1. No category

Stivelsesmetabolisme i blade fra gåsemad Arabidopsis thaliana
analyseret ved iodid komplexering af stivelse i mutanter
Ved
Lektor Andreas Blennow
Institut for Plantebiologi og Bioteknologi, Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns
Universitet
Formål
Formålet med denne øvelse er at analysere stivelsen i bladet på gåsemad, Arabidopsis
thaliana, med klassisk iodid kompleksering. I skal med iodfarvning undersøge hvor
meget stivelse der er i blade som en effekt af specifikke mutationer i stivelsesbiosyntesen
og i stivelsesnedbrydningen samt som en effekt af dyrkning i lys (dag) og i mørke (nat).
de respektive stivelsen har. Det gøres ved at først fjerne alle pigmenter fra bladet ved
ekstraktion med varm ætanol og derefter inkubere det farveløse blad i en sur kaliumiodidopløsning, der kan angive (1) den relative mængde af stivelse, (2) i nogle tilfælde hvilken
type af stivelses-struktur, der er dominerende i bladet. I vil også inspicere stivelseskorn
fra kartoffelknolde (kartoffelmel) samt majskerner (maizena) ved lysmikroskopi.
Lidt om stivelse
Stivelse er et polysakkarid, der fortrinsvis består af lange kæder af glukose bundet
sammen af -1,4 forbindelser og nogle få -1,6 forbindelser som laver
forgreningspunkter i molekylet. Stivelsesmolekyler er blandt naturens største molekyler,
og et enkelt molekyle kan indeholde flere millioner glukoseenheder. De lange
glukosekæder kan være mere eller mindre forgrenede. Stivelsesmolekyler med få eller
1
ingen forgreninger kaldes amylose, mens forgrenede molekyler kaldes amylopektin. I
planter lagres stivelsen i stivelseskorn, hvor glukosekæderne er mere eller mindre tæt
pakket. Amylopektin kan danne dobbelthelixer, som ordner sig i koncentriske
krystallinske lag i stivelseskornene, og amylose lægger sig ind imellem de krystallinske
amylopektinlag. I de fleste plantearter indeholder stivelsen fosfat, som sidder bundet til
glukosen. Kartoffelstivelse indeholder meget fosfat, mens majsstivelse er næsten helt fri
for fosfat. Stivelse, som indeholder meget fosfat, er ikke pakket så tæt som stivelse uden
fosfat. I blade oplagres stivelse under dagen for at bruges som energi om natten for
plantens respiration. Der findes mange mutanter som påvirker stivelsesmetabolismen og
nogle af disse mutanter påvirker også plantens vækst, især når der ikke er stivelse eller
nedbrydelig stivelse tilstede under natten. For mere information om
stivelsesmetabolisme se Andreas Blennow, Inga C. Bach (2009) samt Zeeman et al.,
(2007).
Arabidopsis thaliana (gåsemad) mutanter i stivelses-syntese og nedbrydning: Hvordan
laver man mutanter af planter?
I skal arbejde med tre forskellige plante linier af Arabidopsis thaliana, Columbia
vildtype (Col-0) og mutanterne pgm1 der er muteret i stivelses-syntesen og gwd1 der er
muteret i stivelses-nedbrydningen. pgm1forefindes i databasen TAIR her:
http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=115296&type=polyallele
gwd1 mutanten heder også sex1 (for Starch EXces) og forefindes i databasen TAIR her:
http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?id=115376&type=polyallele
Se den skematiske metabolisme over stivelsessyntesen og stivelsesnedbrydningen neden
for. Arabidopsisplanterne vil altså være enten vildtype eller mutanter og I får her at vide
hvilket enzym, der er nedreguleret i den pågældende plante. Mutanterne er skabt ved
kemisk mutagenese ved at bruge etyl metan sulfonat, EMS (Figur 1,2). Etylgruppen i
EMS reagerer med basen guanine i DNA og generer en anormal base O-6-etylguanin
som parer sig med tymin i stedet for cytosin hvilket resulterer i A:T i stedet for G:C
base par. De specifikke Arabidopsis mutanter vi vil bruge er fundet ved screening efter
vækst og stivelsesoplagringsfænotype efter mutationer i et specifikt gen. I skal
undersøge om de stivelsesmængder I finder i bladene dyrket i lys og i mørke analyseret
2
ved jodkompleksering, stemmer overens med de oplysninger I har fået om de gener, de
respektive mutanter er muteret i. Der er også andre muligheder for at lave mutagenese
ved f eks røntgen bestrålning. Denne teknik generere dog meget mere alvorlige
ændringer i DNAet end EMS.
Figur 1. Mutagenen Etyl Metan Sulfonat, EMS
Figur 2. Skematisk EMS behandling af Arabidopsis frø og selektering af mutanter.
Fra: Damian R. Page & Ueli Grossniklaus (2001) The art and design of genetic
screens: Arabidopsis thaliana, Nature Reviews Genetics 3, 124-136
Brug af jod kompleksering vad analyse af stivelse direkte i blade.
Lidt historie: Allerede i 1814 opdagede de to forskere, Colin og Gaultier de Claubry, at
jod kan binde sig til stivelse og skifte farve. Disse forskere noterede: ”The color is
magnificent blue if the two substances are in the right proportion”. “The two
substances” var selvfølgelig stivelse og jod. Colin var ikke specielt interesseret i
stivelse, men derimod i jod og forebyggelse af struma - en meget udbredt sygdom, som
skyldtes jodmangel. Det er nu almindeligt at tilsætte jod til køkkensalt. Farvereaktionen,
3
som skyldes kompleksbinding (Figur3), opstår selv ved meget lav koncentration af jod,
og ved hjælp af stivelse kunne Colin identificere fødevarer som indeholder jod.
For rå stivelseskorn kan farveintensiteten ikke bruges til at estimere mængden
/ koncentrationen af stivelse i materialet, fordi jodmolekylerne ikke effektivt kan
komme ind til det tæt pakkede stivelseskorn. Men stivelseskorn bliver alligevel farvet af
jod. Ved at gelatinisere stivelsen bliver stivelseskæderne meget mere tilgængelige, og
kan binde store mængder jod. Den farve man får er afhængig stivelsens kædelængde og
man får de følgende farver:
Substrat
Farve
Amylose
Mørkt blåt
Amylopektin
Rød/orange
Hydrolyseret stivelse
Glykogen (korte forgreninger)
Ingen farve
Brunt
Korte kæder
orange/gulligt, jo længere kæder jo
mere orange mod det røde.
Figur 3. Trijodid kompleks med amylose.
4
Øvelsen.
1. Hver gruppe får udleveret planter af gåsemad (Arabidopsis thaliana):
Plantelinier:
1. Vildtype (økotype Columbia)
2. gwd1 (EMS mutant, Columbia)
3. pgm1 (EMS mutant, Columbia)
Planterne er lavet ved at så frø ud på jord i potter og de kan høstes efter cirka 5-6 uger.
Så ikke alt for tæt. Efter en uge kan man sagtens flytte planter til ny jord hvis de
vokser for tæt. Halvdelen af planterne dækkes med metalfolie et døgn før øvelsen
starter. Disse planter har derfor oplevet en lang nat. Den anden halvdel af planterne
skal have stået lyst i hvert fald et antal timer før høst.
2. Tag et godt kig på plantelinierne sammen til brug for senere at kunne beskrive deres
morfologi (størrelse, udseende osv.) og sætte det i relation til data. Vi tager fotos af
planternes opstilling.
Lugol stamopløsning:
2,6 % I2
26% KI
Brugsopløsning (laves frisk) Fortynde stam x 100 med 100 mM HCl
Fjernelse af pigmenter (deriblandt klorofyl) fra bladvæv
1. Put ca. 10 ml 80% EtOH i 15 ml plastikrør med ”løst” låg (ikke skruelåg). Brug to rør
pr. plantelinie, ét til dem der har stået i lys og ét til dem der har stået i mørke. Husk at
mærke dem.
2. To til tre blade klippes af hver plante og puttes forsigtigt ned i røret med EtOH.
5
3. Pigmenterne ekstraheres 2 x 15 min. ved 80° C i varmeblok. Efter 15 min., hælder i den
gamle EtOH ud og hælder ny varm EtOH på. Brug handsker og evt. grydelapper. Tiden
man ekstraherer, er ikke helt afgørende, men sørg for at få al pigment ud af bladene.
Jodfarvning
Når al pigment er ekstraheret, overføres bladene til en firkantet petriskål. Tilsæt
forsigtigt Lugol stamopløsning til bladene med en engangs-pipette. Vær ikke for
nærige med opløsningen, der skal være iod nok til en god indfarvning af alle
bladene. Væsken fjernes igen efter farvning i ca. 5 minutter. Derefter kan man tage
billeder. Notér orienteringen af bladene mht. plantelinie og lys/mørke.
Vurder farven for iod-bindingen og se om I kan sætte det i relation til forskellige
mængder og kvaliteter af stivelse.
Nogle spørgsmål:
Hvorfor analyserer vi planter, der har stået i lys og planter der har stået 24 timer i mørke?
Hvordan kan det være at stivelsen ikke bliver ekstraheret ud af bladet, når vi ekstraherer
pigmenter?
Hvorfor er de muterede planter meget lille?
Mikroskopi af stivelseskorn
Rå stivelseskorn kan observeres i et almindeligt lysmikroskop ved 10-100 gange
forstørrelse.
• Rå stivelse fra majs (Maizena) eller kartoffel opslemmes i lidt vand. En lille dråbe
lægges på et objektglas og monteres med dækglas.
• I mikroskop ses efter vækstringe på stivelseskornene, og stivelseskornes størrelse og
form observeres. Stivelseskorn fra kartoffel
er som regel betydeligt større (op til 100 μm) end stivelseskorn fra majs og øvrige
kornarter, som er kun halvt så store.
• Tilsæt en lille dråbe Lugols jodopløsning (se øvelse 1). Observer farveændring.
6
Farvning af stivelseholdige frugter og grønsager
Vi bruger den klassiske jodkompleksering som stivelsesindikator, hvor jodmolekylerne
bindes i stivelsesmolekylernes helixer (se tegning). Stivelsen skal være tilgængelig for
jodmolekylerne, for at få en effektiv farvning. Tæt pakket resistent stivelse
kompleksbinder ikke effektivt til jod, og ofte er det kun overfladen af de rå
stivelseskorn, der farves. Med jodfarvning af stivelsesholdigt plantemateriale kan
fordelingen af stivelse i vævet vurderes. Plantemateriale, f.eks. frugter og frø, på
forskellige udviklingstrin kan sammenlignes, men man kan ikke bestemme
koncentrationen af stivelse ud fra farveintensitet i frisk plantemateriale.
• Fremstilling af Lugols stamopløsning: 5 g krystallinsk jod (I2) og 10 g kaliumjodid
(KI) opløses i 85 ml destilleret vand. Den brune opløsning har en koncentration på 130
mg jod/ml. I2 og I- vil reagere med hinanden og danne I3-. Denne ion danner et farvede
kompleks med stivelse. Opløsningen opbevares ved rumtemperatur i mørke. Før brug
fortyndes stamopløsningen 1:100 med 100 mM HCl.
• Test fordeling af stivelse i f.eks. modne og umodne æbler, pærer, og bananer.
Frugterne skæres over og snitfladen dyppes i Lugols opløsning. Hvordan kan forskel i
farveintensitet i grønne og modne bananer forklares?
• Test fordeling af stivelse i f.eks. pastinak, jordskok og kartoffel. Hvorfor ses ingen
eller kun lidt farve i jordskokker i forhold til kartoffel og pastinak?
7
Figur 4. Stivelsessyntesen (Fra Zeeman et al., 2007). Fosfoglukomutase, PGM er et
vigtigt trin i stivelsesbiosyntesen
Figur 5. Stivelsesnedbrydningen (Fra Zeeman et al., 2007). Glukan vand dikinase,
GWD, fosforylerer stivelsen sådan at amylaser hydrolysere forbindelsene i
stivelsen.
Literatur:
Zeeman SC, Smith SM, Smith AM. (2007) The diurnal metabolism of leaf starch.
Biochemical Journal 401, 13–28.
Andreas Blennow, Inga C. Bach (2009) Sund stivelse, vegetabilsk vingummi og spiselig
plastic Publiceret 2009 på www.Planteforskning.dk / Baggrund/Aktuel forskning.
8
Yderligere eksperimenter
Rå eller gelatiniseret stivelse
Ved jodfarvning af plantemateriale med rå stivelseskorn kan farveintensiteten ikke
bruges til at estimere mængden/koncentrationen af stivelse i materialet, fordi
jodmolekylerne kan ikke effektivt komme ind til det tæt pakkede stivelseskorn. Ved at
gelatinisere stivelsen bliver stivelseskæderne mere tilgængelige, og kan binde store
mængder jod.
To 0,2 gram store portioner kartoffelmel afvejes og opslemmes i 100 ml vand. Den ene
opslemning koges i vandbad under omrøring i 2 min og nedkøles. Til begge rørene
tilsættes 1 ml Lugols opløsning og farveintensitet sammenlignes.
9