file - Helda
Kromosomin 14q12-q23 tarkempi analysointi suomalaisessa migreeni-epilepsiasuvussa Anna Järvinen LK HYKS neurologian klinikka Folkhälsanin tutkimuskeskus Helsinki 14.1.2015 Tutkielma anna.h.jarvinen@helsinki.fi Ohjaajat: dosentti Mikko Kallela, dosentti Maija Wessman HELSINGIN YLIOPISTO Lääketieteellinen tiedekunta i HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – Faculty Lääketieteellinen tiedekunta Laitos Institution – Department Kliininen laitos TekijäFörfattare – Author Anna Järvinen Työn nimi Arbetets titel – Title Kromosomin 14q12-q23 tarkempi analysointi suomalaisessa migreeni-epilepsiasuvussa Oppiaine Läroämne – Subject Lääketiede Työn laji Arbetets art – Level Tutkielma Aika Datum – Month and year 14.1.2015 Sivumäärä-Sidoantal - Number of pages 46+9 Tiivistelmä Referat – Abstract Tutkimuksen tavoitteena oli löytää migreenille ja epilepsialle altistavia geneettisiä variantteja eksomisekvensoinnin avulla kromosomista 14q12-q23. Aineistona toimi kumpaakin sairautta ilmentävä suuri suomalainen suku. Migreenidiagnoosit asetettiin kyselylomakkeen pohjalta, johon vastasi 111 henkilöä. Lomakkeen avulla karakterisoitiin tarkemmin suvun fenotyyppi migreenin suhteen. Aineistosta 61,3 % kärsi migreenistä ja 13,5 % epilepsiasta. Epilepsia assosioitui selkeästi aurattomaan migreeniin: epileptikoista 73,3 % sairasti auratonta migreeniä ja aurallista vain 20 %. Samanaikainen epilepsia lisäsi migreenioireiden vakavuutta. Epilepsiasta kärsivien migreeni alkoi keskimäärin nuorempana, oli oirekuvaltaan vaikeampaa ja kohtausten lukumäärä oli suurempi kuin vertailuryhmällä, joka kärsi pelkästä migreenistä. Eksomisekvensointia varten valittiin 8 henkilöä, joilta etsittiin harvinaisia variantteja, jotka segregoivat sairauden mukana ja aiheuttavat toiminnallisesti kiinnostavan muutoksen. 13 varianttia pääsi lopulliseen tarkasteluun. Näistä kaksi sijaitsi SYNE2-geenissä, joka osallistuu neurogeneesin säätelyyn. Jompikumpi varianteista esiintyi viidellä eksomisekvensoidulla henkilöllä, kaikilla heterotsygoottisina. Ne eivät kuitenkaan esiintyneet aineistossa siten, että niitä voitaisiin pitää migreenille ja epilepsialle altistavina variantteina. Lisäksi määritettiin kandidaattigeeneiksi SYNE2 ja NPAS3, joista seulottiin ei-eksonisia variantteja ilman vakuuttavia löydöksiä. (155 sanaa) Avainsanat – Nyckelord – Keywords Migraine, epilepsy Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited Helsingin yliopiston digitaalinen arkisto Helda Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information ii 1 Johdanto ..................................................................................................................................... 1 2 Kirjallisuuskatsaus ..................................................................................................................... 2 2.1 Migreenin luokittelu ja diagnostiset kriteerit ...................................................................... 2 2.2 Migreenin patofysiologia .................................................................................................... 3 2.3 Migreenin genetiikka........................................................................................................... 6 2.4 Epilepsian luokittelu ja diagnostiset kriteerit ...................................................................... 8 2.5 Epilepsian patofysiologia .................................................................................................... 9 2.6 Epilepsian genetiikka ........................................................................................................ 11 2.7 Kromosomi 14 ................................................................................................................... 12 3 Aineisto .................................................................................................................................... 14 4 Menetelmät ............................................................................................................................... 15 4.1 Kliininen tarkastelu ........................................................................................................... 15 4.2 Sukupuun piirtäminen ....................................................................................................... 16 4.3 Eksomisekvensointi........................................................................................................... 16 4.4 Kandidaattigeenien määrittäminen ja analysointi ............................................................. 18 5 Tulokset .................................................................................................................................... 20 5.1 Migreenin ja epilepsian kliiniset piirteet suvussa.............................................................. 20 5.2 Varianttien seulonta eksomisekvensoinnissa .................................................................... 24 5.3 Kandidaattigeenit SYNE2 ja NPAS3 .................................................................................. 27 6 Pohdinta.................................................................................................................................... 30 6.1 Migreenin ja epilepsian yhteys suvun kliinisessä tarkastelussa ........................................ 30 6.2 Eksomisekvensoinnissa löytyneiden varianttien merkitys ................................................ 33 6.3 Kandidaattigeeneistä löytyneiden varianttien merkitys..................................................... 36 6.4 Tutkimuksen haasteet ja jatkosuunnitelmat ...................................................................... 36 6.5 Yhteenveto ........................................................................................................................ 38 Lähteet ......................................................................................................................................... 39 Liitteet ......................................................................................................................................... 47 Liite 1 Sukupuu ....................................................................................................................... 47 1 1 Johdanto Migreeni ja epilepsia ovat kroonisia, kohtauksittain esiintyviä neurologisia sairauksia, jotka aiheuttavat huomattavaa inhimillistä kärsimystä sairastuneille ja suuren taloudellisen haasteen terveydenhuollolle. Migreenin esiintyvyydeksi normaaliväestössä Euroopassa on arvioitu naisilla 15 % ja miehillä 6 % (1,2). Epilepsialle vastaava luku kummallekin sukupuolelle on 0,3-0,8 % (3). Migreeniä sairastavilla epilepsian esiintyvyys on kuitenkin verrokkeja huomattavasti korkeampi 1-17 % (2) ja epileptikoilla migreenin todennäköisyys on kasvanut 2,4-kertaiseksi (4). Sairauksilla on siis selkeää komorbiditeettia, joka on tunnistettu jo yli 100 vuotta sitten (5). Kliinisesti migreenillä ja epilepsialla on ilmeisiä yhtäläisyyksiä sensoristen, motoristen ja kognitiivisten kohtausoireiden osalta, vaikka kyseessä onkin nykykäsityksen mukaan kaksi eri sairauskokonaisuutta (6,7). Kummatkin voivat esiintyä monenlaisina erilaisina alatyyppeinä, joista osan on osoitettu jakavan samanlaisia patofysiologisia mekanismeja (8). Myös periytyvyydeltään molemmat sairaudet ovat ainakin osittain kytköksissä toisiinsa. Tästä ensimmäisenä vakuuttavana löydöksenä oli migreenin erään harvinaisen, dominantisti periytyvän alatyypin, familiaalisen hemiplegisen migreenin (FHM), kolmen tunnetun ionikanaviin liittyvien geenivirheiden yhdistyminen epilepsiaan (9,10). Yhteinen geneettinen tausta voisi selittää sairauksien ainakin osittain jaettua patofysiologiaa, yhteisiä kliinisiä piirteitä sekä yhteisesiintyvyyttä. Migreeni ja epilepsia ovat kuitenkin monitekijäisiä ja komplekseja sairauksia, joiden periytyvyydessä on vielä paljon selvitettävää (11,12). Tutkielman seuraavassa luvussa käsitellään tarkemmin aiheeseen liittyvää kirjallisuutta. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli karakterisoida tarkemmin suvun fenotyyppi migreenin suhteen. Toisena tavoitteena oli löytää migreenille ja epilepsialle altistavia geneettisiä variantteja eksomisekvensoinnin avulla. Koko genomin kattava kytkentäanalyysi eräästä laajasta suomalaisesta suvusta on jo aiemmin paljastanut kaksi epilepsialle ja migreenille altistavaa geenilokusta kromosomeista 12 ja 14 (13). Tässä tutkimuksessa analysoitiin tarkemmin alueen 14q12-q23 eksonit. 2 2 Kirjallisuuskatsaus 2.1 Migreenin luokittelu ja diagnostiset kriteerit Migreeni on neurovaskulaarinen sairaus, jonka keskeisin oire on kohtauksellinen päänsärky. Migreenin diagnoosi tehdään kliinisesti ja se perustuu IHS:n (International Headache Societyn) vuonna 1988 asettamiin kriteereihin, joita on sittemmin päivitetty (6). Migreeni jakautuu karkeasti kahteen ryhmään, auralliseen ja aurattomaan muotoon, jotka diagnosoidaan seuraavien taulukoiden osoittamalla tavalla. Huomattavaa on, että sama yksilö voi kokea monenlaisia erilaisia kohtauksia kummastakin kategoriasta siten, että välillä nämä kohtaukset täyttävät tietyt IHS:n kriteerit ja välillä eivät. Migreeni voidaan lisäksi jakaa yli kymmeneen tarkempaan alatyyppiin, joilla on omat diagnostiset kriteerinsä (6). Aurallisen migreenin diagnostiset kriteerit A. Vähintään 2 kohtausta, jotka täyttävät kriteerit B-C B. Kohtaukseen liittyy yksi tai useampi täysin palautuva auraoire (visuaalinen, sensorinen, puheentuoton, kielellinen, motorinen, aivoytimen tai retinaalinen) C. Vähintään kaksi seuraavista neljästä piirteestä 1. Ainakin yksi auraoire leviää asteittain yli ≥ 5 min aikana ja/tai kaksi auraoiretta ilmenee peräkkäin 2. Jokainen auraoire kestää 5-60 min 3. Ainakin yksi auraoire on yksipuolinen 4. Auraa seuraa päänsärky 60 min kuluessa D. Oireet eivät liity toiseen ICHD-3-diagnoosiin ja TIA-kohtaus on poissuljettu Taulukko1. Aurallisen migreenin diagnostiset kriteerit vuoden 2013 ICHD-3:n (International Classification of Headache Disorder) kriteeristön mukaan (6). Aurattoman migreenin diagnostiset kriteerit A. Vähintään 5 kohtausta, jotka täyttävät kriteerit B-D B. Päänsärkykohtaus kestää 4-72 h (hoitamatta tai hoidon epäonnistuessa) C. Päänsäryllä on vähintään kaksi seuraavista neljästä piirteestä 1. Särky on toispuolista 2. Särky on sykkivää 3. Särky on kohtalaista tai kovaa 4. Fyysinen aktiivisuus pahentaa kipua tai särky johtaa fyysisen aktiivisuuden välttelyyn D. Kohtaukseen liittyy vähintään toinen seuraavista oireista 1. Pahoinvointi ja/tai oksentelu 2. Valonarkuus ja ääniherkkyys E. Oireet eivät liity toiseen ICHD-3-diagnoosiin Taulukko2. Aurattoman migreenin diagnostiset kriteerit vuoden 2013 ICHD-3:n (International Classification of Headache Disorder) kriteeristön mukaan (6). 3 Auraoireella tarkoitetaan etenevää ja ohimenevää, kohtaukseen liittyvää neurologista oiretta. Erään tutkimuksen mukaan aurallista migreeniä sairastavista 99%:lla on visuaalisia, 31 %:lla sensorisia, 18 %:lla afaattisia ja 6%:lla motorisia auraoireita (14). Kuva1. Tyypillinen visuaalinen migreeniaura sisältää sahalaitamaisen, värisevän näköhäiriön, joka etenee toispuoleiseksi näkökenttäpuutokseksi (14). Marjo Hiekkalan ottama ja muokkaama kuva, julkaistu hänen luvallaan. 2.2 Migreenin patofysiologia Migreenikohtaus on patofysiologialtaan monimutkainen tapahtumasarja, jossa erilaiset vaiheet seuraavat toisiaan ja tapahtuvat osittain myös samanaikaisesti. Kohtaukseen kuuluu muutakin kuin auraoire ja päänsärky. On selvää, ettei 1940-luvulla esitetty teoria aivoverisuonten supistumisesta (”aura”) ja laajenemisesta (”päänsärky”) migreenin aiheuttajana riitä patofysiologian selittäjäksi (15). Migreeni on luonteeltaan koko aivoihin vaikuttava säätelyhäiriö (16), jonka perimmäistä laukaisijaa ei ole saatu selville (17). Nykyään migreeniin tiedetään liittyvän progressiivisia muutoksia aivojen kuvantamistutkimuksissa, vaikka taudin luonne kliinisesti onkin kohtausmainen (18). Seuraavassa kaaviossa on esitetty tyypillisen migreenikohtauksen kulku pohjautuen kattavaan viimeaikaiseen kirjallisuuskatsaukseen (19). Kaavio1. Tyypillisen migreenikohtauksen kulku. 4 Ennakko-oireet Ennakko-oireisiin kuuluu muun muassa väsyneisyys, ärtyneisyys, muutokset ruokahalussa ja haukottelu, jotka saattavat ilmetä jo 12 tuntia ennen varsinaisen kohtauksen alkua (20). Hypotalamuksen aktivaatiolla on jonkinasteinen rooli oireiden synnyssä, mutta tämän roolin suuruus on vielä selvittämättä (21). Aivojen PETkuvauksella on voitu osoittaa, että hypotalamus aktivoituu spontaanin migreenikohtauksen alkaessa (22). Toinen teoria ennakko-oireiden synnylle on dopaminergisen systeemin aktivoituminen (23) ja migreeniä sairastavien lisääntynyt herkkyys sen vaikutuksille (19). FHM:n yhteys mutaatioihin ionikanavissa (24-27) on myös tuonut uuden näkökulman migreenin patofysiologiaan. Ionikanavien toimintahäiriö aiheuttaa aivokuoren eksitaatio-inhibitiosuhteen häiriön (alentunut ärsyyntyvyyskynnys), joka voi olla kohtauksien alun taustalla myös tavallisimmissa migreenityypeissä kuin FHM:ssä (17). Todennäköisesti useat rinnakkaiset reitit vaikuttavat samanaikaisesti ja johtavat yhdessä migreenikohtauksen alkamiseen (19). Aura Auran patofysiologisena mekanismina pidetään jo 1940-luvulla koe-eläimiltä löydetyn CSD-ilmiön (Cortical Spreading Depression) (28) vastinetta ihmisaivoissa. CSD:ssä neuronit ja gliasolut depolarisoituvat aallossa, joka etenee aivokuorella noin 2-5 mm/min. Samalla solut vapauttavat soluvälitilaan mm. natriumia, kaliumia, NO:ta sekä arakidonihappoa ja paikallinen verenkierto lisääntyy hetkellisesti. Tätä seuraa pitkäaikainen, jopa tunteja kestävä sähköisen toiminnan vaimentuminen ja myös verenkierron vaimeneminen (12,19). Koehenkilöiltä on löydetty CSD:tä vastaavia muutoksia aivoista auraoireen aikana sekä toiminnallisen magneettikuvauksen (29) että magnetoenkefalografian (30) avulla. Lisätodisteena pidetään, että muun muassa tyypillisimmät visuaaliset auraoireet (14) selittyvät CSD:n etenemisnopeuden ja – paikan suhteen okkipitaalilohkossa. Voi olla, että aurattomassa migreenissä CSD tapahtuu kuten aurallisessakin muodossa, mutta kliinisesti hiljaisella aivoalueella (12). Vielä ei ole yksiselitteistä, johtaako CSD itsessään migreenipäänsärkyyn vai onko linkki migreenikohtauksen seuraavaan vaiheeseen jossakin muualla (31). Eläinkokeissa on osoitettu, että CSD voi aktivoida trigeminovaskulaarista systeemiä (TGVS) muun muassa neurogeenisen inflammaation kautta. Tämä tapahtuu vapauttamalla trigeminaalisista hermopäätteistä vasoaktiivisia peptidejä, jotka puolestaan aiheuttavat plasmaproteiinien 5 pääsyn veri-aivoesteen läpi dura materiin (32). Molekyylitasolla ilmiöön on yhdistetty neuronien Pannexiini1-megakanava, joka osaltaan edistää inflammaatiota päästämällä tulehduksenvälittäjäaineita soluvälitilaan (33). Päänsärky Migreenipäänsäryn aiheuttajana pidetään trigeminovaskulaarisen systeemin (TGVS) aktivaatiota ja sensitisaatiota. TGVS koostuu aivokalvoja ja aivokuoren pintaa suonittavista verisuonista ja niihin liittyvistä afferenteista trigeminushermopäätteistä (34). Erään kirjallisuuskatsauksen mukaan keskeistä päänsäryn kannalta on se, että TGVS:ssä tapahtuu sekä perifeeristä että sentraalista sensitisaatiota (35). Päänsäryn alettua noin 10 - 20 minuutin kuluessa verkoston ensimmäiset neuronit muuttuvat hypersensitiivisiksi päänsisäiselle paineelle (perifeerinen sensitisaatio). Näiden neuronien soomat sijaitsevat trigeminaalisessa gangliossa ja synapsiyhteydet aivorungon trigeminaalisessa nucleus caudaliksessa (TNC). Kivun jatkuttua 60 - 120 minuuttia verkoston seuraavissa neuroneissa tapahtuu molekulaarisia muutoksia, joiden johdosta ne siirtyvät ensimmäisistä neuroneista riippumattomaan tilaan (sentraalinen sensitisaatio). Tämä ilmiö voi aiheuttaa joidenkin migreenikkojen kokemaa kutaanista allodyniaa ja migreenikohtauksen kroonistumista (35). Klassinen teoria aivoverisuonten vasodilataatiosta kivun aiheuttajana ei saa nykyisillä kuvantamismenetelmillä yksiselitteistä tukea, vaikka useissa tutkimuksissa onkin huomattu vaihtelevia muutoksia aivovaltimoissa. Muutokset voivat olla myös reaktiivisia muutoksia, eikä itsessään kivun aiheuttaja (19). Suuri merkitys neurogeenisen inflammaation ja sensitisaation synnyssä on hermovälittäjäaineiden epätasapainolla (36) ja monia niistä onkin yhdistetty migreenin patofysiologiaan. Näistä esimerkkeinä serotoniini, glutamaatti ja dopamiini (37). Kohtauksen jälkeiset oireet Migreenikohtauksen jälkeisiä oireita ovat mm. väsymys, heikkous, mielialan vaihtelut, GI-oireet ja päänsärky. Oireet ovat osittain samoja kuin ennakko-oireet ja on esitetty, että ne saattavat olla samaa jatkumoa. Funktionaalisilla kuvantamistutkimuksilla on voitu osoittaa, että päänsäryn loputtua monien aivoalueiden aktiivisuus on vielä muuttunutta ja saattaa olla näiden oireiden taustalla (19). 6 2.3 Migreenin genetiikka Lukuisat kaksos- ja perhetutkimukset ovat osoittaneet migreenin olevan periytyvä sairaus. Eräässä laajassa 29 717 kaksosparia sisältäneessä tutkimuksessa migreenin periytyvyydeksi arvioitiin 34 -57 % (38). Tähän aineistoon sisältyi koko migreenin laaja fenotyyppi: harvinainen dominantisti periytyvä FHM, geneettiset syndroomat, joiden oirekokonaisuuteen migreeni osaltaan kuuluu (mm. CADASIL), perheittäin esiintyvä migreeni ja sporadinen migreeni. On selvää, että migreeni on monitekijäisesti periytyvä sairaus, jossa monet geneettiset alttiustekijät vaikuttavat yhdessä monien ympäristötekijöiden kanssa yksilön lopulliseen fenotyyppiin (39). Tutkimusten mukaan aurallinen migreeni on vahvemmin perinnöllistä kuin auraton muoto. Aurallista migreeniä sairastavan 1. asteen sukulaisella on nelinkertainen riski sairastua auralliseen migreeniin, kun taas auratonta migreeniä sairastavan sukulaisella vastaava riskisuhde aurattomalle migreenille on vain 1,9 (40). On järkevää erottaa nämä kaksi migreenin muotoa geneettisissä tutkimuksissa, koska ne voidaan mieltää genetiikaltaan erillisiksi häiriöiksi (41). Migreenin jakaminen pidemmälle ”endofenotyyppeihin” eli aineiston jakaminen erillisten oireiden perusteella on osoittautunut hyödylliseksi geneettisissä tutkimuksissa (trait component analysis TCA tai latent class analysis LCA) (42). Migreeni yhtenä kokonaisuutena on geneettisesti ja samalla myös kliinisesti niin heterogeeninen, että on vaikea saada merkittäviä yksittäisiä geneettisiä löydöksiä nykyisillä potilasmäärillä (37). Lisäksi migreenidiagnoosin asettaminen epätarkkuus on vaikeuttanut merkittävien tulosten saamista, sillä useimmissa tutkimuksissa diagnoosi on perustunut vain kyselykaavakkeeseen, eikä esimerkiksi tarkempaan lääkärin haastatteluun. Objektiivista biologista markkeria migreenille ei ole saatavilla (12). Migreenin periytyvyyttä voidaan tutkia usealla eri menetelmällä. Perheissä migreenin periytyvyyttä tutkitaan kytkentäanalyysilla, jolla selvitetään, periytyykö tietty geneettinen markkeri migreenifenotyypin mukana useammin kuin sattuma sallisi. Koko genomin laajuiset kytkentäanalyysit ovat paljastaneet useita tavalliselle migreenille altistavia lokuksia, joskaan näistä vielä ei ole löydetty migreenille altistavia geenejä (37). Tietyn altistavan kytkentäalueen löytymisen jälkeen pyritään aluetta rajaamaan pienemmäksi tiheämmällä markkeripatteristolla. Sen jälkeen aluetta voidaan tutkia tarkemmin valitsemalla tutkimuksen kohteeksi ehdokasgeenejä (ns. kandidaattigeenejä), 7 joissa oleva mutaatio loogisesti selittäisi migreenin patofysiologiaa. Toinen vaihtoehto on tutkia kaikki kytkentäalueella olevat geenit sekvensoimalla (eksonit). Tällöin voidaan löytää altistavia variantteja geeneistä, joita aiemmin ei ole liitetty migreeniin. FHM:ää aiheuttavat geenivirheet (24-27) ovat ainoat yksittäiset migreenigeenit, jotka ovat löytyneet perinteisen kytkentäanalyysin kautta. Nämä kolme geeniä (CACNA1A, ATP1A2, SCN1A) koodavat kukin omaa ionikanavaansa aivoissa. On esitetty, että ionikanavien muuttunut toiminta voisi johtaa lisääntyneeseen kalium- ja glutamaattipitoisuuteen synapsiraoissa ja tätä kautta suurentaa todennäköisyyttä CSDilmiölle (43). Tämä on yksi mahdollinen yhteys epilepsian ja migreenin välillä, sillä myös epilepsiassa aivokuoren lisääntyneellä eksitabiliteetilla on keskeinen merkitys kohtauksen alkaessa (44). Migreenin periytyvyyttä voidaan myös tutkia yksittäisistä migreeniyksilöistä. Tällöin pyritään genotyyppaamaan suuri joukko migreenipotilaita ja terveitä verrokkeja jonkin tietyn geneettisen markkerin suhteen tai koko genomin laajuisesti. Tilastollisesti merkittävä ero geenimerkin esiintyvyydessä näiden kahden ryhmän välillä osoittaa assosiaation migreeniin. Vasta hiljattain migreenitutkimuksessa on pystytty hyödyntämään koko genominlaajuista assosiaatiotutkimusta (genome-wide association study GWAS), jossa suurista aineistoista etsitään tilastollisesti merkittäviä yhteyksiä taudin ja yksittäisten geneettisten varianttien (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) välillä. Tällä menetelmällä oli löydetty v. 2011 mennessä yli 3800 SNP:iä liittyen yli 400 eri sairauteen, mutta monitekijäisten tautien kohdalla on tärkeää muistaa, ettei assosiaatio ole vielä tae kausaalisuudesta (45). Ensimmäinen migreeniin liittyvä GWAS vuodelta 2010 paljasti yhden tilastollisesti merkittävän SNP:in (46), jolla on yhteys aivojen glutamaattihomeostaasin säätelyyn, mikä sopisi nykyiseen tietoon migreenin patofysiologiasta. Tämän jälkeen on julkaistu vielä kolme muuta GWAS-tutkimusta, joissa on tilastollisesti merkittävät löydökset (47-49) sekä yksi meta-analyysi (50). Nämä tutkimukset ovat yhdistäneet migreenin moneen yksittäiseen geneettiseen varianttiin eri puolilla genomia, mutta varsinaisia migreeniä aiheuttavia geenivirheitä ei ole löydetty. 8 2.4 Epilepsian luokittelu ja diagnostiset kriteerit Epilepsia on neurologinen sairaus, jossa potilaalla on taipumus saada ohimeneviä, kohtauksittaisia aivotoiminnan häiriöitä. Yleisimpiä kohtausoireita ovat tajunnantason häiriöt ja kouristukset, mutta kohtaukseen voi liittyä myös migreeniauraa muistuttavia neurologisia oireita ja päänsärkyä. Lisäksi epilepsiaan saattaa liittyä kohtauksien lisäksi pidempikestoisia psyykkisiä, neurologisia tai sosiaalisia toimintakyvyn häiriöitä (51). Diagnoosin edellytyksenä on joko yksittäinen epileptinen kohtaus yhdistettynä aivokuvantamislöydökseen tai vähintään kaksi epileptista kohtausta ilman aivolöydöstä (52). Epilepsia luokitellaan kohtausten yleistyneisyyden sasteen ja etiologian mukaan ILAE:n (International League Against Epilepsy) vuonna 1989 asettamien kriteerien perusteella (7). Kliinisesti epilepsia on hyvin laaja ja monimutkainen kokonaisuus, johon kuuluu yli 50 erilaista oireyhtymää. ILAE:n luokitusta on päivitetty v. 2001 (53) vastaamaan nykytietämystä epilepsian etiologiasta ja patofysiologiasta, mutta luokitus kehittyy edelleen. Epilepsia jaetaan kahteen pääryhmään kliinisten kohtausoireiden ja EEG-löydösten perusteella. Suoraan yleistyneessä kohtauksessa hermosolujen poikkeava sähköinen toiminta alkaa samanaikaisesti molemmissa aivopuoliskoissa, kun taas paikallisalkuisessa kohtauksessa toimintahäiriö paikantuu ainakin kohtauksen alussa vain toiseen aivopuoliskoon. Epilepsian hoito ja antiepileptisen lääkkeen valinta määräytyvät kohtaustyypin perusteella (52). Epilepsian esiintyvyydellä on tyypillinen aikaikkuna: lapsilla ja vanhuksilla se on aikuisia yleisempää (54) ja kohtaustyypit eroavat aikuisten epilepsioista. Kehittyvät aivot ovat alttiimpia epileptisille kohtauksille ja monet paranevatkin lapsuusiän epilepsiasta kasvaessaan aikuisiksi. Alle 6-vuotiaista lapsista noin 3 % kärsii lisäksi ns. kuumekouristuskohtauksista (kuumeen laukaisemista kouristukohtauksista), jotka useimmiten häviävät iän myötä kokonaan. On mahdollista, että nämä kohtaukset ovat mekanismeiltaan ja genetiikaltaan samaa jatkumoa epilepsian kanssa (55). Etiologian perusteella ILAE jakaa epilepsian symptomaattiseen ja idiopaattiseen luokkaan (53). Symptomaattisella epilepsialla tarkoitetaan epilepsiaa, jonka taustalla on jokin aivoissa kuvantamalla näkyvä rakenteellinen poikkeama. Tämän epilepsialuokan on perinteisesti ajateltu johtuvan hankituista, ulkopuolisista tekijöistä, mutta nykyään tiedetään myös perintötekijöiden vaikuttavan symptomaattisen epilepsian syntyyn (55). 9 Noin neljäsosa epilepsioista luokitellaan symptomaattiksi. Mahdollisia tekijöitä niiden taustalla ovat mm. traumat, kasvaimet, infektiot, aivohalvaukset, kehityshäiriöt tai synnykseen liittyvä hapenpuute (54). Idiopaattiseen eli etiologialtaan tuntemattomaan luokkaan laskettiin aiemmin valtaosa epilepsioista. Kuvantamisen kehittyessä on osaan myöhemmin liitetty magneettikuvalöydöksiä ja lisäksi on tunnistettu pieni kokonaan uusi luokka, autoimmuuniepilepsia (56). Suurin muutos on kuitenkin lisääntynyt tietoisuus perimän vaikutuksesta epilepsian syntyyn. Nykykäsityksen mukaan perimän merkitys epilepsiassa on ratkaiseva, vaikka sen tarkkaa osuutta ei tunneta ja perimän vaikutus vaihtelee suuresti eri epilepsian tyypeissä (55). 2.5 Epilepsian patofysiologia Epilepsiakohtauksen taustalla on hermosolujen epänormaali, liiallinen tai synkronoitunut sähköinen purkaustoiminta, joka todetaan EEG-käyrällä tyypillisinä piikkeinä. Anatomisesti purkaustoiminta voi sijoittua minne tahansa aivoihin (määrittäen kohtaustyypin), mutta erityisen alttiita epileptiformiselle toiminnalle ovat aivokuori, talamus ja hippokampus (57). Epileptikon aivoissa havaitaan solutasolla neuropatologisia muutoksia, joihin kuuluvat mm. dendriittien ja aksonien muuttunut morfologia, glioosi ja dysplastiset hermosolut. Epänormaalit hermosoluverkot ovat alttiita synkronoitumaan aivojen normaalista sähköisestä rytmistä poiketen, mikä johtaa epilepsiakohtauksen syntyyn (58). Tärkeässä roolissa epilepsian patogeneesissa on hermosolujen lisääntynyt ärsyyntyvyys (hypereksitabiliteetti), joka on liitetty myös migreenin patofysiologiaan. Kuten migreenillä, myöskään epilepsialla ei ole osoitettu yhtä ainoaa molekyylitason mekanismia, joka selittäisi sairauden koko laajan fenotyypin. Mikä tahansa muutos solukalvojen permeabiliteetissa ionien suhteen voi periaatteessa johtaa hermosolujen lisääntyneeseen ärsyyntyvyyteen ja epilepsiakohtauksen syntyyn (59). Epileptikon aivoissa ionikanavien onkin voitu osoittaa olevan sekä rakenteellisesti että toiminnallisesti poikkeavia (60). Haasteena on ollut selvittää, ovatko nämä muutokset pääasiassa primaareja, hermosolujen hypereksitabiliteettia aiheuttavia vai siltä suojaavia sekundaarisia muutoksia. Viimeisimmät tutkimukset vahvistavat ionikanavien roolia epilepsian patogeneesissa. Tietyt epilepsiatyypit liitetään nykyään ns. kanavapatioiden (”chanellopathy”) ryhmään, joita yhdistää solun kalvorakenteilla sijaitsevien 10 ionikanavien häiriintynyt toiminta (61). Tämä ilmiö näyttää olevan yhdistävä tekijä niin geneettisille kuin hankituille epilepsioille, vaikka kyseessä voi olla eri ionikanavat ja erilaiset vauriomekanismit (55). Kuva2. Epilepsiat ovat nykykäsityksen mukaan ionikanavasairauksia. Epilepsian alatyypit idiopaattisesta symptomaattiseen ovat esitettynä x-akselilla. Ionikanavien häiriintynyt toiminta voi olla tulosta tietyn ionikanavaa koodaavan geenin mutaatiosta tai sekundaarisista tekijöistä, mutta se on yhteistä koko epilepsian laajalle neurobiologiselle kirjolle. Kuva muokattu alkuperäisestä (62) Eräs esimerkki epilepsian monimutkaisesta patologiasta on mutaatiot jänniteherkkää natriumkanavaa koodaavassa geenissä SCN1A (sodium channel, voltage-gated, type I, alpha subunit) (63). Kyseisessä geenissä esiintyy monia eri mutaatiota, joista kukin johtaa fenotyypiltään erilaiseen epilepsiaan. Lievimmillään potilas kärsii lapsuuden kuumekouristuksista, kun taas spektrin toisessa päässä on ns. Dravetin syndrooma, joka aiheuttaa vakavan kehityshäiriön, ataksian ja refraktaarisia kouristuskohtauksia. Yhteistä kaikille mutaatioille on se, että natriumkanavan dysfunktio aiheuttaa vähentynyttä ärsyyntyvyyttä inhibitorissa GABAergisissä neuroneissa. Tämän seurauksena aivojen yleinen eksitaatio-inhibitiosuhde kasvaa altistaen potilaan epilepsiakohtaukselle. Toisaalta samaan lopputulokseen johtavat mutaatiot myös eräässä GABA-reseptoria koodaavassa geenissä GABRG2, mikä on toinen Dravetin syndroomaa sairastavilla löydetty geenivirhe (61). On selvää, että epilepsian patogeneesissa ionikanavilla on tärkeä 11 roolinsa, mutta myös muut ionien homeostaasiin, välittäjäaineiden tasapainoon ja solunsisäisiin tapahtumiin vaikuttavat tekijät aiheuttavat osaltaan epilepsiaa (44). 2.6 Epilepsian genetiikka Nykykäsityksen mukaan epilepsialla on aiemmin oletettua vahvempi perinnöllinen komponentti (64). Perimänn osuus vaihtelee kuitenkin suuresti eri epilepsian tyypeissä ja näitä onkin järkevää erottaa toisistaan geneettisen tutkimuksen puitteissa. Kokonaisuutena epilepsia on, kuten migreenikin, monitekijäinen sairauskokonaisuus, jossa geneettiset tekijät ja ympäristötekijät vuorovaikuttavat monimutkaisella tavalla. Eräässä kaksostutkimuksessa suoraan monotsygoottisilla kaksosilla 0,81, yleistyneen epilepsian konkordanssi oli mikä oli huomattavasti korkeampi kuin dizygoottisiten kaksosten vastaava luku 0,26. Myös paikallisalkuisten epilepsioiden konkordanssi oli suurempi monotsygoottisilla kaksosilla (0,36 vs. 0,05) (65). Tähän mennessä on löydetty yhteenlaskettuna kymmeniä geenivirheitä, jotka aiheuttavat harvinaisia, mendeliaanisesti periytyviä epilepsiaoireyhtymiä. Näissä epilepsia on usein osana vaikeaa oirekokonaisuutta, kuten esimerkiksi fragile X-oireyhtymässä (66). Mutaatiot saattavat periytyä potilaan vanhemmilta monogeenisesti tai syntyä de novo alkionkehityksen aikana. Vaikka kyseiset oireyhtymät ovat harvinaisia ja periytyvyydeltään selkeästi muita epilepsioita yksinkertaisempia, on geenivirheiden löytymisestä ollut merkittävää hyötyä epilepsian patogeneesin selvittämisessä. Valtaosa löytyneistä geeneistä koodaa ionikanavan alayksiköitä, mutta osalla on myös muita tehtäviä, jotka eivät liity ionikanaviin (11). Tietoa harvinaisten mendeliaanisten epilepsioiden geenimutaatioista on hyödynnetty myös tavallisempien epilepsioiden periytyvyyden selvittämisessä suhteellisen hyvin tuloksin. Kytkentäanalyysien, GWAS-tutkimusten ja eläinmallitutkimusten avulla on löydetty yli 100 epilepsiaan assosioituvaa geeniä (67). Näiden merkitys idiopaattisen epilepsian etiologiassa vaatii kuitenkin vielä paljon lisää tutkimustyötä, eikä kaikkia epilepsialle altistavia geneettisiä variantteja ole vielä löydetty. Tutkimusta vaikeuttaa epäselvyys siitä, onko epilepsia pääasiassa tavallisten vai harvinaisten varianttien aiheuttama sairaus, sillä samat tutkimusmenetelmät eivät sovellu kummankin tutkimiseen samanaikaisesti. Kuten migreenin kohdalla, myös epilepsialle on hiljattain sovellettu koko genomin kattavaa GWAS-menetelmää. Eräs näistä tutkimuksista löysi neljä tilastollisesti merkittävää epilepsiaan assosioituvaa geneettistä varianttia, joista yksi oli 12 lähellä SCN1A-geeniä (68). Muut tutkimukset eivät kuitenkaan löytäneet yleisiä variantteja, jotka olisivat yhteydessä epilepsiaan (69-71). Useimmat epilepsiat eivät noudata mendeliaanista periytymistä, vaikka saattavatkin esiintyä suvuittain. Nykykäsityksen mukaan noin 40% epilepsioista periytyy polygeenisesti (72). Usean alttiusgeenin yhdistelmä eri puolilta genomia laskee yksilön kouristuskynnystä yhdessä ympäristötekijöiden kanssa niin alas, että tuloksena on epileptinen kohtaus. De novo-mutaatioiden osuus epilepsian aiheuttajana saattaa olla suurempi kuin aikaisemmin on oletettu (64). Lisäksi uusimpien tutkimusten mukaan genettisten varianttien kopiolukuvaihtelut (CNV:t, copy number variants) voivat toimia tavallisempien epilepsioiden altistavina riskialleeleina (11), mikä monimutkaistaa entisestään epilepsian periytyvyyden tutkimista. Vuonna 2009 löydettiin ensimmäinen mikrodeleetio, joka on idiopaattisen yleistyneen epilepsian riskivariantti (73). Tulevaisuudessa suurena apuna tulee olemaan ns. MPS-menetelmän (Massive Parallel Sequensing) käyttöönotto, jonka avulla voidaan analysoida suuria aineistoja koko genomin aluetta paljon aiempaa tehokkaammin (55). 2.7 Kromosomi 14 Kolme erillistä genominlaajuista kytkentäanalyysiä on yhdistänyt lokuksen 14q21 migreeniin. Ensimmäisen tutkimuksen (74) aineistona oli italialainen suku, jossa auraton migreeni periytyi autosomaalisesti vallitsevasti. Kun muut migreenimuodot oli suljettu pois, havaittiin tilastollisesti merkittävä yhteys lokuksen 14q21.2-q22.3 ja aurattoman migreenin välillä. Sama lokus assosioitui migreeniin myös toisessa kytkentäanalyysissa (75), jonka aineistona oli yksittäisiä australialaisia ydinperheitä. Viimeisin kytkentäanalyyseistä (13) toisti kahden aiemman tutkimuksen tuloksen ja löysi vahvan yhteyden (p= 0.0001) lokuksen 14q12-q23 ja migreenin välillä. Aineistona toimi suomalainen suku, jossa esiintyi sekä migreeniä että epilepsiaa laajasti vaihtelevana fenotyyppinä. Pienimmillään migreenille altistava lokus rajautui välille 14q12-q21, mikä ei osunut ensimmäisen tutkimuksen löytämän lokuksen kohdalle. Voi olla, että alueella 14q12-q23 on kaksi erillistä migreenille altistavaa lokusta. Suomalaistutkimuksessa sama migreenille altistava lokus 14q12-q23 assosioitui, tosin heikommin (p=0.0034), ensimmäistä kertaa myös yleistyneisiin toonis-kloonisiin epilepsiakohtauksiin (GTCS). Tämä on yleinen kohtaustyyppi idiopaattisessa yleistyneessä epilepsiassa. Eräällä epilepsiaa sairastavalla koehenkilöllä altistavasta 13 haplotyypista oli rekombinaation seurauksena jäljellä vain distaalinen osa 14q22-q23. Yksi aiempi kytkentäanalyysi on myös yhdistänyt idiopaattisen yleistyneen epilepsian lokukseen 14q23 aineistonaan 130 epilepsiaperhettä viidestä eri Euroopan maasta (76). Osa löydetystä GTCS:lle altistavasta haplotyypistä osui siis samalle alueelle kuin migreenille altistava haplotyyppi. Voi olla, että tällä alueella on altistavia tekijöitä sekä migreenille että epilepsialle. Alue oli lokuksen 14q12-q23 proksimaalisessa osassa, eikä selitä aiemmin havaittua assosiaatiota lokuksen distaalisen pään ja epilepsian välillä. Voi olla, että lokuksessa 14q12-q23 on kaksi epilepsialle altistavaa haplotyyppiä, joista proksimaalisempi altistaa samanaikaisesti myös migreenille. Lokuksessa 14q12-q23 sijaitsee satoja geenejä, joista toistaiseksi yksikään ei ole osoittautunut migreeniä tai epilepsiaa aiheuttavaksi. Alueella sijaitsevan tunnetun ionikanavageenin KCNH5/EAG2 eksoneista ei löydetty kyseisiin sairauksiin assosioituvia variaatioita (13). Tämän tutkimuksen tavoitteena on analysoida aluetta tarkemmin eksomisekvensoinnilla. Kuva3. Alueella 14q12-q23 sijaitsee satoja geenejä. Kuva muokattu kuvasieppauksesta UCSC Genome Browser-sivustolta (77). 14 3 Aineisto Tutkimuksen aineistona toimi viisi sukupolvea kattava laaja suomalainen suku, jossa esiintyy sekä migreeniä että epilepsiaa monimuotoisena fenotyyppinä. Tutkimuksen lopussa on liitteenä kyseisen suvun sukupuu (Liite 1). HUS:n eettinen toimikunta on hyväksynyt tutkimuksen päätöksillään 146/E9/01, 146/E9/02, #33/2004, 111/13/03/01/11, 3.8.2011). Suku toimi aineistona tämän tutkimuksen ohella myös neurologian erikoislääkäri Auli Sirénin (Tampereen yliopisto) epilepsiatutkimuksessa, jossa kaikkien epilepsiasta kärsivien koehenkilöiden potilasasiakirjat käytiin läpi ja potilaat haastateltiin. Auli Sirén diagnosoi potilaat ILAE:n (International League Against Epilepsy) kriteerien perusteella (7) ja samoja diagnooseja hyödynnettiin myös tässä tutkimuksessa. Tutkimusaineisto siirtyi osaksi laajempaa migreenitutkimusta (Finnish Migraine Genome Project FMGP), kun kävi ilmi, että suvussa esiintyy epilepsian ohella myös runsaasti migreeniä. FMGP on neurologien Markus Färkkilän ja Mikko Kallelan vuonna 1992 aloittama, yli 10 000 potilasta käsittävä suomalainen projekti, joka tutkii migreenin kliinisiä piirteitä ja migreenin periytymistä. Tutkimukseen osallistuneet allekirjoittivat suostumuslomakkeen, antoivat verinäytteen molekyyligeneettisiä analyyseja varten ja vastasivat validoituun kyselylomakkeeseen (Finnish Migraine Specific Questionnaire for Family Studies, FMSQFS) (78). Kyselyssä selvitetään tarkasti mm. päänsäryn laatu, mahdollisten aura- ja prodromaalioireiden esiintyminen sekä migreenin liitännäisoireet ja esiintyminen suvussa. Sukuun kuuluvista 224 yksilöstä yhteensä 111 täytti kyselylomakkeen ja 85 luovutti verinäytteen geneettisiä tutkimuksia varten. Migreenidiagnoosit teki neurologian erikoislääkäri Mikko Kallela vuoden 2004 IHSkriteerien (79) mukaisesti kyselylomakkeen pohjalta. Luokittelematon migreeniauradiagnoosi (Unc, unclassified) annettiin henkilöille, joiden auraoireet eivät täyttäneet aurallisen, aurattoman tai hemiplegisen migreenin IHS-kriteerejä. IHS-kriteereistä poiketen aurallisen sekä hemiplegisen migreenin diagnoosiin vaadittiin tässä tutkimuksessa aina myös migreenille ominaista päänsärkyä. Kaikkien epilepsiasta kärsivien koehenkilöiden potilasasiakirjat käytiin läpi ja potilaat haastateltiin. Epilepsiadiagnoosit asetetti neurologian erikoislääkäri Auli Sirén 15 (Folkhälsan, Tampereen yliopisto) ILAE:n (International League Against Epilepsy) kriteerien perusteella (7). Aineistosta valittiin erikseen kahdeksan henkilön ryhmä, jolle suoritettiin koko genomin kattava eksomisekvensointi. Jokaisella eksomisekvensoidulla henkilöllä oli migreeni ja lisäksi neljällä heistä oli epilepsia. Kuvassa 4 esitetään eksomisekvensointiaineito tarkemmin. Kuva4. Eksomisekvensointiaineisto. Neliö kuvaa miessukupuolta ja ympyrä naista. Eksomisekvensointi kattaa ne koehenkilöt, joiden kohdalla lukee Exo. Koehenkilöiden väri määräytyy migreenidiagnoosin mukaan. Hemipleginen migreeni (HM)=keltainen, aurallinen migreeni (MwA)=punainen, auraton migreeni (MwoA)=tummanharmaa, luokittelematon migreeniaura (Unc)=sininen. Tietyllä koehenkilöllä voi olla monenlaisia erilaisia kohtauksia. (No HA) tarkoittaa, että potilaalla ei esiinny päänsärkyä. Epilepsiadiagnoosit ovat kunkin koehenkilön vasemmalla puolella: yleistynyt toonis-klooninen kohtaus (GTC), yleistynyt tooninen kohtaus (GT) ja paikallisalkuinen kohtaus (focal). 4 Menetelmät 4.1 Kliininen tarkastelu Kyselylomakkeeseen vastatut tiedot taulukoitiin Excel for Windows (versio 2013)ohjelmalla. Tilastollinen analyysi oli pääasiassa deskriptiivistä ja tarkastelu tehtiin ristiintaulukoiden. Jos koehenkilö oli jättänyt vastaamatta johonkin kyselylomakkeen kohdista, jätettiin kyseinen kohta pois ja pienentynyt otoskoko otettiin huomioon analyysissa. Yksittäisten muuttujien kohdalla tilastoanalyysin tekemiseen käytettiin IBM 16 SPSS Statistics 22 – ohjelmaa. Tulosten tilastollista merkitsevyyttä arvioitiin KruskalWallisin testillä, jossa raja-arvona pidettiin p-arvoa <0,05. 4.2 Sukupuun piirtäminen Sukupuun piirtämiseen käytettiin HaploPainter (versio 1.043) - ohjelmaa. Sukupuu piirrettiin koehenkilöiden migreenikyselylomakkeessa antamien tietojen perusteella. Epilepsian osalta käytettiin lisäksi neurologi Auli Sirénin koostamia tietoja haastattelujen ja potilasasiakirjojen pohjalta. Koko aineiston kattava sukupuu selityksineen on liitteenä tutkimuksen lopussa (Liite 1). 4.3 Eksomisekvensointi Eksomisekvensoinnissa jokaisen näytteen sisältämä DNA pilkotaan tietyn mittaisiin osiin, jotka sidotaan adaptereihin ja annetaan hybridisoitua niille komplementaaristen oligonukleotidikoettimien kanssa. Sitoutumattomat DNA:n osat pestään pois ja jäljelle jäävä haluttu, pääosin eksoninen DNA monistetaan polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Näin rikastettu DNA-kirjasto sekvensoidaan siten, että jokainen emäs luetaan vähintään 30 kertaa (lukupeitto, engl. coverage). Nykyaikaisilla uuden sukupolven sekvensointimenetelmillä, kuten esimerkiksi Illuminan HiSeq-systeemillä, pienempää lukupeittoa pidetään esteenä tulkita tulos luotettavasti (80). Tässä tutkimuksessa eksomisekvensoinnin tavoitteena oli tunnistaa variantteja, jotka segregoivat aineistossa migreenin tai epilepsian mukana ja aiheuttavat toiminnallisesti kiinnostavan muutoksen. Sekvensointi tehtiin Suomen Molekyylilääketieteen instituutin (FIMM) teknologiakeskuksessa. Sekvensoitavat alueet pyydystettiin NimbleGen SeqCap EZ Human Exome v2.0-menetelmällä ja itse sekvensointi suoritettiin Illuminan HiSeqmenetelmällä. Varianttien tunnistuksessa käytettiin FIMM:ssä kehitettyä VCP-ohjelmaa (Variant Calling Pipeline) (81) ja sekvensoidut alueet paikannettiin GRCh37referenssigenomin avulla. Jokaiselta kahdeksalta eksomisekvensoidulta henkilöltä etsittiin kiinnostavia variantteja samoilla kriteereillä. Tarkasteluun otettiin aluksi koko kromosomi 14. Löytyneiden varianttien alleelifrekvenssiä verrattiin 1000 genomia – projektissa määriteltyihin 17 alleelifrekvensseihin. Kyseisen projektin toimesta noin 1200:n eri etnisistä taustoista olevan henkilön genomi (pääasiassa eksoniset kohdat) on sekvensoitu, jotta voitaisiin tunnistaa toisaalta yleisiä geneettisiä variantteja ja toisaalta niitä variantteja, jotka aiheuttavat kantajalleen sairauden (82). Tässä tutkimuksessa tarkasteluun jäivät ne koehenkilöiden variantit, joiden 1000G- frekvenssi oli harvinaisempi kuin 0,05 tai tuntematon, jolloin niille ei ole vielä määritelty vertailuarvoa kyseisessä projektissa. Seuraavaksi tarkasteluun rajattiin variantit, jotka sijaitsivat eksonissa tai silmukointikohdassa (engl. splice site), koska niillä on todennäköisimmin vaikutusta lopulliseen geenituotteeseen. Tarkastelua rajattiin edelleen kattamaan aminohappoa vaihtavat mutaatiot (engl. missense), lopetuskodoniin vaikuttavat mutaatiot sekä silmukointikohtiin vaikuttavat mutaatiot. Variantit, jotka sijoittuivat hajureseptori-, Tsolureseptori- tai immunoglobuliiniketjugeeneihin rajattiin pois, koska niissä on tavallista enemmän luonnollista vaihtelua. Ensembl-tietokannan (83) avulla paikannettiin jokaisen variantin kohdegeeni. Tämä tehtiin GRCh38-refrenssigenomin pohjalta varianttien rs-numeroiden (referenceSNP eli tunnistenumero) perusteella. Ns. novellivariantit, joilla ei vielä ole rs-numeroa, otettiin myös mukaan analyysiin etsimällä ne GRCh37-tietokannasta sijaintinsa perusteella. Ensembl-tietokannasta etsittiin kaikille jäljelle jäänneille varianteille myös Sift- ja PolyPhen-ennustearvot. Sift-ennuste (Sorting Intolerant from Tolerant) ennustaa mm. aminohappojen fysikaalisten ominaisuuksien pohjalta, vaikuttaako mutaation aiheuttama aminohapon vaihtuminen kyseisen proteiinin toimintaan. Vaihtoehtoina on ”tolerated” ja ”deleterious”, joista jälkimmäinen saattaa muuttaa proteiinin toimintaa. PolyPhenennuste (Polymorphism Phenotyping v2) ottaa huomioon useampia tietokantoja kuin Sift ja jakaa mutaatiot neljään luokkaan: ”probably damaging”, ”possibly damaging”, ”benign” ja ”unknown”. Näistä kaksi ensimmäistä todennäköisesti vaikuttavat proteiinin toimintaan (84). Tässä tutkimuksessa tarkasteluun jäivät ne variantit, joiden Sift-ennuste oli ”deleterious” tai PolyPhen-ennuste oli ”probably damaging” tai ”possibly damaging”. Lopulliseen tarkasteluun otettiin ne variantit, jotka sijoittuivat alueelle 14q12-q23. Tämä alue on markkereiden D14S1071 ja D14S63 rajaama (31,728,339 - 64,751,274 Mbp) ja on ryhmämme aiemmassa tutkimuksessa kytkeytynyt epilepsia-migreeni-fenotyyppiin 18 (13). Kyseisen suomalaisen kytkentäanalyysin aineisto sisälsi myös tässä tutkimuksessa eksomisekvensoidut kahdeksan koehenkilöä. Koska suomalaisten perimä poikkeaa muista kansallisuuksista ainutlaatuisen muuttohistoriamme vuoksi, verrattiin tarkasteluun jääneiden varianttien frekvenssejä 1000 genomia-projektin lisäksi myös SISutietokannasta löytyviin suomalaisiin arvoihin (85). Tarkasteluun jätettiin variantit, joiden frekvenssi oli myös suomalaisissa vertailuarvoissa alle 0,05. Jäljelle jääneistä varianteista kiinnitettiin lisäksi huomiota siihen, kuinka usein ne esiintyvät homotsygoottisina SISutietokannan mukaan. Lisätyökaluna varianttien merkitystä arvioitaessa käytettiin ExAC-työkalua (Exome Aggregation Consortium), johon on koottu kahdestakymmenestä erillisestä projektista saatu sekvensointidata, joka kattaa 61 486 yksilöä useista eri kansallisuuksista (86). Kultakin variantilta tarkistettiin ExAC:n ilmoittama kokonaisfrekvenssi. Huomattakoon, että 1000 genomia- sekä SISu-projektien tulokset sisältyvät ExAC-projektiin. Jokaiselta kahdeksalta koehenkilöltä etsittiin erikseen edellä mainitut kriteerit täyttävät variantit, jonka jälkeen tuloksia verrattiin toisiinsa. Erityistä huomiota kiinnitettiin variantteihin, jotka esiintyivät useammalla kuin yhdellä koehenkilöllä. Toisaalta huomiota kiinnitettiin variantteihin, jotka esiintyivät toiminnallisesti kiinnostavissa geeneissä. Näitä ovat kaikki erityisesti aivoissa ekspressoituvat geenit, neurogeneesiin vaikuttavat geenit sekä ionikanavageenit. 4.4 Kandidaattigeenien määrittäminen ja analysointi Migreeni sekä migreeni-epilepsia -fenotyyppi on ryhmämme aikaisemmin julkisemassa kytkentäanalyysissa kytkeytynyt markkeriin D14S70 (34,359,194 - 34,559,447 Mbp) (13). Epilepsia on puolestaan kytkeytynyt markkeriin D14S276 (55,583,016 - 55,783,343 Mbp) (13) sekä D14S63 (64,551,007 - 64,751,274 Mbp) (76). Tässä tutkimuksessa etsittiin lähellä näitä alueita sijaitsevat kandidaattigeenit, joissa olevat variantit voisivat todennäköisimmin aiheuttaa migreeniä tai epilepsiaa. Etsintään käytettiin UCSC Genome Browser-tietokantaa (77). Etsintäalueeksi valittiin 3,0 Mbp kumpaakin suuntaan kaikista kolmesta edellä mainitusta markkerista. Lisäksi kahden viimeisen markkerin välinen alue seulottiin kokonaisuudessaan. Täten kandidaattigeenejä etsittiin alueilta 31,4 - 37,6 Mbp sekä 52,6 - 71,2 Mbp. Erityistä huomiota kiinnitettiin neurogeeneesiin osallistuviin sekä 19 aivoissa ekspressoituviin geeneihin. Kaikki ionikanavageenit määritettiin myös kandidaattigeeneiksi. Lähempään tarkasteluun valittiin kaksi kandidaattigeeniä SYNE2 sekä NPAS3, joista kummallakin on rooli neurogeneesissä (87,88). Perusteena valinnoille oli se, että kyseisistä toiminnallisesti mielenkiintoisista geeneistä oli löytynyt eksomisekvensoinnin yhteydessä variantteja, jotka täyttivät edellisessä kappaleessa mainitut tiukat kriteerit. Nämä kaksi geeniä analysoitiin uudelleen käyttäen löyhempiä kriteerejä, jotta mukaan saataisiin mahdolliset geenitoimintaan vaikuttavat introniset tai säätelyalueilla sijaitsevat variantit. Kummankin geenin tarkka sijainti tarkistettiin UCSC-tietokannasta (SYNE2 63,852,965 - 64,693,167 Mbp ja NPAS3 32,934,909 - 34,273,382 Mbp) jonka jälkeen kultakin koehenkilöltä analysoitiin kaikki kyseisille alueille sijoittuvat variantit. Erona edellisessä kappaleessa mainittuihin kriteereihin oli se, että tällä kertaa tarkastelua ei rajattu eksonisiin tai silmukointikohdassa sijaitseviin variantteihin. Kun kriteerit täyttävät variantit (sijainti kandidaattigeenin alueella, 1000G- ja SISu-frekvenssit <0,05) oli määritetty kultakin koehenkilöltä, rajattiin tarkastelu niihin variantteihin, jotka esiintyivät vähintään kahdella koehenkilöllä. Näiden varianttien ennustettu vaikutus tarkistettiin Ensembl-tietokannasta GRCh38-referenssigenomia käyttäen. Erityisesti kiinnitettiin huomiota variantteihin, jotka sijaitsivat geenien säätelyalueella. Kaikkien koehenkilön tuloksia verrattiin keskenään ja tarkistettiin, segregoiko jokin varianteista aineistossa migreenin tai epilepsian mukaan. ExAC-tietokannasta tarkistettiin, kuinka paljon kussakin varianttien sijaintigeenissä esiintyy toimintaa muuttavia mutaatioita (loss of function, LoF). Tämä tehtiin, jotta voitaisiin arvioida tässä tutkimuksessa löytyneiden varianttien todellista toiminnallista merkitystä. 20 5 Tulokset 5.1 Migreenin ja epilepsian kliiniset piirteet suvussa Kyselylomakkeeseen vastasi 111 henkilöä, joista 68 (61,3 %) kärsi migreenistä ja 15 (13,5 %) epilepsiasta. Sekä epilepsiaa että migreeniä sairastavia potilaita oli 11 (9,9 %), pelkkää migreeniä sairastavia 57 (51,3 %) ja pelkkää epilepsiaa sairastavia 4 (3,6 %). Naisia oli 75 (67,6 %) ja kuumekouristuksista oli joskus elämänsä aikana kärsinyt 10 henkilöä (9,0 %). Taulukoissa 4 ja 5 esitetään tarkemmin aineiston sukupuolijakauma sekä miten kuumekouristusten esiintyminen on jakaantunut aineistossa. Taulukko4. Aineiston sukupuolijakauma. Taulukko5. Kuumekouristusten esiintyminen aineistossa. Migreenin suhteen koehenkilöiden diagnoosit jakautuivat kolmeen ryhmään: hemipleginen migreeni, aurallinen migreeni ja auraton migreeni. Seuraavassa taulukossa esitetään, miten nämä kolme migreenin alatyyppiä sekä epilepsia jakautuivat aineistossa. Taulukko6. Migreenin ja epilepsian jakaantuminen aineistossa. Kullakin rivillä olevan diagnoosin esiintyminen esitetään pystysarakkeilla olevan ryhmän suhteen. Esimerkiksi kaikista koehenkilöistä 13,51% kärsi epilepsiasta, mutta hemiplegisen migreenin sairastajista epilepsia oli 45,45%:lla. HM = hemipleginen migreeni, MwA = aurallinen migreeni, MwoA = auraton migreeni. Koehenkilöiltä tarkistettiin, kuinka hyvin heidän oireensa täyttivät migreenin IHSkriteerit. Lisäksi selvitettiin kohtausta edeltävien ennakko-oireiden esiintyminen sekä päänsärkykohtausten lukumäärä elämän aikana. Vertailua tehtiin niiden välillä, jotka kärsivät pelkästä migreenistä sekä niiden välillä, joilla oli migreenin lisäksi myös epilepsia. Tulokset esitetään taulukossa 7. 21 Taulukko7. Migreenikohtauksen vertailua koehenkilöiden välillä, jotka kärsivät pelkästä migreenistä tai migreenistä ja epilepsiasta. Otoskoon pieneneminen on otettu huomioon, jos koehenkilöitä on jättänyt vastaamatta johonkin kyselylomakkeen kohtaan. Koehenkilöiltä kysyttiin myös päänsärkyjen alkamisikä sekä auraoireiden alkamisikä. Vertailu tehtiin samojen ryhmien välillä kuin edellisessä taulukossa. Tulokset esitetään taulukoissa 8 ja 9. 22 Taulukko8. Päänsärkyjen alkamisikä koko aineistossa, pelkkää migreeniä sairastavilla ja sekä epilepsiaa että migreeniä sairastavilla. 95 henkilöä vastasi kyselylomakkeen kohtaan, jossa kysyttiin päänsärkyjen alkamisikää. Otos sisälsi kaikki 57 pelkästä migreenistä kärsivää sekä kaikki 11 sekä migreeniä että epilepsiaa sairastavaa. Tulosten tilastollista merkitsevyyttä arvioitiin Kruskal-Wallisin testillä, josta p-arvoksi saatiin 0,730. Raja-arvona pidettiin p-arvoa <0,05, joten tuloksia ei voi pitää tilastollisesti merkitsevinä. 23 Taulukko9. Auraoireiden alkamisikä koko aineistossa, pelkkää migreeniä sairastavilla ja sekä epilepsiaa että migreeniä sairastavilla. Otoksen koko on pieni, koska aineistossa valtaosa migreenistä on auratonta muotoa ja tämän takia vain 40 koehenkilöä vastasi kyseiseen lomakkeen kohtaan. Otos sisälsi 28 pelkästä migreenistä kärsivää ja 6 sekä migreenistä että epilepsiasta kärsivää. Kruskal-Wallisin testillä tulosten p-arvoksi saatiin 0,648, joten löydöstä ei voi pitää tilastollisesti merkitsevänä. 24 5.2 Varianttien seulonta eksomisekvensoinnissa Seuraavia kriteeereitä käytettiin varianttien seulonnassa: 1. 1000G - frekvenssi harvinaisempi kuin 0,05 tai tuntematon 2. Sijainti eksonissa tai silmukointikohdassa 3. Aminohappoa vaihtava, lopetuskodoniin vaikuttava tai silmukointikohtaan vaikuttava mutaatio 4. Ei hajureseptoria, T-solureseptoria tai immunoglobuliiniketjua koodaavaan geeniin sijoittuva variantti 5. Sijainti alueella 31,728,339 - 64,751,274 Mbp (14q12-q23) 6. SISu- frekvenssi harvinaisempi kuin 0,05 tai tuntematon 7. Sift-ennuste ”deleterious” tai PolyPhen-ennuste ”probably damaging” tai PolyPhen-ennuste ”possibly damaging” Koehenkilöiden näytteistä löytyi kromosomin 14 alueelta yhteensä 119 varianttia, jotka täyttivät kriteerit 1-4. Näistä 95 oli aikaisemmin tunnistettuja eli rs-numerollisia ja 24 oli aikaisemmin tunnistamattomia (novel), jolloin niiltä puuttui rs-numero. Kun lisäksi varianttien tuli täyttää kriteerit 5-7, jäi jäljelle 10 tunnettua, rs-numerollista varianttia ja kolme uutta (novellia). Taulukoissa 10 ja 11 esitellään tarkemmin kyseiset kriteerit täyttäneet variantit. Taulukko10. Tarkastelussa mielenkiintoisimmiksi osoittautuneet variantit. 25 Taulukko11. Varianttien frekvenssit ExAc-tietokannan, 1000G-tietokannan ja SISu-tietokannan mukaan. Lisäksi taulukossa on esitetty SISu-tietokannan mukaiset varianttien kantajien lukumäärät: N_Minor tarkoittaa variantin homotsygoottisten kantajien lukumäärää, N_het heterotsygoottisten kantajien määrää ja N_major valta-alleelin kantajien lukumäärää. Kaikki variantit sijaitsivat eri geeneissä lukuun ottamatta SYNE2-geeniä, jonka alueella sijaitsi kaksi erillistä varianttia. Kuvassa 4 esitetään näiden kahden variantin kantajat kahdeksan henkilön eksomisekvensointiaineistossa. Kyseisten varianttien osalta tarkistettiin erikseen niiden lukupeitto tulosten luotettavuuden arvioimiseksi. Variantin rs17766354 osalta se oli 40 - 65 koehenkilöstä riippuen ja variantin rs36215895 osalta se oli 12 (henkilöllä 6406) - 14 (henkilöllä 6438). Kuva5. Kahden SYNE2-geenissä sijaitsevan variantin jakutuminen aineistossa. Vihreä tähti kuvaa mutaatiota rs36215895, jossa sytosiini (C) on korvautunut tymiinillä (T). Keltainen tähti kuvaa mutaatiota rs17766354, jossa sytosiini (C) on korvautunut guaniinilla (G). Kaikki koehenkilöt olivat kummankin mutaation suhteen heterotsygootteja. Migreeni-ja epilepsiadiagnoosien lyhenteet löytyvät kuvan 4 selitteestä sivulta 15. 26 Löytyneistä 12:sta geenistä aivoissa ekspressoituvia oli ainakin 6 kappaletta: SYNE2, SIX6, TRIM9, TXNDC16, ARF6 ja NPAS. Lisäksi funktioltaan vielä tuntemattomat CCDC175, ABHD12B ja KLHL28 saattavat myös ekspressoitua aivoissa. Joukossa ei ollut yhtäkään ionikanavageeniä. Taulukossa 12 esitellään tarkemmin niiden geenien funktiot, joissa variantit sijaitsivat. Geeni Geenin nimi Geenin toiminta SYNE2 Spectrin repeat containing, nuclear envelope 2 Tukee tuman rakennetta, yhdistää tumakoteloa ja solun tukirankaa, osallistuu neurogeneesiin (87,89) SIX6 SIX homeobox 6 Osallistuu sikiöaikaiseen silmänkehitykseen (90) PYGL Phosphorylase, glycogen, liver Säätelee elimistön sokeritasapainoa vapauttamalla maksan glykogeenista glukoosi-1-fosfaattia (91) TRIM9 Tripartite motif containing 9 Funktio osin tuntematon, ekspressoituu spesifisesti sikiön ja aikuisen aivoissa, vähentynyt ekspressio yhteydessä Parkinsonin tautiin ja Lewyn kappale-dementiaan (92,93) CCDC175 Coiled-coil domain-containing protein 175 Funktio vielä tuntematon TXNDC16 Thioredoxin domain containing 16 Solun sileän limakalvoston glykoproteiini, jota eritetään myös seerumiin, meningioomaan assosioituva antigeeni (94) ARF6 ADP-ribosylation factor 6 Säätelee solukalvon vesikkeliliikennettä, osallistuu membraanilipidien järjestämiseen ja solun tukirankaan vaikuttaviin signaaliketjuihin (95) ABHD12B Abhydrolase domain containing 12B Funktio vielä tuntematon NPAS3 Neuronal PAS domain protein 3 Transkriptiotekijä, joka säätelee luultavasti neurogeneesiä. Mutaatioihin liittyy skitsofreniaa ja henkistä kehitysvammaisuutta (88,96) CGRRF1 Cell growth regulator with ring finger domain 1 Rajoittaa kasvua useissa eri solulinjoissa pysäyttämällä solusyklin, ekspressoituu mm. kohdun endometriumilla, yhteydessä moniin syöpiin (97,98) FOXA1 Forkhead box A1 Transkriptiotekijä, joka aktivoi useiden maksaspesifisten geenien ilmentymisen maksassa, säätelee useiden kudosten toimintaa, toiminta häiriintynyt monissa syövissä (99) KLHL28 Kelch-like family member 28 Funktio vielä tuntematon. Saman geeniperheen jäsenistä esim. KLHL2 säätelee oligodendrosyyttien aksonien kasvua (100) Taulukko12. Aineistosta löytyneiden mielenkiintoisten varianttien sijaintigeenien nimet ja funktiot. 27 5.3 Kandidaattigeenit SYNE2 ja NPAS3 Menetelmät-osiossa esiteltyjen kriteerien mukaan alueilta 31,4 - 37,6 Mbp sekä 52,6 71,2 Mbp kartoitettiin mahdolliset migreenin tai epilepsiaan kytkeytyvät kandidaattigeenit. Tulokset esitellään taulukossa 13. Taulukko13. Kandidaattigeenit. Kaikki geenit joko ekspressoituvat spesifisesti aivoissa, osallistuvat neurogeneesiin tai osallistuvat jonkin ionikanavan toimintaan. Lähempään tarkasteluun valittiin Menetelmät-osiossa esitellyin perustein NPAS3 (32,934,3 Mbp) sekä SYNE2 (63,9 - 64,7 Mbp). SYNE2 SYNE2 on valtavan kokoinen geeni, joka käsittää yli 373 kb alueen lokuksessa 14q22.1q22.3. Geenillä on yhteensä 114 eksonia ja lukuisia isoformeja. Koodaavaa DNA:ta geeniin kuuluu yhteensä 21,8 kb (101). Geenituote nespriini 2 sijoittuu tumakotelon ulkomembraanille useissa eri kudoksissa, kuten munuaisissa, maksassa, kohdussa ja pernassa, mutta myös aivoissa. Nespriini 2 on tärkeä rakenneproteiini, joka sitoutuu solun tukirangan aktiiniin vaikuttaen täten koko solun arkkitehtuuriin sekä tuman rakenteen säilyttämiseen. Proteiinilla on vaikutusta myös sentrosomien liikkumiseen ciliogeneesin aikana (89). Hiirikokein on osoitettu, että nespriini 2:lla on tärkeä vaikutus neurogeneesiin ja neuronien migraatioon tuman liikkeitä säätelemällä. Lisäksi hiirillä, joilla oli aiheutettu mutaatioita SYNE2-geenissä, kehittyi muisti-ja oppimisvaikeuksia (87). Kaikkien koehenkilöiden eksomisekvensointinäytteet SYNE2-geenin alueelta käytiin läpi kriteerein, jotka on esitelty Menetelmät-osiossa. Yhteensä löytyi 20 varianttia, jotka täyttivät asetetut ehdot. Näistä kaksi oli missense-variantteja (rs36215895 ja rs17766354), joita on tarkasteltu jo tutkimuksen aiemmassa vaiheessa. Loput 18 sijoittuvat intronien ja 28 ei-koodaavien alueiden kohdalle. Yksikään variantti ei sijoittunut geenin säätelyalueille. Eräs varianteista (rs113745698) paikantui viereisen geenin WDR89 mRNA:n 3´-pään eitransloitavalle alueelle. Taulukossa 14 esitellään tarkemmin löytyneet variantit. Taulukko14. SYNE2-geenin alueelta löytyneet variantit. Geeni-sarakkeessa sulkeet tarkoittavat, että variantti sijoittuu geenin ei-koodaavaan osaan. Synonymous_variant sijaitsee eksonissa, mutta ei johda aminohapon vaihtumiseen. Ei-koodaavalla alueella sijaitsevat nc_transcript_variant, intron_variant ja 3_prime_UTR_variant. NMD_transcript_variantit sijoittuu myös ei-koodaavalle alueelle, mutta NMDsäätelyketjun ((nonsense-mediated mRNA decay) (102) vaikutuspiiriin. ExAC-tietokannassa SYNE2-geenistä löytyi 173 kappaletta loss of function - mutaatioita (LoF), mikä heijastaa geenin suurta kokoa. Kaikkia LoF-mutaatioita ei tarkistettu niiden suuren määrän vuoksi, mutta tarkistetuista 30 kappaleesta yksikään ei esiintynyt homotsygoottisena missään vertailuryhmässä. NPAS3 NPAS3-geeni sijaitsee alueen 14q13 proksimaaliosassa ja käsittää yhteensä 864 kb koodaavaa DNA:ta. Geenillä on 12 eksonia ja kaksi vaihtoehtoista transkriptia (103). Geenituote on transkriptiotekijä, jolla on tärkeä rooli aivojen kehityksessä sekä neuronien kehityksen että mahdollisesti myös sokerimetabolismin kautta (104). NPAS3-geeniä ekspressoidaan useassa kohtaa kehittyviä aivoja koko sikiönkehityksen ajan (105). Geenin toimintaa muuttavat mutaatiot aiheuttavat skitsofreniaa sekä henkistä kehitysvammaisuutta (96,103). Hiirikokeissa ne hiiret, joilta puuttui NPAS3, olivat aivojen kehitykseltään ja käytökseltään selkeästi epänormaaleja (106). 29 NPAS3 analysoitiin samoin ehdoin kuin SYNE2-geeni. Geenin alueelta löytyi yhteensä kolme varianttia, jotka täyttivät Menetelmät-osiossa esitellyt kriteerit. Yksi varianteista oli löytynyt jo tutkimuksen aiemmassa vaiheessa (kohdassa 33,836 451 Mbp sijaitseva, rs-numeroton novellivariantti). Kaksi muuta sijaitsivat kumpikin ei-koodaavalla DNAalueella. Löytyneet variantit esitellään tarkemmin taulukossa 15. Taulukko15. NPAS3-geenin alueelta löytyneet variantit. ExAC-tietokannassa NPAS3-geenistä löytyi 13 kappaletta loss of function - mutaatioita (LoF). Yksikään niistä ei esiintynyt homotsygoottisena missään vertailuryhmässä. 30 6 Pohdinta 6.1 Migreenin ja epilepsian yhteys suvun kliinisessä tarkastelussa Epilepsian ja migreenin eri alatyyppien jakautuminen aineistossa antoi muutamia mielenkiintoisia havaintoja. Merkittävin löydös lienee aurattoman migreenin selkeä assosiaatio epilepsiaan: epileptikoista 73 % kärsi aurattomasta migreenistä, kun taas aurallisesta kärsi vain 20 %. Koko aineistosta 55 %:lla oli auraton migreeni ja aurallinen 19 %:lla, joten prevalenssi oli aurattomalla migreenillä suhteessa paljon korkeampi epilepsiaryhmässä kuin aurallisella. Aiemmin epilepsia on yhdistetty voimakkaammin auralliseen kuin aurattomaan migreeniin (44). Tämän tutkimuksen tulos on siis ristiriidassa aiempaan tietoon nähden. Toisaalta on muistettava, että auraoireet saattavat alkaa myöhemmällä iällä kuin migreenityyppiset päänsäryt. Epilepsian esiintyvyys on myös hyvin ikäriippuvaista. Tämän takia olisi mielenkiintoista päivittää tutkimusaineiston diagnoosit myöhemmin uudestaan. Toinen merkittävä löydös oli hemiplegisen migreenin ja epilepsian yhteys. Hemiplegisen migreenin osuus oli melkein nelinkertainen (33 %) epilepsiaa sairastavien ryhmässä verrattuna koko aineistoon (9,9 %). Yhteys oli selkeä myös toisinpäin: epilepsian osuus oli huomattavasti korkeampi (45 %) hemiplegikkojen ryhmässä kuin koko aineistossa (14 %). Tämä oli odotettavissa kyseisten sairauksien jo tiedossa olevan yhteisen etiologian pohjalta ja vahvistaa aiempien tutkimusten tuloksia. Diagnoositaulukon perusteella voidaan sanoa yhteenvetona, että kaikki migreenidiagnoosit ja epilepsiadiagnoosit näyttivät kasvattavan toistensa riskiä. Yksittäisenä huomiona sanottakoon, että kaikki hemiplegisestä migreenistä kärsivät saivat välillä myös aurattomia migreenikohtauksia. Tämän tutkimuksen tavoitteiden kannalta tärkein huomio oli, että aineiston kliinisen tarkastelun perusteella epilepsialla ja migreenillä oli selkeää komorbiditeettia. Yllättäen komorbiditeettia epilepsian kanssa osoitti nimenomaan auraton migreeni, kun taas aurallinen migreeni ei osoittanut sitä. Kolmantena päälöydöksenä voidaan pitää sitä, että yleisesti ottaen epilepsia näytti lisäävän sekä migreenioireiden esiintyvyyttä että niiden vakavuutta. Taulukosta 7 käy mielenkiintoisella tavalla ilmi, kuinka epilepsiasta kärsivien migreenikkojen päänsärkykohtauksiin liittyi keskimäärin enemmän oireita kuin pelkkää migreeniä 31 sairastavilla. Ainoa poikkeus oli näköauran esiintyminen, mikä oli epileptikkojen ryhmässä viisi prosenttiyksikköä harvinaisempaa kuin pelkkää migreeniä sairastavien ryhmässä (27 % vs 32 %). Ero selittyy osaltaan sen puolesta, että migreenin yleisin auraoire on visuaalinen aura, mutta epilepsiaan assosioitui tässä aineistossa nimenomaan auraton eikä aurallinen migreeni. Epileptikkojen ryhmässä migreenikohtausta edeltävät oireet olivat huomattavasti tavallisempia kuin vertailuryhmässä. Ruuanhimon suhteen ero oli jopa viisinkertainen (30 % vs 6 %). Erityisen mielenkiintoista oli, että yli puolella (55 %) epileptikoista valo provosoi migreenikohtausta. Valon tiedetään toisaalta olevan myös eräs epilepsiakohtauksia laukaisevista tekijöistä. Koehenkilöiltä olisi mielenkiintoista selvittää, provosoiko valo migreenikohtauksen ohella myös epilepsiakohtausta. Auraoireiden suhteen epilepsia näytti lisäävän muiden paitsi näköauran esiintymistä. Ero oli lähes kymmenkertainen tuntoauran suhteen ja motorisen oireenkin kohdalla yli nelinkertainen. Tulos on linjassa sen kanssa, mitä migreeniauran synnystä tiedetään. Auran taustalla oleva CSD-ilmiö ja siihen läheisesti liittyvä neuronien yliaktiivisuus on kenties linkki migreenin ja epilepsian välillä, joten oletettavasti kummastakin sairaudesta kärsivillä auraoireiden määräkin voi olla suurempi. Tarkastelussa selvisi, että epilepsiasta kärsivillä migreenikoilla migreenikohtauksia on huomattavasti useammin kuin vertailuryhmällä. Yli 100 kohtausta oli ollut jopa 63 %:lla epileptikoista, mikä on melkein kaksinkertainen määrä verrattuna vertailuryhmän vastaavaan arvoon 38 %. Kukaan epileptikoista ei ollut kokenut alle 10 kohtausta, kun taas vertailuryhmässä 11 % migreenikoista oli kokenut kohtauksia alle 10 kertaa. Myös kohtausten kesto oli pidempi epileptikkojen ryhmässä: jopa 9 % raportoi pitkittyneitä, yli 72 tunnin kohtauksia, kun taas vertailuryhmästä niitä oli kokenut vain 2 %. Lyhyitä, alle neljän tunnin kohtauksia epileptikoista oli kokenut vain 27 %, kun taas jopa 41 %:lla pelkkää migreeniä sairastavilla oli ollut lyhyitä kohtauksia. Päänsäryn piirteiden suhteen epilepsia näytti lisäävän toispuoleisuuden tunnetta (64 % vs 32 %), mutta vähentävän sykkivyyttä (45 % vs 62 %). Intensiteetiltään epileptikkojen kokema päänsärky ilmoitettiin selkeästi voimakkaammaksi. 18 % epileptikoista kärsi sietämättömästä päänsärystä, kun taas yksikään vertailuryhmän migreenikko ei kuvaillut 32 päänsärkyään sietämättömäksi. Näiden tulosten pohjalta on vaikea vetää kovin pitäviä johtopäätöksiä. Voi olla, että epileptikoille ominainen migreenipäänsärky on luonteeltaan enemmän toiselle puolelle sijoittuvaa, tasaista ja erittäin kovaa päänsärkyä. Fyysisen rasituksen vaikutus oli kummassakin ryhmässä samankaltainen. Epilepsiamigreeniyhmästä 89 % ja migreeniryhmästä 85 % ilmoitti fyysisen rasituksen pahentavan päänsärkyä, mikä on linjassa IHS-kriteerien kanssa. Migreenipäänsärkyyn liittyvät liitännäisoireet olivat selkeästi yleisempiä epilepsiasta kärsivien ryhmästä. Kaikki epilepsiaa sairastavat koehenkilöt raportoivat kohtauksiin liittyvän pahoinvointia, ääniarkuutta ja valoarkuutta, kun taas vertailuryhmästä näistä oireista kärsi 83 - 87 %. Oksentelu oli myös huomattavasti yleisempää epileptikkojen ryhmässä (64 % vs 40 %). Taulukosta 8 käy ilmi, että päänsärkyjen keskimääräinen alkamisikä oli erilainen, kun verrattiin keskenään pelkkää migreeniä potevien ja toisaalta sekä migreeniä että epilepsiaa sairastavien ryhmiä. Epilepsia näytti aikaistavan koehenkilöiden migreenin puhkeamista. Tulos ei ole kuitenkaan tilastollisesti merkittävä (p-arvo 0,730), vaikka selkeä trendi on havaittavissa. Alle 5-vuotiaana päänsäryt alkoivat migreeniryhmässä 3,6 %:lla, mutta luku oli yli kaksinkertainen (9,1 %) epilepsia-migreeniryhmässä. Myös 510-vuotiaiden ryhmässä oli vastaava löydös: epileptikoista 36 % kärsi ensimmäisestä päänsärkykohtauksestaan 5-10-vuotiaana, mutta pelkkää migreeniä sairastavien kohdalla osuus oli pienempi 29 %. Toisaalta vanhimmissa ikäluokissa 30-vuotiaista eteenpäin kenelläkään epileptikolla ei enää puhjennut migreeniä, kun taas yhteensä noin 6 % pelkkää migreeniä sairastavista sai ensimmäisen päänsärkynsä vasta vanhemmalla iällä. Aurojen alkamisiän suhteen otoksen tulisi olla suurempi, jotta tuloksista voitaisiin tehdä perusteltuja päätelmiä. Käytössä olleen pienen otoksen mukaan näyttää siltä, että pelkkää migreeniä sairastavilla aurojen alkaminen jakaantuu tasaisemmin koko elämän ajalle. Epilepsiaa sairastavista kolmesta koehenkilöstä kaikilla auraoireet olivat alkaneet nuorella aikuisiällä 10 – 30 – vuotiaana. On mielenkiintoista, että epilepsiaa sairastavat migreenikot kärsivät keskimäärin sekä useammista että oirekuvaltaan vaikeammista migreenikohtauksista kuin pelkkää 33 migreeniä sairastavat. Toisaalta aineistosta selvisi, että suurin osa epileptikoista sairasti nimenomaan auratonta migreeniä. Suuremman aineiston pohjalta olisi mielenkiintoista selvittää, miten epileptikon kokeman migreenin oirekuvaan ja alkamisikään vaikuttaa se, onko kyseessä migreenin aurallinen vai auraton muoto. Vähiten merkitsevät löydökset liittyivät kuumekouristusten esiintymiseen aineistossa. Kuumekouristuksista oli joskus elämänsä aikana kärsinyt 9 % koehenkilöistä. Sekä epilepsiaa että migreeniä sairastavien ryhmässä kuumekouristuksista kärsineiden osuus oli tähän verrattuna kolminkertainen (27 %), mikä ei ole yllättävää kuumekouristusten ja epilepsian mahdollisen yhteisen etiologisen tekijän takia. Toisaalta kukaan neljästä pelkkää epilepsiaa sairastavista ei ollut kokenut kuumekouristusta, mikä oli hieman yllättävä löydös. Aineiston vinoutunutta sukupuolijakaumaa ei voi pitää merkittävänä löydöksenä. Valtaosa tutkimuksen aineistosta (68 %) oli naisia, mutta sukupuolijakauma oli vielä selkeämmin naisvoittoinen epilepsiaa sairastavilla. Sekä epilepsiaa että migreeniä sairastavien ryhmästä kaikki olivat naisia, kun taas pelkkää epilepsiaa sairastavista kolme henkilöä neljästä oli naisia. Tämä ei kuitenkaan aineiston pienuuden takia liene merkittävä löydös. Aiempien tutkimusten mukaan tietyt epilepsiatyypit ovat naisilla yleisempiä kuin miehillä, vaikka yleisesti ottaen miehet kärsivät hieman useammin kouristuskohtauksista kuin naiset (107). 6.2 Eksomisekvensoinnissa löytyneiden varianttien merkitys Eksomisekvensoinnin tavoitteena oli tunnistaa variantteja, jotka segregoivat aineistossa migreenin tai epilepsian mukana ja aiheuttavat toiminnallisesti kiinnostavan muutoksen. Jotta jotakin varianttia voitaisiin perustellusti pitää potentiaalisena migreenin ja/tai epilepsian aiheuttajana, tulisi sen esiintyä aineistossa selkeästi yhdessä tietyn fenotyypin kanssa. Lisäksi variantin tulisi sijaita geenissä, jolla on teoreettinen yhteys tunnettuun tietoon sairauksien patologiasta, tai geenissä, jonka funktio on vielä tutkimatta. Mahdollista on myös, että useat erilliset samassa geenissä esiintyvät variantit aiheuttavat migreeniä ja epilepsiaa. Tällöinkin niiden tulee kuitenkin täyttää yllä mainitut ehdot. Taulukoissa 9 ja 10 esitellään tämän tutkimuksen tunnistamat variantit, jotka täyttivät tiukat, Menetelmät-osiossa esitellyt ehdot sijaintinsa, yleisyytensä ja seuraustensa 34 puolesta. Täten mikä tahansa niistä olisi voinut olla merkityksellinen migreenin ja epilepsian synnyssä. Kuitenkin vain yksi niistä, SYNE2-geenissä sijaitseva rs17766354, esiintyy useammalla kuin kahdella koehenkilöllä. Muiden varianttien kohdalla ehto segregoitumisesta aineistossa tietyn fenotyypin mukana ei siis täyty. Tämä ei sulje pois mahdollisuutta, että niillä voisi olla oma merkityksensä sairauksien synnyssä, mutta tämän tutkimuksen perusteella tätä johtopäätöstä ei voi tehdä. Mielenkiintoisimmaksi variantiksi valikoituu siis SYNE2-geenissä sijaitseva rs17766354. Toisaalta myös rs36215895 sijaitsee samassa geenissä, joten se nousee mukaan tarkasteluun. Kuvassa 5 esitetään näiden SYNE2-geenissä sijaitsevien varianttien segregoituminen aineistossa. Kaikki varianttien kantajat sairastavat migreeniä (tosin henkilön 6406 auraoireet eivät ole täyttäneet tässä tutkimuksessa käytettyjä aurallisen migreenin kriteerejä). Henkilö 6438, joka on ainoa kummankin variantin kantaja, kärsii oirekuvaltaan laajimmasta migreenistä ja lisäksi suoraan yleistyvistä toonis-kloonisista kohtauksista. Hänen sisarellaan, henkilöllä 6422, ei ole kuitenkaan kumpaakaan varianteista, vaikka diagnooseina on luokittelematon migreeniaura, auraton migreeni, yleistyneet tooniset kohtaukset ja paikallisalkuiset kohtaukset. Variantit eivät näytä segregoituvan myöskään hemiplegisen migreenin mukaan, sillä henkilöllä 6544 ei ole kumpaakaan varianteista. Kaiken kaikkiaan näyttää siltä, että mikään tietty diagnoosi tai oire ei liity aineistossa SYNE2-geenissä sijaitseviin variantteihin. SYNE2-geenissä sijaitsevien varianttien frekvenssejä tarkasteltaessa huomataan, että ensimmäinen niistä on suomalaisessa väestössä itse asiassa melko yleinen. Kun tutkimuksen poissulkurajana pidettiin SISu-frekvenssiä 0,05, on variantin rs17766354 SISu-frekvenssi 0,04707. Homotsygoottisena varianttia esiintyi seitsemällä koehenkilöllä SISu:n aineistosta, kun taas heterotsygoottisena jopa 299:llä. Tämän tutkimuksen aineistossa kaikilla neljällä koehenkilöllä tämä variantti esiintyi heterotsygoottisena. Kyseessä ei siis ole järin harvinainen variantti. Toinen SYNE2-geenin varianteista oli kuitenkin ensimmäiseen verrattuna hyvin harvinainen. Sekin esiintyi koehenkilöillä heterotsygoottisena. Tulosten luotettavuuden arvioimiseksi tarkastettiin varianttien lukupeitto. Variantin rs17766354 osalta se oli 40 - 65 koehenkilöstä riippuen ja variantin rs36215895 osalta se oli 12 (henkilöllä 6406) - 14 (henkilöllä 6438). Ensimmäinen variantti on siis luetettavasti 35 sekvensoitu (lukupeitto yli 30), mutta toisen variantin kohdalla tulee muistaa, että on olemassa väärän positiivisen tuloksen mahdollisuus. Yli 11-kertaisesti sekvensoidun heterotsygoottisen mutaation tulos on käytetyllä menetelmällä kuitenkin 99 % todennäköisyydellä oikea (81), joten on järkevää pitää kyseinen variantti mukana tarkastelussa. Taulukossa 10 esitellään geenit, jossa kaikki yleisyyden, sijainnin ja seurauksen mukaan valikoituneet variantit sijaitsevat. Mielenkiintoista on, että ainakin puolet geeneistä ovat funktioltaan tutkimuksen aiheen kannalta mielenkiintoisia. SYNE2, SIX6, TRIM9, TXNDC16, ARF6 ja NPAS ekspressoituvat aivoissa ja osallistuvat sekä hermoston kehityksen että toiminnan kannalta tärkeisiin tehtäviin. Aiemmat tutkimukset eivät ole yhdistäneet kyseisiä geenejä migreeniin tai epilepsiaan, mutta sen sijaan yhteys moniin muihin neurologisiin sairauksiin on olemassa. Koska tämän tutkimuksen löytämät variantit esiintyivät useimmiten vain yhdellä koehenkilöllä, jää tilanne ainakin toistaiseksi ennalleen. Eksomisekvensoinnin tuloksesta yhteenvetona voi sanoa, että ei löytynyt yhtäkään varianttia, joka segregoituisi aineistossa migreenin tai epilepsian mukana ja aiheuttaisi toiminnallisesti kiinnostavan muutoksen. SYNE2-geenissä sijaitsevat variantit olivat mielenkiintoisin löydös, mutta nekään eivät segregoituneet aineistossa tyydyttävästi. SYNE2 on esitelty osiossa 5.3 (Kandidaattigeenien määrittäminen ja analysointi). Geeni on laajuudeltaan niin valtava, että siihen sijoittuu muutenkin paljon sekä yleisiä että harvinaisia variantteja. Tässä tutkimuksessa löytyneiden, heterotsygoottisina esiintyvien varianttien merkitys lienee kokonaiskuvan kannalta pieni. Eksomisekvensoinnin tulos vahvistaa käsitystä, jonka mukaan sekä epilepsia että migreeni ovat perimältään monimutkaisia ja monitekijäisiä sairauksia. Sairauksiin vaikuttava geneettinen vaihtelu sijaitsee todennäköisesti muualla kuin eksoneissa. Suoraan proteiinia koodaavaan osaan sattuva mutaatio aiheuttaa todennäköisesti proteiinin toiminnan kannalta niin suuren muutoksen, että seuraukset ovat vakavammat ja helpommin havaittavat kuin migreenin ja epilepsian kaltaisissa monitekijäisissä taudeissa. Luultavasti geneettisiä variantteja tulisi etsiä geenien säätelyalueilta. Siellä niiden merkitys on salakavalampi: proteiinituotteet ovat rakenteeltaan normaaleja, mutta niiden tuottamiseen liittyy säätelyhäiriöitä. 36 6.3 Kandidaattigeeneissä sijaitsevien varianttien merkitys SYNE2-geenistä eikä NPAS-geenistä löytynyt mielenkiintoisia variantteja, jotka segregoituisivat aineistossa tietyn ominaisuuden suhteen ja sijaitsisivat geenien säätelyalueella. Tämä ei tosin ollutkaan todennäköistä, koska analyysi tehtiin eksoneista ja mukana oli täten vain hyvin pieni osa geenien ei-eksonisesta osasta. Jotta kandidaattigeenit saataisiin tarkasti tutkittua, tulisi koko geeni (myös intronit) ja sitä ympäröivät säätelyalueet sekvensoida ja analysoida. Oli kuitenkin järkevää hyödyntää kromosomista 14 käytössä oleva eksoniaineisto, vaikka todennäköisyys löytää tuloksia tästä tutkimuksen osiosta olikin pieni. 6.4 Tutkimuksen haasteet ja jatkosuunnitelmat Tutkimusten tuloksia tarkasteltaessa on otettava huomioon tietyt virhelähteet. Ilmeinen haaste on luotettavien diagnoosien asettaminen koehenkilöille. Vaikka käytetty migreenikyselylomake on perinpohjainen, ei se korvaa lääkärin tekemää haastattelua. Potilas saattaa jättää kirjoittamatta lomakkeeseen tärkeitäkin oireita, jos ei osaa tarkasti kuvata niitä ja toisaalta liioitella toisia oireita. Kyselylomake on vaivalloinen täyttää ja osa koehenkilöistä olikin jättänyt vastaamatta osaan kysymyksistä. Toisaalta huolella täytetty migreenikysely on osoittautunut aiemmissa tutkimuksissa hyvin tarkaksi mittariksi ja on käytännössä ainoa vaihtoehto suuria potilasmääriä tutkittaessa (108). Tässä tutkimuksessa aineistona käytetty suku oli ainutlaatuinen kokonsa ja monimuotoisen migreeni- ja epilepsiafenotyyppinsä ansiosta. On järkevää käyttää tämän kaltaista sukuaineistoa silloin kun sellainen on saatavilla, koska todennäköisesti samat geneettiset variantit selittävät sukulaisten samankaltaiset oireet. Kliiniseen tarkasteluun kerätty kyselylomakedata antoikin arvokasta tietoa epilepsian ja migreenin oireista koehenkilöillä. Eksomisekvensointia varten valittiin kuitenkin verrattain pieni osa suvusta. Suurentamalla otoskokoa olisi voitu tunnistaa luotettavammin aineistossa esiintyviä variantteja. Toisaalta eksomisekvensoitujen henkilöiden vielä tarkempi kliininen karakterisointi olisi voinut tuoda lisäarvoa tuloksia arvioitaessa. Nyt löytyneiden varianttien merkitys tietyn oireen kannalta olisi jäänyt joka tapauksessa epäselväksi, 37 koska kaikilla kahdeksalla eksomisekvensoiduilla henkilöllä oli moninaisia oireita sekä migreeniin että epilepsiaan liittyen. Tuloksia tarkasteltaessa tulee muistaa, että kyseessä oli eksomisekvensointi ja tämän takia koehenkilöiden DNA:sta suurin osa jäi tarkastelun ulkopuolelle. Tämä on toki tässä tutkimuksen vaiheessa järkevää, sillä eksomisekvensointi on paljon kustannustehokkaampaa kuin koko genomin läpikäyminen. Eksomisekvensoinnissa mahdollisesti löytyvien varianttien merkitystä on myös helpompi arvioida kuin niiden DNA:n osien, jotka eivät koodaa proteiineja. Myöhemmässä vaiheessa tulee arvioida uudestaan, käydäänkö myös koehenkilöiden ei-eksonisia perimän alueita läpi mahdollisten säätelyalueille sijoittuvien varianttien löytämiseksi. Tämän tutkimuksen aineistona toiminutta sukua kannattaa ehdottomasti seurata tulevaisuudessa. On ilmeistä, että suvussa on perinnöllistä taakkaa migreenin ja epilepsian suhteen. Haasteena on tunnistaa, missä tämä taakka tarkasti ottaen sijaitsee. Aineistoa saadaan vähitellen kasvatettua, kun suvun nuoremmat jäsenet saadaan mukaan tutkimukseen ja vanhemmilta koehenkilöiltä saadaan tieto oirekuvan muuttumisesta ajan myötä. Molekyyligeneettistä analyysia on syytä rajata tarkasti valikoituun otokseen aineistosta sen mukaan, mitä oireita pääasiallisesti tutkitaan. Harkintaan jää myös eieksonisten alueiden sekvensointi. Lähitulevaisuudessa analysoidaan kaikkien kahdeksan koehenkilön eksomisekvenssidata kolmen tunnetun FHM:ää aiheuttavan geenin CACNA1A, ATP1A2 ja SCN1A alueilta. Tavoitteena on tarkistaa, selittääkö kyseisten geenien alueelta löytyvä vaihtelu migreenin ja/tai epilepsian esiintymisen tässä suvussa. Jatkosuunnitelmana on myös analysoida kohdennetusti geenejä, jotka on liitetty laajemmin migreenifenotyyppiin aikaisemmissa kokogenominlaajuisissa GWA-tutkimuksissa (46-49). 38 6.5 Yhteenveto Tämän tutkimuksen tavoitteena oli karakterisoida suuren suomalaisen migreeniepilepsiasuvun fenotyyppi migreenin suhteen sekä tunnistaa migreenille ja epilepsialle altistavia geneettisiä variantteja kromosomista 14q12-q23 eksomisekvensoinnin avulla. Kliininen tavoite onnistui hyvin ja antoi monta mielenkiintoista löydöstä. Yllättävin tulos oli epilepsian selkeä assosiaatio aurattomaan migreeniin. Toisena päähavaintona voidaan pitää sitä, että samanaikainen epilepsia näytti lisäävän migreenioireiden vakavuutta. Epilepsiasta kärsivien migreeni alkoi keskimäärin nuorempana, oli oirekuvaltaan vaikeampaa ja kohtausten lukumäärä oli suurempi kuin vertailuryhmällä, joka kärsi pelkästä migreenistä. Kromosomin 14q12-q23 alueelta tutkituista eksoneista ei löytynyt migreenille tai epilepsialle altistavaa geneettistä varianttia. Tämä tulos vahvistaa käsitystä migreenin ja epilepsian monitekijäisesti periytyvästä luonteesta. Useat geneettiset alttiustekijät vaikuttavat yhdessä monien ympäristötekijöiden kanssa yksilön lopulliseen fenotyyppiin. Geneettiset alttiusvariantit sijaitsevat ulottumattomissa geenien säätelyalueilla. todennäköisesti eksomisekvensoinnin 39 Lähteet (1) Rasmussen BK, Jensen R, Schroll M, Olesen J. Epidemiology of headache in a general population--a prevalence study. J Clin Epidemiol 1991;44(11):1147-1157. (2) Haut SR, Bigal ME, Lipton RB. Chronic disorders with episodic manifestations: focus on epilepsy and migraine. Lancet Neurol 2006 Feb;5(2):148-157. (3) Forsgren L, Beghi E, Oun A, Sillanpaa M. The epidemiology of epilepsy in Europe a systematic review. Eur J Neurol 2005 Apr;12(4):245-253. (4) Ottman R, Lipton RB. Is the comorbidity of epilepsy and migraine due to a shared genetic susceptibility? Neurology 1996 Oct;47(4):918-924. (5) Pace BP, Sullivan-Fowler M. JAMA 100 years ago: A slander on the medical profession. JAMA 1996 Oct 16;276(15):1222b. (6) Headache Classification Committee of the International Headache Society (IHS). The International Classification of Headache Disorders, 3rd edition (beta version). Cephalalgia 2013 Jul;33(9):629-808. (7) Proposal for revised classification of epilepsies and epileptic syndromes. Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy. Epilepsia 1989 Jul-Aug;30(4):389-399. (8) Piccinelli P, Borgatti R, Nicoli F, Calcagno P, Bassi MT, Quadrelli M, et al. Relationship between migraine and epilepsy in pediatric age. Headache 2006 Mar;46(3):413-421. (9) Haan J, Terwindt GM, van den Maagdenberg AM, Stam AH, Ferrari MD. A review of the genetic relation between migraine and epilepsy. Cephalalgia 2008 Feb;28(2):105113. (10) Ducros A. Familial hemiplegic migraine: A model for the genetic studies of migraine. Cephalalgia 2014 Apr 4. (11) Hildebrand MS, Dahl HH, Damiano JA, Smith RJ, Scheffer IE, Berkovic SF. Recent advances in the molecular genetics of epilepsy. J Med Genet 2013 May;50(5):271-279. (12) de Vries B, Frants RR, Ferrari MD, van den Maagdenberg AM. Molecular genetics of migraine. Hum Genet 2009 Jul;126(1):115-132. (13) Polvi A, Siren A, Kallela M, Rantala H, Artto V, Sobel EM, et al. Shared loci for migraine and epilepsy on chromosomes 14q12-q23 and 12q24.2-q24.3. Neurology 2012 Jan 17;78(3):202-209. (14) Russell MB, Olesen J. A nosographic analysis of the migraine aura in a general population. Brain 1996 Apr;119 ( Pt 2)(Pt 2):355-361. 40 (15) Blau J. Harold G Wolff: the man and his migraine. Cephalalgia 2004 Mar;24(3):215-222. (16) Magis D, Vigano A, Sava S, d'Elia TS, Schoenen J, Coppola G. Pearls and pitfalls: electrophysiology for primary headaches. Cephalalgia 2013 Jun;33(8):526-539. (17) Zameel Cader M. The molecular pathogenesis of migraine: new developments and opportunities. Hum Mol Genet 2013 Oct 15;22(R1):R39-44. (18) Ferrari MD. Headache: the changing migraine brain. Lancet Neurol 2013 Jan;12(1):6-8. (19) Charles A. The evolution of a migraine attack - a review of recent evidence. Headache 2013 Feb;53(2):413-419. (20) Giffin NJ, Ruggiero L, Lipton RB, Silberstein SD, Tvedskov JF, Olesen J, et al. Premonitory symptoms in migraine: an electronic diary study. Neurology 2003 Mar 25;60(6):935-940. (21) Alstadhaug KB. Migraine and the hypothalamus. Cephalalgia 2009 Aug;29(8):809817. (22) Denuelle M, Fabre N, Payoux P, Chollet F, Geraud G. Hypothalamic activation in spontaneous migraine attacks. Headache 2007 Nov-Dec;47(10):1418-1426. (23) Fanciullacci M, Alessandri M, Del Rosso A. Dopamine involvement in the migraine attack. Funct Neurol 2000;15 Suppl 3:171-181. (24) Carrera P, Stenirri S, Ferrari M, Battistini S. Familial hemiplegic migraine: a ion channel disorder. Brain Res Bull 2001 Oct-Nov 1;56(3-4):239-241. (25) De Fusco M, Marconi R, Silvestri L, Atorino L, Rampoldi L, Morgante L, et al. Haploinsufficiency of ATP1A2 encoding the Na+/K+ pump alpha2 subunit associated with familial hemiplegic migraine type 2. Nat Genet 2003 Feb;33(2):192-196. (26) Dichgans M, Freilinger T, Eckstein G, Babini E, Lorenz-Depiereux B, Biskup S, et al. Mutation in the neuronal voltage-gated sodium channel SCN1A in familial hemiplegic migraine. Lancet 2005 Jul 30-Aug 5;366(9483):371-377. (27) Ophoff RA, Terwindt GM, Vergouwe MN, van Eijk R, Oefner PJ, Hoffman SM, et al. Familial hemiplegic migraine and episodic ataxia type-2 are caused by mutations in the Ca2+ channel gene CACNL1A4. Cell 1996 Nov 1;87(3):543-552. (28) Leão A. Spreading depression of activity in the cerebral cortex. 1944(Neurophysiology):359-390. (29) Hadjikhani N, Sanchez Del Rio M, Wu O, Schwartz D, Bakker D, Fischl B, et al. Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Apr 10;98(8):4687-4692. 41 (30) Bowyer SM, Aurora KS, Moran JE, Tepley N, Welch KM. Magnetoencephalographic fields from patients with spontaneous and induced migraine aura. Ann Neurol 2001 Nov;50(5):582-587. (31) De Simone R, Ranieri A, Montella S, Bonavita V. Cortical spreading depression and central pain networks in trigeminal nuclei modulation: time for an integrated migraine pathogenesis perspective. Neurol Sci 2013 May;34 Suppl 1:S51-5. (32) Bolay H, Reuter U, Dunn AK, Huang Z, Boas DA, Moskowitz MA. Intrinsic brain activity triggers trigeminal meningeal afferents in a migraine model. Nat Med 2002 Feb;8(2):136-142. (33) Karatas H, Erdener SE, Gursoy-Ozdemir Y, Lule S, Eren-Kocak E, Sen ZD, et al. Spreading depression triggers headache by activating neuronal Panx1 channels. Science 2013 Mar 1;339(6123):1092-1095. (34) Olesen J, Burstein R, Ashina M, Tfelt-Hansen P. Origin of pain in migraine: evidence for peripheral sensitisation. Lancet Neurol 2009 Jul;8(7):679-690. (35) Burstein R, Jakubowski M, Rauch SD. The science of migraine. J Vestib Res 2011;21(6):305-314. (36) Pietrobon D, Striessnig J. Neurobiology of migraine. Nat Rev Neurosci 2003 May;4(5):386-398. (37) Schurks M. Genetics of migraine in the age of genome-wide association studies. J Headache Pain 2012 Jan;13(1):1-9. (38) Mulder EJ, Van Baal C, Gaist D, Kallela M, Kaprio J, Svensson DA, et al. Genetic and environmental influences on migraine: a twin study across six countries. Twin Res 2003 Oct;6(5):422-431. (39) Silberstein SD, Dodick DW. Migraine genetics: Part II. Headache 2013 Sep;53(8):1218-1229. (40) Russell MB, Iselius L, Olesen J. Migraine without aura and migraine with aura are inherited disorders. Cephalalgia 1996 Aug;16(5):305-309. (41) Russell MB, Ulrich V, Gervil M, Olesen J. Migraine without aura and migraine with aura are distinct disorders. A population-based twin survey. Headache 2002 May;42(5):332-336. (42) Anttila V, Kallela M, Oswell G, Kaunisto MA, Nyholt DR, Hamalainen E, et al. Trait components provide tools to dissect the genetic susceptibility of migraine. Am J Hum Genet 2006 Jul;79(1):85-99. (43) Moskowitz MA, Bolay H, Dalkara T. Deciphering migraine mechanisms: clues from familial hemiplegic migraine genotypes. Ann Neurol 2004 Feb;55(2):276-280. 42 (44) Bianchin MM, Londero RG, Lima JE, Bigal ME. Migraine and epilepsy: a focus on overlapping clinical, pathophysiological, molecular, and therapeutic aspects. Curr Pain Headache Rep 2010 Aug;14(4):276-283. (45) Pennisi E. The Biology of Genomes. Disease risk links to gene regulation. Science 2011 May 27;332(6033):1031. (46) Anttila V, Stefansson H, Kallela M, Todt U, Terwindt GM, Calafato MS, et al. Genome-wide association study of migraine implicates a common susceptibility variant on 8q22.1. Nat Genet 2010 Oct;42(10):869-873. (47) Chasman DI, Schurks M, Anttila V, de Vries B, Schminke U, Launer LJ, et al. Genome-wide association study reveals three susceptibility loci for common migraine in the general population. Nat Genet 2011 Jun 12;43(7):695-698. (48) Freilinger T, Anttila V, de Vries B, Malik R, Kallela M, Terwindt GM, et al. Genome-wide association analysis identifies susceptibility loci for migraine without aura. Nat Genet 2012 Jun 10;44(7):777-782. (49) Anttila V, Winsvold BS, Gormley P, Kurth T, Bettella F, McMahon G, et al. Genome-wide meta-analysis identifies new susceptibility loci for migraine. Nat Genet 2013 Aug;45(8):912-917. (50) Ligthart L, de Vries B, Smith AV, Ikram MA, Amin N, Hottenga JJ, et al. Metaanalysis of genome-wide association for migraine in six population-based European cohorts. Eur J Hum Genet 2011 Aug;19(8):901-907. (51) Institute of Medicine (US) Committee on the Public Health Dimensions of the Epilepsies. 2012. (52) Kälviäinen R, Ansakorpi H, Flander S, Immonen A, Keränen T, Kivistö J, et al. Käypä hoito-suositus, Epilepsiat (aikuiset). 2014; Available at: http://www.terveysportti.fi/dtk/ltk/koti?p_artikkeli=ykt00683&p_haku=epilepsia. (53) Engel J,Jr, International League Against Epilepsy (ILAE). A proposed diagnostic scheme for people with epileptic seizures and with epilepsy: report of the ILAE Task Force on Classification and Terminology. Epilepsia 2001 Jun;42(6):796-803. (54) Hauser WA, Annegers JF, Kurland LT. Incidence of epilepsy and unprovoked seizures in Rochester, Minnesota: 1935-1984. Epilepsia 1993 May-Jun;34(3):453-468. (55) Berkovic SF, Mulley JC, Scheffer IE, Petrou S. Human epilepsies: interaction of genetic and acquired factors. Trends Neurosci 2006 Jul;29(7):391-397. (56) Lancaster E, Dalmau J. Neuronal autoantigens--pathogenesis, associated disorders and antibody testing. Nat Rev Neurol 2012 Jun 19;8(7):380-390. (57) McCormick DA, Contreras D. On the cellular and network bases of epileptic seizures. Annu Rev Physiol 2001;63:815-846. 43 (58) Armstrong DD. The neuropathology of temporal lobe epilepsy. J Neuropathol Exp Neurol 1993 Sep;52(5):433-443. (59) Goldin AL. Resurgence of sodium channel research. Annu Rev Physiol 2001;63:871-894. (60) Mody I. Ion channels in epilepsy. Int Rev Neurobiol 1998;42:199-226. (61) Kim JB. Channelopathies. Korean J Pediatr 2014 Jan;57(1):1-18. (62) Helbig I, Scheffer IE, Mulley JC, Berkovic SF. Navigating the channels and beyond: unravelling the genetics of the epilepsies. Lancet Neurol 2008 Mar;7(3):231245. (63) Escayg A, Goldin AL. Sodium channel SCN1A and epilepsy: mutations and mechanisms. Epilepsia 2010 Sep;51(9):1650-1658. (64) Thomas RH, Berkovic SF. The hidden genetics of epilepsy-a clinically important new paradigm. Nat Rev Neurol 2014 May;10(5):283-292. (65) Berkovic SF, Howell RA, Hay DA, Hopper JL. Epilepsies in twins: genetics of the major epilepsy syndromes. Ann Neurol 1998 Apr;43(4):435-445. (66) Yu S, Pritchard M, Kremer E, Lynch M, Nancarrow J, Baker E, et al. Fragile X genotype characterized by an unstable region of DNA. Science 1991 May 24;252(5009):1179-1181. (67) Jensen FE. Epilepsy in 2013: progress across the spectrum of epilepsy research. Nat Rev Neurol 2014 Feb;10(2):63-64. (68) EPICURE Consortium, EMINet Consortium, Steffens M, Leu C, Ruppert AK, Zara F, et al. Genome-wide association analysis of genetic generalized epilepsies implicates susceptibility loci at 1q43, 2p16.1, 2q22.3 and 17q21.32. Hum Mol Genet 2012 Dec 15;21(24):5359-5372. (69) Cavalleri GL, Weale ME, Shianna KV, Singh R, Lynch JM, Grinton B, et al. Multicentre search for genetic susceptibility loci in sporadic epilepsy syndrome and seizure types: a case-control study. Lancet Neurol 2007 Nov;6(11):970-980. (70) Speed D, Hoggart C, Petrovski S, Tachmazidou I, Coffey A, Jorgensen A, et al. A genome-wide association study and biological pathway analysis of epilepsy prognosis in a prospective cohort of newly treated epilepsy. Hum Mol Genet 2014 Jan 1;23(1):247-258. (71) Kasperaviciute D, Catarino CB, Heinzen EL, Depondt C, Cavalleri GL, Caboclo LO, et al. Common genetic variation and susceptibility to partial epilepsies: a genomewide association study. Brain 2010 Jul;133(Pt 7):2136-2147. (72) Dibbens LM, Heron SE, Mulley JC. A polygenic heterogeneity model for common epilepsies with complex genetics. Genes Brain Behav 2007 Oct;6(7):593-597. 44 (73) Helbig I, Mefford HC, Sharp AJ, Guipponi M, Fichera M, Franke A, et al. 15q13.3 Microdeletions Increase Risk of Idiopathic Generalized Epilepsy. Nat Genet 2009 Feb;41(2):160-162. (74) Soragna D, Vettori A, Carraro G, Marchioni E, Vazza G, Bellini S, et al. A locus for migraine without aura maps on chromosome 14q21.2-q22.3. Am J Hum Genet 2003 Jan;72(1):161-167. (75) Anttila V, Nyholt DR, Kallela M, Artto V, Vepsalainen S, Jakkula E, et al. Consistently replicating locus linked to migraine on 10q22-q23. Am J Hum Genet 2008 May;82(5):1051-1063. (76) Sander T, Schulz H, Saar K, Gennaro E, Riggio MC, Bianchi A, et al. Genome search for susceptibility loci of common idiopathic generalised epilepsies. Hum Mol Genet 2000 Jun 12;9(10):1465-1472. (77) the University of California Santa Cruz Genome Browser. Available at: http://genome.ucsc.edu/. (78) Kallela M, Wessman M, Farkkila M. Validation of a migraine-specific questionnaire for use in family studies. Eur J Neurol 2001 Jan;8(1):61-66. (79) Headache Classification Subcommittee of the International Headache Society. The International Classification of Headache Disorders: 2nd edition. Cephalalgia 2004;24 Suppl 1:9-160. (80) Ku CS, Cooper DN, Polychronakos C, Naidoo N, Wu M, Soong R. Exome sequencing: dual role as a discovery and diagnostic tool. Ann Neurol 2012 Jan;71(1):514. (81) Sulonen AM, Ellonen P, Almusa H, Lepisto M, Eldfors S, Hannula S, et al. Comparison of solution-based exome capture methods for next generation sequencing. Genome Biol 2011 Sep 28;12(9):R94-2011-12-9-r94. (82) The 1000 Genomes Project (human). Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/28889. (83) Cunningham F, Amode MR, Barrell D, Beal K, Billis K, Brent S, et al. Ensembl 2015. Nucleic Acids Res 2014 Oct 28. (84) Ensembl Variation - Predicted data. 2014; Available at: http://www.ensembl.org/info/genome/variation/predicted_data.html. (85) SISu-tietokanta. Available at: http://www.sisuproject.fi/. (86) Exome Aggregation Consortium. Available at: http://exac.broadinstitute.org/. (87) Zhang X, Lei K, Yuan X, Wu X, Zhuang Y, Xu T, et al. SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice. Neuron 2009 Oct 29;64(2):173-187. 45 (88) Sha L, MacIntyre L, Machell JA, Kelly MP, Porteous DJ, Brandon NJ, et al. Transcriptional regulation of neurodevelopmental and metabolic pathways by NPAS3. Mol Psychiatry 2012 Mar;17(3):267-279. (89) Dawe HR, Adams M, Wheway G, Szymanska K, Logan CV, Noegel AA, et al. Nesprin-2 interacts with meckelin and mediates ciliogenesis via remodelling of the actin cytoskeleton. J Cell Sci 2009 Aug 1;122(Pt 15):2716-2726. (90) Slavotinek AM. Eye development genes and known syndromes. Mol Genet Metab 2011 Dec;104(4):448-456. (91) Burwinkel B, Bakker HD, Herschkovitz E, Moses SW, Shin YS, Kilimann MW. Mutations in the liver glycogen phosphorylase gene (PYGL) underlying glycogenosis type VI. Am J Hum Genet 1998 Apr;62(4):785-791. (92) Berti C, Messali S, Ballabio A, Reymond A, Meroni G. TRIM9 is specifically expressed in the embryonic and adult nervous system. Mech Dev 2002 May;113(2):159-162. (93) Tanji K, Kamitani T, Mori F, Kakita A, Takahashi H, Wakabayashi K. TRIM9, a novel brain-specific E3 ubiquitin ligase, is repressed in the brain of Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Neurobiol Dis 2010 May;38(2):210-218. (94) Harz C, Ludwig N, Lang S, Werner TV, Galata V, Backes C, et al. Secretion and immunogenicity of the meningioma-associated antigen TXNDC16. J Immunol 2014 Sep 15;193(6):3146-3154. (95) Hongu T, Kanaho Y. Activation machinery of the small GTPase Arf6. Adv Biol Regul 2014 Jan;54:59-66. (96) Pickard BS, Pieper AA, Porteous DJ, Blackwood DH, Muir WJ. The NPAS3 gene-emerging evidence for a role in psychiatric illness. Ann Med 2006;38(6):439-448. (97) Zhang Q, Schmandt R, Celestino J, McCampbell A, Yates MS, Urbauer DL, et al. CGRRF1 as a novel biomarker of tissue response to metformin in the context of obesity. Gynecol Oncol 2014 Apr;133(1):83-89. (98) De Falco G, Leucci E, Lenze D, Piccaluga PP, Claudio PP, Onnis A, et al. Geneexpression analysis identifies novel RBL2/p130 target genes in endemic Burkitt lymphoma cell lines and primary tumors. Blood 2007 Aug 15;110(4):1301-1307. (99) Bernardo GM, Keri RA. FOXA1: a transcription factor with parallel functions in development and cancer. Biosci Rep 2012 Apr 1;32(2):113-130. (100) Dhanoa BS, Cogliati T, Satish AG, Bruford EA, Friedman JS. Update on the Kelch-like (KLHL) gene family. Hum Genomics 2013 May 15;7(1):13-7364-7-13. (101) Zhen YY, Libotte T, Munck M, Noegel AA, Korenbaum E. NUANCE, a giant protein connecting the nucleus and actin cytoskeleton. J Cell Sci 2002 Aug 1;115(Pt 15):3207-3222. 46 (102) Miller JN, Pearce DA. Nonsense-mediated decay in genetic disease: Friend or foe? Mutat Res Rev Mutat Res 2014 October - December;762C:52-64. (103) Kamnasaran D, Muir WJ, Ferguson-Smith MA, Cox DW. Disruption of the neuronal PAS3 gene in a family affected with schizophrenia. J Med Genet 2003 May;40(5):325-332. (104) Sha L, MacIntyre L, Machell JA, Kelly MP, Porteous DJ, Brandon NJ, et al. Transcriptional regulation of neurodevelopmental and metabolic pathways by NPAS3. Mol Psychiatry 2012 Mar;17(3):267-279. (105) Gould P, Kamnasaran D. Immunohistochemical analyses of NPAS3 expression in the developing human fetal brain. Anat Histol Embryol 2011 Jun;40(3):196-203. (106) Brunskill EW, Ehrman LA, Williams MT, Klanke J, Hammer D, Schaefer TL, et al. Abnormal neurodevelopment, neurosignaling and behaviour in Npas3-deficient mice. Eur J Neurosci 2005 Sep;22(6):1265-1276. (107) Carlson C, Dugan P, Kirsch HE, Friedman D, The EPGP Investigators. Sex differences in seizure types and symptoms. Epilepsy Behav 2014 Oct 14;41C:103-108. (108) Kallela M, Wessman M, Farkkila M. Validation of a migraine-specific questionnaire for use in family studies. Eur J Neurol 2001 Jan;8(1):61-66. 47 Liitteet Liite 1 Sukupuu 48 49 50 51 52 53 54 55
© Copyright 2024