sharon et al (2006‬כשהיה צורך נעשה שימוש ב‪ .manual alignment -‬תוצאות ההשוואה‬
‫הועתקו לתוכנת ‪ )Nicholas et al, 1997( GeneDoc‬ועובדו במרוכז (הורדת מקטעי ‪ 18S‬ו‪-‬‬
‫‪ 28S‬של ה‪ DNA -‬הריבוזומלי)‪ .‬תוצאות ההשוואה על מקטעי ה‪ ITS1-‬ו‪ ITS2 -‬בלבד הועברו‬
‫לתוכנת ‪ EMBL-EBI‬באתר ‪Lopez, ( http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html‬‬
‫‪ )1997‬לשיבוץ הרצפים של התבדידים השונים בעץ הפילוגנטי‪ .‬העץ עובד בתוכנת ‪TreeView‬‬
‫(‪.)Page, 1996‬‬
‫‪ 2.7‬רמת שעתוק גנים המעורבים בתהליכי השתעמות (ביוסינתזת סוברין)‬
‫‪ 2.7.1‬הפקת ‪ RNA‬מרקמה צמחית‪ :‬הפקת ‪ total RNA‬מרקמות הפרידרם נעשתה‬
‫בשיטת ‪ CTAB‬בהתאם לפרוטוקול של ‪ Meisel‬וחובריו )‪ .(2005‬כל התמיסות הוכנו בעזרת‬
‫מים מטופלים ב‪ .diethyl pyrocarbonate (DEPC) -‬שישה גרם רקמה מפקעות מאולחות‬
‫וביקורת כמצוין לעיל נאספו ישירות לחנקן נוזלי‪ ,‬נכתשה בעזרת מטחנה חשמלית ‪A11‬‬
‫)‪ .analytical grinding mill, IKA, (ScienceLab, Houston, TX, USA‬הפקת ה‪ RNA -‬נעשתה‬
‫בשלוש חזרות בלתי תלויות ‪ ,‬של שני גרם בכל חזרה ‪ ,‬שהוקפאו ב‪ -80°C -‬עד לשימוש ‪.‬‬
‫הרקמה הועברה למבחנת ‪ 15‬מ"ל ומיד הוספו ‪ 6‬מ"ל ‪CTAB‬‬
‫‪2% CTAB, 2%‬‬
‫‪polyvinylpyrrolidone] (PVP), K-30 (soluble), 100mM Tris HCl (pH 8.0), 25 mM EDTA‬‬
‫‪ ]pH 8.0, 2M NaCl, 0.05% spermidine trihydrochloride‬ו‪ 1-‬מ"ל – ‪,2% β‬‬
‫‪ .mercaptoethanol‬המבחנות עורבבו בוורטקס והודגרו באמבט חם ב‪ 65°C -‬למשך ‪10‬‬
‫דקות‪ .‬לאחר מכן הוספו ‪ 7‬מ"ל כלורופורם איזואמיל )‪ )24:1 ( )Bio-Lab‬לשם הפרדת‬
‫החלבונים ועורבבו בעדינות ידנית במשך ‪ 5‬דקות‪ .‬הדוגמאות סורכזו למשך ‪ 25‬דקות‬
‫‪ 8,500‬סל"ד ב‪ 4°C -‬והפאזה העליונה הועברה למבחנה חדשה‪ .‬למיצוי חוזר‪ ,‬הוספו ‪ 12‬מ"ל‬
‫תמיסת כלורופורם איזואמיל ולאחר ערבוב וסרכוז חוזרים‪ ,‬הועברה הפאזה העליונה‬
‫למבחנה נקייה‪ .‬השקעת ה‪ RNA -‬בוצעה על‪-‬ידי הוספת ‪(Sigma Aldrich) DEPC LiCl 10M‬‬
‫בנפח השווה לשליש מנפח התמיסה לקבלת ריכוז סופי של ‪ ,2.5M‬והדוגמה הודגרה למשך‬
‫לילה ב‪ .4°C -‬למחרת המבחנות סורכזו ב‪ 40 ,4°C -‬דקות‪ 8,500 ,‬סל"ד‪ .‬הפלט הורחף ב‪-‬‬
‫‪ 500µl‬של תמיסת ‪1M NaCl, 0.5% SDS, 10 mM Tris-HCL (pH 8.0), 1mM EDTA :SSTE‬‬
‫)‪ .(pH 8.0‬התרחיף הועבר למבחנות אפנדורף נקיות והדוגמה מוצתה על‪-‬ידי כלורופורם‪-‬‬
‫איזואמיל‪ .‬המבחנות עברו וורטקס וסירכוז של ‪ 10,000‬סל"ד ב‪ 4°C -‬למשך ‪ 25‬דקות‪.‬‬
‫המשקע נשטף ב‪ 500µl -‬של ‪ 100%‬אתנול קר ב‪ -80°C-‬למשך ‪ 30‬דקות‪ ,‬סורכז במהירות‬
‫של ‪ 8,500‬סל"ד למשך ‪ 30‬דקות והמשקע נשטף ב‪ 1-‬מ"ל ‪ 70%‬אתנול קר ע"ג קרח משך‬
‫‪29‬‬
‫‪ 10‬דקות‪ .‬הדוגמאות סורכזו משך ‪ 30‬דקות במהירות ‪ 8,500‬סל"ד‪ .‬לאחר מכן הוצא הנוזל‬
‫והמשקע יובש במשך כחצי שעה בטמפרטורת החדר‬
‫‪ .‬המשקע הורחף ב‪-‬‬
‫‪ 100µl‬מים‬
‫מטופלים ב‪ .DEPC -‬ניקוי ה‪ RNA-‬משאריות ‪ DNA‬בוצע על‪ -‬ידי ‪TURBO DNase (Ambion‬‬
‫)‪ Austin, TX, USA‬לפי פרוטוקול היצרן ‪ .‬ריכוז ה‪ RNA -‬נמדד במכשיר ‪ND-1000 NanoDrop‬‬
‫(‪ .)Technologies, Rockland, DE, USA Nanodrop‬איכות ה‪ RNA-‬נמדדה על‪ -‬ידי הרצתו על‬
‫ג'ל ‪ 1%‬אגרוז )‪ (Lonza, ME, USA‬המכיל ‪ 0.5 μg‬למ"ל ‪Safe-View (NBS Biologicals‬‬
‫)‪ Huntingdon, UK‬לצביעת חומצות גרעין‪.‬‬
‫‪ 2.7.2‬סינתזת ‪ :cDNA‬המידע הקיים עד כה על גנים המעורבים בביוסינתיזה של‬
‫סוברין בתפו"א ידוע בעיקר על הזן דזירה (’‪ . (‘Désirée‬על כן היה צורך למצוא גנים אלו בזן‬
‫ניקולה‪ .‬לשם כך‪ ,‬הוגברו מקטעים בעזרת תחלים מדזירה ונעשתה השוואה לרצפים הידועים‬
‫בבנק הגנים (‪ .)GenBank‬אזורים שהיו זהים גם בזן ניקולה שמשו לתכנון תחלים קצרים‬
‫יותר ל‪.Real time PCR -‬‬
‫לצורך הכנת ה‪ cDNA-‬נלקח ‪ 1 μg‬מדוגמת ה‪ .RNA -‬הסינתזה נעשתה לפי ערכה ‪cDNA Kit‬‬
‫)‪ (Verso™ Abgene , Surrey, UK‬בנפח ריאקציה של ‪ 20µl‬לפי הוראות היצרן עם תחלים של‬
‫‪ random hexamers : oligodT‬ביחס ‪ 3:1‬בהתאמה‪ .‬התוצר שהתקבל נמהל ‪ 1:10‬במים‬
‫מטופלים ב‪ DEPC -‬ריאקצית ה‪ PCR -‬בוצעה עם ערכת )‪ReadyMixTM (Abgene, Surrey,UK‬‬
‫תוך שימוש בתמיסות הערכה ‪ .‬נפח הריאקציה היה ‪ 20µl‬וכלל ‪ 1µl ,ReaddyMix 10µl‬מכל‬
‫תחל והשאר ‪ cDNA‬ומים‪ .‬תנאי הריאקציה היו ‪ :‬שלב דנטורציה ראשוני של ‪ 95ºC‬ל‪ 3-‬דקות‪,‬‬
‫שלב דנטורציה שני של ‪ 59 ºC‬ל‪ 30 -‬שניות‪ ,‬שלב צימוד התחלים עם גרדיאנט של ‪55-60ºC‬‬
‫ל‪ 30 -‬שניות (לתחלים של ‪ 18s rRNA‬הטמפ' היתה ‪ ,)60ºC‬שלב הארכה של ‪ 72ºC‬ל‪60 -‬‬
‫שניות‪ ,‬חזרה לשלב הדנטורציה השני ‪ 36 ,‬מחזורים‪ .‬שלב סיום הארכה ‪ 72ºC ,‬ל‪ 10 -‬דקות‪.‬‬
‫למרות הטיפול ב‪ ,DNase-‬שפורט בסעיף הקודם‪ ,‬הוחלט לבחון האם נותרו שאריות של ‪DNA‬‬
‫גנומי בדוגמאות‪ .‬לשם כך בוצעה ריאקצית ‪ ,PCR‬בתנאים המפורטים בסעיף זה ‪ ,‬תוך‬
‫שימוש בתחלים של הגן‬
‫‪( StKCS6‬טבלה ‪ )2‬אשר מגבירים מקטע של‬
‫‪ 737bp‬הכולל‬
‫אינטרון באורך של ‪ .237bp‬בריאקציה המכילה ‪ cDNA‬ציפינו להגברה של מקטע בגודל של‬
‫‪ ,500bp‬במקרה של נוכחות ‪ DNA‬גנומי צפוי היה שיתקבלו בנדים בשני הגדלים‪ .‬בהרצה על‬
‫הג'ל התקבל בנד בודד באורך של ‪.500bp‬‬
‫‪ 2.7.3‬קביעת רצף ואנליזה של תוצרי ‪ :PCR‬תוצרי הריאקציה (‪ )10µl‬הוטענו על ג 'ל‬
‫אגרוז ‪ 1%‬בבופר ‪ 242( TAE X0.5‬גרם ‪ 57.1 ,Tris base‬מ"ל חומצה אצטית ‪ 100 ,‬מ"ל‬
‫‪ pH 8 EDTA 0.5M‬ו‪ 842.9 -‬מ"ל מים לקבלת תמיסת סטוק ‪ ,)50X‬מתח ההרצה היה ‪.100V‬‬
‫בג'ל הורץ גם סמן‬
‫‪:DNA‬‬
‫™‪100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use (O'GeneRuler‬‬
‫‪30‬‬
SafeView™ (NBS Biologicals, ‫ נצבעו בצבען‬PCR-‫ תוצרי ה‬.Fermentas, Ontario,Canada)
Molecular Imager ChemiDoc XRS (Bio-Rad, CA, , ‫ הג'ל צולם במצלמה‬,Huntingdon, UK)
‫ התוצרים‬Quantity one software version 4.6.5 (Bio-Rad) ‫ והתוצאות נותחו בתוכנה‬USA)
(HY-Laboratories
:
‫ וקביעת רצף במעבדות חי‬PCR ‫בעלי בנד בודד נשלחו ל ניקוי מתוצרי‬
‫ניתוח הרצפים נעשה בעזרת התוכנות‬
.Ltd.
Rehovot,
Israel)
BioEdit)html.bioedit/BioEdit/http://www.mbio.ncsu.edu)
DNAMAN software (Lynnon BioSoft, Vaudreuil, Canada)
‫( ואתרים בעלי זהות‬ftp://ncbi.nlm.nih.gov) NCBI ‫ באתר‬multiple alignment
‫בוצע‬
‫ התחלים‬. Quantitative Real Time RT-PCR -‫) נבחרו לשם תכנון תחלים ל‬100%( ‫מלאה‬
‫ איכות התחלים נבדקה‬.Primer Express2.0 (Applied Biosystems) ‫תוכננו בעזרת התוכנה‬
IDT
SciTools
‫בעזרת‬
(http://eu.idtdna.com/Scitools/Applications/mFold)
.Sigma Aldrich, Rehovot ‫ידי‬-‫התחלים סונטזו על‬
‫ להגברת רצף ראשוני (נלקחו מעבודות קודמות‬PCR ‫ תחלים ששימשו ב ריאקצית‬: 2 ‫טבלה‬
-‫ התחלים ל‬.Quantitative Real Time RT-PCR -‫שבוצעו על תפו"א מזן דזירה ) ממנו תוכננו תחלים ל‬
Primer Express2.0 (Applied ‫) תוכננו בעזרת‬qRT -‫ (מסומן כ‬Quantitative Real Time RT-PCR
.Biosystems)
Gene
Foreword primer
Reverse primer
Accession
18S (RT)
5' AAACGGCTACCACATCCAAG 3'
5' GCCATCCCAAAGTCCAACTA 3'
X67238
18S (qRT)
5' AATTACCCAATCCTGACACGGG 3'
5' TTGCCCTCCAATGGATCCTCGTTA 3'
StKCS5 (RT)
5' TGGGTGGTGCTGCTATACTTT 3'
5' TCCTTTCGCCTCGATGTAAC 3'
StKCS5 qRT
5' CCAGCATCAGAGCAGCTTCTT 3'
5' AACAGCTCTTCCACCAGCATG 3'
Cyp86A33 (RT)
5' TCTACTGGGGTATCCGCAAC 3'
5' TTTGGTGAAAGGGTTTCAGG 3'
Cyp86A33 (qRT)
5' GGTGGGTAAACCGGACCATC 3'
5' GCAACTCGACCGGGTTTTTT 3'
POP_A (RT)
5' GGATCAAGTTTTGACCGGGGATG 3'
5' GCATCAACTGATCATAATACTGAAAG 3'
POP_A (qRT)
5' TTGCTGCTGCCATGATCA 3'
5' CCCTGCTACAAACATCACGA 3'
*
EU616538
**
EU293405
***
M21334 ****
*Du et al (2006) **Serra et al (2009a) ***Serra et al (2009b) ****Barel and Ginzberg (2008)
Quantitative Real Time RT--‫ שיטת ה‬:Quantitative Real Time RT-PCR 2.7.4
cDNA ‫ רצויות בדוגמת מיצוי‬cDNA ‫ מאפשרת כימות של תבניות‬SYBR Green ‫ מסוג‬PCR
cDNA ‫ שיטה זו משתמשת בז וג תחלים לשם הגברת מקטע‬PCR ‫ בדומה לריאקצית‬.‫צמחי‬
‫ עוצמת‬.SYBR Green ‫ בשיטה זו תערובת הריאקציה מכילה מולקולות צבע מסוג‬.‫ספציפי‬
‫ על כן כימות יחסי של‬.‫הפלואורסנציה הנפלטת נמצאת ביחס ישר לכמות תוצרי ההגברה‬
31
‫תוצר ההגברה בכל מחזור במהלך הריאקציה מתאפשר על‪-‬ידי מדידת עוצמת‬
‫הפלואורסנציה‪ .‬ההשוואה בין דוגמאות שונות נעשתה בעזרת קביעת ערך סף (‪)Threshold‬‬
‫אחיד לפלואורסנציה‪ .‬ערך הסף שנבחר צריך להימצא בשלב ההגברה האקספוננציאלי ומעל‬
‫לערכי הפלואורסנציה של רעש הרקע‪ .‬שלב ההגברה שבו רמת הסף נחתכת על‪-‬ידי עקומות‬
‫ההגברה הוגדר כערך ה‪ .CT -‬ערכי ה‪ CT -‬המתקבלים נמצאים ביחס הפוך לריכוז תבניות ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬המתאימות בדוגמה הנבדקת‪ .‬כימות מדויק של תבניות ה‪ DNA -‬שעברו הגברה‬
‫התאפשר על ‪-‬ידי השוואה לעקומת כיול‪ .‬עקומת כיול זו התקבלה על‪-‬ידי ביצוע ניסוי ‪Real‬‬
‫‪ Time PCR‬מקדים לסדרת מהולים של דוגמה בעלת מספר תבניות ‪ DNA‬ידועות‪ .‬התאמה‬
‫בין דוגמאות הניסוי לעקומת הכיול התקבלה בעזרת הרצה של דוגמת סטנדרט עם ריכוז‬
‫ידוע של תבניות ‪ DNA‬מתאימות‪ .‬הריאקציה בוצעה בעזרת המכשיר ‪Rotor Gene3000‬‬
‫)‪ (Australia Corbett Research, Mortlake‬ותערובת הריאקציה של ‪ 10µl‬הכילה‪ABsolute :‬‬
‫)‪ 1µl ,7.5µl QPCR SYBR Green Mix (ABgene, Epsom, Surrey, UK‬מכל תחל‪ 1.5µl ,‬מים‬
‫ו‪ 2.5µl-‬מדוגמת מיצוי ה‪ . cDNA-‬בהתחלת הריאקציה נוסף שלב של הפרדה ראשונית של‬
‫כלל זוגות ה‪ DNA-‬בטמפרטורה של ‪ 95°C‬למשך ‪ 15‬דקות ולשם הפעלה של ‪Hot-Start Taq‬‬
‫‪ .Polymerase‬הריאקציה כללה ‪ 40‬מחזורים של הפרדת זוג הגדילים בטמפרטורה של ‪95°C‬‬
‫למשך ‪ 10‬שניות‪ ,‬צימוד התחלים לגדילי ה‪ DNA -‬המתאימים בטמפרטורה של ‪ 60°C‬למשך‬
‫‪ 15‬שניות‪ ,‬הארכת תוצרי הצימוד בטמפרטורה של ‪ 72°C‬למשך ‪ 20‬שניות וקריאת‬
‫פלואורסנציה האופיינית למולקולת צבע ‪ SYBR-Green‬המשולבות בתוצרי ההגברה‪ .‬לבדיקת‬
‫נוכחות ‪ DNA‬גנומי שולבו מבחנות ביקורת שלילית אשר מכילות את כל מרכיבי הריאקציה‬
‫למעט ‪ .)NTC- non template control( cDNA‬לאחר סיום שלב ריאקצית ההגברה הוסף‬
‫שלב התכה (‪ )Melt‬לתוצרי ההגברה‪ .‬שלב ההתכה הנוסף אפשר את ההתבוננות בקינטיקה‬
‫של הפרדת גדילי תוצרי ההגברה‪ .‬בשלב זה הטמפרטורה מועלת בקצב ליניארי‬
‫והפלואורסנציה של כל דוגמה נמדדת‪ .‬העלאת הטמפרטורה גרמה לפתיחה של גדילי תוצרי‬
‫ההגברה ושחרורן של מולקולות ה‪ SYBR Green-‬במשולבות בהם‪ .‬שחרור מולקולות הצבע‬
‫יגרום לירידה בעוצמת הפלואורסנציה הנמדדת‪ .‬הירידה בפלואורסנציה ליחידת זמן עולה עם‬
‫ההתקרבות לערך ה‪ .Tm -‬ערך ה‪ Tm-‬הינו הטמפרטורה בה מחצית מכלל תוצרי ההגברה‬
‫עברו הפרדה למצב חד גדילי‪ .‬לפיכך שיא הירידה בעוצמת הפלואורסנציה ליחידת זמן ימוקם‬
‫בערך ה‪ .Tm -‬ערכי ה‪ Tm -‬מושפעים מאורך והרכב הבסיסים של תוצרי ההגברה לכן תוצרי‬
‫הגברה שונים יאופיינו בערכי ‪ Tm‬שונים‪ .‬ההעלאה נעשתה במחזורים של חימום במעלה‬
‫אחת ומדידת הפלואורסנציה‪ .‬המחזורים השונים תוזמנו במרווחים של חמש שניות למעט‬
‫המחזור הראשון שלפניו נלקח מרווח של ‪ 45‬שניות‪ .‬התוצאות המוצגות הן יחסיות לתוצאה‬
‫הנמוכה ביותר ועל כן ערכה של תוצאה זו הוא אחד‪.‬‬
‫‪32‬‬
‫‪ .3‬תוצאות‬
‫‪ 3.1‬בידוד פתוגנים מהכתמים הכהים‬
‫פקעות עם סימפטומים אופייניים‪ ,‬לאחר הובלה ימית‪ ,‬יובאו חזרה ארצה לצורך‬
‫בידוד הפתוגן והשלמת מבחן קוך‪ .‬מהסימפטומים האופייניים בודדו מספר פטריות בעלות‬
‫מופע שונה של צימוח תפטיר (איור ‪ .)6‬אפיון מיקרוסקופי הביא לזיהוי הסוגים ריזוקטוניה‪,‬‬
‫פוזריום‪ ,‬פיטופטורה וטריכודרמה ‪.‬‬
‫בניסיון להשלים את מבחן קוך אולחו פקעות מהזן ניקולה והודגרו למשך ‪ 7‬ימים‬
‫בטמפרטורה של ‪ 25°C‬בתא לח‪ .‬נראה שהפטרייה ריזוקטוניה אכן יצרה את הסימפטומים‬
‫הקשים והדומים ביותר לכתמים הספונטניים (איור ‪ .)6‬הסוג ריזוקטוניה בודד ברוב הפעמים‬
‫בהם נעשה בידוד מהכתמים אולם‪ ,‬היה קושי בהשראת סימפטומים אופייניים באופן הדיר‬
‫מה שהביא להנחה שתנאי האילוח אינם מיטביים‪.‬‬
‫איור ‪ :6‬פתוגנים‬
‫שבודדו מכתמים ספונטניים‬
‫שהתפתחו בהובלה ימית‪.‬‬
‫בעזרת פתוגנים אלו נעשה‬
‫ניסיון להשלים מבחן קוך‬
‫לקבלת כתמים כהים (איור‬
‫תבדידי‬
‫‪:A-B‬‬
‫מימין)‪.‬‬
‫ריזוקטוניה שהובילו לקבלת‬
‫החמורים‬
‫הסימפטומים‬
‫והקרובים ביותר לכתמים‬
‫כהים‪ :C .‬טריכודרמה‪:D .‬‬
‫פיטופטורה‪ :E-F .‬תבדידי‬
‫פוזריום‪.‬‬
‫‪B‬‬
‫‪CON.‬‬
‫‪A‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫‪D‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪D‬‬
‫‪F‬‬
‫‪E‬‬
‫‪F‬‬
‫‪ 3.2‬ניסוי צוברים‪ -‬אפיון התנאים בהם נוצרים הכתמים הכהים‬
‫בניסיון לשפר את יכולת האילוח המלאכותי‪ ,‬כלי מחקרי שנראה היה לנו חשוב‪,‬‬
‫נלמדו תנאי הסביבה המובילים להיווצרות ספונטנית של הסימפטומים האופייניים‪ .‬פקעות‬
‫תפו"א מהזן ניקולה אוחסנו בארבעה צוברים מסחריים של ‪ 1.25‬טון כל אחד (איור ‪.)7A‬‬
‫הצוברים הודגרו בחדרי אחסון מסחריים בטמפרטורה של ‪ .8°C‬הטמפרטורה ההתחלתית‬
‫של סביבת הפקעות בצובר הייתה ‪ 12-13°C‬ועלתה ל‪ 14°C -‬בשבוע הראשון לאחסון‪.‬‬
‫‪33‬‬
‫‪E‬‬
‫במפתיע‪ ,‬הטמפרטורה בצוברים ירדה לטמפרטורת החדר (‪ ,)8°C‬רק לאחר ‪ 25‬ימי אחסון‬
‫(איור ‪ .)7C‬ריכוז פד"ח באוויר בסובב את הפקעות עלה מ‪ 0.15% -‬ל‪ 0.6% -‬במהלך השבוע‬
‫הראשון לאחסון וחזר לרמתו ההתחלתית רק לאחר שלושה שבועות (איור ‪ .)7C‬את ריכוז‬
‫האתילן לא ניתן היה למדוד בשל רגישות הקולונה לנוכחותם של גזים נוספים אשר זיהמו‬
‫את הקולונה ובכך מנעו את מדידת האתילן‪ .‬אחד הגזים האפשריים שנמצאו בצוברים בריכוז‬
‫גבוה הוא אתנול‪ ,‬אולם הנתונים לא נאספו מסודר באופן קונסיסטנטי ולכן לא מוצגים‪ .‬תכולת‬
‫המים סביב הפקעות בתחילת הניסוי הגיעה ל‪ 60% -‬ממשקל הכבול‪ .‬לאחר האחסון הכבול‬
‫איבד נוזלים לטובת הסביבה משליש בחלק העליון ועד יותר משני שלישי בחלק התחתון‬
‫(איור ‪.)7B‬‬
‫‪B‬‬
‫‪A‬‬
‫‪41‬‬
‫‪31.25‬‬
‫‪22.25‬‬
‫‪23.75‬‬
‫‪20.25‬‬
‫‪17.25‬‬
‫‪40‬‬
‫‪50‬‬
‫‪20‬‬
‫‪30‬‬
‫‪0‬‬
‫‪10‬‬
‫)‪Water content (% w/w‬‬
‫‪C‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪0.5‬‬
‫)‪CO2 (%‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪30‬‬
‫‪25‬‬
‫‪20‬‬
‫‪15‬‬
‫‪10‬‬
‫‪5‬‬
‫)‪Temerature (C‬‬
‫‪16‬‬
‫‪14‬‬
‫‪12‬‬
‫‪10‬‬
‫‪8‬‬
‫‪6‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪Storage days‬‬
‫איור ‪ : 7‬השתנות הטמפרטורה‪ ,‬רמת הפחמן הדו‪-‬חמצני ורטיבות הכבול במהלך אחסון‬
‫פקעות תפו"א מהזן ניקולה בצובר מסחרי מיד לאחר אסיף הנתונים מייצגים ממוצע של ארבע חזרות‬
‫(צוברים )‪ .‬הצוברים אוחסנו בטמפרטורה של ‪ -A .8°C‬צובר מסחרי ארוז המכיל ‪ 1.25‬טון פקעות‬
‫תפו"א וכבול ‪ -B .‬רטיבות הכבול בגבהים שונים בצובר‪ .‬נדגם כבול לאחר ‪ 5‬שבועות אחסון‪ ,‬מחמישה‬
‫גבהים בצובר‪ :‬מתחתית הצובר לחלק העליון ‪ .‬כל עמודה הוצבה במקביל לגובה המקורי באיור ‪-C .A‬‬
‫השתנות הטמפרטורה היומית הממוצעת (קו כחול) כפי שנמדדה כל ‪ 20‬דקות והשתנות רמות פד"ח‬
‫(קו אדום)‪ .‬מדידות נלקחו מארבעה גבהים‪ .‬סטיית התקן חושבה מארבעה צוברים‪.‬‬
‫‪34‬‬
‫‪ 3.3‬השלמת מבחן קוך ובידוד הפתוגן‬
‫הקושי בהשלמת מבחן קוך באופן הדיר העלה את ההנחה שהפתוגן הגורם‬
‫להיווצרות "הכתמים הכהים" זקוק לתנאי סביבה ספציפיים המתקיימים באחסון מסחרי‪.‬‬
‫לימוד תנאי סביבת הפקעות בצוברים (לחות‪ ,‬טמפרטורה ואווירת גזים) בהם נוצרים‬
‫"הכתמים הכהים" אפשר בניית מערכת מודל בתנאי מעבדה ולהשלים בהצלחה את מבחן‬
‫קוך‪ .‬מספר פתוגנים בודדו מכתמים אי‪-‬רגולריים‪ ,‬נקרוטיים (איור ‪ )8A‬ושמשו לאילוח פקעות‬
‫בריאות‪ .‬הפקעות הודגרו בתא לח בטמפ' של ‪ 14°C‬למשך שבועיים‪ .‬סימפטומים אופייניים‬
‫התקבלו רק עם הסרה מקומית של הקליפה בסמוך לפעולת האילוח בתבדיד הריזוקטוניה‬
‫שבודד מ"הכתמים הכהים" (איור ‪ .)8B‬הכתמים שהתקבלו באילוח עם תבדידי הריזוקטוניה‬
‫נותרו שטחיים ולא התפתחו אל מעבר לקליפה (איור ‪ )8F‬כמו בכתמים הספונטניים‪ ,‬זאת‬
‫בזמן שפתוגנים אחרים שבודדו‪ ,‬כגון ‪ ,P. infestans‬חדרו אל ליבת הפקעת (איור ‪.)8D‬‬
‫מהכתמים שהתקבלו בודדה שוב ריזוקטוניה שזוהתה תחת מיקרוסקופ לפי המאפיינים‬
‫שנזכרו לעיל ובכך הושלם מבחן קוך ‪ .‬הפקעות שאולחו בתנאים זהים בדסקית ‪ PDA‬בלבד‬
‫(ביקורת) פיתחו קליפת החלמה המאפיינת הגלדה ספונטנית (איור ‪.)8B,E‬‬
‫‪B‬‬
‫‪C‬‬
‫‪A‬‬
‫‪:8‬‬
‫איור‬
‫כהים‬
‫כתמים‬
‫המתפתחים בקליפת‬
‫פקעות מהזן ניקולה ‪.‬‬
‫‪ -A‬אילוח ספונטני‬
‫בתנאי מסחר‪-B .‬‬
‫ביקורת‬
‫פקעות‬
‫שלושה ימים לאחר‬
‫‪D‬‬
‫‪E‬‬
‫‪F‬‬
‫פציעה ואילוח באגר‬
‫בלבד‪ -C .‬שלושה‬
‫ימים לאחר פציעה‬
‫ואילוח בתבדיד ‪R.‬‬
‫שבודד‬
‫‪solani‬‬
‫מהכתמים‪ .‬חץ שחור‬
‫‪G‬‬
‫‪H‬‬
‫מורה על אזור הנחת‬
‫הדסקית ‪ PDA‬עם או‬
‫ללא תפטיר הפטרייה ‪.‬‬
‫‪ -D‬חתך רוחב‪ ,‬אילוח‬
‫‪P. infestans‬‬
‫ב‪-‬‬
‫כדוגמה לפתוגן חודר‬
‫חתך‬
‫קליפה‪-E .‬‬
‫רוחב ‪ ,‬פקעת ביקורת‬
‫אילוח בדסקית ‪.PDA‬‬
‫‪ -F‬חתך רוחב‪ ,‬אילוח בתבדיד ‪ R. solani‬שבודד מהכתמים ולא חודר קליפה ‪ - G-H.‬דסקיות רוחב לא‬
‫מאולחות ומאולחות בהתאמה‪.‬‬
‫‪35‬‬
‫‪ 3.4‬השפעת גורמי ההזנה סידן וחנקן על התפתחות "הכתמים הכהים"‬
‫בשל עדויות מגדלים שקשרו את הופעת המחלה בשנים האחרונות עם שינוי ברמות‬
‫החנקן והסידן הנהוגות בגידול‪ ,‬הוחלט לבדוק את מעורבותם של גורמי הזנה אלו ביצירת‬
‫"הכתמים הכהים" בזן ניקולה‪ .‬לצורך כך גודלו צמחי תפו"א במצע פרלייט בחממה סגורה‪,‬‬
‫בשלוש רמות חנקן וסידן (כפי שמתואר בסעיף ‪ 2.4‬טבלה ‪ 1‬בפרק שיטות וחומרים)‪.‬‬
‫‪ 3.4.1‬מדדים פיטופתולוגיים‪ :‬כבר ביום ה‪( 80 -‬במהלך הגידול ) מהזריעה הבחנו‬
‫בקשיונות אופייניים ל‪ R. solani-‬על גבי הפקעות בכל הטיפולים המאולחים (איור ‪ .)9C‬ואכן‪,‬‬
‫בתום תקופת הגידול נמצא כי בכל הטיפולים המאולחים נוצרו קשיונות על גבי קליפת‬
‫הפקעות אך לא נמצאו "כתמים כהים" אופייניים (איור ‪ .)9F-G‬במהלך האחסון נצפתה נגיעות‬
‫בריקבונות לחים האופייניים לחיידקי ‪ Pectobacterium carotovorum‬וריקבונות קשים‬
‫האופייניים לפטריות פוזריום אולם לא בקורלציה עם אחד הטיפולים (נתונים לא מוצגים)‪.‬‬
‫לאחר האחסון קליפת הפקעת התפתחה מעל קשיונות שהתפתחו לכתמים אם כי לא במופע‬
‫הספונטני של "כתמים כהים" (איור ‪ .)9H-J‬ניתן לראות את הקישיונות באיור לאחר הסרת‬
‫חלק מהקליפה‪.‬‬
‫‪.‬‬
‫‪36‬‬
‫‪C‬‬
‫‪G‬‬
‫‪B‬‬
‫‪F‬‬
‫‪A‬‬
‫‪D‬‬
‫‪E‬‬
‫‪I‬‬
‫‪J‬‬
‫איור ‪ : 9‬ניסוי הזנה בתנאי חממה בצמחי תפו"א 'ניקולה '‪ :A .‬זריעת שלוש פקעות ניקולה‬
‫בדלי פרלייט והנחת הקישיונות בתעלת ‪ T‬ביניהם‪ :B .‬צמחי תפו"א במהלך הגידול ‪ :C‬פקעות שהוצאו‬
‫‪ 80‬יום לאחר הזריעה מטיפול מאולח וללא אילוח (שמאל ומימין בהתאמה)‪ :D-E .‬שורשים של טיפול‬
‫לא מאולח (ביקורת ) וטיפול מאולח בהתאמה ‪ : F-G‬פקעות ביקורת ומאולחות מיד לאחר הניסוי‬
‫(בהתאמה) ‪ : H-I‬צילום תקריב של הפקעות באיור ‪ ,J‬כיסוי קליפה מעל קשיונות ‪ :J .‬משמאל פקעות‬
‫מאולחות ומימין פקעות ביקורת חודש לאחר האחסון‪.‬‬
‫‪ 3.4.2‬השפעה על מדדי גידול‪ :‬בנוף הצמח לא נצפה הבדל בעוצמת הצימוח או נזק‬
‫אחר בקורלציה עם אחד הטיפולים‪ .‬מאחר והפקעות נאספו במצב בו ה נוף היה ירוק עדיין ‪,‬‬
‫מצבן היה קליף ‪ .‬האילוח השרה הסתעפות שורשים מועטה‪ ,‬קיצר את השורשים‪ ,‬וכן צבעם‬
‫נטה יותר להחמה בלי קשר לטיפולי הדישון (איור ‪ .)9D-E‬הפרמטרים שנבדקו על מנת‬
‫לאמוד פחת ביבול ופגיעה בפקעות היו גודל‪ ,‬משקל ומספר הפקעות‪ .‬בניתוח ‪ANOVA‬‬
‫במבנה תלת גורמי לא נמצאה כל אינטראקציה בין גורמי ההזנה לאילוח‪ ,‬אך נמצאה השפעה‬
‫מובהקת לגורמים חנקן וסידן‪ ,‬כל אחד בנפרד ואינטראקציה היחידה שנמצאה היא השפעת‬
‫‪37‬‬
‫‪H‬‬
‫שילוב סידן לחנקן על משקל הפקעות‪ .‬משקל הפקעות הכולל לצמח הושפע מרמת הסידן‬
‫במובהקות של ‪ .P< 0.018‬ריכוז סידן נמוך הפחית את משקל הפקעות משמעותית לעומת‬
‫טיפול בריכוזים בינוניים וגבוהים (איור ‪ .)10A‬לרמות החנקן הייתה השפעה מובהקת על‬
‫משקל הפקעות הכללי ברמת מובהקות של ‪ .P<0.0062‬משקל הפקעות הכללי לצמח קטן‬
‫משמעותית בריכוזי חנקן גבוהים לעומת ריכוזי חנקן בינוניים אך לא במובהק לעומת ריכוזים‬
‫נמוכים (איור ‪ .)10A‬השפעת האילוח על משקל הפקעות לא שמרה על מגמה אחידה‬
‫בהתאם לטיפולי הדישון‪ .‬הטיפול היחיד שהראה הבדל הוא טיפול ‪( 5‬ריכוזי חנקן וסידן‬
‫בינוניים) בו משקל הפקעות היה גבוה יותר בטיפול ללא אילוח אולם‪ ,‬בניתוח השונות לא‬
‫נצפתה אינטראקציה בין גורמי ההזנה לאילוח (איור ‪ .)10A‬טיפולי חנקן נמוך העלו במובהק‬
‫את מספר הפקעות (איור ‪ .)10B‬לריכוזי הסידן לא נרשמה השפעה על מספר הפקעות‪.‬‬
‫האילוח השפיע רק בטיפול מספר ‪( 7‬ריכוז חנקן גבוה וסידן נמוך) אך באופן כללי לא נצפתה‬
‫אינטראקציה בין האילוח לגורמי ההזנה‪ .‬טיפולי סידן נמוכים או גבוהים הפחיתו את גודל‬
‫הפקעות ברמת מובהקות של ‪ P<0.0234‬בהשוואה לריכוז האמצעי המיושם במסחר‪ .‬האילוח‬
‫בפטרייה השפיע על גודל הפקעות בשני טיפולים‪ 5 ,‬ו‪ 7 -‬לעומת טיפולי הביקורת (איור‬
‫‪.)10C‬‬
‫‪38‬‬
‫‪4‬‬
‫משקל הפקעות‬
‫‪Sum of‬‬
‫‪Squares‬‬
‫‪0.65491904‬‬
‫‪0.86246450‬‬
‫‪0.85656671‬‬
‫‪0.24676852‬‬
‫‪0.00869668‬‬
‫‪0.03669482‬‬
‫‪0.25824143‬‬
‫‪DF‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Nparm‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Source‬‬
‫סידן‬
‫חנקן‬
‫סידן*חנקן‬
‫אילוח‬
‫סידן*אילוח‬
‫חנקן*אילוח‬
‫סידן*חנקן*אילוח‬
‫‪3‬‬
‫‪R. solani‬‬
‫‪2.5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0‬‬
‫‪N‬‬
‫‪140‬‬
‫‪140‬‬
‫‪140‬‬
‫‪70‬‬
‫‪70‬‬
‫‪70‬‬
‫‪14‬‬
‫‪14‬‬
‫‪14‬‬
‫‪Ca‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫)‪Tubers weight (kg‬‬
‫‪F Ratio Prob > F‬‬
‫‪4.4601‬‬
‫*‪0.0186‬‬
‫‪5.8736‬‬
‫*‪0.0062‬‬
‫‪2.9167‬‬
‫*‪0.0345‬‬
‫‪3.3611‬‬
‫‪0.0750‬‬
‫‪0.0592‬‬
‫‪0.9426‬‬
‫‪0.2499‬‬
‫‪0.7802‬‬
‫‪0.8793‬‬
‫‪0.4860‬‬
‫‪3.5‬‬
‫‪Con.‬‬
‫‪Effect Tests‬‬
‫‪A‬‬
‫)‪Concentrations (mg/l‬‬
‫‪B‬‬
‫מספר הפקעות‬
‫‪Effect Tests‬‬
‫‪R. solani‬‬
‫‪40‬‬
‫‪30‬‬
‫‪Source‬‬
‫סידן‬
‫חנקן‬
‫סידן*חנקן‬
‫אילוח‬
‫סידן*אילוח‬
‫חנקן*אילוח‬
‫סידן*חנקן*אילוח‬
‫‪20‬‬
‫‪Tubers no.‬‬
‫‪Prob > F‬‬
‫‪0.7080‬‬
‫*‪0.0363‬‬
‫‪0.9414‬‬
‫‪0.7864‬‬
‫‪0.8329‬‬
‫‪0.0884‬‬
‫‪0.9541‬‬
‫‪F Ratio‬‬
‫‪0.3486‬‬
‫‪3.6404‬‬
‫‪0.1913‬‬
‫‪0.0745‬‬
‫‪0.1838‬‬
‫‪2.5967‬‬
‫‪0.1663‬‬
‫‪Sum of‬‬
‫‪Squares‬‬
‫‪44.33333‬‬
‫‪463.00000‬‬
‫‪48.66667‬‬
‫‪4.74074‬‬
‫‪23.37037‬‬
‫‪330.25926‬‬
‫‪42.29630‬‬
‫‪DF‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Nparm‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Con.‬‬
‫‪50‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫‪N‬‬
‫‪140‬‬
‫‪140‬‬
‫‪140‬‬
‫‪70‬‬
‫‪70‬‬
‫‪70‬‬
‫‪14‬‬
‫‪14‬‬
‫‪14‬‬
‫‪Ca‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫)‪Concentrations (mg/l‬‬
‫‪7.00‬‬
‫גודל הפקעות‬
‫‪6.00‬‬
‫‪Effect Tests‬‬
‫‪Sum of‬‬
‫‪Squares‬‬
‫‪0.22630000‬‬
‫‪0.01991111‬‬
‫‪0.19208889‬‬
‫‪0.00856296‬‬
‫‪0.03071481‬‬
‫‪0.08623704‬‬
‫‪0.07058519‬‬
‫‪DF‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Nparm‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Source‬‬
‫סידן‬
‫חנקן‬
‫סידן*חנקן‬
‫אילוח‬
‫סידן*אילוח‬
‫חנקן*אילוח‬
‫סידן*חנקן*אילוח‬
‫‪Con.‬‬
‫‪5.00‬‬
‫‪R.solani‬‬
‫‪4.00‬‬
‫‪3.00‬‬
‫‪2.00‬‬
‫‪1.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪N‬‬
‫‪140‬‬
‫‪140‬‬
‫‪140‬‬
‫‪70‬‬
‫‪70‬‬
‫‪70‬‬
‫‪14‬‬
‫‪14‬‬
‫‪14‬‬
‫‪Ca‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫‪80‬‬
‫‪16‬‬
‫‪4‬‬
‫)‪Concentrations (mg/l‬‬
‫איור ‪ : 10‬השפעת אילוח והזנה דיפרנציאלית בסידן וחנקן על איכות היבול ‪ 110‬ימים לאחר‬
‫הזריעה‪ .‬ציר ה‪ X -‬מציין שילוב ריכוזי החנקן (עליון ) והסידן (תחתון) שניתנו בכל טיפול (במ"ג לליטר)‪.‬‬
‫העמודות בצבע כחול מייצגות טיפולים ללא אילוח (ביקורת )‪ .‬העמודות בצבע אדום מייצגות טיפול‬
‫אילוח ב‪ R. solani -‬שבודדה מכתמים כהים‪ .‬עמודות קווי השגיאה מעל כל עמודה מייצגות שגיאת תקן‬
‫(‪ .)SE‬מימין לכל איור מרכיבי וניתוחי השונות כפי שבוצעו בתוכנת ‪ JMP‬בניתוח תלת גורמי‪ .‬סימון (*)‬
‫מעיד מבוהקות ברמה של ‪ -A .α=0.05‬ממוצע משקל הפקעות לטיפול (ק"ג)‪ -B .‬ממוצע מספר‬
‫הפקעות לטיפול ‪ -C .‬התפלגות גודל הפקעות לפי אינדקס גודל (גדול=‪ ,10‬בינוני =‪ 5‬וקטן=‪ )1‬כפי‬
‫שמפורט בסעיף ‪( 2.4.3‬גודל הפקעות מוצג באיור ‪.)5‬‬
‫‪39‬‬
‫‪Tubers size‬‬
‫‪F Ratio Prob > F‬‬
‫‪4.1764‬‬
‫*‪0.0234‬‬
‫‪0.3675‬‬
‫‪0.6951‬‬
‫‪1.7725‬‬
‫‪0.1558‬‬
‫‪0.3161‬‬
‫‪0.5775‬‬
‫‪0.5668‬‬
‫‪0.5723‬‬
‫‪1.5915‬‬
‫‪0.2176‬‬
‫‪0.6513‬‬
‫‪0.6297‬‬
‫‪C‬‬
‫‪ 3.5‬אפיון תבדיד ‪ R. solani‬מכתמים כהים בעזרת ‪rDNA-ITS‬‬
‫כיוון שהסימפטומים שהתקבלו באילוח ספונטני ובאילוח מלאכותי אינם אופייניים ל‪-‬‬
‫‪ R. solani‬וכן מורפולוגית צימוח התפטיר ופיזור הקישיונות על גבי מצע המזון הייתה מעט‬
‫שונה מהצפוי‪ ,‬עלה הצורך לאפיין את התבדיד שזוהה כגורם לתופעה‪ .‬זיהוי ואפיון ראשוני‬
‫של תפטיר הפטרייה במיקרוסקופ הראה כי אכן מדובר בריזוקטוניה (איור ‪ .)11‬קביעה זו‬
‫בוססה על פי מאפייני הפטרייה כגון‪ :‬הסתעפות מקור מרכזי בצורת ‪ ,T‬מחיצת התא‬
‫(ספטום) קרובה להסתעפות‪ ,‬יצירת קשיונות‪ ,‬תאים דמויי חבית סביב קשיונות‪ ,‬וצבירת‬
‫פיגמנט צהוב‪-‬חום בתאי התפטיר )‪ .(Parmeter and whitney, 1970; Sneh et al, 1991‬אולם‬
‫בחינה זו לא מספקת לשם קביעת המין וקבוצת האנסטומוזיס‪ .‬בהשוואת רצפי ‪rDNA-ITS‬‬
‫(‪ )Internal Transcribed Spacer‬של התבדיד שבודד לעץ פילוגנטי קיים נמצא כי התבדיד‬
‫משתייך ל‪ R. solani -‬מקבוצת אנאסטומוזיס ‪ )AG3( 3‬ולתת הקבוצה ‪( PT‬איור ‪ .)12‬התוצאה‬
‫המוצגת הינה ניסוי מייצג של אחת החזרות ‪ ,‬שתי החזרות הנוספות השתייכו גם הן לתת‬
‫הקבוצה ‪ .PT‬ההשוואה בוצעה בין רצפי ‪ ITS‬של התבדיד הנבדק לאותם רצפים של תבדידים‬
‫ידועים המופקדים בבנק הגנים‪ .‬זהות (‪ )identity‬ודמיון (‪ )similarity‬הרצף של התבדיד בתוך‬
‫ובין תת קבוצות האנסטומוזיס ‪ PT‬ו‪ TB -‬חושבו על ידי התוכנה ‪Campanella et al,) MatGat‬‬
‫‪ (2003‬ומסוכמות בטבלה מס' ‪ .3‬ערכי המינימום והמקסימום של הזהות בין התבדיד הנבדק‬
‫לשאר תבדידי ‪ PT‬היו ‪ 98.9%‬ו‪ ,99.4% -‬בהתאמה‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬הערכי הזהות של‬
‫התבדיד לעומת תבדידי ‪ TB‬היו ‪ .95.1%‬אותה מגמה נשמרה גם בדמיון בין ובתוך תת‬
‫הקבוצות‪ .‬הערכים מול קבוצת החוץ (‪ )out-group‬כצפוי היו נמוכים בהרבה לעומת תת‬
‫הקבוצות (טבלה מס' ‪.)3‬‬
‫‪B‬‬
‫‪C‬‬
‫איור ‪ : 11‬בחינה במיקרוסקופ אור של מאפייני תפטיר הריזוקטוניה שבודדה מהכתמים‬
‫הכהים‪ :A .‬היווצרות של קשיונות ‪ .‬החץ השחור מורה על תאי דמוי חבית ‪ :B-C .‬הסתעפות בצורת ‪T‬‬
‫ומחיצות תאים קרובות לאזור ההסתעפות‪.‬‬
‫‪40‬‬
‫‪A‬‬
‫‪A.rolfsii‬‬
‫‪AY684917‬‬
‫‪AB000004‬‬
‫‪TB‬‬
‫‪99‬‬
‫‪AB000001‬‬
‫‪94‬‬
‫‪AY154319‬‬
‫‪AG3‬‬
‫‪AB019023‬‬
‫‪AB000042‬‬
‫‪PT‬‬
‫‪85‬‬
‫‪68‬‬
‫‪Rh17‬‬
‫‪AB019017‬‬
‫‪90‬‬
‫‪0.1‬‬
‫איור ‪ : 12‬עץ פילוגנטי של קבוצת האנסטומוזיס ‪ 3‬של ‪ R. solani‬שנבנה על פי השוואת‬
‫רצפי ‪ ITS1‬ו‪ ITS2-‬של ה‪ . rDNA-‬השוואת הרצפים נעשתה בעזרת תוכנת ‪,BCM search launcher‬‬
‫עיבוד הרצפים בעזרת תוכנת ‪ ,GeneDoc‬בניית העץ הפילוגנטי בעזרת תוכנת ‪ EMBL-EBI‬ושרטוטו‬
‫בעזרת תוכנת ‪ .TreeView‬הסרגל מסמל את השוני הגנטי בין התבדידים ‪ .‬כל ענף בעץ נתמך על ידי‬
‫ערך ‪ .Bootstrap‬ערכים מעל מ‪ 60% -‬הוצגו בעץ‪ .‬התבדיד ‪ AY684917‬שימש כקבוצת חוץ ונלקח‬
‫מאורגניזם שונה ]‪ .[Athelia (Sclerotium) rolfsii‬תתי קבוצה מוצגים מימין ‪ PT-potato‬ו‪.TB-tobacco-‬‬
‫תבדיד הריזוקטוניה שבודד מכתמים כהים מוצג כ‪ . Rh17 -‬מוצג ניתוח של חזרה אחת מתוך שלוש‬
‫שבוצעו על שלושה תבדידים שונים ‪.‬‬
‫טבלה ‪ :3‬רצפי ‪ rDNA-ITS‬המייצגים טווחי זהות ודמיון בין ובתוך תתי קבוצת‬
‫האנסטומוזיס ‪ PT‬ו‪ .TB -‬תבדיד הריזוקטוניה שבודד מכתמים כהים מסומן כ‪.Rh17 -‬‬
‫התבדיד ‪ Athelia (Sclerotium) rolfsii AY684917‬שימש כקבוצת חוץ (‪)out-group‬‬
‫‪8‬‬
‫‪7‬‬
‫‪6‬‬
‫‪Identity‬‬
‫‪4‬‬
‫‪5‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪61.7‬‬
‫‪94.9‬‬
‫‪95.4‬‬
‫‪95.1‬‬
‫‪94.8‬‬
‫‪1‬‬
‫‪61.7‬‬
‫‪94.9‬‬
‫‪95.4‬‬
‫‪95.1‬‬
‫‪94.8‬‬
‫‪1‬‬
‫‪61.7‬‬
‫‪94.9‬‬
‫‪95.4‬‬
‫‪95.1‬‬
‫‪94.8‬‬
‫‪63.1‬‬
‫‪63.4‬‬
‫‪98.9‬‬
‫‪98.9‬‬
‫‪98.3‬‬
‫‪98.3‬‬
‫‪99.4‬‬
‫‪62.9‬‬
‫‪98.1‬‬
‫‪63.3‬‬
‫‪67.3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫‪99.4‬‬
‫‪94.9‬‬
‫‪95.2‬‬
‫‪94.9‬‬
‫‪95.2‬‬
‫‪94.9‬‬
‫‪95.2‬‬
‫‪98.3‬‬
‫‪98.3‬‬
‫‪95.4‬‬
‫‪95.4‬‬
‫‪95.4‬‬
‫‪98.1‬‬
‫‪98.9‬‬
‫‪98.9‬‬
‫‪95.2‬‬
‫‪95.2‬‬
‫‪95.2‬‬
‫‪66.9‬‬
‫‪67.3‬‬
‫‪66.9‬‬
‫‪65‬‬
‫‪65‬‬
‫‪65‬‬
‫‪41‬‬
‫‪1.‬‬
‫‪AB000001‬‬
‫‪2.‬‬
‫‪AY154319‬‬
‫‪3.‬‬
‫‪AB000004‬‬
‫‪4.‬‬
‫‪AB000042‬‬
‫‪5. Rh17‬‬
‫‪6.‬‬
‫‪AB019023‬‬
‫‪7.‬‬
‫‪AB019017‬‬
‫‪8.‬‬
‫‪AY684917‬‬
‫‪TB‬‬
‫‪TB‬‬
‫‪TB‬‬
‫‪similarity PT‬‬
‫‪PT‬‬
‫‪PT‬‬
‫‪PT‬‬
‫‪Out‬‬
‫‪Group‬‬
‫‪ 3.6‬הצטברות ‪ ROS‬ויצירת פרידרם מוגברת בתגובה לאילוח ב‪R. solani -‬‬
‫בשל הסימפטומים הייחודיים לגיל הפיסיולוגי הצעיר של הפקעות ולמצבה הלא יציב‬
‫של הקליפה‪ ,‬היה מקום לבחון האם מקורה של הנקרוזה וההשתעמות האופיינית בתגובת‬
‫הרקמה הצמחית לאילוח בפטרייה‪ .‬אכן רקמה מפקעות מאולחות באופן מלאכותי הראתה‬
‫הצטברות מוגברת של ‪ ROS‬שלוותה ביצירה מהירה ומוגברת של פרידרם החלמה וכתוצאה‬
‫מכך השתעמות מוגברת (איור ‪ .)13B‬רקמה מפקעות לא מאולחות לא הראתה סימנים ל‪-‬‬
‫‪ ROS‬באזור הפרידרם‪ 48 ,‬שעות לאחר הפציעה‪ ,‬למרות סימנים לכך באזור העמילופלסטים‬
‫שבקורטקס‬
‫(איור ‪ .)13A‬הצטברות מי החמצן תאמה את חדירת תפטיר הריזוקטוניה‬
‫לרקמה ורוב הפרידרם המאולח נצבע בצבען הספציפי (‪ )DCF‬כמו גם רקמת הקורטס‬
‫שמתחתיו (איור ‪.)13B‬‬
‫השתעמות היתר הנוצרת בעקבות האילוח בפטרייה‪ ,‬באה לידי ביטוי בעליה במספר‬
‫שכבות תאים מהמכילים סוברין שנוצרו בקליפה‪ .‬כך שבעוד שבקליפה פצועה אך לא‬
‫מאולחת הופיעו ‪ 62‬שכבות הסוברין שנצבעו באדום על ידי הצבען ‪ ,Sudan IV‬הרי שברקמה‬
‫מאולחת מלאכותית‪ ,‬עלה ממוצע שכבות התאים ל‪ 102 -‬תוך ‪ 3‬ימים מפציעה ואילוח‪ .‬מעל‬
‫לשכבת השעם נוצרה שכבת סגירה גדולה ומשמעותית לרקמה האולחת לעומת הלא‬
‫מאולחת (‪ .)13C, 13E‬רקמת הסגירה מזוהה מורפולוגית כתאי פרנכימה שעברו השתעמות‬
‫עם הפציעה ומכאן הזהירה האוטופלואורוצנטית כחולה המוגברת שנצפתה בתאורת ‪U.V‬‬
‫באורכי גל של ‪( 365nm‬איורים ‪ .)13D,13F‬כמו כן ני תן לראות כי באותו טווח זמן ‪ 72,‬שעות‪,‬‬
‫רקמת קורטקס מגיבה‬
‫מהר יותר ליצירת פרידרם‬
‫(איורים ‪ )13C-F‬לעומת רקמת ליבת‬
‫הפקעת המכילה תאי פרנכימה ‪ ,‬אשר בטווח זמן זה נמצאת רק ביצירת שכבת הסגירה‬
‫בביקורת ובאילוח כאחת (איורים ‪ .)13G-H‬באיורים אלו לא נוצרו עדיין תאי‬
‫פרידרם‬
‫שאמורים להראות מאורגנים ומסודרים בטור כמוצג באיור ‪ .13I‬שכבת הסגירה שנוצרה גם‬
‫בחתכים החיים וגם ברקמה המקובעת עבה יותר ברקמה המאולחת לעומת הרקמה‬
‫הפצועה בלבד‪.‬‬
‫‪42‬‬
‫איור ‪ : 13‬השתעמות יתר ותהליך יצירת פרידרם בפקעות שלמות ודסקיות תפו"א מאולחות‬
‫מלאכותית ב‪ R. solani -‬שבודדה מהכתמים הכהים‪ ,A-B .‬חתכים חיים של רקמת ביקורת ומאולחת‬
‫(בהתאמה) ‪ 48‬שעות לאחר אילוח צבועות ב‪ .DCF -‬החיצים בצבע כחול‪ ,‬לבן ואדום מורים על תפטיר‬
‫הפטרייה‪ ,‬שכבת הפרידרם‪ ,‬ותאי קורטקס ‪ ,‬בהתאמה‪ ,C-D .‬חתכים חיים של רקמת פרידרם בפקעת‬
‫ביקורת שנצבעה על ידי ‪ Sudan IV‬כפי שנראים במקרוסקופ אור ותחת הארת ‪ ,UV‬בהתאמה‪,E-F .‬‬
‫חתכים חיים של רקמת פרידרם בפקעת מאולחת בריזוקטוניה שנצבעה על ידי ‪ Sudan IV‬כפי‬
‫שנראים במקרוסקופ אור ותחת הארת ‪ ,UV‬בהתאמה‪ .‬החץ הלבן מורה על שכבת הסגירה ‪-Pm‬‬
‫פלם‪ -Pg .‬פלוגן ‪ ,G-H .‬רקמה מקובעת מדסקיות תפו "א ביקורת ומאולחות בהתאמה‪ ,‬כפי שנצפו‬
‫במקרוסקופ אור תחת הארת ‪ ,I . UV‬חתך ברקמה מקובעת מפרידרם טבעי (קליפה ) במקרוסקופ אור‬
‫בהארת ‪.UV‬‬
‫‪43‬‬
‫‪ 3.7‬ביטוי גנים המעורבים בביוסינתזה של סוברין בתגובה לאילוח ב‪R. solani -‬‬
‫במטרה להבין מהו המנגנון בו משרה הפטרייה השתעמות יתר בפרידרם המטופל‪,‬‬
‫נבחנה האפשרות להשראת ביטוי יתר של גנים המקודדים למרכיבים במסלול הביוכימי‬
‫היוצר סוברין‪ .‬בהתאם לתיאור של )‪ Bernards (2002‬את ביוסינתזת הסוברין ואת הגנים‬
‫המעורבים בה‪ ,‬הראנו עלייה בשלושה גנים חשובים במערכת זו‪ .‬ביטוי ‪ StKCS6‬ו‪CYP86A33 -‬‬
‫עלה פי ‪ 6.5‬ופי ‪ ,3.4‬בהתאמה‪ 24 ,‬שעות לאחר אילוח בריזוקטוניה לעומת הביקורת (איור‬
‫‪ .)14A-B‬בנוסף לכך נצפתה עלייה בביטוי הגן ‪ POP_A‬פי ‪ 48 ,1.5‬שעות לאחר האילוח‬
‫בהשוואה לביקורת (איור ‪ .)14C‬המגמה נעצרה ‪ 48‬שעות לאחר האילוח בגנים ‪StKCS6‬‬
‫ו‪ CYP86A33 -‬ולאחר ‪ 72‬שעות בגן ‪ POP_A‬ונמשכה ‪ 24‬בלבד כש לאחריהן חזר ה ביטוי‬
‫לקדמותו‪.‬‬
‫‪.CON‬‬
‫‪30‬‬
‫‪20‬‬
‫‪10‬‬
‫‪Relative abundance‬‬
‫‪R‬‬
‫‪A- StKCS6‬‬
‫‪40‬‬
‫‪0‬‬
‫‪48‬‬
‫‪24‬‬
‫‪4‬‬
‫‪B- CYP86A33‬‬
‫‪200‬‬
‫‪150‬‬
‫‪100‬‬
‫‪50‬‬
‫‪Relative abundance‬‬
‫‪48‬‬
‫‪24‬‬
‫‪0‬‬
‫‪250‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪4‬‬
‫‪60‬‬
‫‪50‬‬
‫‪40‬‬
‫‪30‬‬
‫‪20‬‬
‫‪10‬‬
‫‪Relative abundance‬‬
‫‪C- POP_A‬‬
‫‪70‬‬
‫‪0‬‬
‫‪72‬‬
‫‪48‬‬
‫‪24‬‬
‫‪Hours after inoculation‬‬
‫‪4‬‬
‫‪0‬‬
‫איור ‪ : 14‬השפעת אילוח פקעת תפו"א ב‪ R. solani -‬על ביטוי גנים המעורבים בביוסינטזה‬
‫של סוברין ‪ StKCS6, CYP86A33‬ו‪ A, B, C( POP_A -‬בהתאמה)‪ .‬רמת הביטוי נבחנה באנליזת‬
‫‪ .Quantitative Real-time RT-PCR‬הערכים נורמלו על ידי השוואה עם הגן ‪(housekeeping ( 18S‬‬
‫‪ .reference gene‬הרקמה נאספה בחמישה זמנים‪ 48 ,24 ,4 ,0 :‬ו‪ 72 -‬שעות‪ .‬בכל מועד עמודה‬
‫שחורה מייצגת את פקעות הביקורת ולבנה את הפקעות המאולחות בריזוקטוניה ‪ .‬באיור מוצג ניסוי‬
‫מייצג מתוך שלוש ה ניסויים בלתי תלויים שבוצעו (חזרות ביולוגיות )‪ .‬עמודות השגיאה מייצגות ניתוח‬
‫‪ STD‬של שלוש החזרות בניסוי המייצג ‪.‬‬
‫‪44‬‬
‫‪ .4‬דיון ומסקנות‬
‫‪ 4.1‬אפיון התנאים המובילים ליצירת "כתמים כהים"‬
‫"כתמים כהים" בפקעות תפו"א הנאספות לפני התייצבות קליפתן נוצרים במהלך‬
‫אחסון בצוברים לאפיון התנאים בהם מאוחסנות הפקעות ובהם מופיעים ה "כתמים הכהים "‬
‫נמצא ערך רב ביכולת לבצע סימולציה של התופעה בתנאי מעבדה‪ .‬הצוברים אוחסנו ב‪8C -‬‬
‫מתוך ציפייה כי טמפרטורת הפקעות תרד תוך מספר ימים אולם‪ ,‬במפתיע הטמפרטורה‬
‫עלתה בשבוע הראשון וכך גם רמת הפד"ח בסביבת הפקעות‪ .‬אסיף הפקעות בשלב הקליף‬
‫עוד לפני התייצבות הקליפה‪ ,‬תרם ככל הנראה לנשימה המוגברת של הפקעות‪ ,‬כחלק‬
‫מתהליך ההגלדה‪ .‬בתהליך ההגלדה ויצירת הפרידרם ישנה התחלקות מואצת של תאים‬
‫מריסטמטיים של הפלוגן ומכאן נשימה מואצת ושחרור פד"ח‪ .‬לאחר שלושה שבועות‬
‫הקליפה מתייצבת‪ ,‬התהליך מואט ועל כן חלה ירידה ברמות הפד"ח וירידה בטמפרטורות‪.‬‬
‫האוויר בחדרי אחסון אלו מסוחרר אך יתכן כי תחלופת האוויר אינה יעילה בין הצוברים‬
‫לסביבה ובתוכם‪ .‬תופעה נוספת שנצפתה בניסוי זה היא אובדן הנוזלים בכבול העוטף את‬
‫הפקעות וזאת בניגוד להערכה המוקדמת בה ציפינו להצטברות נוזלים בתחתית הצובר‪ .‬כיוון‬
‫שמדידות הרטיבות בכבול בוצעו בסוף האחסון‪ ,‬ניתן להניח שעם העלייה ברמת הנשימה‬
‫עלתה רטיבות בתוך הצובר‪ ,‬אך תנועת האוויר וההצטננות ההדרגתית של הפקעות הביאו‬
‫בסוף תקופת האחסון לירידה ברטיבות הכבול בהשוואה למצב ההתחלתי‪.‬‬
‫תופעת "הכתמים הכהים"‪ ,‬אשר נמצא שמקורה באילוח בפטרייה ‪Rhizoctonia‬‬
‫‪ solani‬מקבלת ככל הנראה עידוד מחוסר יציבות הקליפה ומאי קיום תהליך ההגלדה‪ .‬כפי‬
‫שהוכח בעבודות קודמות‪ ,‬בפקעות קליפות שלא עברו הגלדה מספקת‪ ,‬נראה כי גם במקרה‬
‫זה התרחשות המחלה היא שילוב של רגישות הפקעות ונוכחות הפתוגן בתנאים‬
‫אופטימאליים להיווצרות התופעה (‪.)Murphy, 1968; Lulal and Orr, 1993‬‬
‫ההערכה היא כי הטמפרטורה הנוחה לריזוקטוניה כתוצאה מנשימה מוגברת‬
‫בצוברים בשילוב הלחות הגבוהה המשתחררת מהכבול או מהפקעות‪ ,‬מובילה לתנאים‬
‫הנוחים להתבססות הפטרייה‪ .‬בישראל ישנן שתי עונות עיקריות של אסיף תפו"א‪ ,‬באביב‬
‫(מאי‪-‬יוני) ובסתיו (דצמבר‪-‬פברואר)‪ .‬בדיקות אלו נעשו בחורף לאחר אסיף הסתיו‪ .‬באסיף‬
‫האביבי הטמפרטורה ההתחלתית של הפקעות באחסון גבוהה יותר ותהליך קירור הפקעות‬
‫צפוי להמשך לאורך זמן‪ ,‬דבר שעלול להוביל להחמרת התופעה‪ .‬אולם מטעמים שיווקיים‬
‫בעונת האביב לא נאספות פקעות במצב קליף ולכן נראה שזאת הסיבה שהתופעה לא‬
‫נצפתה בעונה זאת‪.‬‬
‫‪45‬‬
‫‪ 4.2‬בידוד הפתוגן והשלמת מבחן קוך‬
‫לימוד התנאים בצובר סיפק מידע חשוב שיושם בעת ביצוע‬
‫אופטימאליים לקבלת סימפטומים ביעילות של‬
‫מבחן קוך בתנאים‬
‫כ‪ ,95% -‬ולקבוע שאכן ‪ R. solani‬היא‬
‫הפטרייה הגורמת ל"כתמים הכהים"‪ .‬למעשה‪ ,‬בעבודה זאת מוצגת לראשונה עדות לכך‬
‫שהפטרייה ‪ R. solani‬גורמת גם למחלת אחסון בתפו"א‪ .‬עם מעבר מחסום הקליפה הצעירה‬
‫והחדירה‪ ,‬על ידי פציעה מכוונת או בשל נזק מכני במהלך האסיף מתבססת הפטרייה‬
‫ברקמת הפרידרם‪ .‬אסיף הפקעות לפני התייצבות הקליפה ללא ספק תורם ליצירת פצעי‬
‫חדירה רבים‪ ,‬בשל רגישות הקליפה הקיימת (קליפות)‪ .‬מתוך פתוגנים שונים שבודדו‬
‫מסימפטומים אופייניים נמצא כי ריזוקטוניה הינה הפתוגן האחראי העיקרי על התפתחות‬
‫הכתמים הקשים ביותר בפרידרם‪ ,‬בעקבות אילוח מלאכותי‪ .‬בפקעות ללא פציעה לא נצפו‬
‫הכתמים האופייניים והתפתחה בהם רקמת‬
‫פרידרם החלמה בדומה לפקעות הביקורת‬
‫ש"אולחו" בדסקית ‪ PDA‬בלבד‪ .‬תצפית זו מפתיעה מאחר ו‪ R. solani -‬גורמת בעיקר לכיבים‬
‫בגבעול ולקשיונות על גבי הפקעת אשר מתפתחים בשדה ולא באחסון )‪ ,(Tsror, 2010‬עד כה‬
‫פקעות שנאספו בשדה ללא קשיונות לא פיתחו סימפטום זה בשלב האחסון‪ .‬עובדה זו‬
‫מחזקת את הנחת העבודה כי ‪ R. solani‬היא הגורם הראשי ביצירת "כתמים כהים"‪.‬‬
‫‪ 4.3‬מעורבות גורמי הזנה סידן וחנקן ביצירת הסימפטומים‬
‫לטיפולי הדישון השונים לא נמצאה השפעה על הנגיעות במחלה מאחר ובכל‬
‫הטיפולים נוצרו קשיונות על הפקעות ולא נמצא אף טיפול שהשרה "כתמים כהים" אופייניים‪.‬‬
‫לעומת השפעה על פרמטרים כגון מספר‪ ,‬משקל וגודל הפקעות‪ ,‬לא נמצאה כל אינטראקציה‬
‫בין טיפול דישון מסוים לאילוח בפטרייה‪ .‬להשפעת החנקן על משקל הפקעות הנובע ממספר‬
‫פקעות נמוך ישנן עדויות רבות בספרות מאחר ובריכוזי חנקן גבוהים ישנה העדפה של‬
‫הצמח להתפתחות הנוף ולא לפקעות )‪ .(Ewing and Struik, 1992‬השפעת הסידן על מספר‬
‫וגודל הפקעות תוארה בעבודות קודמות‪ ,‬ריכוזים שונים בשילוב סוגי קרקע שונות השפיעו‬
‫על איכות כמות וגודל היבול (‪ .)Simmons and Kelling, 1987‬כמו כן ‪ ,‬מחקרים קודמים הראו‬
‫כי ריכוזים אופטימאליים של סידן אף מעורבים ביצירה מהירה של קליפה דבר המסייע‬
‫לגדילה טובה יותר של פקעות (‪.)Simmons et al, 1988; Locascio et al, 1992‬‬
‫ניסוי ההזנה סבל מחוסר דיוק ברמות הדשן המיושמות‪ ,‬בשל קשיים טכניים‪ .‬אף על‬
‫פי כן בכל הטיפולים המאולחים נוצרו קשיונות ונצפה דלדול של בית השורשים כנראה בשל‬
‫נגיעות זו‪" .‬כתמים כהים" אופייניים לא התפתחו באופן ספונטני גם לאחר אחסון ממושך של‬
‫‪ 40‬יום בתנאים שנמצאו מתאימים לאילוח בניסוי צוברים‪ .‬יתכן שתנאי הגידול (מצע‬
‫הפרלייט‪ ,‬גידול בחממה וכו') לא יצרו שילוב גורמים שהביא ליצירת הכתמים האופייניים‪.‬‬
‫‪46‬‬
‫‪ 4.4‬אפיון תבדיד הריזוקטוניה שבודד מ"כתמים כהים"‬
‫בעבר היה נהוג לאפיין תבדידי ריזוקטוניה לפי מספר הגרעינים בתא כשהחלוקה‬
‫הייתה לפי טיפוסים רב גרעיניים (‪ ,)MNR‬דו‪-‬גרעיניים (‪ )BNR‬וחד‪-‬גרעיניים (‪ )UNR‬וכן לפי‬
‫יכולת איחוי הקורים ושיוך לקבוצות אנאסטומוזיס (‪ .(Sneh et al, 1991) )AGs‬למעט ‪R.‬‬
‫‪ ,solani‬רוב מיני הריזוקטוניה אינם פתוגנים לתפו"א‪ ,‬אם כי חלקם כן מאכלסים חלקים‬
‫שונים של הצמח )‪ .(Carling and Leiner, 1990‬בתוך מין זה ישנן כמה קבוצות אנאסטומוזיס‬
‫אשר מדביקות תפו"א )‪ (Banville et al, 1996‬אך רובן מוגבלות לחלקים מסוימים בצמח‪.‬‬
‫‪ AG3‬היא הקבוצה הגורמת לעיקר מחלות הריזוקטוניה בתפו"א והיא מחולקת לשתי תתי‬
‫קבוצות‪ PT :‬בתפו"א ו‪ TB -‬בטבק )‪ .(Kuninaga et al, 2000‬בשל קירבתן‪ ,‬נבחרו שלושה‬
‫נציגים מכל אחת מתתי קבוצות‪ .‬אחת השיטות המקובלות לאפיון תבדידי ריזוקטוניה עד‬
‫לרמת תת קבוצה היא ‪ .)Sharon et al, 2006) ITS-rDNA‬שיטה זו תמכה בסיווג שבוצע‬
‫בעזרת איחוי הקורים ואף העלתה את רמת הדיוק לכדי תתי קבוצות ( ;‪Carling et al, 2002b‬‬
‫‪ .)Gonzalez et al, 2001; Kuninaga et al, 1997‬יש בשיטה זאת פיתרון לקבוצות שהיה קושי‬
‫לבדוק בשיטת האיחוי בשל מוות הפטרייה לאחר האיחוי (אי‪-‬התאם)‪ ,‬אובדן היכולת לאיחוי‬
‫בתוך הקבוצות ואיחוי עם קבוצות אחרות במקרים מסוימים ( ‪Carling et ; Sneh et al, 1991‬‬
‫‪ .)al, 1996‬בבדיקה שבוצעה נבחרו שלושה תבדידים מייצגים של שני תתי הקבוצות של‬
‫‪ AG3‬של ‪ R. solani‬וכן קבוצת חוץ הנותנת תמיכה לעץ הפילוגנטי‪ .‬על פי העץ הפילוגנטי‪,‬‬
‫התבדיד הנבדק אכן משתייך לקבוצת האנסטומוזיס ‪ 3‬מהמין ‪ R. solani‬כשתבדיד זה הוא‬
‫בעל דמיון וזהות גבוהים לתת הקבוצה ‪ PT‬לעומת דמיון וזהות נמוכים יותר לתת הקבוצה‬
‫‪ .TB‬תוצאות אלו תואמות את המידע הקיים בספרות ובו אכן תבדידים מתת הקבוצה ‪PT‬‬
‫נמצאו כפתוגנים של תפו"א (‪.)Kuninaga et al, 2000‬‬
‫הפטרייה ‪ R. solani‬ידועה כפתוגן התוקף בשלב הגידול הגורם לכיבים בגבעול‬
‫ובסטולון וכן לקשיונות על גבי פקעות )‪ (Banville, 1978; Scholte, 1989‬אולם עד כה לא‬
‫דווח על ‪ R. solani‬התוקפת בשלב האחסון‪ .‬פקעות שנאספו ללא נגיעות בקשיונות מהשדה‬
‫לא פיתחו קשיונות בהמשך‪ .‬כאשר מדובר ב"כתמים כהים"‪ ,‬הפקעות נאספות ללא כל נגיעות‬
‫בכתמים אך לאחר אחסון ממושך מתפתחת התופעה והחשד הוא כי האילוח אכן מתרחש‬
‫כבר בשדה‪ ,‬אך ההתפתחות ההתבטאות התסמינים היא מאוחרת יותר ‪ -‬באחסון‪ .‬תבדיד‬
‫זה אמנם משתייך לתת הקבוצה ‪ PT‬אך במאפיינים כגון צורת הגדילה על מצע מזון‪,‬‬
‫סימפטומים‪ ,‬ותזמון התופעה (באחסון) ישנו הבדל והתבדיד אינו מתנהג כ‪R. solani -‬‬
‫אופיינית‪ .‬יתכן והתנאים השונים באסיף ו באחסון גורמים לשינויים ב אופי החדירה‬
‫וההתבססות הפטרייה ברקמה אשר מובילים לסימפטומים שלא היו מוכרים עד כה‪.‬‬
‫‪47‬‬
‫‪ 4.5‬תגובת רקמת הפקעת‪ -‬השתעמות וגורמי חמצון‬
‫קליפת תפו"א כוללת תאי פלם אשר דפנותיהם מכילים כמות גדולה יחסית של‬
‫סוברין‪ .‬יצירת הסוברין וצבירתו בתאי הפלם בתגובה לפציעה נחשב לתהליך איטי יחסית‬
‫המגיע לשיאו תוך ‪ 5-10‬ימים )‪ .(Hammerschmidt, 1985‬עבודה קודמת הראתה כי עקה‬
‫ביוטית או א‪-‬ביוטית יכולה לזרז את התהליך ולגרום להשתעמות יתר בתאי הפרידרם‬
‫בקליפת תפו"א )‪ Lulal and Corsini (1998) .(Hammerschmidt, 1985‬הראו בפקעות תפו"א‬
‫כי עיכוב תהליכי סובריזציה‪ ,‬גורם לאילוח אגרסיבי ומהיר יותר ב‪Pectobacterium -‬‬
‫‪ caratovorum‬וב‪ .Fusarium sambucinum -‬כמו כן הם הראו כי לאחר פציעה ישנה עלייה‬
‫בגורם הפנולי תחילה ובמקרה של מתקפה בפטרייה ישנה עלייה תחילה של הגורם הפנולי‬
‫ומאוחר יותר עלייה בגורם האליפטי ‪ .‬בעבודה זו הראנו כי אילוח ב‪ R. solani -‬משרה תגובת‬
‫השתעמות יתר בקליפת הפקעות המובילה להופעת "הכתמים הכהים" הנצפים על פני‬
‫הקליפה‪ .‬השתעמות זו שונה‪ ,‬בארגון ובגודל התאים‪ ,‬משכבת פרידרם אשר נוצרת בקליפה‬
‫טבעית‪ .‬שכבת תאי הפרידרם שנוצרה בתגובה לאילוח בפטרייה הייתה עבה יותר וכללה‬
‫יותר תאים בכל שלושת מרכיבי הפרידרם לעומת הביקורת בה שכבות תאים אלו היו‬
‫מועטות יותר ונוצרו באטיות רבה יותר בתגובה לפציעה‪ .‬כמו כן הרקמ ה המאולחת פיתחה‬
‫שכבת סגירה עבה ‪ ,‬מהר יותר‪ ,‬דבר הכרחי להחלמה תקינה‬
‫ומהירה של רקמה ומניעת‬
‫חדירת הפתוגן בשלבים הראשונים של ההדבקה ‪ .‬תופעה זו נצפתה אף באילוח דסקיות‬
‫תפו"א‪ ,‬הפטרייה לא חדרה לעומק הרקמה והתפתחה באופן‬
‫שטחי בלבד ‪ .‬עבודה קודמת‬
‫הראתה כי ‪ R. solani‬לא מצליחה לחדור אל תאי הפרנכימה הנמצאים מעבר לפלוגן למרות‬
‫כי הייתה חדירה אל תוך תאי הפרידרם )‪ .)Lulai et al, 2006‬תגובת הרקמה לאילוח דומה‬
‫לתגובה לפציעה בלבד אך בעלת אופי מהיר ומוגבר ‪ .‬גם שכבת הסגירה עבה יותר בעלת‬
‫תאים גדולים המכילים יותר חומרים הגנה ושעם בד ופן‪ ,‬ובנוסף לכך תאי הפרידרם אף הם‬
‫מרובים ועבים יותר‪.‬‬
‫בתגובה לאילוח ב‪ ,R. solani -‬ברקמת הפקעת‪ ,‬הראנו כי ישנה הצטברות של‬
‫גורמים מחמצנים (‪ .)ROS‬ייצור מוגבר של ‪ ROS‬בתהליכי יצירת פרידרם בפקעת תפו"א דווח‬
‫בעבר )‪ (Espelie and Kolattukudy, 1985; Bernards et al, 1999‬כמו כן‪ ,‬הוצע כי גורמים אלו‬
‫מעורבים בביוסינתיזה של סוברין בעגבנייה (‪ .)Quiroga et al, 2000‬בהתאם להסבר‬
‫המפורט בפרק ‪ 1.2.3‬במבוא‪ ,‬על הכרחיות פראוקסידאז ומי חמצן לפילמור הגורם הפנולי‬
‫בסוברין‪ ,‬אנו מראים בעבודה זו הצטברות ‪ ROS‬כהוכחה נוספת להשתעמות יתר בתגובה‬
‫לאילוח ב‪ .R. solani -‬בהתאם לכך נצפה ביטוי מוגבר של הגן ‪ POP_A‬אשר הוכח כמעורב‬
‫בתהליכי סובריזציה בתגובה לפציעה של פקעות תפו"א )‪ 48 ,(Roberts et al, 1988‬שעות‬
‫‪48‬‬
‫לאחר האילוח‪ .‬העלייה במי החמצן היא תגובה לחדירת הפתוגן בדמות יצירה של רקמת‬
‫הגנה– הפרידרם‪.‬‬
‫בנוסף לעלייה בביטוי ‪ POP_A‬נצפתה עלייה בביטוי שני גנים נוספים המעורבים‬
‫בתהליכי סובריזציה בפקעות תפו"א‪ StKCS6 ,‬ו‪ . CYP86A33 -‬אילוח בפטרייה הוביל לביטוי‬
‫מוגבר בשני הגנים ‪ 24‬שעות לאחר האילוח וזאת בקורלציה להשתעמות היתר שנצפתה‬
‫חזותית ובחתכים ההיסטולוגיים‪ 72 ,‬שעות לאחר האילוח‪ .‬העלייה נמשכה כ‪ 24 -‬שעות‬
‫בלבד‪ .‬תהליך ההשתעמות מתרחש גם בביקורת אולם ברמה מתונה יותר ‪ ,‬התגובה מהירה‬
‫והקצרה נועדה ככל הנראה לבלום את חדירת והתקדמות הפתוגן ‪ ,‬לאחר שהדבר בוצע יש‬
‫חזרה לרמה המתונה כבביקורת ‪ .‬בכמה מקרים דווח כי ‪VLCFAs (very long chain fatty‬‬
‫)‪ acids‬ונגזרותיהן הופקו כמרכיב עיקרי ברקמות סוברין בעץ השעם )‪(Quercus suber‬‬
‫)‪ )Silva et al, 2005‬ובתפו"א )‪ VLCFAs .(Schreiber et al, 2005‬משמשות כסובסטראט‬
‫לחלבון ‪ cytochrome P450 monooxygenases‬אשר מתורגם מהגן ‪ .CYP86A33‬העלייה‬
‫בביטוי ‪ StKCS6‬מובילה להצטברות חומצות שומן ארוכות (‪ )VLCFAs‬אשר ככל הנראה משרות‬
‫ביטוי מוגבר של ‪ .CYP86A33‬ביטוי מוגבר של גנים אלו‪ ,‬בתגובה לאילוח בפתוגן‪ ,‬מצביע על‬
‫קשר להצטברות הסוברין‪ .‬כפי שדווח על ידי )‪ Lulal and Corsini (1998‬ופורט לעיל הצטברות‬
‫גנים המעורבים בביוסינתזה של הגורם האליפאטי הם‬
‫ספציפיים בתגובה למתקפה‬
‫פטרייתית‪ .‬במחקר נוסף נצפה כי ברקמת תפו "א שהייתה פגועה ביצירת גורם זה הייתה‬
‫חדירה של ‪ R. solani‬אל תאי פרנכימה )‪ .)Lulai et al, 2006‬ניתן לשער כי הגורם האליפאטי‬
‫הוא המונע את חדירת הפטרייה אל לב הפקעת והגורם הפנולי אחראי בעיקר על‬
‫תהליך‬
‫ההחלמה מפציעה‪ ,‬השערה שיש לבחון במחקר עתידי‪.‬‬
‫‪ 4.6‬סיכום‬
‫לסיכום‪ ,‬בעבודה זו אנו הראנו לראשונה כי הפטרייה ‪ R. solani‬גורמת להיווצרותם‬
‫של "כתמים כהים" בשלב האחסון של תפו"א‪ .‬הראנו כי אחסון בתנאים סטנדרטיים‬
‫ומקובלים של פקעות אשר נאספו לפני התייצבות קליפתן (תפו"א קליפים)‪ ,‬מעודד‬
‫משמעותית את האילוח ב‪ .R. solani -‬תוצאות עבודה זו מצביעות גם על כך שבתגובה‬
‫לאילוח בריזוקטוניה‪ ,‬ישנה הצטברות של ‪ ROS‬ברקמה אשר מעורב הן בביוסינתיזת סוברין‬
‫והן בתגובת רקמה צמחית לפתוגנים ‪ .‬סביר להניח שתגובה זו של הרקמה אינה מאפשרת‬
‫לפתוגן לחדור אל מעבר לקליפה‪ .‬למרות הפגיעה השטחית של הקליפה והיעדר חדירה‬
‫לעומק (ל"בשר" הפקעת) נגרם נזק כלכלי לאיכות הפקעת ‪ ,‬בעיקר בפקעות המיועדות‬
‫לייצוא‪ .‬מאחר וחדירת הפתוגן נעצרת‪ ,‬התגובה היא ככל הנראה דמוית רגישות יתר‬
‫‪49‬‬
‫(‪ ,)hypersensitive response-like‬המקנה עמידות לפקעת והתוצאה הם כתמים נקרוטיים‬
‫שטחיים על גבי הקליפה‪.‬‬
‫בעבודות קודמות שבוצעו בשעועית )‪(Phaseolus vulgaris L.‬‬
‫‪(Stockwell and‬‬
‫)‪ Hanchey, 1987; Guillon et al, 2002; Wen et al, 2005‬וכן באורז )‪(Oryza sativa L.‬‬
‫)‪ (Deborah et al, 2001; Lee et al, 2006‬דווח כי אילוח בתבדיד פתוגני של ‪ R. solani‬הביא‬
‫לביטוי של מנגנוני הגנה רבים שבסופו של דבר הובילו לייצור חלבוני ‪pathogenesis-( PR‬‬
‫‪ )related proteins‬רבים ולתהליכי ליגניפיקציה‪ Friend et al (1973) .‬הראו עלייה בפעילות‬
‫האנזים ‪ )PAL( phenylalanine ammonia-lyase‬וברמות חומצה כלוריגנית והצטברות של‬
‫פולימר דמוי‪-‬ליגנין בדסקיות פקעות תפו"א בתגובה לאילוח ב‪ .P. infestans -‬באינטראקציה‬
‫בין פקעות תפו"א ל‪ Verticillium dahliae -‬אופיינה עמידות שהחלה ברגישות יתר שהובילה‬
‫להחמה והצטברות סוברין )‪ .(Vaughn and Lulai, 1991‬במהלך תגובת רגישות יתר (‪)HR‬‬
‫לעקות ביוטיות וא‪-‬ביוטיות‪ ,‬ישנה הצטברות של ‪ ROS‬המעורב בשני תהליכים‪ :‬האחד פגיעה‬
‫בפתוגן והשני פגיעה עצמית בתאי הפונדקאי שמובילים לתמותה מתוכננת ונקרוזה ‪(Lamb‬‬
‫)‪ .and Dixon, 1997‬סובריזציה בתגובה לאילוח ב‪ R. solani -‬מלווה גם ברמה גבוהה של‬
‫‪ ROS‬וכן בביטוי מוגבר של גנים המעורבים בהגנה וזאת בדומה לתגובת ‪ .HR‬בביוסינתיזה‬
‫של סוברין בכלל‪ ,‬ובתגובה לפתוגנים כמנגנון המשרה עמידות בפרט חסר מידע רב בכדי‬
‫להבין את המסלול הביוכימי‪ .‬בכדי להמשיך ולהגדיל את שוק ייצוא תפו"א הצעירים ("בייבי")‬
‫יש צורך להעריך ולבחון מחדש את שיטת האחסון הנהוגה לפקעות מסוג זה בכדי למנוע את‬
‫התפתחות "הכתמים הכהים" בשלב האחסון וההובלה הימית‪ .‬יתכן שיש צורך לצנן את‬
‫הפקעות ביעילות רבה יותר ואולי אף לבצע בהן פעולות חיטוי במהלך אריזתן בצוברים‪ .‬ללא‬
‫ספק יש מקום להמשיך מחקר זה בעיקר מההיבט של בחינת פתרונות יישומיים בטווח הקצר‬
‫לצד המשך לימוד מנגנון החדירה וההתבססות של הגורם‪.‬‬
‫‪50‬‬
‫ רשימת ספרות‬.5
‫ מחקר‬.‫אדמה בישראל – בעיות ופתרונות‬-‫ אחסון תפוחי‬.)1992 ( .‫ וורשבסקי ש‬,.‫אפק ע‬
.97-114 :1 .‫חקלאי בישראל‬
‫ אחסנת פירות פלפל לאחר קטיף בטמפרטורות נמוכות מאוד‬.)2008( .‫ ופליק א‬,.‫יוסף א‬-‫בר‬
, ‫ עבודת מוסמך‬. ‫ פתולוגיים וביוכימיים‬, ‫ היבטים פיסיולוגיים‬-‫ מ"צ) כטיפול הסגר‬1.5(
.‫ המזון ואיכות הסביבה של האוניברסיטה העברית‬,‫הפקולטה לחקלאות‬
,‫ כרך שישי‬,‫ בתוך אנציקלופדיה לחקלאות‬.‫ תפוחי אדמה‬:‫ ירקות פקעת‬.)1992( .‫שוהם ח‬
.3-58 .‫אביב האנציקלופדיה לחקלאות‬-‫ תל‬.'‫גידול ירקות ב‬
Armentrout, V.N., and Downer, A.J. (1987). Infection cushion development by
Rhizoctonia solani on cotton. Phytopathology 77:619-623.
Bain, R.A., Millard, P., and Perombelon, M.C.M. (1996). The resistance of potato plants
to Erwinia carotovora subsp. atroseptica in relation to their calcium and magnesium
content. Potato Res. 39:185-193.
Baker, C.J., and Bateman, D.F. (1978). Cutin degradation by plant pathogenic fungi.
Phytopathology 68:1577-1584.
Bandy, B.P., Leach, S.S., and Tavantzis, S.M. (1988). Anastomosis group 3 is the major
cause of Rhizoctonia disease of potato in Maine. Plant Dis. 72:596-598.
Barel, G., and Ginzberg, I. (2008). Potato skin proteome is enriched with plant defense
components. J. Exp. Bot. 59:3347–3357.
Banville, G.J. (1978). Studies on the Rhizoctonia disease of potatoes. Am. J. Potato Res.
55:56.
Banville, G.J. (1989). Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia
solani Kühn. Am. Potato J. Res. 66:821–34.
Banville, G.J., Carling, D.E., and Otrysko, B.E. (1996). Rhizoctonia disease on potato.
321-330 in:
Rhizoctonia Species: Molecular Biology, Ecology, Pathology and
Disease Control. S.B. Sneh, S. Jabaji-Hare, and G. Dijst eds. Kluwer Academic
Publishers. Dordrecht, The Netherlands.
Belanger, G., Walsh, J.R., Richards, J.E., Milburn, P.H., and Ziadi, N. (2002). Nitrogen
fertilization and irrigation affects tuber characteristics of two potato cultivars Am. J.
Potato Res. 79:269-279
Bernards, M.A. (2002). Demystifying suberin. Can. J. Bot. 80:227–240.
51
Borchert, R. (1978). Time course and spatial distribution of phenylalanine ammonialyase and peroxidase activity in wounded potato tuber tissue. Plant Physiol. 62:
789–793.
Borchert. R., and Decedue, C.J. (1978). Simultaneous separation of acidic and basic
isoperoxidases in wounded potato tissue by acrylamide gel electrophoresis. Plant
Physiol. 62:794–797.
Boysen, M., Borja, M., Moral, C.D., Salazar, O., and Rubio, V. (1996). Identification at
strain level of Rhizoctonia solani AG-4 isolates by direct sequence of asymmetric
PCR products of the ITS regions. Curr. Genet. 29:174-181.
Botha, A., Denman, S., Lamprecht, S. C., Mazzola, M., and Crous, P. W. (2003).
Characterization and pathogenicity of Rhizoctonia isolates associated with black
root rot of strawberries in the Western Cape Province, South Africa. Aus. J. Plant
Pathol. 32:195–201.
Braue, C.A., Wample, R.L., Kolattukudy, R.E. and Dean, B.B. (1983). Relationship of
Potato Tuber Periderm Resistance to Plant Water Status. Am. Potato J. Res. 60:827837.
Bruns, T.D., White, T.J., and Taylor, J.W. (1991). Fungi molecular systematics. Annu.
Rev. Ecol. Syst. 22:525–564.
Burton, W.G. (1974). The oxygen uptake, in air and in 5% 02, and the carbon dioxide
output of stored potato tubers. Am. J. Potato Res. 17:113-137.
Campanella, J.J., Bitincka, L., and Smalley, J. (2003). MatGAT: an application that
generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. BMC
Bioinformatics 4:29.
Carling, D.E., and Leiner, R.H. (1990). Virulence of isolates of Rhizoctonia solani AG-3
collected from potato plant organs and soil. Plant Dis. 74:901-903.
Carling, D.E. (1996). Grouping in Rhizoctonia solani by the anastomosis reaction. 37–47
in: Rhizoctonia Species: Molecular Biology, Ecology, Pathology and Disease
Control. S.B. Sneh, S. Jabaji-Hare, and G. Dijst eds. Kluwer Academic Publishers.
Dordrecht, The Netherlands.
Carling, D.E., Kuninaga, S., and Brainard, K.A. (2002b). Hyphal anastomosis reactions,
and rDNA-ITS sequences and virulence levels among subsets of Rhizoctonia solani
anastomosis group-2 (AG2) and AG BI. Phytopathology 92:43–50.
52
Carling, D.E., Leiner, R.H., and Westphale, P.C. (1989). Symptoms, signs and yield
reduction associated with Rhizoctonia disease of potato induced by tuber-borne
inoculum of Rhizoctonia solani AG-3. Am. Potato J. 66:693-701.
Cassagne, C., Lessire, R., Bessoule, J.J., Moreau, P., Creach, A., Schneider, F., and
Sturbois, B. (1994). Biosynthesis of very long chain fatty acids in higher plants.
Prog. Lip. Res. 33:55–69.
Conde, E., Cadahia, E., Garcia-Vallejo, M.C., and González-Adrados, J.R. (1998).
Chemical characterization of reproduction cork from Spanish Quercus suber L. J.
Wood Chem. Tech. 18:447–469.
Cottle, W., and Kolattukudy, P.E. (1982). Biosynthesis, deposition, and partial
characterization of potato suberin phenolics. Plant Physiol. 69:393–399.
Date, H., Yagi, S., Okamoto, Y., and Oniki, M. (1984). Leaf blight of tomato caused by
Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk. Kinki Chugoku. Agric. Res. 76:12-16.
Deborah, S. D., Palaniswami, A., Vidhyasekaran, P., and Velazhahan, R. (2001). Timecourse study of the induction of defense enzymes, phenolics and lignin in rice in
response to infection by pathogen and non-pathogen. J. Plant Dis. Prot. 108:204216.
Du, Z.Y., Chen, J.S., Hiruki, C. (2006). Optimization and application of a multiplex RTPCR system for simultaneous detection of five potato viruses using 18S rRNA as an
internal control. Plant Dis. 90:185−189.
Ewing, E.E., and Struik, P.C. (1992). Tuber formation in potato: induction, initiation and
growth. Hortic. Rev. 14:89-197.
Es, A.V., and Hartmans, K.J. (1987). Water balance of potato tuber. 141-147 in: Storage
of Potatoes: Post-Harvest Behavior, Store Design, Storage Practice, Handling. A.
Rastovski, and A.V. Es Eds. Wageningen, The Netherlands.
Esau, K. (1965). Plant Anatomy, 2nd ed. New York: John Wiley & Sons.
Espelie, K.E., and Kolattukudy, P.E. (1985). Purification and characterization of an
abscisic acid-inducible anionic peroxidase associated with suberization in potato
(Solanum tuberosum). Arch. Biochem. Biophys. 240:539–545.
Espelie, K.E., Franceschi, V.R., and Kolattukudy, P.E. (1986). Immunocytochemical
localization and time course of appearance of an anionic peroxidase associated with
suberization in wound-healing potato tuber tissue. Plant Physiol 81:487–492.
53
Franke, R., Briesen, I., Wojciechowski, T., Faust, A., Yephremov, A., Nawrath, C., and
Schreiber, L. (2005). Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues: a typical
suberin and a particular cutin. Phytochemistry 66:2643–2658.
Franke, R., and Schreiber, L. (2007). Suberin—a biopolyester forming apoplastic plant
interfaces. Curr. Opin. Plant Biol. 10:252–259.
Freeman, S., Pham, M., and Rodriguez, R.J. (1993). Molecular genotyping of
Colletotrichum species based on arbitrarily primed PCR, A+T-rich DNA, and
nuclear DNA analyses. Exp. Mycol. 17:309-322.
Gerlach, D. (1984). Botanische Mikrotechnik. Thieme, Stuttgart
Gonzalez, D., Carling, D.E., Kuninaga, S., Vilgalys, R., and Cubeta, M.A. (2001).
Ribosomal DNA systematics of Ceratobasidium and Thanatephorus with
Rhizoctonia anamorph. Mycologia 93:1138–1150.
Graça, J., and Pereira, H. (2000a). Methanolysis of bark suberins: analysis of glycerol
and acid monomers. Phytochem. Anal. 11:45–51.
Graça, J., and Pereira, H. (2000b). Diglycerol alkendioates in suberin: building units of a
poly(acylglycerol) polyester. Biomacromolecules 1:519–522.
Graca, J., and Pereira, H. (2000c). Suberin structure in potato periderm: glycerol, longchain monomers, and glyceryl and feruloyl dimers. J. Agric. Food. Chem. 48:5476–
5483.
Graça, J., and Pereira, H. (1997). Cork suberin: a glyceryl based polyester.
Holzforschung 51:225–234.
Gregory, L.E. (1965). Physiology of tuberization in plants. Encyc. Plant Physiol.
15:1328-1354.
Haderlie, L.C., Leino, P.W., Halderson, J.L., and Corsini, D.L. (1984). Chemical
desiccation of potato vines. Proc. West Soc. Weed. Sci. 37:159-165.
Hammerschmidt, R. (1985). Determination of natural and wound-induced potato tuber
suberin phenolics by thioglycolic acid derivatization and cupric oxide oxidation.
Potato Res. 28:23-27.
Harlan, J. R. (1975). Crops and man. Am. Soc. Agro. Cro. Sci. 4:63-80.
Hawkes, J.G. (1978). Biosystematics of the potato. 15-69 in: The Potato Crop. P.M.
Harris, eds. Chapman and Hall, London.
Hawksworth, D.L., Kirk, P.M., Sutton, B.C., and Pegler, D.N. (1995). 395 in: Ainsworth
& Bisby's Dictionary of the Fungi, 8th ed. Wallingford, Oxon, UK: CAB
International.
54
Hide, G.A. and Firmager, J.P., (1990). Effects of an isolate of Rhizoctonia solani Kiahn
AG8 from diseased barley on the growth and infection of potatoes (Solanum
tuberosum L.). Potato Res. 33:229-234.
Hofer, R., Briesen, I., Beck, M., Pinot, F., Schreiber, L., and Franke, R. (2008). The
Arabidopsis cytochrome P450 CYP86A1 encodes a fatty acid v-hydroxylase
involved in suberin monomer biosynthesis. J. Exp. Bot. 59:2347–2360.
Holloway, P.J. (1983). Some variations in the composition of suberin from the cork
layers of higher plants. Phytochemistry 22:495–502.
Honeycutt, C.W., Clapham, W.M., and Leach, S.S. (1996). Crop rotation and N
fertilization effects on growth, yield, and disease incidence in potato. Am. J. Potato
Res. 73:45-62.
Jeger, M.J., Hide, G.A., Van Den Boogert, P.H.J.F., Termorshuizen, A.J., and Van
Baarlen, P. (1996). Soil-borne fungal pathogens of potato. Potato Res. 39:437-469.
Jager, G. and Velvis, H. (1989). Dynamics of damage from Rhizoctonia solani in potato
fields. 237-246 in: J. Vos, C.D. Van Loon and G.J. Bollen, eds. Effects of Crop
Rotation on Potato Production in the Temperate Zones. Kluwer, Academic
Publishers Dordrecht, The Netherland.
Joube`s. J., Raffaele, S., Bourdenx, B., Garcia, C., Laroche-Traineau, J., Moreau, P.,
Domergue, F., and Lessire, R. (2008). The VLCFA elongase gene family in
Arabidopsis thaliana: phylogenetic analysis, 3D modeling and expression profiling.
Plant Mol. Biol. 67:547–566.
Knowles, N.R., Iritani, W.M., Weller, L.D., and Gross, D.C. (1982). Suscetibility of
potatoes to bacterial rot and weight loss as a function of wound-healing interval and
temperature. Am. Potato J. Res. 59:515–522.
Kodama, T., Horimoto, K., and Ogoshi, A. (1982). On the brown spot of eggplants
caused by Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk (Rhizoctonia solani) AG-3. Ann.
Phytopathol. Soc. J. 48:356-357.
Kolattukudy, P.E. (1980). Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin. Science
208:990–1000.
Kolattukudy, P.E. (1984). Biochemistry and function of cutin and suberin. Can. J. Bot.
62:2918–2933.
Kolattukudy, P.E. (2001). Polyesters in higher plants. Adv. Biochem. Eng.
Biotechnol.71:1–49.
55
Kuninaga, S., Natsuaki, T., Takeuchi, T., and Yokosawa, R. (1997). Sequence variation
of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia
solani. Curr. Gen. 32:237–43.
Kuninaga, S., Carling, D.E., Takeuchi, T., and Yokosawa, R. (2000a). Comparison of
rDNA-ITS sequences between potato and tobacco strains of Rhizoctonia solani
AG3. J. Gene. Plant Pathol. 66:2–11.
Kuramae, E.E., Buzeto, A.L., Ciampi, M.B., and Souza, N.L. (2003). Identification of
Rhizoctonia solani AG 1-IB in lettuce, AG 4 HG-I in tomato and melon, and AG 4
HG-III in broccoli and spinach, in Brazil. Eur. J. Plant Pathol. 109:391–395.
Lambert, D.H., Powelson, M.L., and Stevenson, W.R. (2005). Nutritional interactions
influencing diseases of potato. Am. J. Potato. Res. 82:309-319.
Lehtonen, M.J., Ahvenniemi, P., Wilson, P.S., German-Kinnari, M., Valkonen J.P.T.
(2008). Biological diversity of Rhizoctonia solani (AG-3) in a northern potatocultivation environment in Finland. Plant Pathol. 57:141-151.
Leide, J., Hildebrandt, U., Reussing, K., Riederer, M., and Vogg, G. (2007). The
developmental pattern of tomato fruit wax accumulation and its impact on cuticular
transpiration barrier properties: effects of a deficiency in a b-ketoacyl-coenzyme A
synthase (LeCER6). Plant Physiol. 144:1667–1679.
Li, Y., Beisson, F., Koo, A.J.K., Molina, I., Pollard, M., and Ohlrogge, J. (2007).
Identification of acyltransferases required for cutin biosynthesis and production of
cutin with suberin-like monomers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:18339–18344.
Lisinska, G., and Leszczynski, W. (1987). Potato Science and Technology. Elsevier
Applied Science, London , England .
Liu, Z. L., and Sinclair, J. B. (1992). Genetic diversity of Rhizoctonia solani
anastomosis group 2. Phytopathology 82:778–787.
Locascio, S.J., Bartz, J.A., and Weingartner. D.P. (1992). Calcium and potassium
fertilization of potatoes grown in North Florida: I. Effects on potato yield and tissue
Ca and K concentrations. Am. Potato J. Res. 69:95–104.
Lulai, E.C., and Orr, P.H. (1993). Determining the feasibility of measuring genotypic
differences in skin-set. Am. Potato J. Res. 70:599-609.
Lulai, E.C., and Orr, P.H. (1998). Porometric measurements indicate wound severity and
tuber maturity affect the early stages of wound-healing. Am. J. Potato Res. 72:225241.
56
Lulai, E.C., and Corsini, D.L. (1998). Differential depositions of suberin phenolic and
aliphatic domains and their roles in resistance to infection during potato tuber
(Solanum tuberosum L.) woundhealing. Physiol. Mol. Plant Pathol. 153:209-222.
Lulai, E.C., and Freenmn, T.C. (2001). The importance of phellogen cells and their
structural characteristics in susceptibility and resistance to excoriation of potato
tuber (Solarium tuberosum L.) upon periderm maturation. Anna. Bot. 88:555-561.
Lulai, E.C. (2001). The canon of potato science: 43. skin-set and woundhealing/suberization. Potato Res. 50:387-390.
Lulai, E.C. (2002) The roles of phellem (skin) tensile-related fractures and phellogen
shear-related fractures in susceptibility to tuber-skinning injury and skin-set
development. Am. J. Potato Res. 79:241-248.
Lulai, E.C., Weiland, J.J., Suttle, J.C., Sabba, R.P., Bussan, A.J. (2006). Pink eye is an
unusual periderm disorder characterized by aberrant suberization: a cytological
analysis. Am. J. Potato Res. 83:409–421
Martin, F.N. (2000). Rhizoctonia spp. recovered from strawberry roots in central coastal
California. Phytopathology 90:345–353.
McGuire, R.G., and Kelman, A. (1986). Calcium in potato tuber cell walls in relation to
tissue maceration by Erwinia carotuvora pv. atroseptica. Phytopathology 76:401406.
McGregor, A. J., and Wilson, G.C.S. (1966). The influence of manganese on the
development of potato scab. Plant Soil 25:3-16.
Meijers, C.P. (1987). Diseases and defects liable to affect potatoes during storage. 148174.in: Storage of Potatoes: Post-Harvest Behavior, Store Design, Storage Practice,
Hhandling. A. Rastovski, and A. Van Es., eds. Wageningen, The Netherlands.
Meisel, L., Fonseca, B., González, S., Baezayates, R., Cambiazo, V., Campos, R.,
Gonzalez, M., Orellana, A., Retamales, J., and Silva, H. (2005). A rapid and
efficient method for purifying high quality total RNA from peaches (Prunus
persica) for functional genomics analyses. Biol. Res. 38:83-88.
Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R.E., and Ryser, U. (1999).
Glycerol is a suberin monomer. New experimental evidence for an old hypothesis.
Plant Physiol. 119:1137–1146
Murphy, H.J. (1968). Potato vine killing. Am. Potato J. Res. 45:472-477.
57
Neto, C.P., Cordiero, N., Seca, A., Domingues, F., Gandini, A., and Robert, D. (1996).
Isolation and characterization of a lignin-like polymer of the cork of Quercus suber
L. Holzforschung 50:563–568.
Nicholas, K. B., Nicholas, H.B., and Deerfield, D.W. (1997). GeneDoc: Analysis and
visualization of genetic variation. Embnew News 4:14.
Ogoshi, A. (1996). Introduction-the Genus Rhizoctonia. 1-9 in: Rhizoctonia Species:
Molecular Biology, Ecology, Pathology and Disease Control. S.B. Sneh, S. JabajiHare, and G. Dijst, eds. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands.
Olsen, N.L., Hiller, L.K., and Mikitzel, L.J. (1996). The dependence of internal brown
spot development upon calcium fertility in potato tubers. Potato Res. 39:165-178.
Page, R.D.M. (1996). TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on
personal computers. Comp. Appl. Biosci. 12:357–358.
Parmeter Jr, J.R., and Whitney, H.S. (1970). Taxonomy and nomenclature of the
imperfect state. 7–19 in: Rhizoctonia solani: Biology and Pathology. J.R. Parmeter
Jr., eds. University of California Press, Berkeley, CA.
Platt, H.W. (1989). Potato growth and tuber production as affected by inoculation of cut
and whole seed with Rhizoctonia solani (AG 3) and the use of seed treatment
fungicides. Am. Potato J. 66:365-378.
Powelson, M.L., Johnson, K.B., and Rowe, R.C. (1993). Management of diseases
caused by soil borne pathogens. 149-156 in: Potato Health Management. R.C.
Rowe, ed. The APS Press, St Paul, MN.
Rastovski, A. (1987). Ventilation system in potato store. 286-309 in: Storage of
Potatoes: Post-Harvest Behavior, Store Design, Storage Practice and Handling. A.
Rastovsld, and A. Van Es, eds. Wageningen, The Netherlands.
Reeve, R.M., Hautala, E., and Weaver, M.L. (1969). Anatomy and compositional
variation within potatoes. Am. J. Potato Res. 46:361-373.
Rich, A.E. (1968). Potato diseases. 397–437 in: Potatoes: Production, Storing,
Processing. O. Smith, ed. The Avi Publishing Company, Inc., Wesport, CT.
Roberts, E., Kutchan, T., and Kolattukudy, P.E. (1988). Cloning and sequencing of
cDNA for a highly anionic peroxidase from potato and the induction of its mRNA in
suberizing potato tubers and tomato fruits. Plant. Mol. Biol. 11:15–26.
Roberts, E., and Kolattukudy, P.E. (1989). Molecular cloning, nucleotide sequence, and
abscisic acid induction of a suberization-associated highly anionic peroxidase. Mol.
Gen. Genet. 217:223–232.
58
Rosenvasser, S., Mayak, S., and Friedman, H. (2006). Increase in reactive oxygen
species (ROS) and in senescence-associated gene transcript (SAG) levels during
dark-induced senescence of Pelargonium cuttings, and the effect of gibberellic acid.
Plant Sci. 170:873–879.
Ruzin, S.E. (1999). Plant Microtechnique and Microscopy. Oxford University Press,
New York.
Sabba, R.P., and Lulai, E.C. (2002). Histological analysis of the maturation of native and
wound periderm in potato (Solanum tuberosum L.) tuber. Ann. Bot. 90:1–10.
Scholte, K., (1989). Effects of soil-borne Rhizoctonia solani on yield and quality of ten
potato cultivars. Potato Res. 32:367-376.
Schreiber, L., Franke, R., and Hartmann, K. (2005). Wax and suberin development of
native and wound periderm of potato (Solanum tuberosum L.) and its relation to
peridermal transpiration. Planta 220:520–530.
Reis, R.L. (2005). Cork: properties, capabilities and applications. Inter. Mat. Rev.
50:345–365.
Serra, O., Soler, M., Hohn, C., Franke, R., Schreiber, L., Prat, S., Molinas, M., and
Figueras, M. (2009a). Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced
chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal
transpiration. J. Exp. Bot. 60:697-707.
Serra, O., Soler, M., Hohn, C., Sauveplane, V., Pinot, F., Franke, R., Schreiber, L., Prat,
S., Molinas, M., and Figueras, M. (2009b). CYP86A33 targeted gene silencing in
potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae and impairs the
periderm’s water barrier function. Plant Physiol. 149:1050–1060.
Sharon, M., Kuninaga, S., Hyakumachi, M., and Sneh, B. (2006). The advancing
identification and classification of Rhizoctonia spp. using molecular and
biotechnological methods compared with the classical anastomosis grouping.
Mycoscience 47:299–316.
Sharon, M., Freeman, S., Kuninaga, S., and Sneh B (2007). Genetic diversity,
anastomosis groups, and pathogenicity of Rhizoctonia spp. isolates from strawberry.
Eur. J. Plant Pathol. 117:247–265.
Shew, H.D. and Main, C.E. (1985). Rhizoctonia leaf spot flue-cured tobacco in North
Carolina. Plant Dis. 69:901-903.
Shew, H. D. and Main,C. E. (1990). Infection and development of target spot of fluecured tobacco caused by Thanatephorus cucumeris. Plant Dis. 74:1009-1013.
59
Silva, S. P., Sabino, M. A., Fernandes, E. M., Correlo, V. M., Boesel, L. F., and Reis, R.
L. (2005). Cork: properties, capabilities and applications. Int. Mat. Rev. 50:345365.
Simmons, K.E., and Kelling. K.A. (1987). Potato responses to calcium application on
several soil types. Am. Potato J. Res. 64:119-136.
Simmons, K.E., Kelling, K.A., Wolkowski R.P., and Kelman. A. (1988). Effect of
calcium source and application method on potato yield and cation composition.
Agron. J. 80:13–21.
Sneh, B., Burpee, L. L. and Ogoshi, A. (1991). Identification of Rhizoctonia Species. pp
133: American Phytopathological Society Press. St. Paul, MT.
Snowdon, A.L., (1992). Color Atlas of Post-Harvest Diseases and Disorders of Fruits
and Vegetables. pp 416: CRC Press, Boca Raton, FL.
Stevens-Johnk, J., Jones, R.K., Shew, H.D., and Carling, D.E. (1993). Characterizationof
populations of Rhizoctonia solani AG-3 from potato and tobacco. Phytopathology
83:854–858.
Suneja, K., Nagi, M.N., Cook, L., and Cinti, D.L. (1991). Decreased longchain fatty acyl
CoA elongation activity in quaking and jimpy mouse brain: deficiency in one
enzyme or multiple enzyme activities. J. Neurochem. 57:140–146.
Taiz, L., and Zeiger, E. (1998). Plant Physiology. Sinauer Associates Publishers,
Sunderland, MA.
Tawfik, A.A., Kleinhenz, M.D., and Palta, J.P. (1996). Application of calcium and
nitrogen for mitigating heat stress effects on potatoes. Am. Potato J. Res. 73:261273.
Thomson, N., Evert, R.F., and Kelman, A. (1995). Wound healing in whole potato
tubers: a cytochemical, fluorescence and ultrastructural analysis of cut and bruise
wounds. Can. J. Bot. 73: 1436–1450.
Toda, T., Hyakumachi, M., Suga, H., Kageyama, K., Tanaka, A., and Tani, T. (1999b).
Differentiation of Rhizoctonia AG-D isolates from turfgrass into subgroups I and II
based on rDNA and RAPD analysis. Eur. J. Plant. Pathol. 105:835–846.
Todd, J., Post-Beittenmiller, D., and Jaworski, J.G. (1999). KCS1 encodes a fatty acid
elongase 3-ketoacyl-CoA synthase affecting wax biosynthesis in Arabidopsis
thaliana. Plant J. 17:119–130.
60
Tzeng, K.C., Kelman, A., Simmons, K.E., and Kelling K.A. (1986). Relationship of
calcium nutrition to internal brown spot of potato tubers and sub-apical necrosis of
sprouts. Am. Potato J. Res. 63:87-97.
Tsror (Lahkim), L., Aharon, M., and Erlich, O. (1999). Survey of bacterial and fungal
seedborne diseases in imported and domestic potato seed tubers. Phytoparasitica
27:215-226.
Tsror (Lahkim), L., Nachmias, A., Erlich, O., Aharon, M., Perombelon, M., (1993). A 9year monitoring of diseases on potato seed tubers imported to Israel.
Phytoparasitica 21:321-328.
Tsror (Lahkim), L. (2010). Biology, epidemiology and management of Rhizoctonia
solani on potato. J. Phytopathol. in press.
Ulloa, M., and Hanlin, R.T. (2000). Illustrated Dictionary of Mmycology. APS Press.
MT.
Vanderplank, J.E. (1963). Plant Diseases: Epidemics and Control. Academic Press, New
York.
Van der Zaag, D.E., and Horton, D. (1983). Potato production and utilization in world
perspective with special reference to the tropics and sub-tropics. Am. Potato J. Res.
26:323-362.
Vogg, G., Fischer, S., Leide, J., Emmanuel, E., Jetter, R., Levy, A.A., and Riederer, M.
(2004). Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier
properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain
fatty acid b-ketoacyl-CoA synthase. J. Exp. Bot. 55:1401–1410.
Weinhold, A. R., and Motta, J. (1973). Initial host responses in cotton to infection by
Rhizoctonia solani. Phytopathology 63:157-162.
White, T.J., Bruns, T.D., Lee, S., and Taylor, J.W. (1990). Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. 315–322 in: PCR
Protocols: a Guide to Methods and Applications. M. Gelfand, J.I. Sninsky, and T.J.
White, eds. Academic Press, New York.
Woolfe, J. A. (1987). The Potato in the Human Diet. Cambridge University Press,
London.
Yamaguchi, M., Timm, H., and Spurr, A. (1964). Effect of soil temperature on growth
and nutrition of potato plants and tuberization, composition, and periderm structure
of tubers. Amer. Soc. Hort. Sci. 84:412-423.
61
Zhu, H., Bannenberg, G.L., Moldeus, P., and Shertzer, H.G. (1994). Oxidation pathways
for the intracellular probe 2’ 7-dichlorofluorescein. Arch. Toxicol. 68:582-587.
62
Abstract
Israeli farmers export 250,000 tons of potato tubers annually, about 40,000 tons of
which are harvested early, before skin set. In recent years, there has been an increase in the
occurrence of dark skin spots on early-harvested potato tubers (cv. Nicola) packed in large
bags containing peat to retain moisture. The irregular necrotic spots form in the packaging
during storage and overseas transport. Characterization of the conditions required for
symptom development indicated that target temperature (8°C) is reached only 25 days
postharvest and that there is a raise of the CO2 level in the first week due to high respiration
and skin recovery. The peat in the container lost nearly 30% of its water content to the
environment and creates high humidity around the tubers. Isolates from typical lesions were
identified as Rhizoctonia spp., and Koch postulates were completed by artificial inoculation
performed at 13-14°C. Phylogenetic analysis of the internal transcribed spacer sequences
(ITS1 and ITS2) of rDNA genes assigned the isolate to anastomosis group 3 of R. solani.
Different concentrations of calcium and nitrogen fertilization along with the fungi
inoculation did not induced dark spots formation. However, in all the inoculation treatments
black scurf was formed on the tubers. Inoculation of wounded tubers with R. solani
mycelium resulted in an over-suberization response and development of a thick periderm
layer. Expression of the suberin-pathway genes StKCS6 and CYP86A33 increased 6.4- and
3.4-fold, respectively, 24 h post inoculation, followed by a 1.5-fold increase in POP_A gene
expression, 48 h post inoculation. We suggest that postharvest dark spot disease is an oversuberization response to R. solani infection that occurs prior to tuber skin set.
63
Postharvest dark skin spots in potato tubers are
caused by over-suberization response to Rhizoctonia
solani
M.Sc. Thesis
Submitted to the Robert H. Smith Faculty of
Agriculture, Food and Environment, The Hebrew
University of Jerusalem
By
Yossi Buskila
May 2010
Rehovot
64